Summary
カプセル化、poly(ethylene glycol) (PEG) ゲル修飾と蛍光マトリックスメタロプロテアーゼ (MMP) の細胞を培養するためのプロトコルを提示するここでは、-分解性ペプチド。携帯電話の MMP と代謝活性は、標準的なマイクロ プレート リーダーを使用したハイドロゲルの文化から直接測定されます。
Abstract
しばしば三次元 (3 D) 細胞培養システムが、生体内での細胞および機能をより密接に要約するので、二次元 (2 D) の伝統文化システムよりも。しかし、三次元培養における細胞機能の測定より困難頻繁です。多くの生物学的アッセイは、3 D の文化で困難なことができる細胞材料の取得を要求します。この課題に対処する方法の 1 つは材料内の細胞機能の測定を有効にする新しい材料を開発します。ここでは、96 ウェル フォーマットで 3 D ゲルにおける細胞外マトリックス マトリックスメタロプロテアーゼ (MMP) の活性の測定の手法を提案します。このシステムで蛍光の MMP 分解センサー poly(ethylene glycol) (PEG) ハイドロゲルに修飾します。細胞遊走は蛍光強度に比例して、標準的なマイクロ プレート リーダーで測定することができます。96 ウェル フォーマットにこのアッセイの小型化アッセイの前 24 ウェルのバージョンと比較して条件ごとに 80% 50% と試薬の使用によって実験のセットアップに必要な時間の短縮。この試金はまた細胞機能の他の測定と互換性です。たとえば、代謝活性アッセイは、ここで示します同じハイドロゲル内の MMP 活性測定を同時に行なうことができます。ヒトメラノーマ細胞播種密度アッセイの作業範囲の適切なカプセル化の密度を決定するセルの範囲にわたってカプセル化でアッセイを発揮します。カプセル化細胞の 24 h 後 MMP と代謝活性の読み出し、細胞播種密度に比例します。1 つ出来る分解蛍光基質でアッセイをここで発揮、間分析と方法論はさまざまなハイドロゲル システムや他の蛍光センサーの適応かもしれません。このようなアッセイは、さまざまなアプリケーションのための実用的で効率的かつ簡単にアクセスできる 3 D 培養プラットフォームを提供します。
Introduction
三次元 (3 D) 培養システム多くの場合より密接に二次元 (2 D) の伝統文化システムよりも生体内の細胞応答を要約、いくつか優れた出版物1,2,3を参照.しかし、細胞の機能を測定する三次元培養システムを利用して携帯電話の検索の難しさのために挑戦している、さらに処理のサンプルします。この難易度は、3次元培養システムで多くの細胞機能の測定を制限します。この困難を克服するために新しい技術が必要な 3 D 環境内で細胞機能の簡単な測定を可能にします。この必要性に対処する方法の 1 つは、3 D 細胞培養のサポートだけでなく、また、細胞の機能を測定するセンサーを組み込む材料の開発です。たとえば、いくつかのハイドロゲル システムは蛍光プロテアーゼ分解部分 3 D 環境4,5,6,7内プロテアーゼ活性の可視化を有効にするを組み込まれています。一方、これらのシステムは、もともと顕微鏡イメージングのために利用された、これらのシステムも 3 D で細胞機能の簡易測定を有効にする標準的なプレート リーダーを使用してグローバル ・ マトリックス マトリックスメタロプロテアーゼ (MMP) の活性用適応できます。環境8。
Mmp、亜鉛プロテアーゼのスーパーファミリーは、正常組織の恒常性と多くの疾患で重要な役割を果たします。Mmp が低下して細胞外マトリックス (ECM) を改造、サイトカインと細胞表面受容体を切断、他 Mmp の9,10をアクティブにします。Mmp は、関節炎、動脈硬化、アルツハイマー病、および癌 ( 9,10,11のレビューを参照してください) などの疾患、創傷治癒など生理学的なプロセスで重要な役割を果たします。癌で高い MMP の発現は癌の転移と予後不良12相関します。さらに、Mmp は、癌細胞の浸潤や移行、本質的に 3 D 現象13,14細胞プロセスを促進することによって腫瘍の進行に貢献します。したがって、基礎生物学的研究や薬剤のスクリーニングの試金など、多くの場面で 3 D 培養の MMP 活性を測定することに関心があります。
ペグ ゲルは、高含水率により 3 D 細胞培養、タンパク質吸着と可変自然への抵抗のため活躍しています。ペグ ヒドロゲルは、細胞接着を促進する増殖因子 β (TGF-β)の変換などの成長因子のテザリングを直接 RGD、RLD と IKVAV のような ECM 擬態ペプチドなど直接セルに関数、鎖の数と機能されて15,16。最近では、PEG ヒドロゲルよく5,8と細胞機能の測定を可能にするセンサー ペプチド修飾されてが。具体的には、ペグ ハイドロゲル システムの使用は修飾と蛍光標準プレート リーダー 3 D 培養細胞の MMP 活性の測定 MMP 分解ペプチドを有効に、それ以上の処理は必要ありません。これらのシステムは、細胞機能、代謝活性を含む他の測定。蛍光の MMP 分解ペプチド修飾 3 D ペグ ハイドロゲルとこれの使用のために必要な最初の最適化実験を示す示された結果で培養された細胞の MMP 活性の測定のためのプロトコルの説明ここでは、試金。ひと悪性黒色腫細胞 (A375) された播種アッセイの作業範囲内にある適切な播種密度を決定する量の範囲で蛍光ゲルでカプセル化されます。カプセル化の 24 h 後 MMP と代謝活性を標準的なマイクロ プレート リーダーを用いた測定しました。次に、MMP 活性アッセイの線形範囲内播種密度を決定するための代謝活性と正常化しました。最後に、得られた結果の再現性を反映するようにトリプリケート間変動パーセンテージ (%cv) のプレート内の係数を求めた。このメソッドには、シンプルで高速な 3 D 細胞培養、および最小限のサンプル処理とプロテアーゼ活性の簡易測定ができます。
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Protocol
1. ハイドロゲル コンポーネントの準備
- 8、フルオレセイン蛍光分子としてや、クェンチャーとして dabcyl 活用他前述の蛍光プロテアーゼ分解性ペプチドを合成します。10 mM の濃度の DMSO のペプチドや凍結融解の繰り返しを避けるために小さい (〜 30 μ L) 因数で-80 ° C の冷凍庫に保管を溶解します。
注: これらのペプチドは、市販も購入できます。このプロトコルには、ハイドロゲル ポリマー ネットワークに共有結合結合を有効にするペプチド配列の C 末端のシステインが必要です。 - 8 腕 40 kDa ポリ (エチレング リコール) アミン (PEG) の準備-ノルボルネン (NB) として説明17。1H NMR を使用して 90% 以上の最後のグループ化を確認します。溶かしてペグ NB 滅菌リン酸バッファー生理食塩水 (PBS) 25 %w/v で (~ 300 μ L) 因数で-80 ° C の冷凍庫に保管してください。
注: PEG 修飾ノルボルネンは商業的また購入することができます。 - 18を他の場所で説明されているように光開始剤リチウム フェニル 2,4,6 trimethylbenzoylphosphinate (ラップ) を合成します。68 mM の濃度に滅菌水でラップを溶解し、(~ 300 μ L) 因数で-80 ° C のフリーザーで保存します。
注: Irgacure (2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) は光開始剤として使用することができます別の方法として。ラップと Irgacure は、商業的に購入することができます。 - それぞれ、ペプチド MMP 分解 (KCGPQG↓IWGQCK) 架橋剤と滅菌水 200 mM と 100 mM の濃度で細胞接着ペプチド (CRGDS) を溶解し、(~ 300 μ L と 〜 30 μ L)-80 ° C のフリーザーに保管因数、それぞれ。
2. 分析メディアの準備
- 熱不活化準備、炭剥奪 MMP の試金のためのウシ胎児血清 (FBS)。
注: FBS のプロテアーゼは MMP の試金; 高いバック グラウンド信号を作り出すことができます。したがって、熱不活化し、炭に勧めアッセイ メディアの FBS をストリップします。- 55 ° C で 30 分間加熱による政府短期証券の 100 mL を不活性化します。
注: FBS の 100 mL は、早かったと将来の使用のための-20 ° C で保存のためここで利用されました。小さいボリュームは、必要に応じて使用できます。 - FBS (約 5 mL) の少量に 0.25% デキストランの活性炭と 0.025% の w/v の w/v を加え、スラリーが形成されるまでをかき混ぜます。FBS の残りの部分を追加し、55 ° C で 30 分間かき混ぜる
- 1,962 x gで 4 ° C で 20 分間遠心上澄みを別の容器に転送します。
- 2.1.2 手順を繰り返しますが、37 ° C ではステップ 2.1.3 続きます。0.45 μ m フィルターとし、0.2 μ m フィルターを使用して上清を滅菌します。
- 55 ° C で 30 分間加熱による政府短期証券の 100 mL を不活性化します。
- アッセイ メディアを準備 FBS、2 mM 10 U/mL ペニシリン、L-グルタミン 10 μ G/ml ストレプトマイシンを剥奪 1% 炭を添加したメディアを使用しています。
注: 蛍光干渉が少ないを持っているので、フェノールレッドなしメディアはお勧めします。インシュリン、成長因子などのアッセイ メディア他の追加等.は吸光度限り追加可能性があります、センサー (494 nm/521 nm) と蛍光スペクトルのピークは重複しません。 - 希薄細菌コラゲナーゼ酵素 I 型 10 と 1,000 μ g/mL アッセイ メディアで肯定的な制御として。
3. ゲル作製と細胞のカプセル化
- ヒドロゲル前駆体溶液を準備します。
- 次の順序で 1.5 mL チューブ、ボルテックス各コンポーネントの付加の後に試薬を追加: 20 mM 8 腕 40 kDa ペグ NB、12.75 mM MMP 分解性架橋剤ペプチド、17.8 mM NaOH、1 mM 2 mM ラップ、CRGDS、0.25 mM 蛍光の MMP 分解ペプチド。
注意:表 1に示しますゲル前駆体ソリューション内容、ストック濃度、作業濃度ボリューム計算式と必要なボリュームを実施するのに十分なゲル前駆体溶液の 120 μ L をするために必要な10 ヒドロゲルを試してください。ピペッティングによるハイドロゲル、ソリューションの損失を考慮して、20% の総容積を増やします。商業のペプチドが備わっておりしばしば酸性塩化水素溶液。従って、水酸化ナトリウムは 7 の最終 pH を達成するために加えられます。最終的な解決の pH は、ユーザーによって確認する必要があります。 - 複数の 1.5 mL チューブにゲル前駆体溶液を分割対象条件ごとの 1 つの管。
注: ゲルが細胞添加せず準備は、いくつかの制御条件が示唆されました。陰性対照の非特異蛍光センサーの劣化を考慮するハイドロゲル条件の 1 つことができます培養車両制御と実験的メディアだけで治療条件がない場合。肯定的な制御と実験間の校正では、ヒドロゲルは蛍光センサーを切断するプロテアーゼ孵化することができます。たとえば、細菌コラゲナーゼの 2 つの濃度はここで使用されました。
- 次の順序で 1.5 mL チューブ、ボルテックス各コンポーネントの付加の後に試薬を追加: 20 mM 8 腕 40 kDa ペグ NB、12.75 mM MMP 分解性架橋剤ペプチド、17.8 mM NaOH、1 mM 2 mM ラップ、CRGDS、0.25 mM 蛍光の MMP 分解ペプチド。
- ヒドロゲルのセルをカプセル化します。
- 使用しているセルの種類に応じて単一細胞懸濁液を準備します。たとえば、10 ml の PBS の A375 メラノーマ細胞の 10 センチメートルの皿を洗ってください。Trypsinize 0.05% トリプシンを用いた細胞と細胞数を決定する検定の 3 分カウント電池の CO2を 37 ° C、5% で孵化させなさい。
- 314 x g 3 分で細胞液を遠心分離機、培地を吸引し、約 3 倍、最高必要な播種密度実験のための PBS のセルを再度中断します。たとえば、21 x 10 の6セルの密度と細胞懸濁液は、7 × 106セル/mL の最終的なカプセル化された密度を達成するためにここで使用されました。
- 正確な細胞濃度のように、再びセルをカウントします。
- (0.25、0.5、1、2、3、4、5、6、および 7 x 106セル/mL この例で) 必要な播種密度に応じてヒドロゲル前駆体溶液の各チューブに浮遊細胞と PBS を追加します。浮遊細胞の代わりにセルがいない条件に PBS を追加します。
注: すべての条件ではハイドロゲル成分比を確保するため同じ最終的なヒドロゲル前駆体の解決の容積を持っているし、PBS は一定。細胞内には、前駆体溶液を混合するために泡を作成せず積極的にピペットを上下するボルテックス チューブないを行います。 - 黒の無菌調剤中に先端を各ウェルの真ん中に中央揃えされていることを確認、下 96 ウェル プレート ラウンドにヒドロゲル前駆体溶液 10 μ L を調剤します。
- ヒドロゲル前駆体溶液を 3 分の 4 mW/cm2で紫外 (紫外線) 光にプレートを公開することによって重合します。
注: UV ランプ (UVL 56 ハンドヘルド UV ランプ、UVP、アップランド、カリフォルニア州) を生成する紫外線波長の長い UV-A 光 (365 nm)、細胞の生存率には影響しません。 - カプセル化されたセルのない肯定的な制御条件を除いてすべての井戸にアッセイ メディアの 150 μ L を追加します。ポジティブ コントロールするコラゲナーゼ酵素液の 150 μ L を追加します。
- 孵卵中の蒸発を減らすためにプレートのウェルに 150 μ L の PBS を追加します。
4. MMP と代謝活性の測定
- 蛍光を測定すぐにポスト カプセル化ベースライン蛍光測定を確立し、ゲルの重合における均一性を確保します。蛍光マイクロ プレートを用いたプレートを読む領域と不透明の 96 ウェル プレート プロトコルを活用したリーダーは、494 nm/521 nm (励起/蛍光) で設定をスキャンします。これを読む 0 h になります。
- プレート 18 h の 37 ° C、5% CO2で加湿のインキュベーターで孵化させなさい。
- 1:10 (v/v) 各井戸のための代謝活性試薬 (レサズリン) を追加します。
- さらに 6 時間 37 ° C、5% CO2で加湿のインキュベーターでプレートを孵化させなさい。
注: このインキュベーション時間は、細胞の種類に応じて異なる場合があります。 - 24 h 後カプセル化で蛍光を測定します。蛍光マイクロ プレートを用いたプレートを読む領域と不透明の 96 ウェル プレート プロトコルを活用したリーダーは、494 nm/521 nm (励起/蛍光) MMP 活性と代謝活性の 560 nm/590 nm (励起/蛍光) で設定をスキャンします。
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Representative Results
現在のアッセイは、修飾と蛍光の MMP 分解センサー8以前開発と特徴づけられる三次元ハイドロゲル培養系から適応されました。ここで使用される蛍光の MMP センサーは GPLAC (pMeOBzl) ↓WARKDDK (AdOO) C ペプチッド シーケンスで構成されています (↓ は、胸の谷間のサイトを示す) ことは以前 MMP 14 と MMP 1119で胸の谷間を最適化しました。ペプチドには蛍光分子 (蛍光) と胸の谷間のサイト (図 1) の両側を癒す分子 (dabcyl) が付いています。適切なプロテアーゼを浴びる蛍光センサーの fluorophore とクエンチャを分離し、蛍光を増加させます。ここでは、アッセイは 24 ウェル プレートから小型化された 96 ウェル プレート形式にカプセル化プロセスの複数のステップを排除し、50% の実験の実行に必要な時間を短縮します。さらに、10 μ L/ウェルに 50 μ L からハイドロゲルのボリュームが減った、試薬の 80% が消費量を削減しました。また、24 ウェル プレート当り重複で 12 の条件ではなく、96 ウェル プレートを使用して、トリプリケート 20 条件をテストできます。セル封止工程の概略図を図 2に示します。ラベルに 1 と 2 は、手順 3.1 と 3.2 プロトコルでは、それぞれに対応しています。3 に 5 のラベルは、プロトコルの手順 3.2.5 に 3.2.7 に対応します。9 に 6 のラベルは、プロトコルの手順 4.5 4.2 に対応します。
検出限界を確立し信号の分析の範囲、蛍光の MMP 分解ペプチド修飾ヒドロゲル培養細菌コラゲナーゼ酵素型の濃度 (0 に 2,000 μ g/mL) の範囲で私。37 ° C で培養 24 時間後プレート リーダーは、(図 3) 蛍光を測定に使用されました。これらの測定は動的から (最低、最高検出信号) と (上記の最低検出信号 3 標準偏差) と最高の検出信号以下 3 の標準偏差の作業範囲と判断されました。培養 24 時間後最低検出信号は 0 μ g/mL コラゲナーゼでネガティブ コントロール (雑音など) によって生成された、1,000 μ g/mL コラゲナーゼや信号の開始の上、最高検出信号が生産されたことが観察されました。高原 (図 3)。ダイナミック レンジから ≈0.16 μ g/mL から ≈474 μ g/mL コラゲナーゼ、3 桁にわたって広い信号範囲の間で作業範囲を求めた。
細胞培養の試金のセル タイプごとに適切な細胞密度アッセイの作業範囲内の蛍光測定値の結果を決定する必要があります。ここでは、悪性黒色腫細胞株 A375、密度 0.25 から 7 × 106セル/mL の範囲でカプセル化の代表的なデータを提示します。蛍光強度は、2 つの異なる時点での標準的なマイクロ プレート リーダーを用いた買収された: 1) 直接カプセル化 (0 h) と 2) カプセル化の 24 h 後。0 h、蛍光測定値低い播種密度 (図 4A) で期待どおりにあった。文化 (図 4B) の 24 h 後 MMP 活動はより多くの細胞が蛍光の MMP 分解センサーと高い蛍光強度のより多くの切断で起因した、播種密度に比例。I がそれぞれ (におけるコラゲナーゼ信号範囲の特性によって決定される信号の低、中、および高レベルを示す酵素コラゲナーゼの 10、および 1,000 μ g/mL 型として内部統制、細胞を含まないゲル 0 を添加して、図 3)、図 4Bでは破線で表されます。さらに、作業範囲制限 0/1,000 μ g/mL 信号から算出し、図 4Bでは点線で示されます。播種密度 1 x 106セル/mL 以上では、動作範囲の限界の内で落ちる。A375 細胞の代謝活性の測定も播種密度 (図 4C) セルに直接比例していた。以前は、セルごとに8の MMP 活性を決定する内部統制として代謝活性に MMP 活動を正規化されています。播種密度 2 x 106セル/mL (図 4D) より大きいの MMP 活性に有意差なしで起因した播種密度の間で代謝活性に MMP の活性を正常化します。各プレート (プレート内変動) でトリプリケート間変動を決定するには、変動割合 (%cv) の係数は MMP の代謝活性を計算し、表 2にまとめています。20% 以下 CV % は、トリプリケート内プレート内変動ある一貫した結果20,21を生成するシステムでは許容を示します。
図 1: 蛍光の MMP 分解ペプチドのデザイン。蛍光の MMP 分解ペプチドから成っているバックボーン ペプチド GPLAC (pMeOBzl) ↓WARKDDK (AdOO) C (↓ は、胸の谷間のサイトを示す) センサーの特異性を決定します。クェンチャー (dabcyl) と焼入れである蛍光体 (フルオレセイン) ラベルは、ペプチド (蛍光を発する) MMP によるバックボーン ペプチドを切断するとき。チオール グループは、ヒドロゲルへセンサーを結合ノルボルネン官能ペグ分子と共有結合反応を有効にバックボーン ペプチド共役です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 回路図をアッセイします。ヒドロゲル前駆体ソリューション コンポーネント PBS 中に浮遊細胞と混在しています。前駆体溶液は、ブラックに戻、96 ウェル プレート下部のラウンド、3 分の試金のための紫外線への露出によってメディアが追加され、重合、プレートは 18 h (37 ° C、5% CO2) インキュベートします。代謝活性試薬レサズリンが追加されますプレートに追加 6 h MMP の孵化し、代謝活性が示された励起/蛍光波長でよくスキャン プロトコル蛍光マイクロ プレート リーダーを使用して測定されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3:動的とアッセイの作業範囲。37 ° C と蛍光強度で 24 時間私が測定したコラゲナーゼ酵素型の濃度の範囲で蛍光の MMP 分解ペプチド修飾ヒドロゲル培養。点線は、ダイナミックな作業範囲を表しています。n = 3、平均 ± 標準偏差 (SD)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4:の播種密度の悪性黒色腫細胞株 A375 MMP 活性に影響します。(A) 播種密度の範囲にわたってカプセル A375 細胞ラインの MMP 活性の測定 (0 h) を初期します。n = 3 の平均 ± SD. (B) 24 時間 0、10、1000 μ g/ml コラゲナーゼの MMP 活性測定は破線で表されます。点線は、コラゲナーゼ コントロールから計算作業範囲 (WR) を表しています。n = 3、A375 細胞株播種量の範囲で 24 時間カプセル化され、6 h n レサズリンと孵化させるため ± SD. (C) 代謝活性の測定の意味 = 3、± SD. (D) を意味 A375 MMP 活性代謝活性に正規化します。n = 3、意味 ± SD.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
表 1:ヒドロゲル前駆体溶液製剤。
表 2:A375 細胞ラインとアッセイ プレート内 %cv.
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Discussion
3 D の in vitro における細胞培養を繰り返す体内環境の多くの重要な側面です。3次元培養も評価する細胞機能になり、携帯電話の検索と多数のセルを必要と多くの生物学的アッセイ挑戦を伝達します。したがって、開発処理と 3次元培養システムの有用性を大きくさらにサンプルなし細胞機能の測定を可能にする単純な 3次元培養システム。ここで説明した 3 D システムは、様々 な異なるアプリケーションに対応が可能します。蛍光センサーのシーケンスを変更して、他のプロテアーゼを検出できます。例えば、蛍光劈開センサーと順番 (GPQG↓IWGQK)、MMP 1 は切断することができます-2、-3、-7、-8、-9、以前化学療法22に応えて黒色 MMP 活性を検出する利用されました。ペグ ハイドロゲル システムの使用は、機械的性質、分解性、ヒドロゲル内マトリックス接着部分など、細胞の微小環境の正確な独立チューニングもできます。RGD この作業で使用する接着分子フィブロネクチン由来のシーケンスは、インテグリンを介する接着。(RLD) など他の接着分子と (IKVAV) フィブリノゲンから派生してラミニンそれぞれインテグリン受容体の他の種類を有効に利用できます。たとえば、接着分子を変更する変更大動脈弁間質細胞 (VIC)、大動脈弁狭窄症15に影響を及ぼす可能性のある茎の伸長であることが示された.ゲルの架橋剤シーケンスは、ハイドロゲルとヒドロゲル内でカプセル化された細胞挙動の分解を制御できます。たとえば、増殖と拡散23生体内で癒しのプロセスを迅速化がゲルを高速分解で培養細胞、線維芽細胞が増加していたことを示した。制御の機械的性質は細胞機能を調節することがまた、ハイドロゲル剛性はペグと架橋剤の比率、PEG 分子量ペグ macromer 腕の数を変えることによって変更できます。
MMP の活性は、細胞の種類によって異なります、ので新しいセル タイプごとに重要です例に示すようにカプセル化密度最適化実験を実施します。カプセル化の 24 h 後 MMP と代謝活性、細胞の播種密度に比例する直接。ただし、蛍光信号することができます高原時間が長く、したがってアッセイのタイミングかもしれませんユーザー8に最適化します。特定プロテアーゼ センサーは、作業範囲、アッセイのタイミングにも影響します。アッセイの作業範囲は、広い濃度以上セルの蛋白質分解酵素と信号範囲の実験を行うことにより決定できます。孵化酵素コントロールにより低 (雑音) 創立ないのいくつかの携帯ハイドロゲル条件を含めること、それぞれの試金 (0, 10, 1,000 μ g/mL コラゲナーゼここの) 内の信号の中および高レベル。これは、細胞によって生成される信号がアッセイの作業範囲内秋の指示を与えます。この試金はまた重複の励起とここで使用される代謝活性アッセイなどの発光スペクトルを持っていない他の蛍光センサーと互換性 MMP アクティビティをセルごとに計算する内部統制、以前に報告された8.MMP 活動代謝に正規化された活動を示した播種量 2 × 106細胞/ml である以上、このアプローチの妥当性の播種量に大きな変化はないです。この正規化は MMP 活性曲線の作業範囲内および正規化曲線の直線部分は、適切な播種密度を識別するために重要です。
一方、アッセイは、いくつかの目的のために合わせることができる、いくつかの制限と蛍光信号や、ゲルの作製との干渉に関して具体的には、ユーザーが考慮すべき重要な側面があります。最初に、これら重複する吸光度スペクトルまたは不透明蛍光性の検出を妨げる可能性がありますまたは信号を消すことができるようにケアを文化メディアと付加的な処置の選択で取られなければなりません。フェノールレッドが含まれていない文化メディアを使用することをお勧めします。また、いくつかの薬物治療、蛍光 (例えば、ドキソルビシン) または (例えば、クルクミン) 蛍光体の励起/蛍光スペクトルと重なる吸光度スペクトルを持っています。アッセイのパフォーマンスに影響を与えることができます 2 番目の側面は、ハイドロゲルの準備です。ヒドロゲル前駆体溶液の粘度のためケアはハイドロゲル ソリューションと各ウェルに不平等な fluorophore コンテンツまたはハイドロゲルの解決の容積を回避するための注意のピペッティング プラクティスの徹底的な混合を確実に取られる必要があります。あらかじめピペット チップの湿潤と低保持ヒントを使用して、変動を減らすことができます。ハイドロゲルの準備のもう一つの重要な側面は、ハイドロゲル形状と井戸の場所です。井戸内と少ない変動15で正確な蛍光測定に均一な形状のヒドロゲルを中心する必要があります。ここでは、すべての井戸の間で一貫して各ウェル ・半球状ヒドロゲルの生産のピペット チップを中心にエイズの丸底板の使用。
3 D のプロテアーゼ分解性ハイドロゲル システムを適応することによりリアルタイム プロテアーゼと代謝活性の読み出しを最小限のサンプル処理による 3次元微小環境で検出できます。さらに、合成の釘ゲルの使用は天然由来の ECM ハイドロゲルと、バッチごとに変動を低減します。また、PEG ハイドロゲルを利用したヒドロゲル、微小環境の改善された制御のための化学および機械の微調整できます。さらに、ここで説明したペグ ゲル重合は写真開始プロセス、迅速かつより古典的な自然な ECM ゲルよりも高スループット方法論に従うこと (すなわち.、コラーゲンやマトリゲル)、低速であると温度に敏感。このクイック、ユーザー制御重合により、さらにロボットの液体ハンドラーの使用を自動化するシステムのスケーリング アップ15他の人によって示されるように。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者は、キング サウド大学 (KSU)、リヤド、サウジアラビア最初の著者のスポンサーと同様、オハイオ州がん研究 (OCR)、ああ、この仕事を資金調達のため米国を認めたいと思います。蛍光ペプチド センサーの分子量は、マトリックス、支援レーザー脱離イオン化法、キャンパス化学楽器センター質量分析及びプロテオミクスから支援を受けて飛行時間 (MALDI-TOF) 質量分析法を用いて測定しました。オハイオ州立大学の施設。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| Activated charcoal | Sigma-Aldrich | C3345 | |
| Black round bottom 96-well plate | Brand-Tech | 89093-600 | |
| Cell adhesion peptide (CRGDS) | GenScript USA Inc. | custom made | |
| Collagenase enzyme type I | Life Technologies | 17100-017 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | D4876 | |
| DMEM High Glucose Media | Invitrogen | 11965118 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Seradigm | 1500-500 | |
| Fluorescence microplate reader | BioTek | Cytation 3 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific Co. | 3200 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| MMP-degradable peptide crosslinker (KCGPQG↓IWGQCK) | GenScript USA Inc. | custom made | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318500 | |
| Penicillin /streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Resazurin (Alamar Blue) | Life Technologies | DAL1100 | |
| UV light | UVP | 95-0006-02 |
References
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