Summary
Här, ett protokoll presenteras för inkapsling och odla celler i poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels functionalized med en fluorogenic matrix metalloproteinas (MMP)-nedbrytbara peptid. Cellulära MMP och metabolisk aktivitet mäts direkt från hydrogel kulturer använder en standard microplate reader.
Abstract
Tredimensionella (3D) cellsystem kultur sammanfatta ofta närmare i vivo cellulära svar och funktioner än traditionella tvådimensionella (2D) kultur system. Mätning av cellernas funktion i 3D kultur är dock ofta mer utmanande. Många biologiska analyser kräver hämtning av cellulära material som kan vara svårt i 3D kulturer. Ett sätt att ta itu med denna utmaning är att utveckla nya material som möjliggör mätning av cellernas funktion inom materialet. Här presenteras en metod för mätning av cellular matrix metalloproteinas (MMP) aktivitet i 3D hydrogels i 96 brunnar format. I detta system, en poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogel är functionalized med en fluorogenic MMP cleavable sensor. Cellulär MMP aktivitet är proportionell mot fluorescensintensiteten och kan mätas med en standard microplate reader. Miniatyrisering av denna analys till en 96 brunnar format minskat den tid som krävs för experimentell uppsättning upp av 50% och reagens användning av 80% per tillstånd jämfört med den tidigare 24-väl versionen av analysen. Denna analys är också kompatibel med andra mätningar av cellulär funktion. Exempelvis är en metabolisk aktivitet assay visat här, som kan utföras samtidigt med MMP Aktivitetsmätningar inom den samma hydrogel. Analysens demonstreras med mänskliga melanomceller inkapslade i en rad cell sådd densiteter för att bestämma den lämpliga inkapsling densiteten för arbetsområdet i analysen. Efter 24 h på cell inkapsling var MMP och metabolisk aktivitet utläsningar proportionell till cell sådd densitet. Medan analysen framgår här med en fluorogenic nedbrytbart substrat, skulle analys och metod kunna anpassas för en mängd av hydrogel system och andra fluorescerande sensorer. En sådan analys ger en praktisk, effektiv och lättillgänglig 3D culturing plattform för en mängd olika applikationer.
Introduction
Tredimensionella (3D) kultur system ofta närmare recapitulate i vivo cellulära svar än traditionella tvådimensionella (2D) kultur system, se flera utmärkta publikationer1,2,3 . Dock utnyttja 3D kultur system för att mäta cellernas funktion har varit en utmaning på grund av svårigheten att cellulära hämtning och prova ytterligare bearbetning. Denna svårighet begränsar mätning av många cellulära funktioner i 3D kultur system. Att övervinna denna svårighet, nya tekniker behövs som möjliggör enkel mätning av cellernas funktion inom 3D-miljöer. Ett sätt att bemöta detta behov är utveckling av material som inte bara stödja 3D cellkultur men också införliva sensorer för att mäta cellernas funktion. Till exempel har flera hydrogel system inbyggda fluorogenic proteashämmare cleavable beståndsdelarna för att aktivera visualisering av proteas aktivitet inom 3D miljöer4,5,6,7. Medan dessa system var ursprungligen utnyttjas för mikroskopbilder, kan dessa system också anpassas för användning i en global matrix metalloproteinas (MMP) aktivitet assay använder en Kantbockade reader, aktivera lättköpt mätning av en cell-funktion i en 3D miljö8.
MMP, en superfamilj av zink proteaser, spela avgörande roller i normal vävnad homeostas och många sjukdomar. MMP försämra och omskapa extracellulär matrix (ECM), klyva ytan cellreceptorer och cytokiner och aktivera andra MMP9,10. MMP spela avgörande roller i fysiologiska processer såsom sårläkning och sjukdomar såsom artrit, åderförkalkning, Alzheimers och cancer (se recensioner 9,10,11). I cancer, är hög MMP uttrycket starkt korrelerade med cancer metastaser och dålig prognos12. Dessutom bidra MMP till tumör progression genom att främja cancer cell invasion och migration, cellulära processer som är till sin natur 3D fenomen13,14. Därför finns det mycket intresse i förmågan att mäta MMP aktivitet i 3D kultur i många sammanhang, inklusive grundläggande biologiska studier och drug screening analyser.
PEG hydrogeler används allmänt för 3D cellkultur tack vare sin höga vattenhalt, resistens mot protein adsorption och avstämbara natur. PEG hydrogeler har varit functionalized med ett antal beståndsdelarna till direkta cellens funktion, såsom med ECM mimetiska peptider som RGD, RLD och IKVAV att underlätta celladhesion, eller direkt tjudra tillväxt faktorer såsom omvandla tillväxt factor-beta (TGF-β) 15,16. Mer nyligen, PEG hydrogeler har varit functionalized med sensor peptider som möjliggör mätning av cellens funktion som väl5,8. Specifikt, att en PEG hydrogel systemet functionalized med en fluorogenic MMP-nedbrytbara peptid aktiverat mätning av cellulär MMP aktivitet i 3D kulturer med en Kantbockade läsare och krävs ingen ytterligare bearbetning. Dessa system är också kompatibla med andra mätningar av cellulär funktion, inklusive metabolisk aktivitet. Här beskrivs ett protokoll för mätning av MMP celler odlade i en 3D PEG hydrogel functionalized med en fluorogenic MMP-nedbrytbara peptid och resultat som presenteras visar de ursprungliga optimering experiment behövs för användandet av denna aktivitet assay. Mänskliga melanomceller (A375) var inkapslad i den fluorogenic hydrogels över en rad sådd densiteter för att bestämma den lämpliga sådd tätheter som ligger inom arbetsområdet för analys. Efter 24 h för inkapsling mättes MMP och metabolisk aktivitet utnyttjar en standard microplate reader. Nästa, MMP aktivitet var normaliserade till metabolisk aktivitet att avgöra den sådd täthet inom analysens linjära intervallet. Slutligen beräknades intra-plattan koefficient av variation procentsatser (% CV) mellan exemplar att återspegla reproducerbarheten av de erhållna resultaten. Denna metod möjliggör enkel och snabb 3D cellkultur och enkel mätning av proteas aktivitet med minimal prov bearbetning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hydrogel komponenter förberedelse
- Syntetisera fluorescerande proteas-nedbrytbara peptiderna som beskrivs på annat håll8, utnyttja fluorescein som den fluorescerande molekylen och dabcyl som törstsläckare. Lös upp peptiden i DMSO till en koncentration av 10 mM och förvaras i-80 ° C i små (~ 30 µL) delprover att undvika upprepad frysning-tining cykler.
Obs: Dessa peptider kan också köpas kommersiellt. Detta protokoll kräver en C-terminal cystein i sekvensen peptid aktivera kovalent införlivande hydrogel polymer nätverket. - Förbereda 8 arm 40 kDa poly (etylenglykol) Amin (PEG)-norbornen (NB) som beskrivs17. Verifiera slutet gruppen funktionalisering av större än 90% med 1H NMR. Lös PEG-NB i sterila fosfat buffert saltlösning (PBS) på 25% w/v och store i-80 ° C frys i (~ 300 µL) alikvoter.
Obs: PEG functionalized med statsminister kan också köpas kommersiellt. - Syntetisera den foto-initierare litium fenyl 2,4,6 trimethylbenzoylphosphinate (LAP) som beskrivs på annan plats18. Lös upp varv i sterilt vatten till en koncentration på 68 mM och förvaras i-80 ° C frys i (~ 300 µL) alikvoter.
Obs: som ett alternativ, Irgacure (2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) kan användas som foto-initiativtagare. VARV och Irgacure kan köpas kommersiellt. - Upplösa de MMP-nedbrytbara peptid crosslinker (KCGPQG↓IWGQCK) och cell adhesion peptiden (CRGDS) i sterilt vatten till en koncentration på 200 mM och 100 mM respektive, och lagra dem i-80 ° C frys i (~ 300 µL och ~ 30 µL) portioner, respektive.
2. analys media förberedelse
- Förbereda den Värmeinaktiverade, träkol strippad fetalt bovint serum (FBS) för MMP analysen:
Obs: Proteaser i FBS kan producera en hög bakgrund signal med MMP-analys; Det rekommenderas därför att värme-inaktivera och träkol remsa FBS för assay media.- Inaktivera 100 mL FBS genom uppvärmning under 30 minuter vid 55 ° C.
Obs: 100 mL FBS var utnyttjas här för alikvotering och lagring vid-20 ° C för framtida bruk. Mindre volymer kan användas efter behov. - Tillsätt 0,25% w/v av aktivt kol och 0.025% w/v av dextran till en liten mängd FBS (ca 5 mL) och rör tills ett slam bildas. Lägg resten av FBS sedan och rör om 30 minuter vid 55 ° C.
- Centrifugera vid 1 962 x g under 20 minuter vid 4 ° C. Sedan överför supernatanten till ett annat fartyg.
- Upprepa steg 2.1.2 men vid 37 ° C följt av steg 2.1.3. Sterilisera supernatanten med ett 0,45 µm filter och sedan ett 0,2 µm filter.
- Inaktivera 100 mL FBS genom uppvärmning under 30 minuter vid 55 ° C.
- Förbereda assay media använder media kompletteras med 1% träkol strippad FBS, 2 mM L-glutamin, 10 U/mL penicillin, 10 µg/mL streptomycin.
Obs: Media utan fenolrött rekommenderas eftersom den har mindre störningar av fluorescens. Andra tillägg till assay media såsom insulin, tillväxtfaktorer, etc. kan läggas så länge som absorbans och fluorescens spektrum toppar inte överlappar med sensor (494 nm/521 nm). - Utspädd bakteriell kollagenas enzym skriver jag vid 10 och 1000 µg/mL i assay media som positiv kontroll.
3. Hydrogel förberedelse och cell inkapsling
- Bered den hydrogel föregångare.
- Lägg till reagenser till en 1,5 mL tub i följande ordning, vortexa efter tillsats av varje komponent: 20 mM 8 arm 40 kDa PEG-NB, 12.75 mM crosslinker MMP-nedbrytbara peptid, 17,8 mM NaOH, 1 mM CRGDS, 2 mM varv, och 0,25 mM fluorogenic MMP-nedbrytbara peptid.
Obs: Tabell 1 visar hydrogel föregångare lösning innehållet, lager koncentrationer, arbetande koncentrationer, volym beräkningsformler och volymerna som krävs behövs för att göra 120 µL av hydrogel föregångare lösning, som är tillräcklig för att genomföra en experimentera med 10 hydrogels. För att kompensera för förlusten av hydrogel lösningen på grund av pipettering, öka totalvolymen av 20%. De kommersiella peptiderna levereras ofta i en sura väteklorid lösning; NaOH läggs därför för att uppnå ett slutligt pH på 7. den slutliga lösningen pH bör bekräftas av användaren. - Dela hydrogel föregångare lösningen i flera 1,5 mL rör, en tub per villkoret testas.
Obs: Flera villkor för kontroll där hydrogels bereds utan tillsats av celler föreslås. För en negativ kontroll, för att beakta icke-specifik nedbrytning av fluorogenic sensorn, kan ett hydrogel villkor inkuberas med fordonskontroll eller experimentella media ensam om det finns ingen behandling villkor. För en positiv kontroll och kalibrering mellan experiment, kan hydrogels inkuberas med en proteashämmare som känt att klyva fluorogenic sensorn. Exempelvis användes två koncentrationer av bakteriell kollagenas här.
- Lägg till reagenser till en 1,5 mL tub i följande ordning, vortexa efter tillsats av varje komponent: 20 mM 8 arm 40 kDa PEG-NB, 12.75 mM crosslinker MMP-nedbrytbara peptid, 17,8 mM NaOH, 1 mM CRGDS, 2 mM varv, och 0,25 mM fluorogenic MMP-nedbrytbara peptid.
- Kapsla in celler i hydrogels.
- Förbered en enda cellsuspension som passar den celltyp som används. Till exempel tvätta en 10 cm skålen A375 melanom celler med 10 mL PBS. Trypsinize celler med 0,05% trypsin och inkubera vid 37 ° C och 5% CO2 för 3 min. antal celler med en hemocytometer att bestämma antalet totala celler.
- Centrifugera cell lösningen vid 314 x g i 3 min, aspirera kultur media och resuspendera cellerna i PBS på ungefär tre gånger den högsta krävda sådd tätheten för experimentet. Till exempel användes en cellsuspension med en densitet av 21 x 106 celler här att uppnå en slutlig inkapslade täthet av 7 x 106 celler/mL.
- Räkna cellerna igen för att säkerställa en korrekt cellkoncentrationen.
- Tillsätt suspenderade celler och PBS i varje rör hydrogel föregångare lösning enligt krävs sådd densiteten (0,25, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6 och 7 x 106 celler/mL i det här exemplet). Lägg till PBS i förhållanden med inga celler i stället för suspenderade celler.
Obs: Alla förhållanden bör ha samma slutliga hydrogel föregångare lösningsvolym att säkerställa förhållandet mellan hydrogel komponenterna och PBS är konstant. Gör inte cyklontuber som har celler i dem, Pipettera upp och ner kraftigt utan att skapa bubblor för att blanda lösningen föregångare. - Dispensera 10 µL av hydrogel föregångare lösningen i en steril Svart Rund bottenplattan med 96 brunnar, se till att spetsen är centrerad i mitten av varje brunnen medan dispensering.
- Polymerisera hydrogel föregångare lösning genom att exponera plattan till ultraviolett (UV) ljus på 4 mW/cm2 3 min.
Obs: UV-lampa (UVL-56 handhållna UV lampa, UVP, Uppland, CA) ger UV-A ljus lång UV våglängden (365 nm), som inte påverkar cellernas livskraft. - Tillsätt 150 µL av assay media i alla brunnar utom de positiva kontrollen villkor utan inkapslade celler. Till de positiva kontrollerna, tillsätt 150 µL av kollagenas enzym lösning.
- Tillsätt 150 µL av PBS till de yttre brunnarna i plattan att minska avdunstning under inkubation.
4. MMP och metabolisk aktivitet mätning
- Mäta fluorescens omedelbart efter inkapsling att etablera en baslinjemätning för fluorescens och säkerställa enhetlighet i hydrogel polymerisation. Läs plattan med en fluorescens mikroplattan Skanna läsare utnyttja en ogenomskinlig plattan med 96 brunnar protokoll med ett område inställningen vid 494 nm/521 nm (excitation/utsläpp). Detta kommer att vara 0 h Läs.
- Inkubera plattan i en fuktad inkubator vid 37 ° C och 5% CO2 för 18 h.
- Tillsätt metabolisk aktivitet reagens (resazurin) på 1:10 (v/v) för varje brunn.
- Inkubera plattan i en fuktad inkubator vid 37 ° C och 5% CO2 för en ytterligare 6 h.
Obs: Denna inkubationstiden kan variera beroende på celltyp. - Mäta fluorescens på 24 h efter inkapsling. Läs plattan med en fluorescens mikroplattan Skanna läsare utnyttja en ogenomskinlig plattan med 96 brunnar protokoll med ett område inställningen på 494 nm/521 nm (excitation/utsläpp) för MMP aktivitet och 560 nm/590 nm (excitation/utsläpp) för metabolisk aktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aktuella analysen var anpassad från en tidigare utvecklade och kännetecknas 3D hydrogel kultur system functionalized med en fluorogenic MMP cleavable sensor8. Fluorogenic MMP sensorn används här består av en peptid sekvens, GPLAC (pMeOBzl) ↓WARKDDK (Snorbilligt) C (↓ anger webbplatsen klyvning) som tidigare var optimerad för klyvning av MMP-14 och MMP-1119. Peptiden är märkt med en fluorescerande molekyl (fluorescein) och en törstsläckare molekyl (dabcyl) på vardera sidan av webbplatsen klyvning (figur 1). Vid exponering av fluorogenic sensor för den lämpliga proteasen, de fluorophore och törstsläckare avgränsas och fluorescens ökar. Här, var analysens miniatyriserade från en 24-väl plattan till ett plattan med 96 brunnar format, att eliminera flera steg i processen inkapsling och minskar den tid som behövs för att utföra ett experiment med 50%. Ytterligare, det minskade volymen av reagenser som konsumeras av 80%, som hydrogel volymer minskade från 50 µL till 10 µL per brunn. Dessutom, genom att använda en plattan med 96 brunnar, 20 villkor i exemplar kunde testas istället för 12 villkoren i dubbletter per 24-bra platta. En schematisk av cell inkapsling processen illustreras i figur 2. Etikett 1 och 2 motsvarar steg 3.1 och 3.2 i protokollet, respektive. Etiketter 3 till 5 motsvarar steg punkterna 3.2.5 till 3.2.7 i protokollet. Etiketter 6 till 9 motsvarar steg 4,2-4,5 i protokollet.
För att upprätta detektionsgränserna och räckvidd för analysen, inkuberades de hydrogels functionalized med den fluorogenic MMP-nedbrytbara peptiden med en serie koncentrationer (0 till 2 000 µg/mL) av bakteriell kollagenas enzymet typ jag. Efter 24 h inkubation vid 37 ° C användes en Plattläsare för att mäta fluorescensen (figur 3). Från dessa mätningar, dynamiskt (lägsta och högsta upptäcks signaler) och arbetsområde (3 standardavvikelser över den lägsta upptäckta signalen) och 3 standardavvikelser under högsta upptäckta signalen bestämdes. Efter 24 h inkubation observerades det att lägsta upptäckta signalen producerades av negativa kontroller (bakgrundsljud) på 0 µg/mL kollagenas, medan den högsta upptäckt signal producerades av 1000 µg/mL kollagenas eller ovan, där signalen börjar platå (figur 3). Från det dynamiska omfånget beräknades arbetsområde till mellan ≈0.16 µg/mL och ≈474 µg/mL kollagenas, en bred räckvidd över tre tiopotenser.
För cell kultur analyser, måste lämplig cell densiteten som resulterar i fluorescens avläsningar inom arbetsområde analysens bestämmas för varje celltyp. Här presenteras representativa uppgifter för melanom cell linje A375, inkapslade i olika densiteter från 0,25 till 7 x 106 celler/mL. Fluorescensintensiteten förvärvades utnyttjar en standard microplate reader vid två olika tidpunkter: 1) direkt efter inkapsling (0 h) och (2) efter 24 h för inkapsling. 0 h var fluorescens avläsningar låg över sådd tätheter (figur 4A), som förväntat. Efter 24 h av kultur (figur 4B) var MMP aktiviteten direkt proportionell mot sådd densiteten, där fler celler resulterade i mer klyvning av fluorogenic MMP cleavable sensor och högre fluorescensintensiteten. Som interna kontroller, hydrogels som innehåller inga celler inkuberades med 0, typ 10 och 1000 µg/mL kollagenas I enzymet att indikera låg, medelhög och hög nivåerna av signalen respektive (som bestäms av kollagenas signal utbud karakterisering i Figur 3) och representeras av streckade linjer i figur 4B. Dessutom var arbetande intervallgränserna räknat från 0 och 1 000 µg/mL signalerna och representeras av streckade linjer i figur 4B. Sådd tätheter på eller större än 1 x 106 celler/mL faller inom ramen för arbetsområdet. Metabolisk Aktivitetsmätningar av A375 cell fodrar var också direkt proportionell till cellen sådd densitet (figur 4C). MMP aktivitet har tidigare varit normaliserade till metabolisk aktivitet som intern kontroll att bestämma MMP aktivitet på en per cell grund8. Normalisera MMP aktivitet till metabolisk aktivitet över sådd tätheter medförde ingen signifikant skillnad i MMP aktivitet vid sådd tätheter större än 2 x 106 celler/mL (figur 4D). För att bestämma variabiliteten mellan exemplar i varje platta (intra-plattan variabilitet), koefficienten för variation andel (% CV) beräknades för både MMP och metaboliska aktivitet och sammanfattas i tabell 2. % CV under 20% anger att intra-plattan variabiliteten inom exemplar är acceptabel för systemet att producera konsekventa resultat20,21.
Figur 1 : Fluorogenic MMP-nedbrytbara peptid design. Fluorogenic MMP-nedbrytbara peptiden består av en ryggrad peptid GPLAC (pMeOBzl) ↓WARKDDK (Snorbilligt) C (↓ anger webbplatsen klyvning) som avgör specificiteten av sensorn. Peptiden är märkt med en törstsläckare (dabcyl) och en fluorophore (fluorescein), vilket är OSLÄCKT (fluorescerar) när ryggraden peptiden är klyvs av MMP. En tiolgrupp är konjugerat med ryggraden peptiden aktivera kovalent reaktion med statsminister funktionella grupper i molekylen PEG, koppling sensorn till hydrogel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Assay Schematisk. De hydrogel föregångare komponenterna blandas med celler upphängd i PBS. Föregångaren lösningen är då pipetteras i svart, rund botten, 96 brunnar och polymeriseras av exponering för UV-ljus för 3 min. Assay media läggs, och plattorna inkuberas i 18 h (37 ° C, 5% CO2). Metaboliska aktiviteten reagens resazurin läggs sedan, och plattorna inkuberas i en ytterligare 6 h. MMP och metaboliska aktiviteten mäts med en fluorescerande microplate reader med ett väl scan protokoll vid de angivna excitation/utsläpp våglängderna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Dynamisk och arbetsområde analysens. Hydrogeler functionalized med fluorogenic MMP-nedbrytbara peptid inkuberades med en serie koncentrationer av kollagenas enzymet typ jag under 24 timmar vid 37 ° C och fluorescens intensitet mättes. Streckade linjerna representerar den dynamiska och arbeta. n = 3, medelvärde ± standardavvikelse (SD). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Effekten av sådd täthet av melanom cell fodrar A375 på MMP aktivitet. (A) inledande mätning (0 h) av MMP aktivitet för A375 cellinje inkapslade över en rad sådd tätheter. n = 3 medelvärde ± SD. (B) mätning av MMP verksamheten på 24 h. 0, 10 och 1000 µg/mL kollagenas representeras av streckade linjer. Streckade linjer avser arbetsområde (WR) beräknas från kollagenas kontroller. n = 3, menar ± SD. (C) Measurement av metabolisk aktivitet för A375 cellinje inkapslade för 24 h över en rad sådd tätheter och inkuberas med resazurin för 6 h. n = 3, menar ± SD. (D) A375 MMP aktivitet normaliseras till metabolisk aktivitet. n = 3, menar ± SD. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Tabell 1: Hydrogel föregångare lösning förberedelse.
Tabell 2: Intra-plattan % CV analysens med A375 cellinje.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
3D in vitro rapportör cellkultur recapitulates många viktiga aspekter av invivo miljön. Men 3D kultur gör också bedömningen av cellens funktion och signalering utmanande, så många biologiska analyser kräver cellulära hämtning och stort antal celler. Därför utvecklingen av ett enkelt 3D kultur-system som möjliggör mätning av cellulär funktion utan ytterligare urval bearbetning skulle kraftigt öka nyttan av 3D kultur system. 3D-systemet beskrivs här kan anpassas för en mängd olika applikationer. Sekvensen av fluorogenic sensorn kan ändras för att upptäcka andra proteaser. Exempelvis fluorogenic cleavable sensor sekvensen (GPQG↓IWGQK) som kan vara klyvs av MMP-1, 2, -3, -7, -8, och 9, var tidigare utnyttjas för att upptäcka melanom MMP aktivitet i svar till kemoterapeutika22. Användningen av PEG hydrogel systemet möjliggör också exakt oberoende trimning av den cellulära mikromiljö, inklusive mekaniska egenskaper, nedbrytbarhet och matris vidhäftning delarna inom hydrogel. Vidhäftning molekylen RGD används i detta arbete är en Fibronektin-derived sekvens och möjliggör integrin-medierad vidhäftning. Andra adhesionsmolekyler såsom (RLD) och (IKVAV) som härletts från fibrinogen och laminin respektive skulle kunna utnyttjas för att aktivera andra typer av integrin receptorer. Till exempel visades det att förändra adhesionsmolekyler ändrat förlängning av aorta valvulär interstitiella celler (VIC), som kan ha en effekt på aortaklaffen stenos15. Hydrogel crosslinker sekvensen kan styra nedbrytningen av hydrogel och inkapslade cellulära beteende inom hydrogel. Till exempel, visades det att fibroblaster hade ökat spridning och cell spridning när odlade i snabbare förnedrande hydrogels, som kan påskynda den läkande process i vivo23. Mekaniska egenskaper i närmiljön kan också reglera cellernas funktion och hydrogel stelhet kan ändras genom att ändra antalet vapen i den PEG macromer, PEG molekylvikt och förhållandet mellan PEG och crosslinker.
Eftersom MMP aktivitet varierar beroende på celltyp, för varje ny celltyp är det viktigt att genomföra en inkapsling densitet optimering experiment som visat här. Efter 24 h för inkapsling var MMP och metabolisk aktivitet direkt proportionell mot cell sådd densitet. Men vid längre tider fluorescerande signalen kan platå, kan tidpunkten för analysen därför behöva optimeras genom den användare8. Specifika proteas sensorn kan också påverka arbetsområde och tidpunkten för analysen. Arbetsområde i analysen kan bestämmas genom att bedriva en signal utbud experiment med inga celler och ett proteolytiskt enzym över en bred koncentration. Integration av flera ingen cell hydrogel villkor inkuberas med enzym kontrollerna möjliggör inrättandet av låga (bakgrundsljud), medelhöga och höga nivåer av signal inom varje assay (0, 10 och 1000 µg/mL kollagenas här). Detta ger en indikation på om de signaler som produceras av celler omfattas arbetsområde analysens. Denna analys är även kompatibel med andra fluorescerande sensorer som inte har överlappande excitation och utsläpp spectra, såsom metabolisk aktivitet analysen används här som intern kontroll att beräkna MMP aktivitet per cell utifrån, som tidigare rapporterats8 . MMP aktivitet normaliserat till metaboliska aktivitet visade giltigheten av detta tillvägagångssätt för sådd tätheter på eller över 2 x 106 celler/mL, där det var ingen signifikant förändring över seedning tätheter. Denna normalisering är avgörande för att identifiera lämpliga sådd tätheterna som finns inom arbetsområdet av MMP aktivitet kurvan och inom den linjära delen av kurvan normalisering.
Medan analysen kan anpassas för flera ändamål, finns det flera begränsningar och kritiska aspekter som användaren bör överväga, särskilt när det gäller störningar med fluorescerande signal och beredning av hydrogels. Först måste vara försiktig med val av kultur media och ytterligare behandlingar, eftersom dessa kan ha en överlappande absorbansen spektrum eller oklarhet som kan störa detektion av fluorescens eller släcka signalen. Det rekommenderas att använda kultur media som inte innehåller fenolrött. Även vissa läkemedelsbehandlingar är fluorescerande (t ex doxorubicin), eller har absorbansen spektrum som överlappar med excitation/utsläpp spectrumen av fluorophore (t.ex. curcuminoiderna). En andra aspekt som kan påverka prestanda för analysen är hydrogel beredning. På grund av den höga viskositeten av hydrogel föregångare lösningen måste vidtas för att säkerställa noggrann blandning av hydrogel lösning och försiktig pipettering metoder att förhindra ojämlika fluorophore innehåll eller hydrogel lösningsvolym i varje brunn. Pre vätning av pipettspetsarna och använda låg-lagring tips kan du minska variabiliteten. En annan viktig aspekt av hydrogel förberedelser är hydrogel form och läge i brunnar. Hydrogel ska centreras i brunnen och en enhetlig form för att möjliggöra korrekt fluorescens mätningar med mindre variabilitet15. Bruket av rund botten pläterar hjälpmedel här, centrering pipettspetsen i varje brunn och produktionen av semi sfäriska hydrogels konsekvent över alla brunnar.
Genom att anpassa systemets 3D proteas-nedbrytbara hydrogel, kan realtid proteas och metabolisk aktivitet avläsning upptäckas i en 3D närmiljön med minimal prov bearbetning. Dessutom minskar användningen av den syntetiska PEG hydrogel sats till sats variationer observerats med naturligt framställda ECM hydrogels. Dessutom utnyttjar PEG hydrogels möjliggör finjustering av kemiska och mekaniska signaler för hydrogeler för en förbättrad kontroll av mikromiljö. Dessutom PEG hydrogel polymerisation beskrivs här är en foto-initierade process, vilket gör det snabbt och mer mottagliga för hög genomströmning metoder än klassiska naturliga ECM hydrogels (i.e., kollagen eller Matrigel), som är långsammare och temperaturkänsliga. Denna snabba, användarkontrollerade polymerisation tillåter upptrappningen av systemet att automatiseras ytterligare använder robotic flytande hanterare, vilket framgår av andra15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill erkänna Ohio Cancer forskning (OCR), OH, USA för att finansiera detta arbete samt King Saud University (KSU), Riyadh, Saudiarabien för sponsring första författaren. Molekylvikt av fluorescerande peptid sensorn mättes med matrix assisterad, laser desorption-jonisering, time-of-flight (MALDI-TOF) masspektrometri med bistånd från Campus kemiska Instrument Center Mass Spectrometry och proteomik Anläggning vid Ohio State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| Activated charcoal | Sigma-Aldrich | C3345 | |
| Black round bottom 96-well plate | Brand-Tech | 89093-600 | |
| Cell adhesion peptide (CRGDS) | GenScript USA Inc. | custom made | |
| Collagenase enzyme type I | Life Technologies | 17100-017 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | D4876 | |
| DMEM High Glucose Media | Invitrogen | 11965118 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Seradigm | 1500-500 | |
| Fluorescence microplate reader | BioTek | Cytation 3 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific Co. | 3200 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| MMP-degradable peptide crosslinker (KCGPQG↓IWGQCK) | GenScript USA Inc. | custom made | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318500 | |
| Penicillin /streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Resazurin (Alamar Blue) | Life Technologies | DAL1100 | |
| UV light | UVP | 95-0006-02 |
References
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
- Duval, K., et al. Modeling Physiological Events in 2D vs. 3D Cell Culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
- Hoarau-Véchot, J., Rafii, A., Touboul, C., Pasquier, J. Halfway between 2D and Animal Models: Are 3D Cultures the Ideal Tool to Study Cancer-Microenvironment Interactions. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), (2018).
- Lee, S. -H., Miller, J. S., Moon, J. J., West, J. L. Proteolytically Degradable Hydrogels with a Fluorogenic Substrate for Studies of Cellular Proteolytic Activity and Migration. Biotechnology Progress. 21 (6), 1736-1741 (2005).
- DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments. Nature Materials. 8 (8), 659-664 (2009).
- Chalasani, A., et al. Live-Cell Imaging of Protease Activity: Assays to Screen Therapeutic Approaches. Methods in Molecular Biology. 1574, Clifton, N.J. 215-225 (2017).
- Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M., Moin, K., Sloane, B. F. Visualizing Protease Activity in Living Cells: From Two Dimensions to Four Dimensions. Current Protocols in Cell Biology. 04, Unit-4.20 (2008).
- Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
- Nagase, H., Visse, R., Murphy, G. Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs. Cardiovascular Research. 69 (3), 562-573 (2006).
- Tokito, A., Jougasaki, M., Tokito, A., Jougasaki, M. Matrix Metalloproteinases in Non-Neoplastic Disorders. International Journal of Molecular Sciences. 17 (7), 1178 (2016).
- Visse, R., Nagase, H. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, function, and biochemistry. Circulation Research. 92 (8), 827-839 (2003).
- Vihinen, P., Kähäri, V. -M. Matrix metalloproteinases in cancer: Prognostic markers and therapeutic targets. International Journal of Cancer. 99 (2), 157-166 (2002).
- Yodkeeree, S., Garbisa, S., Limtrakul, P. Tetrahydrocurcumin inhibits HT1080 cell migration and invasion via. downregulation of MMPs and uPA1. APHS Acta Pharmacologica Sinica. 29 (7), 853-860 (2008).
- Yodkeeree, S., Chaiwangyen, W., Garbisa, S., Limtrakul, P. Curcumin, demethoxycurcumin and bisdemethoxycurcumin differentially inhibit cancer cell invasion through the down-regulation of MMPs and uPA. The Journal of Nutritional Biochemistry. 20 (2), 87-95 (2009).
- Mabry, K. M., Schroeder, M. E., Payne, S. Z., Anseth, K. S. Three-Dimensional High-Throughput Cell Encapsulation Platform to Study Changes in Cell-Matrix Interactions. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21914-21922 (2016).
- Sridhar, B. V., Doyle, N. R., Randolph, M. A., Anseth, K. S. Covalently tethered TGF-β1 with encapsulated chondrocytes in a PEG hydrogel system enhances extracellular matrix production. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 102 (12), 4464-4472 (2014).
- Sridhar, B. V., et al. Development of a cellularly degradable PEG hydrogel to promote articular cartilage extracellular matrix deposition. Advanced Healthcare Materials. 4 (5), 702-713 (2015).
- Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).
- Mucha, A., et al. Membrane Type-1 Matrix Metalloprotease and Stromelysin-3 Cleave More Efficiently Synthetic Substrates Containing Unusual Amino Acids in Their P1' Positions. Journal of Biological Chemistry. 273 (5), 2763-2768 (1998).
- Chai, S. C., Goktug, A. N., Chen, T. Assay Validation in High Throughput Screening - from Concept to Application. Drug Discovery and Development. , (2015).
- Iversen, P. W., et al. HTS Assay Validation. Assay Guidance Manual. , http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK83783/ (2004).
- Leight, J. L., Tokuda, E. Y., Jones, C. E., Lin, A. J., Anseth, K. S. Multifunctional bioscaffolds for 3D culture of melanoma cells reveal increased MMP activity and migration with BRAF kinase inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (17), 5366-5371 (2015).
- Patterson, J., Hubbell, J. A. Enhanced proteolytic degradation of molecularly engineered PEG hydrogels in response to MMP-1 and MMP-2. Biomaterials. 31 (30), 7836-7845 (2010).
