Summary
Burada, bir protokol Kapsüllenen ve bir fluorogenic matriks metalloproteinaz (MMP) functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels hücrelerde kültür sunulan-parçalanabilir peptid. Hücresel MMP ve metabolik aktivite doğrudan bir standart Mikroplaka Okuyucu kullanarak hidrojel kültürler ölçülür.
Abstract
Üç boyutlu (3D) hücre kültür sistemleri genellikle daha yakından vivo içinde hücresel yanıt ve işlevleri geleneksel iki boyutlu (2D) kültür sistemleri özetlemek. Ancak, hücre işlevi 3D kültür ölçümü kez daha zordur. Birçok biyolojik deneyleri 3D kültürlerde zor olabilir hücresel malzeme alınmasını gerektirir. Bu sorun adrese bir ölçüm-in malzeme içinde hücre işlevi etkinleştirmek yeni malzemeleri geliştirmek için yoludur. Burada, ölçüm hücresel matriks metalloproteinaz (MMP) faaliyet bir 96-iyi biçimde 3D hydrogels için bir yöntem sunulur. Bu sistemde, bir poly(ethylene glycol) (PEG) hidrojel fluorogenic MMP yarilabilir sensörü ile functionalized. Hücresel MMP hareketlilik floresan yoğunluğu ile doğru orantılıdır ve bir standart Mikroplaka Okuyucu ile ölçülebilir. Bu testin bir 96-şey biçimine minyatür deneysel kurmak için koşul tahlil önceki 24-iyi sürümü ile karşılaştırıldığında başına 80 oranında % 50 ve reaktif kullanımını gerekli zaman azaltılmış. Bu tahlil da hücresel fonksiyon diğer ölçümleri ile uyumludur. Örneğin, bir metabolik aktivite assay burada, aynı anda MMP etkinlik ölçüleri içinde aynı hidrojel ile yürütülen gösterilmiştir. Tahlil yoğunlukları testin çalışma aralığı için uygun kapsülleme yoğunluğu belirlemek için tohum hücre aralığı boyunca saklanmış insan Melanom hücreleri ile gösterilmiştir. Hücre kapsüllemenin 24 saat sonra MMP ve metabolik aktivite dökümanları yoğunluğu tohum hücreye orantılı idi. Tahlil burada bir fluorogenic parçalanabilir substrat ile gösterdi, tahlil ve metodoloji çok çeşitli hidrojel sistemleri ve Diğer Floresan sensörler için adapte olabilir. Bu tür bir tahlil bir pratik, verimli ve kolay erişilebilir 3D kodlamayla platform için geniş bir uygulama yelpazesi sağlar.
Introduction
Üç boyutlu (3D) kültür sistemleri genellikle daha yakından vivo içinde hücresel yanıt-e doğru geleneksel iki boyutlu (2D) kültür sistemleri daha özetlemek, birkaç mükemmel yayınlar1,2,3 ' e bakın . Ancak, hücre işlevi ölçmek için 3D kültür sistemleri kullanan hücresel alma zorluğu nedeniyle zorlu ve daha fazla işleme örnek. Bu zorluk çok hücresel işlevler ölçümü 3D kültür sistemlerinde sınırlar. Bu zorluk üstesinden gelmek için yeni teknikler 3D ortamlar içinde hücre işlevinin kolay ölçüm etkinleştirmek ihtiyaç vardır. Bu gereksinimi karşılamak için bir yol sadece 3D hücre kültürü destekleyen ama ayrıca hücre işlevi ölçmek için sensörler dahil malzeme gelişmedir. Örneğin, birkaç hidrojel sistemleri görselleştirme 3D ortamlarda4,5,6,7içinde proteaz aktivitesinin etkinleştirmek için fluorogenic proteaz yarilabilir moieties dahil. Bu sistemler aslında mikroskobik görüntüleme için kullanılmıştır iken, bu sistemler de facile sicakligi ölçümü için bir hücre işlevi bir 3D etkinleştirme bir çift plaka okuyucu kullanarak bir küresel matriks metalloproteinaz (MMP) faaliyet tahlil kullanmak için adapte edilebilir çevre8.
MMPs, çinko proteaz, süper normal doku homeostazı ve birçok hastalığın önemli rol oynarlar. MMPs bozulmasına yol açar ve hücre dışı matriks (ECM) yeni model, hücre yüzey reseptörlerinin ve sitokinler ayırmak ve diğer MMPs9,10harekete geçirmek. MMPs yara iyileşmesi gibi fizyolojik süreçleri ve artrit, ateroskleroz, Alzheimer ve kanser ( 9,10,11değerlendirmeleri görmek) gibi hastalıkların önemli rol oynarlar. Kanser, MMP ifade düzeyi yüksek güçlü kanser metastaz ve kötü prognoz12ile ilişkili. Ayrıca, MMPs kanser hücre işgali ve geçiş, doğal olarak 3D olayları13,14hücresel süreçler teşvik ederek tümör ilerleme katkıda bulunur. Bu nedenle, temel biyolojik çalışmalar ve ilaç deneyleri eleme de dahil olmak üzere birçok bağlamlarda 3D kültür etkinliğinde MMP ölçmek için yeteneği çok fazla ilgi yoktur.
PEG hydrogels yaygın olarak kullanılan 3D hücre kültürü onların yüksek su içeriği nedeniyle, protein adsorpsiyon ve akort doğa karşı dayanıklılık için. PEG hydrogels moieties için doğrudan hücre işlevi, bir sayı ile gibi ECM mimetic peptidler RGD, RLD ve IKVAV hücre adezyon kolaylaştırmak veya dönüştürme büyüme faktörü-β (TGF-β) gibi büyüme faktörlerinin hayvan zinciri yolu tarif etmek gibi ile functionalized 15,16. Daha yakın zamanlarda, PEG hydrogels hücre işlevinin ölçüyü iyi5,8etkinleştirmek sensör peptidler ile functionalized. Özellikle, PEG hidrojel sisteminin kullanımı bir fluorogenic bir çift plaka okuyucu ile 3D kültürlerde hücresel MMP aktivitesinin MMP-parçalanabilir etkin peptid ölçüm ile functionalized ve hiçbir daha fazla işlem gerekli. Bu sistemler aynı zamanda hücresel işlev, metabolik aktivite de dahil olmak üzere diğer ölçümleri ile uyumludur. Burada, bir protokol MMP etkinliği bir 3D PEG hidrojel fluorogenic MMP-parçalanabilir peptid ile functionalized ve bunların kullanımı için gerekli ilk optimizasyonu deneyler gösteren sonuçları sunulan kültürlü hücre ölçümü için anlatılan tahlil. İnsan Melanom hücreleri (A375) fluorogenic hydrogels bir dizi tahlil çalışma sınırları içindeki uygun tohumlama yoğunluğunu belirlemek için yoğunlukları tohum üzerinde kapsüllü. Kapsüllemenin 24 saat sonra MMP ve metabolik aktivite bir standart Mikroplaka Okuyucu kullanan ölçüldü. Daha sonra MMP etkinliği tahlil doğrusal Aralık içinde tohum yoğunluğunu belirlemek için metabolik aktivite için normalleştirilmiş. Son olarak, değişim yüzdeleri (% CV) katsayısı içi-plaka triplicates arasında elde edilen sonuçları tekrarlanabilirlik yansıtmak için hesaplanan. Bu yöntem basit ve hızlı 3D hücre kültürü ve proteaz aktivitesinin en az örnek işleme ile kolay ölçüm sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. hidrojel bileşenleri hazırlık
- Floresan proteaz parçalanabilir peptidler açıklandığı gibi başka bir yerde kullanmak floresein floresan molekül olarak ve dabcyl içki olarak8, sentez. DMSO içinde peptid için 10 mM bir konsantrasyon ve tekrarlanan donma-çözülme döngüsü önlemek için küçük (~ 30 µL) aliquots-80 ° C dondurucuya deposunda geçiyoruz.
Not: Bu peptidler de ticari olarak satın alınabilir. Bu iletişim kuralı bir C-terminal sistein hidrojel polimer ağ içine kovalent birleşme etkinleştirmek için peptid sırayla gerektirir. - 8 kolu 40 kDa poli (etilen glikol) Amin (PEG) hazırlamak-norbornene (NB) olarak açıklanan17. Son grup functionalization, %90 1H NMR kullanarak daha fazla doğrulayın. PEG-NB steril fosfat tampon serum (PBS) % 25 w/v ve-80 ° C (~ 300 µL) aliquots dondurucuya deposunda geçiyoruz.
Not: PEG ile functionalized norbornene da ticari olarak satın alınabilir. - Fotoğraf-Başlatıcı Lityum fenil 2,4,6 trimethylbenzoylphosphinate (LAP) başka bir yerde18açıklandığı gibi sentez. 68 mM bir konsantrasyon için steril su kucağına dağıtılması ve (~ 300 µL) aliquots-80 ° C dondurucuda saklayın.
Not: Alternatif olarak, Irgacure (2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) fotoğraf-başlatıcı olarak kullanılabilir. Tur ve Irgacure ticari olarak satın alınabilir. - MMP-parçalanabilir peptid crosslinker (KCGPQG↓IWGQCK) ve 100 mM ve 200 mM bir konsantrasyon için steril su hücre adezyon peptid (CRGDS) sırasıyla dağıtılması ve onları (~ 300 µL ve ~ 30 µL)-80 ° C dondurucuda saklayın aliquots, anılan sıraya göre.
2. tahlil medyası hazırlama
- Isı inaktive hazırlamak, kömür fetal Sığır serum (FBS) MMP tahlil için elimden alındı:
Not: FBS proteaz MMP tahlil ile yüksek arka plan sinyali üretebilir; Bu nedenle, bu ısı devre dışı bırakın ve kömür önerilir FBS tahlil medya için şerit.- FBS 100 mL 55 ° C'de 30 dk için Isıtma tarafından devre dışı
Not: FBS 100 mL aliquoting ve -20 ° c ileride kullanmak üzere saklamak için burada kullanılmıştır. Daha küçük birimler gerektiğinde kullanılabilir. - % 0,25 w/v, aktif kömür ve % 0,025 w/v dextran, FBS (yaklaşık 5 mL) küçük bir miktar için ekleyin ve karıştırın kadar bir bulamaç oluşturulur. O zaman, FBS geri kalanını ekleyin ve 55 ° C'de 30 dakika karıştırın
- 4 ° C'de 20 dk için 1,962 x g , santrifüj Ardından süpernatant için başka bir gemi aktarın.
- 2.1.2 adımı yineleyin ama 37 ° C'de 2.1.3 adım gelir. 0,45 µm filtre ve daha sonra bir 0.2 µm filtresi kullanarak süpernatant sterilize.
- FBS 100 mL 55 ° C'de 30 dk için Isıtma tarafından devre dışı
- Tahlil ortam hazırlamak % 1 kömür ile desteklenen medya kullanarak FBS, 2 mM L-glutamin, 10 U/mL penisilin, 10 µg/mL streptomisin çıkardı.
Not: daha az floresans girişim olduğundan medya fenol red olmadan önerilir. İnsülin, büyüme faktörleri, gibi tahlil medya diğer eklemeler vb. absorbans sürece ekledi ve floresan spektrum dorukları sensör (494 nm/521 nm) ile örtüşmesi değil. - Seyreltik bakteriyel collagenase enzim yazın ben 10 ve 1000 µg/mL tahlil medya, olumlu bir denetim olarak.
3. hidrojel hazırlık ve hücre kapsülleme
- Hidrojel öncü çözüm hazırlamak.
- Reaktifler aşağıdaki sırada 1.5 mL Tüp, vortexing sonra her bileşenin eklenmesi için Ekle: 20 mM 8 kol 40 kDa PEG-NB, 12.75 mM crosslinker MMP-parçalanabilir peptid, 17,8 mM NaOH, 1 mM CRGDS, 2 mM Tur ve 0,25 mM fluorogenic MMP-parçalanabilir peptid.
Not: Tablo 1 gösterir hidrojel öncü çözüm içeriğini, hisse senedi konsantrasyonları, çalışma konsantrasyonları, hacim hesaplama formülleri ve gerekli birimler gerekli yapmak yeterli hidrojel öncü çözüm 120 µL yapmak bir 10 hydrogels ile denemeler yapın. Pipetting nedeniyle hidrojel çözüm kaybı hesaba katan, toplam hacim % 20 artırmak. Ticari peptidler kez bir asidik hidroklorik asit çözümde sağlanır; Bu nedenle, NaOH 7 son pH elde etmek için eklenir. nihai çözüm pH Kullanıcı tarafından onaylanması. - Hidrojel öncü çözüm birden fazla 1,5 mL tüpler içine bölmek Sınanan koşul başına bir tüp.
Not: hydrogels hücreleri ilavesi hazırlanır birkaç denetim koşulları önerilmektedir. Hiçbir tedavi koşul varsa bir negatif kontrol için fluorogenic sensörü, non-spesifik bozulması için hesabınıza hidrojel bir şartım araç kontrol veya yalnız deneysel medya ile inkübe. Olumlu bir denetim ve kalibrasyon deneyler arasında hydrogels fluorogenic sensör ayırmak için bilinen bir proteaz ile inkübe. Örneğin, iki bakteriyel collagenase konsantrasyonları burada kullanılmıştır.
- Reaktifler aşağıdaki sırada 1.5 mL Tüp, vortexing sonra her bileşenin eklenmesi için Ekle: 20 mM 8 kol 40 kDa PEG-NB, 12.75 mM crosslinker MMP-parçalanabilir peptid, 17,8 mM NaOH, 1 mM CRGDS, 2 mM Tur ve 0,25 mM fluorogenic MMP-parçalanabilir peptid.
- Hydrogels hücrelerde kapsüller.
- Kullanılan hücre tipi için uygun bir tek hücre süspansiyon hazırlamak. Örneğin, A375 Melanom hücreleri bir 10 cm çanak PBS 10 mL ile yıkayın. Hücrelerin % 0.05 tripsin kullanarak trypsinize ve 37 ° C ve % 5 CO2 3 dk. Toplam cep numarasını belirlemek için bir hemasitometre ile hücreleri hesaplama için kuluçkaya.
- Hücre çözümü vasıl 314 x g 3 dk santrifüj kapasitesi, Kültür medya Aspire edin, sonra PBS hücrelerde yaklaşık üç kez en yüksek gerekli tohumlama yoğunluğu deneme için yeniden askıya alma. Örneğin, bir hücre süspansiyon 21 x 106 hücre yoğunluğu ile 7 x 106 hücre/mL son kapsüllenmiş yoğunluğu elde etmek için burada kullanılmıştır.
- Yeniden bir doğru hücre konsantrasyonu sağlamak için hücreleri saymak.
- Askıya alınan hücreler ve PBS hidrojel öncü çözüm gerekli tohumlama yoğunluğu (0.25, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ve 7 x 106 hücre/mL Bu örnekte) göre her tüpün ekleyin. PBS koşullar hiçbir hücreler yerine askıya alınan hücreleri ekleyin.
Not: Tüm koşulları hidrojel bileşenleri arasındaki oran sağlamak için aynı son hidrojel öncü çözüm cilt olmalı ve PBS sabittir. Değil bu hücreleri içlerindeki var, yukarı ve aşağı şiddetle öncü çözüm mix için kabarcıklar oluşturmadan pipet girdap tüpleri var. - Steril bir siyah alt 96-şey plaka dağıtımı sırasında belgili tanımlık uç her şey ortasında ortalanır sağlanması, yuvarlak içine 10 µL hidrojel öncü çözüm dağıtmak.
- Hidrojel öncü çözüm ultra violet (UV) ışık 4 mW/cm2 3 dk plakasına açarak polimerize.
Not: UV lambası (UVL-56 el UV lambası, UVP, yayla, CA) uzun bir UV dalga boyu, UV-A ışık üretir (365 nm), hangi hücresel canlılığı etkilemez. - Pozitif kontrol koşul olmadan kapsüllenmiş hücreleri dışında bütün wells için 150 µL tahlil medya ekleyin. Pozitif denetimlere 150 µL collagenase enzim çözüm ekleyin.
- PBS 150 µL dış Kuyu yapımı kuluçka sırasında buharlaşma azaltmak için plaka ekleyin.
4. MMP ve metabolik aktivite ölçüm
- Ölçmek floresans hemen sonrası kapsülleme temel floresans ölçüm kurmak ve hidrojel polimerizasyon tekdüzelik sağlamak için. Bir Floresan Mikroplaka kullanarak plaka okumak okuyucu bir alana sahip bir opak 96-şey plaka protokolü kullanan 494 nm/521 nm (uyarma/emisyon) ayarında inceden inceye gözden geçirmek. Bu-ecek var olmak 0 h okudu.
- 18 h için oksijen bir kuluçka 37 ° C ve % 5 CO2 plaka kuluçkaya.
- 1:10 (v/v) her şey için metabolik aktivite reaktif (resazurin) ekleyin.
- Bir ek 6 h için oksijen bir kuluçka 37 ° C ve % 5 CO2 plaka kuluçkaya.
Not: Bu kuluçka zaman hücre türüne bağlı olarak değişebilir. - 24 saat sonrası kapsülleme, floresans ölçmek. Bir Floresan Mikroplaka kullanarak plaka okumak okuyucu bir alana sahip bir opak 96-şey plaka protokolü kullanan ayarı 494 nm/521 nm (uyarma/emisyon) MMP etkinliği için ve 560 nm/590 nm (uyarma/emisyon) metabolik aktivite için tarayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Geçerli tahlil daha önce gelişmiş ve karakterize 3D hidrojel kültür sisteminden bir fluorogenic MMP yarilabilir sensör8ile functionalized uyarlanmıştır. Burada kullanılan fluorogenic MMP sensör GPLAC (pMeOBzl) ↓WARKDDK (AdOO) C bir peptit dizisi oluşur (↓ gösterir bölünme sitesi) Bu daha önce en iyi duruma getirilmiş bölünme için MMP-14 ve MMP-1119tarafından. Peptid floresan molekül (fluoresein) ve bölünme sitesi (Şekil 1) her iki tarafında bir içki molekül (dabcyl) taşır. Uygun proteaz için maruz fluorogenic sensör üzerine fluorophore ve içki ayrılmıştır ve floresan artırır. Burada, tahlil 24-şey tabağı birkaç adımda kapsülleme işlemi ortadan kaldırmak ve % 50 oranında bir deney gerçekleştirmek için gereken süreyi azaltarak bir 96-şey plaka biçimine minyatürize. Ayrıca, hidrojel birimleri de başına 10 µL 50 µL azaltıldı gibi %80 tarafından tüketilen reaktif hacmi azalır. Ayrıca, bir 96-şey plaka kullanarak, 20 triplicates koşullarda çoğaltmaları 24-şey plaka başına 12 koşullarında yerine test olabilir. Hücre kapsülleme işleminin şematik Şekil 2' de gösterilmiştir. Etiket 1 ve 2 karşılık adımlara 3.1 ve 3.2 iletişim kuralı, anılan sıraya göre. Etiketleri 3-5 adımları 3.2.5 3.2.7 protokolündeki karşılık gelir. Etiketleri 6-9 adımları 4.2-4.5 protokolündeki karşılık gelir.
Ve tahlil çeşitli sinyal algılama sınırları kurmak için fluorogenic MMP-parçalanabilir peptid ile functionalized hydrogels inkübe bakteriyel collagenase enzim türü (0-2.000 µg/mL) konsantrasyonları bir dizi ben. Kuluçka 37 ° C'de 24 saat sonra plaka okuyucu Floresan (Şekil 3) ölçmek için kullanıldı. Bu ölçümler, dinamik üzerinden (en düşük ve en yüksek sinyalleri tespit) ve çalışma aralığı (en düşük tespit edilen sinyal yukarıda 3 standart sapma) ve en yüksek algılanan sinyal aşağıda 3 standart sapma tespit. Kuluçka 24 saat sonra bu gözlenen en düşük tespit edilen sinyal negatif kontrollerde (arka plan gürültü) 0 µg/mL collagenase tarafından üretilen, en yüksek tespit sırasında sinyal 1000 µg/mL collagenase veya yukarıda, sinyal için başladığı üretilen yapıldı. Plato (Şekil 3). Kameranın dinamik alanı çalışma aralığı ≈0.16 µg/mL ve ≈474 µg/mL collagenase, üç büyüklük geniş sinyal aralığında arasında olmak için hesaplanır.
Hücre kültürü deneyleri için floresans okuma testin çalışma aralığı içinde sonuçlanır uygun hücre yoğunluğu her hücre türü için belirlenmelidir. Burada, temsilcisi veriler melanoma hücre kültürünü A375, 0,25 dan yoğunlukları 7 x 106 hücre/ml aralığında kapsüllenmiş için sunulur. Floresan yoğunluğu elde iki farklı zaman noktalarda bir standart Mikroplaka Okuyucu kullanmak: 2) sonra 24 h kapsüllemenin ve 1) doğrudan Kapsülleme (0 h). 0 h floresans okuma beklendiği gibi tohum yoğunlukları (Şekil 4A), arasında düşüktü. Kültür (Şekil 4B) 24 saat sonra MMP etkinlik tohumlama yoğunluğu daha fazla hücre fluorogenic MMP yarilabilir sensör ve daha yüksek floresan yoğunluğu daha fazla bölünme sonuçlandı, doğrudan orantılıdır. İç kontrol, hydrogels yok hücreleri içeren 0 ile inkübe gibi 10 ila 1000 µg/mL collagenase tip ı enzim sırasıyla ( içinde collagenase sinyal aralığı karakterizasyonu tarafından belirlenen sinyal düşük, orta ve yüksek düzeyde belirtmek için Şekil 3) ve Şekil 4Bkesikli çizgilerle gösterilir. Ayrıca, çalışma aralığı sınırları 0 ve 1000 µg/mL sinyalleri hesaplanan ve noktalı çizgiler Şekil 4Btarafından temsil edilen. Tohumlama yoğunluğunu, veya 1 x 106 hücre/mL den büyük çalışma aralığı sınırları içinde düşer. A375 hücre kültürünü metabolik aktivite ölçümleri de yoğunluğu (Şekil 4C) tohum hücreye doğru orantılı. Daha önce MMP etkinliği bir hücre başına temel8MMP etkinliğini belirlemek için dahili bir denetim olarak metabolik aktivite için normalleştirilmiş. MMP etkinlik metabolik aktivite için tohum yoğunlukları arasında normalleştirme MMP faaliyet tohumlama yoğunlukları 2 x 106 hücre/mL (Şekil 4D) büyük, anlamlı bir fark sonuçlandı. Triplicates her plaka (Intra-plaka değişkenlik) arasında değişkenlik belirlemek için çeşitleme yüzdesi (% CV) katsayısı MMP ve metabolik aktivite için hesaplanır ve Tablo 2' de özetlenmiştir. % CV % 20 altında triplicates içinde içi-plaka değişkenlik sistemin tutarlı sonuçlar20,21üretmek için kabul edilebilir olduğunu gösterir.
Resim 1 : Fluorogenic MMP-parçalanabilir peptid tasarım. Bir omurga peptid GPLAC (pMeOBzl) ↓WARKDDK (AdOO) C fluorogenic MMP-parçalanabilir peptid oluşur (↓ gösterir bölünme sitesi) bu sensör özgüllüğü belirler. Peptid bir içki (dabcyl) ve unquenched olan bir fluorophore (fluoresein), etiketli (fluoresces) ne zaman omurga peptid i ciddi MMP tarafından. Thiol grup norbornene fonksiyonel gruplar içinde PEG molekül ile kovalent tepki etkinleştirmek için omurga peptid sensör için hidrojel kaplin Birleşik. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Tahlil şematik. Hidrojel öncü çözüm bileşenlerini PBS içinde askıya hücreleri ile karıştırılır. Öncü çözüm sonra siyah içine pipetted, alt, 96-iyi tabaklar yuvarlak ve polimerli UV ışığı 3 dk. tahlil maruz medya eklenir ve plakaları 18 h (37 ° C, % 5 CO2) inkübe. Metabolik aktivite reaktif resazurin daha sonra eklenen ve plakaları bir ek 6 h. MMP inkübe ve metabolik aktivite ölçülen bir Floresan Mikroplaka Okuyucu ile belirtilen uyarma/emisyon dalga boylarında, iyi tarama protokolü kullanarak. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Dinamik ve testin çalışma aralığı. Fluorogenic MMP-parçalanabilir peptid ile functionalized Hydrogels collagenase enzim türü ben için 24 h 37 ° C ve floresan yoğunluğu ölçüldü konsantrasyonları bir dizi ile inkübe. Noktalı çizgiler dinamik ve çalışma aralığı temsil eder. n = 3, ± standart sapma (SD) demek. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Melanom hücre kültürünü A375 MMP faaliyet yoğunluğunu tohum etkisi. (A) MMP faaliyet tohumlama yoğunlukları aralığında kapsüllü A375 hücre satırı için ölçüm (0 h) ilk. n = 3 Ortalama ± SD (B) ölçüm MMP faaliyet 24 h 0, 10 ile 1000 µg/mL collagenase, kesik çizgilerle gösterilir. Noktalı çizgiler collagenase denetimlerden hesaplanan çalışma aralığı (WR) temsil eder. n = 3, yoğunlukları tohum bir dizi üzerinde 24 h için bilgilerin ve resazurin 6 h. n ile inkübe A375 hücre satırı için ± SD (C) ölçüm metabolik aktivite demek demek ± SD (D) = 3, A375 MMP etkinlik metabolik aktivite için normalleştirilmiş. n = 3, demek ± SD Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Tablo 1: Hidrojel habercisi eriyik hazırlığı.
Tablo 2: İçi-plaka % CV A375 hücre hattı ile testin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
3D in vitro hücre kültürü içinde vivo ortamda birçok önemli yönleri beyannamedir. Ancak, 3D kültür de değerlendirilmesi hücre fonksiyonu yapar ve zorlu sinyal, gibi birçok biyolojik deneyleri hücresel alma ve çok sayıda hücre gerektirir. Bu nedenle, geliştirme daha fazla örnek olmadan hücresel fonksiyonunun ölçüm sağlar basit 3D kültür sisteminin işleme büyük ölçüde yardımcı programı 3D kültür sistemleri artış olacaktır. Burada açıklanan 3D sistem çeşitli farklı uygulamalar için adapte edilebilir. Fluorogenic sensör sırasını diğer proteaz algılamak için değiştirilebilir. MMP-1, i ciddi Örneğin, fluorogenic yarilabilir sensör sırası (GPQG↓IWGQK) -2, -3 -7 -8 ve -9, daha önce kullanılan yanıt chemotherapeutics22olarak Melanom MMP etkinliğini algılamak için. PEG hidrojel sisteminin kullanımı ayrıca mekanik özellikleri, çözünebilirlik ve matris yapışması moieties hidrojel içinde gibi hücresel microenvironment kesin bağımsız ayarlama sağlar. Adezyon molekül RGD Bu çalışmada kullanılan fibronektin kaynaklı dizisidir ve integrin aracılı yapışma sağlar. Diğer adezyon molekülleri (RLD) gibi ve (IKVAV) fibrinojen elde edilen ve laminin sırasıyla kullanılan diğer türleri integrin reseptörlerinin etkinleştirmek için. Örneğin, adezyon molekülleri değiştirme aort stenozu15üzerinde bir etkisi olabilir aort valvüler interstisyel hücreleri (VIC), uzama değişti gösterilmiştir. Hidrojel crosslinker sıra çözünebilirlik hidrojel ve hidrojel içinde kapsüllenmiş hücresel davranışını denetleyebilirsiniz. Örneğin, fibroblast proliferasyonu ve ne zaman daha hızlı iyileşme süreci içinde vivo23hızlandırmak hydrogels aşağılayıcı kültürlü yayılan hücre artmıştı gösterilmiştir. Microenvironment mekanik özelliği aynı zamanda hücre işlevi düzenleyen ve hidrojel sertlik silah PEG macromer, PEG moleküler ağırlık ve PEG ve crosslinker arasındaki oran sayısını değiştirerek değiştirilebilir.
MMP etkinliği hücre türüne göre değiştiğinden, her yeni hücre türü için bu burada gösterildiği gibi bir kapsülleme yoğunluğu en iyi duruma getirme deney yapmak önemlidir. Kapsüllemenin 24 saat sonra MMP ve metabolik aktivite tohumlama yoğunluğu hücre için doğru orantılı. Ancak, floresan sinyal Plato uzun zamanlarda bu nedenle testin zamanlaması Kullanıcı8tarafından optimize gerekebilir. Belirli proteaz sensör çalışma aralığı ve testin zamanlaması da etkileyebilir. Testin çalışma aralığı bir sinyal aralığı yok hücreleri ve proteolitik enzim ile geniş bir konsantrasyon üzerinde deney tarafından belirlenebilir. Enzim denetimleri sağlar kurulması düşük (arka plan gürültü) ile inkübe birkaç hücre hidrojel koşulsuz eklenmesi, sinyal her tahlil (0, 10 ve 1000 µg/mL collagenase burada) içinde orta ve yüksek düzeyde. Bu nerede Güz hücreleri tarafından üretilen sinyalleri tahlil çalışma aralığı içinde bir gösterge verir. Bu tahlil de örtüşen uyarma ve burada kullanılan metabolik aktivite assay gibi emisyon spectra yok Diğer Floresan sensörleri ile uyumludur MMP etkinliği hücre başına olarak hesaplamak için bir iç denetimi, daha önce bildirilen8 . MMP etkinlik normalleştirilmiş için metabolik aktivite yoğunluğu ya da 2 x 106 hücre/mL, hangi orada üzerinde tohum için bu yaklaşımın geçerlilik yoğunlukları tohum arasında önemli bir değişiklik olduğunu gösterdi. Bu normalleştirme MMP etkinlik eğrisi çalışma menzili içinde ve normalleştirme eğrisi doğrusal bölümü içinde uygun tohumlama yoğunluğunu belirlemek çok önemlidir.
Tahlil çeşitli amaçlar için adapte edilebilir, orada iken çeşitli sınırlamalar ve önemli yönleri özellikle flüoresan sinyal ve hydrogels hazırlanması ile girişim ile ilgili Kullanıcı düşünmelisiniz. İlk olarak, bunlar bir örtüşen absorbans spektrum veya floresan algılama ile müdahale veya sinyal gidermek solukluk olabilir gibi bakım Kültür Medya ve ek tedaviler, seçimi ile alınması gerekir. Bu does değil içermek fenol red kültür ortamı kullanmak için tavsiye edilir. Ayrıca, bazı ilaç tedavileri Floresan (örneğin, doksorubisin) veya fluorophore (örneğin, curcuminoids) uyarma/emisyon spektrumu ile örtüşen absorbans spektrum. Tahlil performansını etkileyebilir ikinci bir yönü hidrojel hazırlıktır. Hidrojel öncü çözüm yüksek viskozite nedeniyle, bakım hidrojel çözüm ve her şey eşit olmayan fluorophore içerik veya hidrojel çözüm cilt önlemek için dikkatli pipetting uygulamaların kapsamlı karıştırma sağlamak için alınması gerekiyor. Pipet uçları ön ıslatma ve düşük tutma ipuçlarını kullanarak değişkenliği azaltmak yardımcı olabilir. Bir başka önemli yönü hidrojel hazırlık hidrojel şekli ve Wells konumudur. Hidrojel kuyu içinde ve doğru floresans ölçümleri ile daha az değişkenlik15etkinleştirmek için Tekdüzen bir şeklin merkezli. Burada, yuvarlak alt plaka kullanımı her şey ve yarı küresel hydrogels üretim pipet ucu sürekli olarak karşıdan karşıya tüm kuyu içinde merkezleme yardımcı olur.
3D proteaz parçalanabilir hidrojel sistemi adapte tarafından gerçek zamanlı proteaz ve metabolik aktivite dökümanları en az örnek işleme ile 3D bir microenvironment olarak tespit edilebilir. Ayrıca, sentetik PEG hidrojel kullanımı ile doğal kaynaklı ECM hydrogels gözlenen toplu iş toplu iş değişkenliği azaltır. Ayrıca, PEG hydrogels kullanan hydrogels microenvironment gelişmiş bir denetim için kimyasal ve mekanik sopasıyla ince ayar sağlar. Ayrıca, burada açıklanan PEG hidrojel polimerizasyon yapım o hızlı ve daha klasik doğal ECM hydrogels daha yüksek aktarım yöntemleri için mükellef bir fotoğraf tarafından başlatılan süreçtir (i.e., kollajen veya Matrigel), daha yavaş olan ve sıcaklık duyarlı. Bu hızlı, Kullanıcı tarafından denetlenen polimerizasyon ölçekleme-up daha fazla robot sıvı işleyicileri, kullanarak otomatik olarak sistem sağlar gibi başkaları tarafından15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar Ohio kanser araştırma (OCR), OH, bu eser finansmanı için ABD hem de Kral Suud Üniversitesi (KSÜ), Riyad, KSA ilk yazar sponsorluk için kabul etmek istiyorum. Molekül ağırlığı floresan peptid sensör destekli, matris Lazer Desorpsiyon-İyonizasyon, kampüs kimyasal enstrüman merkezi kütle spektrometresi ve proteomik desteğiyle uçuş saat (MALDI-TOF) kütle spektrometresi kullanılarak ölçüldü Ohio Eyalet Üniversitesi'nde tesis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| Activated charcoal | Sigma-Aldrich | C3345 | |
| Black round bottom 96-well plate | Brand-Tech | 89093-600 | |
| Cell adhesion peptide (CRGDS) | GenScript USA Inc. | custom made | |
| Collagenase enzyme type I | Life Technologies | 17100-017 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | D4876 | |
| DMEM High Glucose Media | Invitrogen | 11965118 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Seradigm | 1500-500 | |
| Fluorescence microplate reader | BioTek | Cytation 3 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific Co. | 3200 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| MMP-degradable peptide crosslinker (KCGPQG↓IWGQCK) | GenScript USA Inc. | custom made | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318500 | |
| Penicillin /streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Resazurin (Alamar Blue) | Life Technologies | DAL1100 | |
| UV light | UVP | 95-0006-02 |
References
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
- Duval, K., et al. Modeling Physiological Events in 2D vs. 3D Cell Culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
- Hoarau-Véchot, J., Rafii, A., Touboul, C., Pasquier, J. Halfway between 2D and Animal Models: Are 3D Cultures the Ideal Tool to Study Cancer-Microenvironment Interactions. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), (2018).
- Lee, S. -H., Miller, J. S., Moon, J. J., West, J. L. Proteolytically Degradable Hydrogels with a Fluorogenic Substrate for Studies of Cellular Proteolytic Activity and Migration. Biotechnology Progress. 21 (6), 1736-1741 (2005).
- DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments. Nature Materials. 8 (8), 659-664 (2009).
- Chalasani, A., et al. Live-Cell Imaging of Protease Activity: Assays to Screen Therapeutic Approaches. Methods in Molecular Biology. 1574, Clifton, N.J. 215-225 (2017).
- Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M., Moin, K., Sloane, B. F. Visualizing Protease Activity in Living Cells: From Two Dimensions to Four Dimensions. Current Protocols in Cell Biology. 04, Unit-4.20 (2008).
- Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
- Nagase, H., Visse, R., Murphy, G. Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs. Cardiovascular Research. 69 (3), 562-573 (2006).
- Tokito, A., Jougasaki, M., Tokito, A., Jougasaki, M. Matrix Metalloproteinases in Non-Neoplastic Disorders. International Journal of Molecular Sciences. 17 (7), 1178 (2016).
- Visse, R., Nagase, H. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, function, and biochemistry. Circulation Research. 92 (8), 827-839 (2003).
- Vihinen, P., Kähäri, V. -M. Matrix metalloproteinases in cancer: Prognostic markers and therapeutic targets. International Journal of Cancer. 99 (2), 157-166 (2002).
- Yodkeeree, S., Garbisa, S., Limtrakul, P. Tetrahydrocurcumin inhibits HT1080 cell migration and invasion via. downregulation of MMPs and uPA1. APHS Acta Pharmacologica Sinica. 29 (7), 853-860 (2008).
- Yodkeeree, S., Chaiwangyen, W., Garbisa, S., Limtrakul, P. Curcumin, demethoxycurcumin and bisdemethoxycurcumin differentially inhibit cancer cell invasion through the down-regulation of MMPs and uPA. The Journal of Nutritional Biochemistry. 20 (2), 87-95 (2009).
- Mabry, K. M., Schroeder, M. E., Payne, S. Z., Anseth, K. S. Three-Dimensional High-Throughput Cell Encapsulation Platform to Study Changes in Cell-Matrix Interactions. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21914-21922 (2016).
- Sridhar, B. V., Doyle, N. R., Randolph, M. A., Anseth, K. S. Covalently tethered TGF-β1 with encapsulated chondrocytes in a PEG hydrogel system enhances extracellular matrix production. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 102 (12), 4464-4472 (2014).
- Sridhar, B. V., et al. Development of a cellularly degradable PEG hydrogel to promote articular cartilage extracellular matrix deposition. Advanced Healthcare Materials. 4 (5), 702-713 (2015).
- Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).
- Mucha, A., et al. Membrane Type-1 Matrix Metalloprotease and Stromelysin-3 Cleave More Efficiently Synthetic Substrates Containing Unusual Amino Acids in Their P1' Positions. Journal of Biological Chemistry. 273 (5), 2763-2768 (1998).
- Chai, S. C., Goktug, A. N., Chen, T. Assay Validation in High Throughput Screening - from Concept to Application. Drug Discovery and Development. , (2015).
- Iversen, P. W., et al. HTS Assay Validation. Assay Guidance Manual. , http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK83783/ (2004).
- Leight, J. L., Tokuda, E. Y., Jones, C. E., Lin, A. J., Anseth, K. S. Multifunctional bioscaffolds for 3D culture of melanoma cells reveal increased MMP activity and migration with BRAF kinase inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (17), 5366-5371 (2015).
- Patterson, J., Hubbell, J. A. Enhanced proteolytic degradation of molecularly engineered PEG hydrogels in response to MMP-1 and MMP-2. Biomaterials. 31 (30), 7836-7845 (2010).
