Summary
Ici, un protocole est présenté pour encapsuler et cultivant les cellules en poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels fonctionnalisés avec un fluorogène matrice métalloprotéinases (MMP)-peptide dégradable. MMP cellulaire et l’activité métabolique sont mesurées directement à partir de l’hydrogel de cultures à l’aide d’un lecteur de microplaques standard.
Abstract
Systèmes de cultures cellulaires (3D) en trois dimensions souvent mieux récapitulent in vivo des réponses cellulaires et les fonctions que les systèmes de la culture traditionnelle à deux dimensions (2D). Toutefois, la mesure de la fonction des cellules en culture 3D est souvent plus difficile. Plusieurs dosages biologiques nécessitent de récupération du matériel cellulaire qui peut être difficile dans les cultures 3D. Pour relever ce défi consiste à développer de nouveaux matériaux qui permettent de mesurer de la fonction des cellules dans le matériau. Ici, on présente une méthode pour la mesure de l’activité cellulaire matrix métalloprotéinases (MMP) hydrogels 3D dans un format de 96 puits. Dans ce système, un hydrogel poly(ethylene glycol) (PEG) est fonctionnalisé avec un capteur de clivables fluorogène MMP. L’activité cellulaire MMP est proportionnelle à l’intensité de la fluorescence et peut être mesurée avec un lecteur de microplaques standard. Miniaturisation de ce test dans un format 96 puits réduit le temps requis pour expérimental mis en place par l’utilisation de 50 % et réactif de 80 % par l’état par rapport à la précédente version de 24 puits du dosage. Ce dosage est également compatible avec les autres mesures de la fonction cellulaire. Par exemple, une analyse de l’activité métabolique est démontrée ici, qui peuvent être menées simultanément avec les mesures de l’activité au sein de l’hydrogel même MMP. Le dosage est illustrée avec des cellules de mélanome humain encapsulés dans un éventail de cellules pour déterminer la densité d’encapsulation approprié pour la plage de travail de l’analyse des densités de semis. Après 24 h d’encapsulation de cellules, MMP et affichages de l’activité métabolique ont été proportionnelles à la densité de semis de cellule. Tandis que le dosage est démontré ici avec un un substrat fluorogène dégradable, le dosage et la méthodologie pourraient être adaptés à une grande variété de systèmes d’hydrogel et autres sondes fluorescentes. Une telle analyse fournit une plate-forme de culture 3D pratique, efficace et facilement accessible pour une grande variété d’applications.
Introduction
Systèmes en trois dimensions (3D) souvent plus étroitement les récapituler en vivo les réponses cellulaires que les systèmes de la culture traditionnelle à deux dimensions (2D), voir plusieurs excellentes publications1,2,3 . Cependant, utilisant des systèmes de culture 3D permettant de mesurer la fonction des cellules a été difficile en raison de la difficulté d’extraction cellulaire et encore goûter de traitement. Cette difficulté limite la mesure de nombreuses fonctions cellulaires dans des systèmes de culture 3D. Pour surmonter cette difficulté, nouvelles techniques sont nécessaires qui permettent de mesurer facilement de la fonction des cellules au sein d’environnements 3D. Une façon de répondre à ce besoin est l’élaboration de matériel qui non seulement soutenir la culture cellulaire 3D mais incorporent également des capteurs pour mesurer la fonction des cellules. Par exemple, plusieurs systèmes d’hydrogel ont intégré des fractions clivables de protéase fluorogène pour permettre la visualisation de l’activité protéase dans les environnements 3D4,5,6,7. Tandis que ces systèmes ont été initialement utilisés pour l’imagerie microscopique, ces systèmes peuvent être adaptées pour une utilisation dans une analyse d’activité de métalloprotéinases (MMP) matrice globale à l’aide d’un lecteur de plaque standard, ce qui permet de mesure facile d’une fonction de la cellule en 3D environnement,8.
MMP, une super-famille de protéases de zinc, joue un rôle crucial dans l’homéostasie des tissus normaux et dans de nombreuses maladies. MPM se dégrade et remodelage de la matrice extracellulaire (mec), Cliver les cytokines et les récepteurs de surface cellulaire et activer les autres MMP9,10. MMP joue un rôle crucial dans les processus physiologiques tels que la cicatrisation des plaies et maladies comme l’arthrite, l’athérosclérose, Alzheimer et le cancer (voir commentaires du 9,10,,11). Dans le cancer, des niveaux élevés d’expression MMP sont fortement corrélés avec les métastases du cancer et de mauvais pronostic,12. En outre, MMPs contribuent à la progression tumorale en favorisant l’invasion des cellules du cancer et la migration des processus cellulaires qui sont intrinsèquement 3D phénomènes13,14. Par conséquent, il y a beaucoup d’intérêt dans la capacité de mesurer l’activité des MMP dans la culture 3D dans de nombreux contextes, y compris des études biologiques fondamentales et les tests de dépistage de drogue.
Les hydrogels PEG sont largement utilisés pour la culture cellulaire 3D en raison de leur forte teneur en eau, résistance à l’adsorption de protéines et la nature accordable. Hydrogels PEG ont été fonctionnalisés avec un certain nombre de portions à la fonction des cellules direct, comme avec des peptides mimétiques ECM comme RGD, RLD et IKVAV pour faciliter l’adhérence de cellules, ou direct attacher des facteurs de croissance tels que transformant β facteur de croissance (TGF-β) 15,,16. Plus récemment, les hydrogels PEG ont été fonctionnalisés avec des peptides de capteurs qui permettent de mesurer de la fonction des cellules bien5,,8. En particulier, l’utilisation d’un système d’hydrogel PEG fonctionnalisés avec un fluorogène MMP-dégradables mesure de peptide a permis de l’activité cellulaire de MMP dans les cultures 3D avec un lecteur de plaque standard et ne requis aucune poursuite de la procédure. Ces systèmes sont également compatibles avec les autres mesures de la fonction cellulaire, y compris l’activité métabolique. Ici, un protocole est décrit pour le mesurage de l’activité des MMP des cellules cultivées dans un hydrogel PEG 3D fonctionnalisés avec un peptide MMP-dégradables fluorogéniques et présentés des résultats montrant les expériences d’optimisation initiale nécessaires à l’utilisation de ce dosage. Cellules de mélanome humain (a375 Office) ont été encapsulés dans les hydrogels fluorogène sur une plage d’ensemencement des densités pour déterminer les densités de semis appropriées qui sont dans la portée de l’essai. Après 24 h d’encapsulation, MMP et l’activité métabolique ont été mesurés en utilisant un lecteur de microplaques standard. Ensuite, l’activité MMP a été normalisée à activité métabolique pour déterminer les densités de semis dans la gamme linéaire du dosage. Enfin, coefficient intraplaques des pourcentages de variation (CV %) ont été calculées entre réanalysés pour refléter la reproductibilité des résultats obtenus. Cette méthode permet à la culture cellulaire 3D simple et rapide et simple mesure de l’activité de la protéase avec traitement de l’échantillon minimal.
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Protocol
1. préparation des composants Hydrogel
- Synthétiser les peptides fluorescents protéase-dégradables comme décrit ailleurs8, utilisant la fluorescéine comme la molécule fluorescente et dabcyl comme l’extincteur. Dissoudre le peptide dans le DMSO à une concentration de 10 mM et le magasin dans un congélateur à-80 ° C dans de petites aliquotes (~ 30 µL) d’éviter les cycles répétés de gel-dégel.
Remarque : Ces peptides peuvent également être achetés dans le commerce. Ce protocole requiert une cystéine C-terminale de la séquence peptidique pour permettre l’incorporation covalente dans le réseau de polymère hydrogel. - Préparer 8 amine (PEG) de (éthylène glycol) de la poly des kDa de l’arm 40-norbornène (NB) comme décrit17. Vérifiez la fonctionnalisation de groupe de fin de plus de 90 % à l’aide d' 1H RMN. Dissoudre PEG-NB en solution saline tampon stérile de phosphate (PBS) à 25 % p/v et l’entreposer dans le congélateur-80 ° C (~ 300 µL) d’extraits.
NOTE : PEG fonctionnalisés avec norbornène peut également être acheté dans le commerce. - Synthétiser le trimethylbenzoylphosphinate de phényle 2,4,6 lithium photo-initiateur (LAP) comme décrit ailleurs18. Dissoudre les genoux dans l’eau stérile à une concentration de 68 mM et stocker dans un congélateur à-80 ° C dans les parties aliquotes (~ 300 µL).
Remarque : comme alternative, Irgacure (2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) utilisable comme l’initiateur de photo. LAP et Irgacure peuvent être achetés dans le commerce. - Dissoudre la reticulation MMP-dégradables de peptide (KCGPQG↓IWGQCK) et le peptide d’adhérence cellulaire (CRGDS) dans de l’eau stérile à une concentration de 200 mM et 100 mM respectivement et les stocker dans un congélateur à-80 ° C (~ 300 µL et ~ 30 µL) parties aliquotes, respectivement.
2. Mode operatoire médias préparation
- Préparer l’inactivés par la chaleur, charbon de bois dépouillé sérum fœtal (SVF) pour le dosage MMP :
NOTE : Protéases dans FBS peuvent produire un signal de fond élevé avec le test MMP ; par conséquent, il est recommandé d’inactiver à la chaleur et du charbon de bois bande la FBS pour les médias de dosage.- Inactiver les 100 mL de FBS en chauffant pendant 30 min à 55 ° C.
Remarque : 100 mL de FBS a été utilisé ici pour aliquotage et stockage à-20 ° C pour une utilisation future. Petits volumes peuvent être utilisés selon les besoins. - Ajouter 0,25 % p/v de charbon actif et 0,025 % p/v de dextran à une petite quantité de FBS (environ 5 mL) et mélangez jusqu'à forme une pâte. Ensuite, ajouter le reste de la FBS et remuez pendant 30 min à 55 ° C.
- Centrifuger à 1 962 x g pendant 20 min à 4 ° C. Puis transférer le surnageant sur un autre navire.
- Répétez l’étape 2.1.2 mais à 37 ° C, suivie de l’étape 2.1.3. Stériliser le surnageant à l’aide d’un filtre de 0,45 µm et ensuite un filtre de 0,2 µm.
- Inactiver les 100 mL de FBS en chauffant pendant 30 min à 55 ° C.
- Préparer les milieux d’essai à l’aide de milieux supplémentés avec 1 % charbon dépouillé FBS, 2 mM de L-glutamine, 10 U/mL de pénicilline, 10 µg/mL de streptomycine.
NOTE : Les médias sans rouge de phénol sont recommandé parce qu’il a moins d’interférences fluorescence. Autres ajouts à la presse d’essai telles que l’insuline, facteurs de croissance, etc.,. peut être ajouté en tant que l’absorbance et pics du spectre de fluorescence ne se chevauchent pas avec le capteur (494 nm/521 nm). - Enzyme collagénase bactérienne diluée de type I à 10 et 1 000 µg/mL dans les médias de dosage comme témoin positif.
3. Hydrogel préparation et cell encapsulation
- Préparer la solution de précurseur d’hydrogel.
- Ajouter les réactifs dans un tube de 1,5 mL dans l’ordre suivant, vortex après addition de chaque composant : 20 mM 8 bras 40 kDa PEG-NB, 12,75 mM reticulation MMP-dégradables peptide, 17,8 mM NaOH, 1 mM CRGDS, 2 mM au tour et le peptide de fluorogène MMP-dégradables de 0,25 mM.
Remarque : Le tableau 1 montre contenu de solution pour le précurseur hydrogel, les concentrations de stock, les concentrations de travail, formules de calcul de volume et les volumes requis nécessaires pour faire 120 µL de solution de précurseur d’hydrogel, suffisante mener une expérimenter avec 10 hydrogels. Pour tenir compte de la perte de la solution d’hydrogel à cause de pipetage, augmenter le volume total de 20 %. Les peptides commerciaux sont souvent fournis dans une solution d’acide chlorhydrique ; NaOH est donc ajouté pour atteindre un pH final de 7. pH de la solution finale doit être confirmée par l’utilisateur. - Diviser la solution de précurseur d’hydrogel en tubes multiples de 1,5 mL, un tube par la condition testée.
Remarque : Plusieurs conditions de contrôle dans lequel les hydrogels sont préparés sans l’ajout de cellules sont suggérées. Pour un contrôle négatif, pour tenir compte de la dégradation non spécifique du capteur fluorogène, une condition d’hydrogel peut être incubée avec le contrôle du véhicule ou les médias expérimentaux seuls s’il n’y a aucune condition de traitement. Pour un contrôle positif et pour l’étalonnage entre les expériences, hydrogels peuvent être incubées avec une protéase connue en conjonction avec le capteur fluorogène. Par exemple, deux concentrations de collagénase bactérienne ont été utilisées ici.
- Ajouter les réactifs dans un tube de 1,5 mL dans l’ordre suivant, vortex après addition de chaque composant : 20 mM 8 bras 40 kDa PEG-NB, 12,75 mM reticulation MMP-dégradables peptide, 17,8 mM NaOH, 1 mM CRGDS, 2 mM au tour et le peptide de fluorogène MMP-dégradables de 0,25 mM.
- Encapsuler des cellules d’hydrogels.
- Préparer une suspension monocellulaire comme approprié pour le type de cellule utilisé. Par exemple, laver un plat de 10 cm de cellules de mélanome a375 Office avec 10 mL de PBS. Trypsinize des cellules à l’aide de la trypsine 0.05 % et incuber à 37 ° C et 5 % CO2 pendant 3 min. numération des cellules avec un hémocytomètre pour déterminer le nombre total de cellules.
- Centrifuger la solution cellulaire à 314 x g pendant 3 min, aspirer les milieux de culture, puis remettre en suspension les cellules dans du PBS à environ trois fois la densité plus élevée requise semie pour l’expérience. Par exemple, une suspension de cellules avec une densité de 21 x 106 cellules a été utilisée ici pour atteindre une densité finale encapsulée de 7 x 106 cellules/mL.
- Compter les cellules à nouveau afin d’assurer une concentration cellulaire précis.
- Ajouter des cellules suspendues et PBS dans chaque tube de solution de précurseur d’hydrogel selon la densité de semis requise (0,25, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6 et 7 x 106 cellules/mL dans cet exemple). Ajouter PBS à conditions avec aucune cellule au lieu de cellules de la suspension.
NOTE : Toutes les conditions doivent avoir le même volume de solution finale hydrogel précurseur pour assurer le rapport entre les composantes de l’hydrogel et PBS est constante. Ne pas les tubes vortex qui possède des cellules en eux, pipette de haut en bas vigoureusement sans créer de bulles afin de mélanger la solution de précurseur. - Diluer 10 µL de la solution de précurseur d’hydrogel dans un stérile noir rond bas plaque 96 puits, veiller à ce que la pointe est centrée au milieu de chaque puits pendant la distribution.
- Polymériser solution de précurseur d’hydrogel en exposant la plaque à la lumière ultraviolette (UV) à 4 mW/cm2 pendant 3 min.
Remarque : La lampe UV (UVL-56 poche UV lampe, UVP, Upland, Californie) produit de lumière UV-A longue longueur d’onde UV (365 nm), qui n’affecte pas la viabilité cellulaire. - Ajouter 150 µL de médias de dosage dans toutes les loges, à l’exception des conditions de contrôle positif sans cellules encapsulées. Les contrôles positifs, ajouter 150 µL de solution d’enzyme collagénase.
- Ajouter 150 µL de PBS aux puits externes de la plaque pour réduire l’évaporation durant l’incubation.
4. MMP et mesure de l’activité métabolique
- Mesurer la fluorescence immédiatement après encapsulation pour établir une mesure de fluorescence de base et d’assurer l’uniformité dans la polymérisation de l’hydrogel. Lire la plaque à l’aide d’une microplaque de fluorescence lecteur utilisant un protocole de plaque à 96 puits opaque avec une superficie scan réglage à 494 nm/521 nm (excitation/émission). Ce sera la 0 h lire.
- Incuber les plaques dans un incubateur humidifié à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 18 h.
- Ajouter une activité métabolique réactif (résazurine) à 01:10 (v/v) pour chaque puits.
- Incuber les plaques dans un incubateur humidifié à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 6 h supplémentaires.
Remarque : Ce temps d’incubation peut varier selon le type de cellule. - Mesurer la fluorescence à l’encapsulation après 24h. Lire la plaque à l’aide d’une microplaque de fluorescence lecteur utilisant un protocole de plaque à 96 puits opaque avec une superficie scan réglage à 494 nm/521 nm (excitation/émission) pour l’activité des MMP et 560 nm/590 nm (excitation/émission) pour l’activité métabolique.
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Representative Results
Le dosage en cours a été adapté d’un système de culture hydrogel 3D précédemment développé et caractérisé fonctionnalisé avec un fluorogène MMP clivables capteur8. Le capteur MMP fluorogène utilisé ici se compose d’une séquence peptidique, GPLAC (pMeOBzl) ↓WARKDDK (Almeras) C (↓ indique le site de clivage) qui a été précédemment optimisé pour le clivage par MMP-14 et MMP-1119. Le peptide est étiqueté avec une molécule fluorescente (fluorescéine) et une molécule d’extincteur (dabcyl) de chaque côté du site de clivage (Figure 1). Au contact du capteur fluorogène de la protéase appropriée, le fluorophore et extincteur sont séparés, et fluorescence augmente. Ici, le dosage a été miniaturisé d’une plaque 24 puits dans un format de plaque à 96 puits, éliminant plusieurs étapes dans le processus d’encapsulation et de réduire le temps nécessaire pour réaliser une expérience de 50 %. En outre, il réduit le volume de réactifs consommés par les 80 %, comme hydrogel volumes ont été réduits de 50 µL à 10 µL / puits. En outre, en utilisant une plaque à 96 puits, 20 conditions réanalysés pourraient être testées au lieu des 12 conditions des doublons par plaque 24 puits. Un schéma du processus d’encapsulation de la cellule est illustré à la Figure 2. Étiquette 1 et 2 correspondent aux étapes 3.1 et 3.2 du protocole, respectivement. Étiquettes de 3 à 5 correspondent aux étapes 3.2.5 à 3.2.7 dans le protocole. Étiquettes de 6 à 9 correspondent aux étapes de 4.2 à 4.5 dans le protocole.
Pour fixer les limites de détection et paramètres de l’essai de signaux, les hydrogels fonctionnalisés avec le peptide MMP-dégradables fluorogène sont incubées avec une gamme de concentrations (0 à 2 000 µg/mL), du type d’enzyme collagénase bactérienne j’ai. Après 24 h d’incubation à 37 ° C, d’un lecteur a été utilisé pour mesurer la fluorescence (Figure 3). Partir de ces mesures, la dynamique (plus bas et le plus élevé détecté des signaux) et rayon d’action (3 écarts-types au-dessus de la plus faible signal détecté) et 3 écarts types au-dessous du signal détecté plus haut ont été déterminés. Après 24 h d’incubation, on a fait observer que le signal détecté la plus basse a été produit par les témoins négatifs (bruit de fond) à collagénase de µg/mL 0, alors que les plus élevées détectées signal a été produite par 1 000 collagénase µg/mL ou plus haut, où le signal commence à plateau (Figure 3). De la plage dynamique, le rayon d’action a été évaluée à entre ≈0.16 µg/mL et ≈474 µg/mL de collagénase, une gamme large de signal entre les trois ordres de grandeur.
Pour des essais de culture de cellules, la densité de la cellule appropriée qui se traduit par des lectures de fluorescence dans la portée de l’essai doit être déterminée pour chaque type de cellule. Ici, les données représentatives sont présentées pour la lignée de cellules de mélanome a375 Office, encapsulé dans une gamme de densités allant de 0,25 à 7 x 106 cellules/mL. Intensité de la fluorescence a été acquis en utilisant un lecteur de microplaques standard à deux moments différents : 1) directement après l’encapsulation (0 h) et 2) après 24 h d’encapsulation. À 0 h, lectures de fluorescence étaient faibles dans les densités de semis (Figure 4A), comme prévu. Après 24h de culture (Figure 4B), activité MMP était directement proportionnelle à la densité de semis, dans lequel plus de cellules conduit à une coupure plus fluorogène MMP clivables détecteur d’et de plus grande intensité de fluorescence. Comme les contrôles internes, hydrogels ne contenant aucuns cellules ont été incubées avec 0, 10 et 1 000 µg/mL de collagénase de type I enzyme pour indiquer les niveaux faibles, moyens et élevés du signal respectivement (tel que déterminé par la caractérisation de gamme de signal de collagénase dans Figure 3) et représentés par des lignes pointillées dans la Figure 4B. De plus, des limites d’échelle de travail ont été calculés à partir des signaux 0 et 1 000 µg/mL et représentées par des lignes pointillées dans la Figure 4B. Densités de semis à ou supérieur à 1 x 106 cellules/mL se situent dans les limites de l’aire de travail. Mesures de l’activité métabolique de la lignée cellulaire a375 Office étaient également directement proportionnelles à la cellule (Figure 4C) la densité de semis. Auparavant, l’activité MMP a été normalisée à activité métabolique comme témoin interne pour déterminer l’activité des MMP sur une base par cellule8. Normaliser l’activité MMP à activité métabolique entre les densités de semis a abouti à aucune différence significative dans l’activité des MMP à semis densités supérieures à 2 x 106 cellules/mL (Figure 4D). Pour déterminer la variabilité entre réanalysés dans chaque assiette (variabilité intra-plaque), le coefficient du pourcentage de variation (% CV) a été calculé pour les MMP et activité métabolique et est résumé dans le tableau 2. CV % inférieur à 20 % indique que la variabilité intra-plaque au sein de la géométrie est acceptable pour le système à produire des résultats constants20,21.
Figure 1 : Le fluorogène MMP-dégradables conception peptide. Le peptide fluorogène MMP-dégradables se compose d’un squelette peptidique GPLAC (pMeOBzl) ↓WARKDDK (Almeras) C (↓ indique le site de clivage) qui détermine la spécificité du capteur. Le peptide est étiqueté avec un extincteur (dabcyl) et un fluorophore (fluorescéine), qui est inassouvie (fluorescente) quand le peptide de l’épine dorsale est clivé par MMP. Un groupe thiol est conjugué au peptide épine dorsale pour permettre une réaction covalente avec groupes fonctionnels norbornène dans la molécule de PEG, coupler le capteur à l’hydrogel. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Schéma de dosage. Les composants de la solution hydrogel précurseur sont mélangés avec les cellules en suspension dans du PBS. La solution de précurseur est alors reversé en noir, fond, plaques à 96 puits rond et polymérisé par l’exposition aux UV pendant 3 min. dosage des médias est ajouté, et les boîtes sont incubées pendant 18 h (37 ° C, 5 % de CO2). L’activité métabolique réactif résazurine est ensuite ajouté et les boîtes sont incubées pendant une h 6 autres MMP et activité métabolique sont mesurées à l’aide d’un lecteur de microplaques fluorescent avec un protocole d’analyse bien à la longueur d’onde d’excitation/émission indiquée. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Dynamique et portée de l’essai. Hydrogels fonctionnalisés avec fluorogène peptide MMP-dégradables ont été incubées avec une gamme de concentrations de type d’enzyme collagénase que j’ai pendant 24 h à 37 ° C et de fluorescence mesuré. Les lignes pointillées représentent la plage dynamique et fonctionnel. n = 3, moyenne ± écart-type (SD). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Effet des semis à densité de lignée de cellules de mélanome a375 Office sur l’activité des MMP. (A) première cote (0 h) de l’activité des MMP pour a375 Office lignée de cellules encapsulée dans une gamme de densités de semis. n = 3 moyenne ± SD. (B) mesure de l’activité des MMP à 24 h. 0, 10 et 1000 µg/mL de collagénase sont représentés par des lignes pointillées. Lignes en pointillés représentent la plage de travail (WR) calculée à partir des contrôles de la collagénase. n = 3, moyenne ± SD. (C) Measurement de l’activité métabolique pour la lignée cellulaire a375 Office encapsulé pendant 24 h dans une gamme de densité de semis et incubées avec résazurine pour 6 h. n = 3, moyenne ± SD. (D) MMP a375 Office activité normalisée à activité métabolique. n = 3, moyenne ± écart-type. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Tableau 1 : Préparation de solutions pour le précurseur Hydrogel.
Tableau 2 : Intra-plaque % CV du dosage avec lignée cellulaire a375 Office.
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Discussion
La culture in vitro de cellules 3D reprend plusieurs aspects importants de l’environnement in vivo. Cependant, la culture 3D permet également d’évaluer la fonction des cellules et signalisation difficile, autant d’épreuves biologiques nécessitent extraction cellulaire et un grand nombre de cellules. Par conséquent, la mise au point d’un système de culture 3D simple qui permet la mesure de la fonction cellulaire sans autre échantillon traitement augmenterait considérablement l’utilité des systèmes de culture 3D. Le système 3D décrit ici peut être adapté pour une variété d’applications différentes. La séquence du capteur fluorogène peut être modifiée afin de détecter d’autres protéases. Par exemple, la fluorogène clivables capteur séquence (GPQG↓IWGQK) qui peut être clivée par MMP-1, -2, -3, -7, -8 et -9, a été précédemment utilisé pour détecter l’activité des MMP mélanome en réponse aux agents chimiothérapeutiques22. L’utilisation du système PEG hydrogel permet également précise Réglage indépendant du microenvironnement cellulaire, dont les propriétés mécaniques, la dégradabilité et les fractions d’adhérence matrice au sein de l’hydrogel. La molécule d’adhésion RGD utilisée dans ce travail est une série dérivée de la fibronectine et permet l’adhésion intégrine-médiée. Autres molécules d’adhésion telles que (RLD) et (IKVAV) qui sont dérivés de fibrinogène et de laminine respectivement pourrait être utilisée pour activer d’autres types d’intégrines. Par exemple, il a été démontré que modifier les molécules d’adhérence changé l’élongation du aortiques valvulaire les cellules interstitielles (VIC), qui peuvent avoir un effet sur de sténose valvulaire aortique15. La séquence de reticulation hydrogel peut contrôler la dégradabilité de l’hydrogel et comportement cellulaire encapsulé au sein de l’hydrogel. Par exemple, il a été démontré que les fibroblastes avaient augmenté la prolifération et cellule diffusion lorsqu’il est cultivé dans la dégradation plus rapide hydrogels, qui peut accélérer le processus en vivoguérison23. Les propriétés mécaniques du microenvironnement peuvent également réguler la fonction des cellules, et rigidité hydrogel peut être modifiée en changeant la quantité d’armes dans le macromère PEG, poids moléculaire de PEG et le rapport entre la cheville et reticulation.
Parce que l’activité des MMP varie selon le type de cellule, pour chaque nouveau type de cellule, il est important de mener une expérience d’optimisation de densité encapsulation comme montré ici. Après 24 h d’encapsulation, MMP et l’activité métabolique ont été directement proportionnelles à la densité de semis de cellules. Cependant, à plus longs que le signal fluorescent peut plateau, le moment du test peut donc être optimisée par l' utilisateur8. Le capteur de protéase spécifique peut aussi affecter la portée et le moment du test. La plage de travail du dosage peut être déterminée en effectuant une expérience de gamme signal avec aucune cellule et une enzyme protéolytique sur une grande concentration. L’inclusion de plusieurs aucune condition d’hydrogel cellulaires incubés avec enzyme contrôles active mise en place de la dépression (bruit de fond), moyens et élevés des niveaux de signal au sein de chaque série de tests (0, 10 et 1 000 µg/mL de collagénase ici). Cela donne une idée d’où les signaux produites par les cellules entrent dans la portée de l’essai. Ce dosage est également compatible avec d’autres capteurs fluorescents qui n’ont pas de chevauchement spectres d’excitation et d’émission, tels que l’essai d’activité métabolique utilisé ici comme un contrôle interne pour calculer l’activité des MMP sur base par cellule, comme indiqué précédemment8 . Activité du MMP activité normalisée à métabolique a démontré la validité de cette approche pour l’ensemencement de densité égale ou supérieure à 2 x 106 cellules/mL, dans lequel il n’y a aucun changement significatif dans les densités de semis. Cette normalisation est primordial d’identifier les densités de semis appropriées qui sont dans le rayon de la courbe de l’activité des MMP et dans la partie linéaire de la courbe de la normalisation.
Alors que le test peut être adapté à diverses fins, il y a plusieurs limites et aspects critiques, que l’utilisateur doit tenir compte, portant en particulier sur l’interférence avec le signal fluorescent et la préparation de l’hydrogel. Tout d’abord, il faut avec le choix des milieux de culture et les traitements complémentaires, car elles ont un spectre d’absorbance qui se chevauchent ou l’opacité qui peut-être interférer avec la détection de la fluorescence ou étancher le signal. Il est recommandé d’utiliser des milieux de culture qui ne contient pas de rouge de phénol. En outre, certains traitements médicamenteux sont fluorescents (p. ex., doxorubicine), ou avoir le spectre d’absorbance qui chevauche avec le spectre d’excitation/émission du fluorophore (p. ex., les curcuminoïdes). Un deuxième aspect qui peut affecter la performance du test est la préparation de l’hydrogel. En raison de la forte viscosité de la solution de précurseur d’hydrogel, les soins doivent être prises pour assurer un mélange intime des solution hydrogel et prudents pipetage pratiques pour empêcher le fluorophore inégal contenu ou hydrogel volume de solution dans chaque puits. Prémouillage des pointes de pipette et en utilisant les conseils de faible rétention peuvent aider à réduire la variabilité. Un autre aspect important de la préparation de l’hydrogel est la forme hydrogel et son emplacement dans les puits. L’hydrogel doit être centré dans le puits et d’une forme uniforme pour permettre des mesures de fluorescence précis avec moins de variabilité15. Ici, l’utilisation de plaques de fond rond favorise l’embout de la pipette dans chaque puits et la production des hydrogels semi-sphérique de centrage uniformément dans l’ensemble de tous les puits.
En adaptant le système 3D hydrogel protéase-dégradables, protéase en temps réel et affichage de l’activité métabolique peut être détecté dans un micro-environnement 3D avec le traitement de l’échantillon minimal. En outre, l’utilisation de l’hydrogel de PEG synthétique réduit la variabilité de lot a observé d’origine naturelle ECM hydrogels. En outre, utilisation PEG hydrogels permet une mise au point d’indices chimiques et mécaniques des hydrogels pour un contrôle amélioré du microenvironnement. En outre, la polymérisation d’hydrogel PEG décrite ici est un processus amorcées, rendant plus propices à des méthodes à haut débit que hydrogels classiques d’ECM naturels et rapide (c’est à dire., collagène ou Matrigel), qui sont plus lents et sensible à la température. Cette polymérisation rapide et contrôlée par l’utilisateur permet l’intensification du système à automatiser davantage à l’aide de gestionnaires de liquides robotiques, comme en témoignent d’autres15.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs aimeraient souligner Ohio Cancer Research (OCR), OH, é.-u., pour le financement de ces travaux ainsi que King Saud University (KSU), Riyad, Arabie saoudite d’avoir parrainé le premier auteur. Poids moléculaire de la sonde fluorescente peptide a été mesurée à l’aide de la matrice assistée, désorption-ionisation laser, spectrométrie de masse (MALDI-TOF) temps de vol avec l’aide de la Campus chimique Instrument centre de spectrométrie de masse et protéomique Installation à l’Ohio State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| Activated charcoal | Sigma-Aldrich | C3345 | |
| Black round bottom 96-well plate | Brand-Tech | 89093-600 | |
| Cell adhesion peptide (CRGDS) | GenScript USA Inc. | custom made | |
| Collagenase enzyme type I | Life Technologies | 17100-017 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | D4876 | |
| DMEM High Glucose Media | Invitrogen | 11965118 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Seradigm | 1500-500 | |
| Fluorescence microplate reader | BioTek | Cytation 3 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific Co. | 3200 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| MMP-degradable peptide crosslinker (KCGPQG↓IWGQCK) | GenScript USA Inc. | custom made | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318500 | |
| Penicillin /streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Resazurin (Alamar Blue) | Life Technologies | DAL1100 | |
| UV light | UVP | 95-0006-02 |
References
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