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Immunology and Infection

मानव सीडी 8 + T सेल सक्रियण में सह-एगोनिज्म की जांच करने के लिए एकल श्रृंखला एमएचसी प्रौद्योगिकी का उपयोग

Published: February 28, 2019 doi: 10.3791/59126
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 3, 4, 3, 1,2,5, 6, 1, 1,2,5
1Department of Microbiology and Immunology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2Immunology Programme, Life Sciences Institute, National University of Singapore, 3Emerging Infectious Diseases Program, Duke-NUS Graduate Medical School, 4Singapore Immunology Network, A*STAR, 5NUS Graduate School for Integrative Sciences and Engineering (NGS), National University of Singapore, 6Department of Immunology, Wright-Fleming Institute, Imperial College London

Summary

यह प्रोटोकॉल मानव सीडी 8 + t सेल सक्रियण में आणविक बातचीत की जांच करने के लिए एकल श्रृंखला mhc वर्ग I परिसरों के उपयोग का वर्णन करता है: इंजीनियर antigen की पीढ़ी के एकल श्रृंखला व्यक्त कोशिकाओं का निर्माण, मानव सीडी 8 + टी सेल क्लोन की संस्कृति और टी सेल सक्रियण प्रयोगों ।

Abstract

गैर-उत्तेजक स्व पेप्टाइड mhc (pmhc) परिसरों टी सेल सक्रियण और effector कार्यों को प्रेरित नहीं करते, लेकिन सह-agonism कहा एक प्रक्रिया के माध्यम से, एगोनिस्ट pmhc के लिए टी सेल प्रतिक्रियाओं को बढ़ा सकते हैं. इस प्रोटोकॉल एक प्रयोगात्मक प्रणाली मानव सीडी 8 + टी सेल सक्रियण के दौरान मानव mhc वर्ग मैं एक xenogeneic सेल लाइन में एकल polypeptides (एकल श्रृंखला mhc) के रूप में पूर्व निर्धारित पेप्टाइड्स पेश अणुओं व्यक्त करके सह-agonism की जांच करने के लिए वर्णन करता है । हमने एकल श्रृंखला mhcs को शर्तों के तहत व्यक्त किया जहां एगोनिस्ट सिंगल चेन पी-एमएचसी परिसरों और गैर-उत्तेजक एकल श्रृंखला पी-एमएचसी परिसरों के उच्च स्तर के निम्न स्तर व्यक्त किए गए थे । इस प्रायोगिक प्रणाली का उपयोग हमें गैर-उत्तेजक pmhc की उपस्थिति या अनुपस्थिति में एगोनिस्ट pmhc के लिए सीडी 8 + T सेल प्रतिक्रियाओं की तुलना करने की अनुमति दी । प्रोटोकॉल एकल श्रृंखला mhc constructs, स्थिर सेल लाइनों की पीढ़ी, हेपेटाइटिस बी वायरस-विशिष्ट मानव सीडी 8 + टी कोशिकाओं और टी सेल सक्रियण प्रयोगों के साथ सेल लाइन ट्रांसफक्शन का वर्णन एक साथ साइटोकाइन उत्पादन बढ़ाता और विकणीकरण. प्रस्तुत तरीके ज्ञात पेप्टाइड mhc विशिष्टता के साथ मानव टी सेल सिस्टम में सीडी 8 + टी सेल सक्रियण के विभिन्न पहलुओं पर अनुसंधान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Introduction

mhc वर्ग i (mhc-i) अणु उपस्थित लघुतम (8-10 अमीनो अम्ल) प्रत्येक कोशिका द्वारा संश्लेषित प्रोटीन से प्राप्त पेप्टाइड्स. mhc-I स्वस्थ कोशिकाओं पर अणु मौजूद स्व पेप्टाइड्स अंतर्जात प्रोटीन से व्युत्पन्न. वायरल संक्रमण गैर स्वयं वायरस की प्रस्तुति की ओर जाता है-mhc-I पर पेप्टाइड्स व्युत्पंन, लेकिन यहां तक कि संक्रमित कोशिकाओं स्वयं पेप्टाइड-mhc (pmhc) की बड़ी मात्रा की उपस्थिति में गैर स्वयं पेप्टाइड उपस्थित. mhc-मैं टी सेल रिसेप्टर (tcr) और टी कोशिकाओं पर सीडी 8 सह रिसेप्टर द्वारा मांयता प्राप्त है । पेप्टाइड pmhc के लिए बाध्यकारी संबंध tcr अत्यधिक प्रस्तुत पेप्टाइड्स के अनुक्रम पर निर्भर है, जबकि सीडी 8 बाध्यकारी पेप्टाइड-स्वतंत्र है. गैर-स्व एगोनिस्ट pmhc जटिल करने के लिए बाइंडिंग tcr टी सेल सक्रियण और effector कार्यों के लिए सुराग । गैर-उत्तेजक स्व pmhc परिसरों टी सेल सक्रियण और effector कार्यों को प्रेरित नहीं करते हैं, लेकिन एक प्रक्रिया के माध्यम से एगोनिस्ट pmhc के लिए टी सेल प्रतिक्रियाओं को बढ़ा सकते हैं, सह-agonism1,2,3कहा जाता है । माउस सीडी4,5,6 के साथ-साथ माउस और मानव सीडी 8 + t कोशिकाओं मेंसह-एगोनिज्म को देखा गया है7,8,9,10, 11 , 12 , 13. शारीरिक स्थितियों के तहत, टी कोशिकाओं को एगोनिस्ट pmhc की सीमित मात्रा में antigen पेश कोशिकाओं (apcs) सह गैर उत्तेजक pmhc परिसरों के उच्च स्तर पेश करने की पहचान करने की जरूरत है, कि सह-agonism का सुझाव देता है इष्टतम टी विवो में सेल प्रतिक्रियाएं । कुल सेल सतह mhc वर्ग मैं स्तर अक्सर वायरल संक्रमण के दौरान downregulated कर रहे हैं14 और ट्यूमर पर15. इस प्रतिरक्षा चोरी रणनीति एगोनिस्ट pmhc प्रस्तुति कम कर देता है, लेकिन यह भी सह एगोनिस्ट pmhc मैं टी सेल सक्रियण संवर्धन के लिए उपलब्ध की राशि कम हो जाती है । इसके अलावा, उच्च सेल mhc वर्ग मैं अणु hla-सी की सतह अभिव्यक्ति स्तर में सुधार एचआईवी नियंत्रण16के साथ सहसंबंधी दिखाया गया है, कुल mhc वर्ग टी सेल सक्रियकरण में मैं अभिव्यक्ति के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका का सुझाव । सह-एगोनिज़्म के शारीरिक महत्व के बावजूद, इसकी आणविक तंत्र अभी भी पूरी तरह से समझ में आता है । यह मुख्यतः एगोनिस्ट pmhc लगातार रखते हुए प्रस्तुत सह-एगोनिस्ट pmhc की मात्रा को नियंत्रित करने की तकनीकी चुनौतियों के कारण है ।

हम एक प्रयोगात्मक प्रणाली विकसित की जांच करने के लिए मानव सीडी 8 + T सेल सक्रियण के दौरान सह-agonism मानव mhc वर्ग व्यक्त करके मैं एक xenogeneic कोशिका में एकल पॉलीपेप्टाइड (सिंगल चेन mhc-I, चित्रा 1a) के रूप में पूर्व निर्धारित पेप्टाइड प्रस्तुत अणुओं लाइन9,10. एकल श्रृंखला (sc) एगोनिस्ट pmhc टेट्रासाइक्लिन के नियंत्रण में व्यक्त किया गया था-हंसटर-व्युत्पन्न टी-रेक्स चो सेल लाइन टेट्रासाइक्लिन repressor व्यक्त करने में यह टेट्रासाइक्लिन (चित्र 1b, C) के अतिरिक्त टेट्रासाइक्लिन और उच्च sc एगोनिस्ट pmhc अभिव्यक्ति के अभाव में sc एगोनिस्ट pmhc की बहुत कम "टपका" अभिव्यक्ति की अनुमति देता है । एससी एगोनिस्ट pmhc-एक्सप्रेस टी-रेक्स चो कोशिकाओं को गैर-उत्तेजक, सह-एगोनिस्ट एससी pmhc-I के साथ एक संवैधानिक रूप से सक्रिय प्रमोटर (चित्रा 1b, सी) के नियंत्रण में सुपरट्रांसफेक्टेड किया गया था । इस प्रायोगिक प्रणाली का उपयोग हमें गैर-उत्तेजक pmhc के उच्च स्तर की उपस्थिति या अनुपस्थिति में एगोनिस्ट pmhc के लिए सीडी 8 + T सेल प्रतिक्रियाओं की तुलना करने की अनुमति दी. गंभीर रूप से, पेप्टाइड और mhc-मैं भारी श्रृंखला के बाद से covalently scmhc-I प्रारूप में जुड़े हुए हैं, यह mhc पूर्व-निर्धारित पेप्टाइड्स पेश अणुओं में परिवर्तन की महत्मकताओं की अनुमति देता है. scmhc-I प्रौद्योगिकी का उपयोग इस प्रकार हमें विशेष रूप से टीसीआर या सीडी 8-एगोनिस्ट या सह-एगोनिस्ट pmhc के बंधन गुण मिलाना करने की अनुमति दी ।

सीडी 8 + टी सेल सक्रियण में सह-एगोनिज्म का उपयोग करके देखा गया है शुद्ध mhc-मैं एगोनिस्ट और सह-एगोनिस्ट पेप्टाइड्स पेश करने के रूप में विषमलिंगी11,17 या क्वांटम डॉट्स12,13पर प्रस्तुत किया । एपीसी पर एगोनिस्ट pmhc मान्यता के संदर्भ में सीडी 8 + T सेल सक्रियण में सह-agonism पर जल्दी काम apc के रूप में TAP2 कमी सेल लाइनों का इस्तेमाल किया । ठोकर अंतर्द्रव्यी रेटिकुलम के लिए कोशिका द्रव्य से पेप्टाइड परिवहन के लिए आवश्यक है, और नल की कमी गंभीर रूप से उपलब्ध mhc वर्ग के पूल मैं-बाध्यकारी पेप्टाइड्स कम कर देता है. पेप्टाइड्स की अनुपस्थिति में, mhc वर्ग के नवजात जटिल मैं भारी श्रृंखला और β2-microglobulin अस्थिर है, बहुत कम mhc-I सेल सतह अभिव्यक्ति में जिसके परिणामस्वरूप. प्रारंभ में, नल-पर्याप्त और कमी माउस rma और rma-S सेल लाइनों पर लोड किए गए antigen के साथ प्रेरित टी कोशिकाओं की तुलना, क्रमशः एपीसीएस के रूप में, माउस टी सेल सक्रियण18के दौरान सह-एगोनिज्म के लिए कोई सबूत प्रकट नहीं किया । हालांकि, इस प्रायोगिक प्रणाली का उपयोग एगोनिस्ट pmhc की राशि पर सटीक नियंत्रण की अनुमति नहीं दी गैर उत्तेजक स्वयं pmhc के स्वतंत्र रूप से प्रस्तुत किया । इसके अलावा, ये दो कोशिका रेखाएँ अन्य अणुओं की अभिव्यक्ति में भी भिन्न हो सकती हैं जो टी सेल सक्रियण को मिलाना, जैसे लिगंडा को टी सेल सह-उत्तेजक या निरोधात्मक रिसेप्टर्स, या आसंजन अणुओं के रूप में.

इसके बाद, हम exogenous पेप्टाइड्स के साथ TAP2 कमी RMA-S कोशिकाओं को लोड करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित गैर-उत्तेजक pmhc की उपस्थिति या अनुपस्थिति में एगोनिस्ट pmhc की एक निश्चित राशि की प्रस्तुति की अनुमति देने के लिए. यह निम्नलिखित के माध्यम से प्राप्त किया गया था: कम तापमान पर TAP2 की कमी आरएमए-एस कोशिकाओं की ऊष्मायन (28 डिग्री सेल्सियस, सामान्य ३७ डिग्री सेल्सियस के बजाय) खाली mhc वर्ग को स्थिर करने के लिए मैं भारी श्रृंखला/β2 microglobulin परिसरों19; exogenous एगोनिस्ट पेप्टाइड के साथ 28 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन; exogenous गैर-उत्तेजक पेप्टाइड की उपस्थिति या अनुपस्थिति में 28 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन; और ३७ डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन खाली mhc वर्ग के सेल सतह अभिव्यक्ति को कम करने के लिए मैं8,9परिसरों । इस प्रयोगात्मक सेट अप का उपयोग पता चला है कि गैर उत्तेजक pmhc की उपस्थिति माउस thymocytes, भोली परिधीय सीडी 8 + टी कोशिकाओं और ctls8की सक्रियता बढ़ाया । यंत्रवत्, गैर-उत्तेजक pmhc की उपस्थिति टी सेल के लिए सीडी 8 भर्ती पैदा कर सकते हैं: एपीसी प्रतिरक्षा synapse भी एगोनिस्ट pmhc की अनुपस्थिति में, और गैर-उत्तेजक pmhc सीडी 8 coreceptor7,8के साथ टीसीआर बातचीत में वृद्धि कर सकते हैं. हालांकि, इस प्रयोगात्मक प्रणाली tcr और सीडी 8 के सापेक्ष योगदान परीक्षण की अनुमति नहीं है एगोनिस्ट और सह के लिए बाइंडिंग coreceptor सक्रियण संवर्धन mediating में, किसी भी संशोधन के रूप में tcr या सीडी 8 mhc वर्ग के लिए बाध्यकारी मैं चाहूंगा सभी mhc अणुओं को प्रभावित, प्रस्तुत पेप्टाइड की परवाह किए बिना. इसलिए हम इस समस्या से उबरने के लिए mhc वर्ग मैं एकल श्रृंखला प्रौद्योगिकी का इस्तेमाल किया ।

एकल श्रृंखला (अनुसूचित जाति) mhc वर्ग मैं प्रारूप पहले चिकित्सकीय रणनीतियों के लिए प्रतिजनी pmhc प्रस्तुति में सुधार करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, और tcr और nk सेल रिसेप्टर सक्रियण और समारोह के तंत्र पर मौलिक सवालों के जवाब देने के लिए20,21 . scmhc-मैं पेप्टाइड के होते हैं, β2-microglobulin और mhc-मैं भारी श्रृंखला में शामिल हो गए दो लचीला serine/glycine-रिच linkers (चित्रा 1a), कई अलग linkers दृश्यों विकसित किया गया है और परीक्षण22. scmhc-मैं पारंपरिक pmhc परिसर20विधानसभा के लिए आवश्यक नल जटिल और निगरानी प्रोटीन के स्वतंत्र रूप से गुना कर सकते हैं. scmhc-मैं सही ढंग से गुना करने के लिए दिखाया गया है, के रूप में conformation विशिष्ट एंटीबॉडी धुंधला22 का उपयोग कर और एक्स-रे क्रि23के साथ अनुसूचित जाति संरचना को सुलझाने के द्वारा निर्धारित किया है । बुनियादी scmhc-मैं डिजाइन कम संबध24,25पेप्टाइड्स के बंधन में सुधार करने के लिए संशोधित किया गया है.

इस प्रोटोकॉल मानव scmhc का उपयोग-मैं मानव ctl क्लोन सक्रियण के दौरान सह-agonism की जांच करने के लिए वर्णन करता है । प्रोटोकॉल हेपेटाइटिस बी वायरस (hbv) के एक epitope के लिए मानव ctl क्लोन विशिष्ट के लिए अनुकूलित किया गया है । hbv एक गंभीर हेल्थकेयर बोझ दुनिया भर में है, के रूप में वहां रहे है ३५०,०००,००० hbv और क्रोनिक hbv संक्रमण से संक्रमित लोगों हेपेटोकोशिलर कार्सिनोमा (hcc) के विकास के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । एचबीवी संक्रमण से उत्पन्न hcc कोशिकाओं को आमतौर पर एचबीवी-व्युत्पन्न epitopes मौजूद कर सकते हैं और विशिष्ट मानव टी कोशिकाओं द्वारा पहचाना जा सकता है । hbv और hcc मंजूरी मानव टी सेल प्रतिक्रियाओं पर निर्भर करता है26, लेकिन hcc रोगियों अक्सर टी सेल थकावट और कम टी सेल प्रतिक्रियाएं27से ग्रस्त हैं । एचबीवी की टी कोशिकाओं में hbv-विशिष्ट tcr की शुरूआत क्रोनिक एचबीवी संक्रमण को खत्म करने के लिए एक संभावित immunotherapy रणनीति के रूप में की कोशिश की गई है28. हालांकि, यह अज्ञात है अगर इस विधि एक नैदानिक सेटिंग में प्रभावी हो जाएगा, सतह mhc के निम्न स्तर के कारण-मैं मानव hepatocytes में29. इसलिए, coagonism के तंत्र को समझने hbv के immunotherapy के लिए वैकल्पिक दृष्टिकोण प्रदान कर सकते हैं, संभवतः अंतर्जात pmhc की प्रस्तुति को बढ़ाने के लिए सह-agonism-मध्यस्थता टी सेल प्रतिक्रियाओं प्रेरित । प्रोटोकॉल मानव सह-एगोनिज्म पर अनुसंधान के लिए सभी आवश्यक कदम शामिल हैं: एगोनिस्ट और सह-एगोनिस्ट अनुसूचित जाति pmhc, स्थिर टी-रेक्स चो सेल लाइनों की संस्कृति, hbv-विशिष्ट मानव ctl सीडी 8 + टी सेल लाइन और सीटीएल सक्रियण की पीढ़ी के साथ टी-रेक्स चो कोशिकाओं का ट्रांसफेक्शन प्रयोगों को बढ़ाता साइटोक्सीन उत्पादन और विकणीकरण टी-रेक्स चो कोशिकाओं के जवाब में. हालांकि हम अनुसूचित जाति mhc वर्ग मैं प्रौद्योगिकी hbv टी सेल सक्रियण के दौरान सह-agonism की जांच का उपयोग करने पर ध्यान केंद्रित, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि प्रस्तुत तरीके आसानी से ज्ञात pmhc के साथ मानव टी सेल सिस्टम में टी सेल सक्रियण के अन्य पहलुओं पर अनुसंधान के लिए अनुकूलित किया जा सकता है-I विशिष्टता.

यह प्रोटोकॉल hbv व्युत्पन्न पेप्टाइड E183-91 (flltrilti: "E183")30 hla-A2 पर प्रस्तुत के लिए एक मानव सीडी 8 + ctl लाइन विशिष्ट का उपयोग करता है । sc hla मानव β2 से एक संकेत अनुक्रम से मिलकर अणुओं-microglobulin, एक hla-A2 ब्याज की पेप्टाइड बाइंडिंग, एक glycine/serine linker, एक मानव β2-microglobulin, एक glycine/serine लिंकर और एक A2 भारी श्रृंखला व्यावसायिक रूप से संश्लेषित किया जा सकता है (चित्र 1a ). plasmids एन्कोडिंग scA2 एगोनिस्ट E183 पेप्टाइड के साथ constructs, या coagonist एचआईवी गैग (slyntvatl)31 पेप्टाइड्स अनुरोध पर लेखकों से उपलब्ध हैं. पेप्टाइड अनुक्रम साइट का उपयोग कर परिवर्तित किया जा सकता है निर्देशित-mutagenesis. एक टेट्रासाइक्लिन-inducible वेक्टर pcDNA5/करने के लिए E183 पेप्टाइड के साथ एगोनिस्ट एकल श्रृंखला hla-a2 व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया था (sc E183-hla-a2). टेट्रासाइक्लिन repressor की उपस्थिति में, pcDNA5/करने के लिए प्लाज्मिड केवल बहुत कम, ब्याज की प्रोटीन की "नलों" अभिव्यक्ति की अनुमति देता है; उच्च अभिव्यक्ति टेट्रासाइक्लिन (चित्रा 1b, सी) के अलावा द्वारा प्रेरित किया जा सकता है । टेट्रासाइक्लिन-inducible अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग सेल सतह एगोनिस्ट pmhc अभिव्यक्ति की मात्रा पर नियंत्रण की अनुमति देता है । एक संवैधानिक अभिव्यक्ति प्लाज्मिड pcdna 3.1 गैग पेप्टाइड (sc gag-hla-A2) के साथ coagonist scA2 व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । टेट्रासाइक्लिन विनियमित अभिव्यक्ति (टी-रेक्स) चो सेल लाइन (हैम्स्टर सेल लाइन, कोई अंतर्जात मानव mhc) को व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया था एगोनिस्ट और सह-एगोनिस्ट अनुसूचित जाति-एचएलए-A2 constructs. इस प्रयोगात्मक प्रणाली pmhc प्रस्तुति पर सटीक नियंत्रण की अनुमति देता है (चित्रा 1c): नहीं pmhc प्रस्तुति (untransfected टी-रेक्स), सह-एगोनिस्ट pmhc प्रस्तुति की एक उच्च राशि (संवैधानिक अनुसूचित जाति झूठ-hla-A2 अभिव्यक्ति), एगोनिस्ट pmhc की एक कम राशि प्रस्तुति (sc E183-hla-a2 टेट्रासाइक्लिन की अनुपस्थिति में), एगोनिस्ट pmhc प्रस्तुति की एक उच्च मात्रा (sc E183-hla-a2 टेट्रासाइक्लिन की उपस्थिति में), एगोनिस्ट pmhc प्रस्तुति और सह-एगोनिस्ट pmhc की उच्च अभिव्यक्ति की एक कम राशि (sc E183-hla-a2 टेट्रासाइक्लिन की अनुपस्थिति, और संवैधानिक अनुसूचित जाति झूठ-hla-A2 अभिव्यक्ति) । इस प्रायोगिक प्रणाली का उपयोग एगोनिस्ट और coagonist pmhc के सेल सतह मात्रा के सटीक नियंत्रण की अनुमति देता है ।

Protocol

नोट: सभी कदम शामिल रहते हैं, गैर निर्धारित कोशिकाओं का उपयोग एक जैव सुरक्षा हुड में किया जाना चाहिए, और किसी भी bioसंकटमय अपशिष्ट स्थानीय स्वास्थ्य और सुरक्षा नियमों के अनुसार छोड़ दिया जाना चाहिए ।

1. चो सेल transfection और स्थिर चो सेल लाइनों के उत्पादन

  1. चो सेल ट्रांसफेक्शन
    नोट:     इस खंड का वर्णन करता है चो सेल ट्रांसफेक्शन का उपयोग कर पॉलीथाइलिएन्माइन (PEI) । हालांकि, वैकल्पिक तरीकों का इस्तेमाल किया जा सकता है, क्योंकि चो कोशिकाओं को वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध लिपिड ट्रांसफेक्शन अभिकर्मकों का उपयोग कर transfect करने के लिए अपेक्षाकृत आसान कर रहे हैं ।
    1. पूर्ण f12 में संस्कृति चो कोशिकाओं (cF12, f12 के साथ पूरक 5% fbs, १०० U/ml penicillin, १०० μg/एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन और 10 μg/एमएल blasticidin की अभिव्यक्ति को बनाए रखने के लिए टेट्रासाइक्लिन repressor) । एक 1:10 अनुपात में हर 3-4 दिन कोशिकाओं बीतने ।
    2. एक दिन पहले transfection, चो सेल निलंबन तैयार करते हैं । पीबीएस का उपयोग करके कुप्पी में चो कोशिकाओं को धोएं (एक T75 फ्लास्क के लिए पीबीएस के लिए 10 मिलीलीटर, एक T25 फ्लास्क के लिए 5 मिलीलीटर पीबीएस) । pbs में ०.०५% trypsin/0.02% edta जोड़ें (एक T75 कुप्पी के लिए 2 मिलीलीटर, एक T25 फ्लास्क के लिए 1 मिलीलीटर) फ्लास्क और कमरे के तापमान पर 5-10 मिनट के लिए सेते (आरटी) । एक प्रकाश सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग, जांच करें कि कोशिकाओं को अलग किया है, और कुप्पी के लिए cF12 जोड़कर trypsinization बंद करो (एक T75 फ्लास्क के लिए 8 मिलीलीटर, एक T25 कुप्पी के लिए 4 मिलीलीटर) ।
    3. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब के लिए चो सेल निलंबन स्थानांतरण, और 4 डिग्री सेल्सियस या आरटी में 5 मिनट के लिए 300-400 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र । सुपरनाटैंट निकालें, cF12 में पुनः निलंबित करें (10 मिलीलीटर एक T75 फ्लास्क के लिए, 5 मिलीलीटर एक T25 फ्लास्क के लिए) और एक हेमोसिटोमीटर का उपयोग करते हुए गणना करें ।
    4. सेल एकाग्रता को समायोजित करने के लिए 60000-100000 चो कोशिकाओं/ एक 6 अच्छी तरह से थाली में प्रति अच्छी तरह से चो सेल निलंबन (300000-500000 चो कोशिकाओं) के 5 मिलीलीटर जोड़ें । ३७ डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते, 5% सह2।
    5. ट्रांसफेक्शन के दिन, एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब के लिए सीरम मुक्त F12 मीडिया या कम सीरम मीडिया के ४०० μl जोड़ें । मीडिया के ४०० μl करने के लिए प्लाज्मिड के 3 μg जोड़ें । पाइपटिंग द्वारा मिक्स । मीडिया/डीएनए मिश्रण, और भंवर के लिए तुरंत 10 एस के लिए (6 μl के 1 मिलीग्राम/एमएल पी समाधान) के 6 μg जोड़ें ।
    6. 10-15 मिनट के लिए आर टी पर मीडिया और डीएनए/ इस ऊष्मायन के दौरान, 6 अच्छी तरह थाली में चो सेल मीडिया ताजा cF12 मीडिया के 5 मिलीलीटर के साथ बदलें ।
    7. मीडिया/DNA/PEI समाधान को चो कक्षों में जोड़ें । समाधान बिंदुश: और समान रूप से अच्छी तरह से ऊपर जोड़ें । ३७ डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते, 5% सह2।
  2. स्थिर चो सेल लाइनों के उत्पादन
    1. एक दिन transfection के बाद, कुओं से मीडिया को हटाने और एक अच्छी तरह से उचित चयन एंटीबायोटिक युक्त cF12 के 5 मिलीलीटर जोड़ें । pcDNA5TO-आधारित plasmids के लिए ०.३ मिलीग्राम/एमएल hygromycin का प्रयोग करें, और pcDNA3 आधारित plasmids के लिए 1 मिलीग्राम/
    2. यदि कक्ष 24 ज पोस्ट ट्रांसफेक्शन पर ९०% से अधिक कन्फ्लुएंसी तक पहुंचते हैं, तो कोशिकाओं को ट्रिप्सिनीज करें ।
    3. अच्छी तरह से प्रति pbs के 1 मिलीलीटर के साथ कुओं को धोएं, पीबीएस में ०.०५% trypsin/0.02% edta की 1 मिलीलीटर जोड़ें और आरटी पर 5-10 मिनट के लिए सेते हैं । एक प्रकाश सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग, जांच करें कि कोशिकाओं अलग है, और cF12 प्रति अच्छी तरह से 3-4 मिलीलीटर जोड़कर trypsinization बंद करो ।
    4. चो सेल निलंबन को 15 मिलीलीटर ट्यूब पर स्थानांतरित करें, और 4 डिग्री सेल्सियस या आरटी में 5 मिनट के लिए 300-400 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र करें । सतह पर तैरनेवाला निकालें और cF12 की 10 मिलीलीटर में फिर से निलंबित । 6 अच्छी तरह से थाली में प्रति अच्छी तरह से सेल निलंबन के 5 मिलीलीटर जोड़ें । ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं की उपज को अधिकतम करने के लिए दो कुओं का उपयोग करें ।
    5. ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% सह2पर 6 अच्छी तरह से प्लेट को सेते हैं । सेल मौत की निगरानी और एक प्रकाश सूक्ष्मदर्शी का उपयोग कर प्रतिरोधी कालोनियों के विकास । मीडिया निकालें और यह ताजा मीडिया के साथ प्रतिस्थापित 4-5 दिनों के बाद उचित एंटीबायोटिक दवाओं युक्त, या जब महत्वपूर्ण कोशिका मृत्यु मनाया जाता है.
    6. एक बार प्रतिरोधी कोशिकाओं से अधिक ७०% संगम तक पहुंचने, trypsinize के रूप में कदम में वर्णित कोशिकाओं 1.2.2 और विस्तार के लिए एक T25 कुप्पी स्थानांतरण । एंटीबायोटिक चयन 1-2 सप्ताह लगते हैं ।
    7. एक बार T25 कुप्पी में एंटीबायोटिक प्रतिरोधी चो कोशिकाओं 70-80% संगम तक पहुंचने के लिए, एंटीबॉडी के लिए रुचि के constructs के सेल की सतह अभिव्यक्ति सत्यापित धुंधला प्रदर्शन । एंटीबॉडी धुंधला होने से एक दिन पहले, चरण 1.2.2 में वर्णित कोशिकाओं को ट्रिप्सिनीज करें और सेल एकाग्रता को २००,००० कोशिकाओं/एमएल में समायोजित करें, और 1 मिलीलीटर सेल सस्पेंशन को 12 अच्छी तरह से प्लेट में जोड़ें । टेट्रासाइक्लिन के परीक्षण के लिए-इंसिटेबल constructs, टेट्रासाइक्लिन के 50-60 एनजी/एमएल जोड़ें । ३७ डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते, 5% सह2।
    8. अच्छी तरह से नीचे से चो कोशिकाओं को अलग करने के लिए सेल स्क्रैपर का उपयोग करें । इस विधि trypsinization के लिए बेहतर है, के रूप में यह proteolytic दरार के कारण epitope क्षति के जोखिम को कम कर देता है.
    9. एक facs ट्यूब के लिए चो कोशिकाओं युक्त मीडिया के 1 मिलीलीटर स्थानांतरण । 300-400 एक्स जी, 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नीचे स्पिन-fwb में पतला विरोधी hla एंटीबॉडी के १०० μl में पुन: निलंबित । बर्फ पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट सेते । एगोनिस्ट pmhc-I सेल सतह अभिव्यक्ति के स्तर का पता लगाने के लिए E183 पेप्टाइड के साथ जटिल में a2 के लिए कुल a2 सेल सतह अभिव्यक्ति का स्तर, और tcr-की तरह विशिष्ट एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए एंटी-a2 एंटीबॉडी के साथ इस धुंधला प्रदर्शन.
    10. mhc अभिव्यक्ति का सत्यापन करने के बाद, facs-सकारात्मक कोशिकाओं को सॉर्ट, और ट्रांसजीन नुकसान को कम करने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के साथ मीडिया में क्रमबद्ध कोशिकाओं को बनाए रखने. चो कोशिकाओं के लिए एगोनिस्ट pmhc व्यक्त, एकल सेल छंटाई की सिफारिश की है, के साथ और सह एगोनिस्ट pmhc के साथ supertransfection बिना तुलनीय एगोनिस्ट pmhc अभिव्यक्ति सुनिश्चित करने के लिए । 2-3 सप्ताह एक सेल छंटाई के बाद चो सेल विकास के लिए आवश्यक हैं ।

2. hbv-विशिष्ट ctl संस्कृति

  1. एचबीवी-विशिष्ट मानव ctl पुनः उत्तेजना के लिए फीडर के रूप में pbmcs की तैयारी
    नोट:     के लिए A2-E183-विशिष्ट ctl क्लोन, नए सिरे से अलग pbmcs के साथ पुनः उत्तेजना, बजाय गल pbmcs, सबसे अच्छा परिणाम देता है.
    सावधानी: रक्त दान के लिए स्वयंसेवकों की भर्ती से पहले सभी आवश्यक नैतिक अनुमोदन प्राप्त करें । इस कार्य के प्रयोजन के लिए, pbmc को NUS irb द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के तहत स्वस्थ स्वयंसेवकों से एकत्र किया गया था । सभी दानदाताओं से सूचित सहमति प्राप्त की गई. रक्त जनित रोगों के संचरण के जोखिम को कम करने के लिए मानव रक्त के साथ काम करते समय सभी आवश्यक सावधानियों का पालन करें ।
    1. शुरू करने से पहले, 19-20 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्री तापमान सेट और घनत्व ढाल (जैसे, ficoll) आरटी को पूर्व गर्म ।
    2. ५० मिलीलीटर ट्यूब के लिए कमरे के तापमान घनत्व ढाल के 15 मिलीलीटर जोड़ें । 19-20 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४०० एक्स जी पर अपकेंद्रिका । यह सुनिश्चित करने के लिए वहां ट्यूब के पक्ष में कोई घनत्व ढाल है ।
    3. venipuncture के माध्यम से एक स्वस्थ स्वयंसेवक दाता से रक्त की 20 मिलीलीटर ले लीजिए । एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में 20 मिलीलीटर रक्त पीबीएस के 15 मिलीलीटर जोड़ें । ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिक्स ।
    4. धीरे, पीबीएस में ३५ मिलीलीटर रक्त की 15 मिलीलीटर घनत्व ढाल से चरण 2.1.2 के ऊपर पतला जोड़ें । सुनिश्चित करें कि रक्त और घनत्व ढाल मिश्रण नहीं है । 19 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब अपकेंद्रिका, ब्रेक के साथ 20 मिनट के लिए १,२०० एक्स जी ।
    5. प्लाज्मा परत के लगभग ७०% निकालें । ध्यान से pbmc युक्त परत महाप्राण (स्पष्ट घनत्व ढाल परत के शीर्ष पर बादल परत) एक pasteur पिपेट का उपयोग कर और एक नया ५० मिलीलीटर ट्यूब में जगह है ।
    6. एक ५० मिलीलीटर कुल मात्रा प्राप्त करने के लिए pbmcs pbs जोड़ें । अपकेंद्रित्र ट्यूब 4 डिग्री सेल्सियस पर, 10 मिनट के लिए 300-400 x जी । ध्यान से वैक्यूम चूषित्र और कांच पाश्चर पिपेट, या decanting द्वारा उपयोग सतह पर तैरनेवाला हटा दें ।
    7. pbs के ५० मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित । अपकेंद्रित्र ट्यूब 4 डिग्री सेल्सियस पर, 10 मिनट के लिए ३०० x जी । ध्यान से वैक्यूम चूषित्र और कांच पाश्चर पिपेट, या decanting द्वारा उपयोग सतह पर तैरनेवाला हटा दें ।
    8. पुन: पूर्ण मानव T सेल मीडिया के 2 मिलीलीटर में कोशिकाओं को निलंबित (सीरम मुक्त मीडिया 2% मानव सीरम के साथ पूरक) । hemocytometer का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना । यह प्रोटोकॉल औसतन 1-2 x 106 pbmcs प्रति 1 मिलीलीटर रक्त का उपयोग करता है ।
  2. सीटीएल पुनः उत्तेजना फीडर कोशिकाओं के रूप में pbmcs का उपयोग
    1. बाद उत्तेजना के जवाब में प्रसार को बाधित करने के लिए 30 Gy पर pbmcs विकिरणित.
      चेतावनी: irradiator का उपयोग करते समय प्रयोगशाला सुरक्षा आवश्यकताओं के साथ पर्याप्त प्रशिक्षण और अनुपालन सुनिश्चित करें ।
    2. 2 x 106 कोशिकाओं में पूर्ण मानव T सेल मीडिया में विकिरणित pbmcs पुनः निलंबित/ pbmc निलंबन में 2x एकाग्रता में सीटीएल पुनः उत्तेजना के लिए साइटोकिन्स और लेक्टिन को फेसिओलस वल्गेरिस (PHA) से जोड़ें । अंतिम साइटोकाइन और PHA सांद्रता कर रहे हैं: 20 U/एमएल पुनः संयोजक मानव आईएल-2, 10 एनजी/एमएल रीकॉम्बींडेंट आईएल-7, 10 एनजी/एमएल पुनः संयोजक मानव आईएल-15 और १.५ मिलीग्राम/
    3. एक ३७ ° c पानी स्नान में जमे हुए सीटीएल शीशी गल । पूरा मानव टी सेल मीडिया के 10 मिलीलीटर के साथ एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में गल कोशिकाओं को स्थानांतरित करें । 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 300-400 एक्स जी पर नीचे स्पिन । ध्यान से वैक्यूम चूषित्र और कांच पाश्चर पिपेट, या decanting द्वारा उपयोग सतह पर तैरनेवाला हटा दें ।
    4. पूर्ण मानव T सेल मीडिया के 2 मिलीलीटर में ctls को पुन: निलंबित करें । hemocytometer का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना । 106 कोशिकाओं की सेल एकाग्रता प्राप्त करने के लिए पूरा मानव टी सेल मीडिया जोड़ें/एमएल ।
    5. एक 24 अच्छी तरह से थाली में, 2x साइटोकिन्स और PHA (2.2.2 कदम) के साथ किरणित pbmcs (106 कोशिकाओं) के ०.५ मिलीलीटर जोड़ने के लिए, और ctls की ०.५ मिलीलीटर (०.५ x 106 कोशिकाओं) प्रति अच्छी तरह से । उपयोग किए गए कुओं की संख्या उपलब्ध ctls या pbmcs की कुल संख्या पर निर्भर करता है । ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेते, 5% सह2।
    6. 4-5 दिनों के बाद, जब ctl विस्फोटों दिखाई दे रहे हैं और मीडिया पीला हो जाता है, 6 अच्छी तरह से प्लेटों में संस्कृतियों का स्थानांतरण, और 20 U/एमएल आईएल-2, 10 एनजी/एमएल आईएल-7 और 10 एनजी/एमएल आईएल-15 (कोई PHA) के साथ पूर्ण मानव टी सेल मीडिया के 4 मिलीलीटर के साथ प्रारंभिक 1 मिलीलीटर मात्रा के पूरक ।
    7. 2-3 दिनों के बाद, एक T75 flask में संस्कृतियों स्थानांतरण, साइटोकिन्स (2.2.2 कदम, कोई PHA) और संस्कृति के साथ पूरा मानव टी सेल मीडिया के ४० एमएल एक ईमानदार स्थिति में जोड़ें ।
    8. नए सिरे से मीडिया साइटोकिन्स (2.2.2 कदम, कोई PHA) हर दूसरे दिन में मौजूदा संस्कृति की मात्रा के बराबर की मात्रा में के साथ पूरक 1-2 x 106 कोशिकाओं की एकाग्रता पर ctls बनाए रखें । ctls प्रयोग 7-14 दिनों के बाद पुनः उत्तेजना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

3. टी सेल सक्रियण प्रयोगों

नोट: एक ठेठ प्रयोग कई अलग टी-rexcho लाइनों की आवश्यकता है: अनट्रांसफेक्टेड टी-रेक्स चो कोशिकाओं (नकारात्मक नियंत्रण), टी rex चो गैर उत्तेजक pmhc केवल (scA2-gag; नकारात्मक नियंत्रण) एक्सप्रेस, टी rex चो एगोनिस्ट pmhc की कम मात्रा में व्यक्त कोशिकाओं-I ( scA2-env बिना टेट्रासाइक्लिन, प्रयोगात्मक नमूना), टी-रेक्स चो एगोनिस्ट pmhc की कम मात्रा और गैर-उत्तेजक सह-एगोनिस्ट pmhc (scA2-env और scA2-गैग, टेट्रासाइक्लिन, प्रयोगात्मक नमूना के बिना), और टी-रेक्स चो कोशिकाओं की उच्च मात्रा व्यक्त टेट्रासाइक्लिन, सकारात्मक नियंत्रण के साथ एगोनिस्ट pmhc-I scA2-env की उच्च मात्रा व्यक्त), के रूप में चित्रा 1c, डीपर दिखाया गया है

  1. antigen की कोशिकाओं को पेश करने के रूप में चो कोशिकाओं चढ़ाना
    1. T75 flask में संस्कृति चो कोशिकाओं, के रूप में 1.1.1 कदम में वर्णित है । सर्वश्रेष्ठ परिणामों के लिए 70-90% संगम पर कोशिकाओं का उपयोग करें । टी सेल सक्रियण प्रयोग से एक दिन पहले, अनुभाग 1.1.2 में बताए गए अनुसार कोशिकाओं को ट्रिप्सिनीज करें । trypsinization के बाद, एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में सेल निलंबन स्थानांतरण, 4 डिग्री सेल्सियस या आरटी में 5 मिनट के लिए ४०० एक्स जी पर अपकेंद्रित्र, पिटिंग या decanting द्वारा सतह पर तैरनेवाला हटा दें ।
    2. cF12 की 5 मिलीलीटर में सेल पेलेट को पुनः निलंबित कर दें । एक hemocytometer का उपयोग कर कोशिकाओं को गिन लो ।
    3. 2 x 105/एमएल cF12 का उपयोग करने के लिए सेल एकाग्रता समायोजित करें । एगोनिस्ट केवल नमूनों के लिए टेट्रासाइक्लिन के 50-60 एनजी/एमएल एगोनिस्ट pmhc-मैं सकारात्मक नियंत्रण (चित्रा 1c) के रूप में अभिव्यक्ति की उच्च मात्रा में प्रेरित करने के लिए जोड़ें । चो कोशिकाओं 15 मिलीलीटर ट्यूबों में नीचे बसा है, तो उन्हें पीटन या चढ़ाना से पहले vortexing द्वारा मिश्रण करने के लिए सुनिश्चित करें कि होगा ।
    4. टी सेल सक्रियकरण परख के लिए, अच्छी तरह से U-नीचे ९६ अच्छी तरह से थाली करने के लिए प्रति चो सेल निलंबन के १०० μl जोड़ें, और चो सेल लाइन प्रति triplicates का उपयोग करें । चो सेल विरोधी mhc धुंधला के लिए, 12 अच्छी तरह से थाली को सेल निलंबन के 1 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, और सेल लाइन प्रति triplicates का उपयोग करें । ३७ डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते, 5% सह2।
  2. टी सेल सक्रियकरण परख
    नोट:     यह टी सेल सक्रियकरण परख टी सेल विकणीकरण के एक साथ परिमाणन की अनुमति देता है (CD107a staining, टी सेल cytotoxicity का एक उपाय) और cytotoxicity उत्पादन ।
    1. प्रयोग के पहले दिन, 4 डिग्री सेल्सियस पर ४०० एक्स जी में 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र ctls कोशिकाओं, hemocytometer का उपयोग कर गिनती और साइटोकिन्स या PHA बिना पूर्ण मानव टी सेल मीडिया में 106 कोशिकाओं/एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित । ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेते, 5% सह2। हम इस कदम के बिना antigen की कम मात्रा के जवाब में अधिकतम सक्रियण मनाया है के रूप में सीटीएल संवेदनशीलता को कम करने के लिए यह बाकी कदम का उद्देश्य है ।
    2. प्रयोग के दिन, 4 डिग्री सेल्सियस पर ४०० एक्स जी 5 मिनट के लिए में अपकेंद्रिप टी कोशिकाओं, decanting या pipetting द्वारा सतह पर तैरनेवाला हटाने, और 2 मिलीलीटर पूर्ण सीरम मुक्त मीडिया में कोशिकाओं को फिर से निलंबित (बिना साइटोकिन्स या PHA) । एक hemocytometer का उपयोग कर लाइव टी कोशिकाओं की गणना, और पूर्ण मानव टी सेल मीडिया (साइटोकिन्स या PHA बिना) का उपयोग कर 106 लाइव कोशिकाओं/एमएल के लिए टी सेल एकाग्रता को समायोजित ।
    3. एक 1:100 कमजोर पड़ने पर विरोधी मानव CD107a एंटीबॉडी जोड़ें (२.५ μg/एमएल के अंतिम एकाग्रता), एक 1:1000 कमजोर पड़ने (1 μg/एमएल की अंतिम एकाग्रता) में brefeldin एक जोड़ें ।
    4. गिलास pasteur पिपेट के साथ या थाली flicking द्वारा ९६ अच्छी तरह से थाली में चो कोशिकाओं से मीडिया निकालें । प्रति अच्छी तरह से, टी सेल निलंबन के २०० μl (०.२ एक्स 106 कोशिकाओं) युक्त विरोधी CD107a और brefeldin ए. सह-संस्कृति टी कोशिकाओं के लिए चो कोशिकाओं के साथ 3-4 एच ।
    5. सह संस्कृति के अंत में, टी सेल सतह antigen धुंधला प्रदर्शन करते हैं । 300-400 एक्स जी, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट में ९६ अच्छी थाली नीचे स्पिन, और aspirating या flicking द्वारा सतह पर तैरनेवाला हटा दें । २.५ μl के CD3 और २.५ μl में सीडी 8 एंटीबॉडी के ५० μl में ०.५% bsa के pbs (फ्लो वॉश बफर, fwb) प्रति अच्छी तरह से सेल सतह एंटीजेन धुंधला के लिए जोड़ें । अंधेरे में 30 मिनट के लिए बर्फ पर नमूने सेते ।
    6. प्रति अच्छी तरह से fwb के १५० μl जोड़कर नमूने धो लें । 300-400 एक्स जी, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट में ९६ अच्छी थाली नीचे स्पिन, और aspirating या flicking द्वारा सतह पर तैरनेवाला हटा दें ।
    7. निर्धारण/permeabilization किट का उपयोग करते हुए स्टेप्स/ (निर्धारण/permeabilization किट से) प्रति अच्छी तरह से, पाइपटिंग द्वारा मिश्रण का निर्धारण के १०० μl जोड़ें । 20 मिनट के लिए बर्फ पर सेते ।
    8. 300-400 एक्स जी और 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रिका, और aspirating या flicking द्वारा सतह पर तैरनेवाला हटा दें । 1x के २०० μl जोड़ें पर्म/धो बफर (किट से पहले का उपयोग करने के लिए 10x perm/धो स्टॉक बफर पतला) प्रति अच्छी तरह से । इस चरण को दोहराएं ।
    9. ५० μl के 1x पर्म/वॉश बफर जिसमें एंटी-ifn-γ एंटीबॉडी पर ०.३ μg/एमएल में सेल पेलेट को पुन: निलंबित कर दें । अंधेरे में 30 मिनट के लिए बर्फ पर सेते ।
    10. जोड़ें १५० μl के 1x पर्म/ 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 300-400 x जी के लिए अपकेंद्रिका, और aspirating या flicking द्वारा सतह पर तैरनेवाला हटा दें । जोड़ें २०० μl के 1x पर्म/वॉश बफर, सेंटअपज 300-400 एक्स जी के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए, और सुपरनेटंट को हटाने के लिए और aspirating या flicking ।
    11. fwb के २०० μl में प्रत्येक नमूने को पुन: निलंबित कर देते हैं । प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के साथ आगे बढ़ें ।
  3. चो सेल mhc वर्ग मैं धुंधला
    नोट:     सेल लाइनों transgene अभिव्यक्ति खो सकते हैं के रूप में यह प्रत्येक प्रयोग पर इस्तेमाल किया कोशिकाओं पर scmhc-मैं सेल सतह के स्तर को सत्यापित करने के लिए महत्वपूर्ण है. जब टी सेल उत्तेजना के लिए ९६ अच्छी थाली की तैयारी, चो सेल धुंधला के लिए 12 अच्छी तरह से थाली सेट, के रूप में धारा 3.1.4 में उल्लिखित ।
    1. अच्छी तरह से नीचे से चो कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक सेल स्क्रैपर का उपयोग करें । इस विधि trypsinization के लिए बेहतर है, के रूप में यह proteolytic दरार के कारण epitope क्षति के जोखिम को कम कर देता है.
    2. मीडिया के 1 मिलीलीटर facs ट्यूब के लिए चो कोशिकाओं युक्त स्थानांतरण । 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 300-400 एक्स जी पर नीचे स्पिन-fwb में पतला विरोधी hla एंटीबॉडी के १०० μl में पुन: निलंबित । बर्फ पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते ।
      1. कुल a2 सेल सतह अभिव्यक्ति के स्तर का पता लगाने के लिए विरोधी-a2 एंटीबॉडी के साथ इस धुंधला प्रदर्शन, और E183 पेप्टाइड के साथ जटिल में a2 के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी की तरह विशेष रूप से एगोनिस्ट pmhc-I सेल सतह अभिव्यक्ति के स्तर का पता लगाने के लिए.
    3. प्रत्येक चो नमूना के लिए fwb के 1 मिलीलीटर जोड़ें, 300-400 एक्स जी, 4 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट में नीचे स्पिन, और फिर fwb के ०.३ मिलीलीटर में नमूना फिर से निलंबित । प्रवाह cytometry विश्लेषण के साथ आगे बढ़ें ।

Representative Results

अनुसूचित जाति mhc वर्ग मैं यहां इस्तेमाल प्रौद्योगिकी mhc वर्ग के सेल सतह अभिव्यक्ति के सटीक नियंत्रण की अनुमति देता है के साथ जाना जाता है, covalently जुड़े पेप्टाइड्स, टी सेल सक्रियण प्रेरित करने के लिए । हम एक इंजीनियर xenogeneic apc प्रणाली (चित्र 1a, बी, सी) है कि उपस्थिति या सह एगोनिस्ट pmhc की अनुपस्थिति में एगोनिस्ट pmhc के निम्न स्तर की प्रस्तुति की अनुमति देता है (चित्रा 1d, ई) उत्पन्न किया है । गंभीर रूप से, हम एक tcr-hla के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी की तरह इस्तेमाल किया है-a2 E183 पेप्टाइड पेश करने के लिए दिखाने के लिए कि एगोनिस्ट अनुसूचित जाति E183-hla-a2 सह द्वारा नहीं बदला है-एगोनिस्ट अनुसूचित जाति झूठ-hla-a2 (चित्रा 1e) । हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि E183-hla-a2 विशिष्ट tcr-एंटीबॉडी की तरह कुछ hla-a2 पेश गैग पेप्टाइड (चित्रा 1e) के लिए बाध्यकारी से पता चलता है । इसी तरह के इंजीनियर antigen पेश सेल सिस्टम अलग पेप्टाइड या mhc अणुओं का उपयोग कर निर्माण किया जा सकता tcr और/या coreceptor बातचीत के लिए आणविक आवश्यकताओं की जांच करने के लिए विभिन्न विशेषताओं के साथ मानव टी कोशिकाओं में.

हम इन इंजीनियर apcs इस्तेमाल के लिए एक E183-hla-A2-विशिष्ट मानव सीडी 8 + टी सेल क्लोन उत्तेजित । तीन नकारात्मक नियंत्रण का इस्तेमाल किया गया: टी कोशिकाओं को केवल, untransfected टी-रेक्स चो कोशिकाओं, और टी-रेक्स चो कोशिकाओं को सह-एगोनिस्ट एससी गैग-एचएलए-एक्सएक्सएक्स की उच्च मात्रा को व्यक्त करता है, टी-रेक्स चो कोशिकाओं पर व्यक्त किसी भी अणुओं द्वारा संभावित टी सेल सक्रियण के लिए परीक्षण करने के लिए (अनट्रांसफेक्टेड टी कोशिकाओं के रूप में केवल टी सेल की तुलना में), और टी सेल सक्रियण के लिए अनुसूचित जाति-gag-hla-a2 (टी rex चो कोशिकाओं अनुसूचित जाति के उच्च स्तर को व्यक्त-झूठ-hla-a2 के रूप में अनट्रांसफेक्टेड टी-रेक्स चो कोशिकाओं की तुलना में) । अट्रांसफेक्टेड टी-रेक्स चो कोशिकाओं या टी-रेक्स चो कोशिकाओं को व्यक्त sc-gag-hla-a2 E183 के सक्रियण प्रेरित नहीं किया-hla-a2-विशिष्ट सीडी 8 + ctl क्लोन, ifn-γ उत्पादन और विकणीकरण मार्कर की अभिव्यक्ति की बढ़ाता द्वारा निर्धारित के रूप में CD107a टी सेल के एक उपाय के रूप में cytotoxicity (चित्रा 2a, बी) । एगोनिस्ट अनुसूचित जाति E183 के उच्च स्तर की अभिव्यक्ति-hla-A2, सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया, बहुत ही कुशल ifn-γ उत्पादन और विकणीकरण प्रेरित (चित्रा 2a, बी), का प्रदर्शन है कि अनुसूचित जाति hla-A2 का निर्माण एक विशिष्ट tcr द्वारा पहचाना जा सकता है सक्रिय करने के लिए टी सेल इफेक्टर कामे. sc E183-hla-A2 के निम्न स्तर की अभिव्यक्ति ifn-γ उत्पादन और डिग्रेनलेशन के निचले स्तर को प्रेरित किया, और यह सह-एगोनिस्ट एससी गैग-एचएलए-A2 (चित्रा 2a, बी) की उपस्थिति से बढ़ाया गया था । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि CD107a + t कोशिकाओं के बहुत उच्च प्रतिशत भी प्रतिजनी pmhc के निम्न स्तर के जवाब में देखा गया (चित्रा 2b), टी सेल के प्रेरण के लिए एगोनिस्ट pmhc की राशि के लिए अपेक्षाकृत कम आवश्यकताओं की पिछली रिपोर्ट के साथ संगत cytotoxicity३३. CD107a mfi, एक एकल सेल के आधार पर विकणीकरण की राशि का संकेत, एक बेहतर गतिशील रेंज प्रदान करता है (चित्रा 2b). टी सेल सक्रियकरण परख इस्तेमाल दो प्रमुख effector कार्यों की एक साथ परिमाणन की अनुमति देता है: साइटोकाइन उत्पादन और साइटोकाइन, और अच्छा गतिशील रेंज के साथ बहुत संवेदनशील readout प्रदान करता है ।

हम परीक्षण करने के लिए एकल श्रृंखला प्रौद्योगिकी का इस्तेमाल किया कि क्या सह agonist pmhc के लिए बाध्य tcr सह agonist pmhc-निर्भर सक्रियण वृद्धि के लिए आवश्यक है । हम V152E उत्परिवर्ती बनाने के लिए ग्लूटामिक एसिड के लिए एचएलए-a2 पेप्टाइड बाइंडिंग नाली (चित्रा 3b) के किनारे पर स्थिति १५२ पर वैलिन उत्परिवर्त, के रूप में इस उत्परिवर्तन hla-a2३४करने के लिए बाध्यकारी टीसीआर समाप्त करने के लिए सूचित किया गया है. हम तो परीक्षण V152E उत्परिवर्तन E183 के लिए बाध्यकारी टीसीआर समाप्त कर सकते हैं-hla-a2 ctl क्लोन इस्तेमाल किया, एगोनिस्ट अनुसूचित जाति में इस उत्परिवर्तन शुरू करने से E183-hla-A2 और उत्परिवर्ती एगोनिस्ट अनुसूचित जाति व्यक्त टी में निर्माण-रेक्स चो कोशिकाओं. जंगली प्रकार, लेकिन V152E नहीं, अनुसूचित जाति E183-एचएलए-a2 E183-hla-a2-विशिष्ट ctl क्लोन इस्तेमाल के सक्रियण प्रेरित (चित्रा 3a) । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि mhc वर्ग पर किसी भी tcr-बाध्यकारी उत्परिवर्तन मैं अलग से प्रत्येक व्यक्ति के tcr/टी सेल क्लोन इस्तेमाल के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए, उत्परिवर्तन के प्रभाव के रूप में tcr और pmhc परिसर के बीच सटीक आणविक बातचीत पर निर्भर करेगा, और इन के बीच अलग होगा अलग टीसीआरएस । उदाहरण के लिए, हम आठ परिवर्तन का परीक्षण किया, या तो पहले की सूचना दी tcr-बंधन म्यूटेशन या परिवर्तन hla-A2 में बाध्यकारी पेप्टाइड abrogating बिना टीसीआर बाध्यकारी बाधित करने की भविष्यवाणी की । इनमें से, V152E केवल उत्परिवर्तन है कि E183 के सक्रियकरण समाप्त कर दिया था विशिष्ट टी सेल क्लोन10इस्तेमाल किया । हम तो सह एगोनिस्ट अनुसूचित जाति झूठ-hla-a2 में V152E उत्परिवर्तन शुरू की, और सह-एगोनिस्ट अनुसूचित जाति E183-एचएलए-a2 के निम्न स्तर के साथ wt या V152E sc झूठ-hla-a2 व्यक्त किया । दोनों wt और V152E sc gag-hla-A2 बढ़ी ifn-γ उत्पादन और विकणीकरण (चित्र 3c, D), सुझाव है कि tcr सह agonist pmhc के लिए बाध्यकारी सह-agonist pmhc-निर्भर सीडी 8 + T सेल सक्रियण वृद्धि के लिए आवश्यक नहीं है । एकल श्रृंखला mhc वर्ग मैं प्रौद्योगिकी, के रूप में यहां प्रस्तुत, tcr संशोधित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और/या coreceptor ज्ञात पेप्टाइड के साथ mhc वर्ग के लिए बाध्यकारी टी सेल antigen मांयता और सक्रियण के लिए आणविक आवश्यकताओं की जांच करने के लिए ।

Figure 1
चित्रा 1: एकल श्रृंखला hla-A2 मानव सीडी 8 + टी सेल सक्रियण में सह-एगोनिस्ट की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया constructs. (क) एक schla के योजनाबद्ध आरेख-A2 का निर्माण, से युक्त संकेत अनुक्रम से युक्त मानव β2 microglobulin, पसंद के पेप्टाइड, लचीला glycine-serine linker (ggggsggs ggggs), मानव β2 microglobulin, लचीला ग्लाइसिन-सेरीन लिंकर और एचएलए-ए2 हैवी चेन । (ख) plasmids के योजनाबद्ध आरेख इंजीनियर antigen प्रस्तुत करने के लिए कोशिकाओं को जांच करने के लिए मानव सीडी 8 + T सेल सक्रियण में सह-agonism उत्पंन करते थे: टेट्रासाइक्लिन repressor, एगोनिस्ट अनुसूचित जाति E183-hla-A2 टेट्रासाइक्लिन के नियंत्रण में-inducible प्रवर्तक, गैर-उत्तेजक सह-एगोनिस्ट एससी गैग-एचएलए-A2 के नियंत्रण में संवैधानिक रूप से सक्रिय प्रवर्तक । (ग) इंजीनियर antigen के योजनाबद्ध आरेख को सह-agonism की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया कोशिकाओं को पेश: टी-रेक्स चो कोशिकाओं (कोई मानव mhc अभिव्यक्ति), टी-रेक्स चो अनुसूचित जाति के संवैधानिक रूप से उच्च स्तर को व्यक्त gag-hla-A2 (गैर-उत्तेजक सह-agonist pmhc), टी-रेक्स चो "टेट्रासाइक्लिन (एगोनिस्ट पेप्टाइड के निम्न स्तर) के अभाव में अनुसूचित जाति E183-एचएलए-a2 के कम" टपका "स्तर को व्यक्त करते हुए, टी-रेक्स चो कोशिकाओं टेट्रासाइक्लिन (एगोनिस्ट पेप्टाइड के उच्च स्तर) की उपस्थिति में अनुसूचित जाति E183-एचएलए-a2 के उच्च स्तर को व्यक्त sc E183-hla-a2 और sc gag-hla-a2 के उच्च स्तर (एगोनिस्ट पेप्टाइड के निम्न स्तर और सह-एगोनिस्ट पेप्टाइड के उच्च स्तर) के निम्न स्तर को व्यक्त करना. (घ) इंजीनियर antigen की कोशिका सतह धुंधला विरोधी hla-A2 एंटीबॉडी का उपयोग कर सेल लाइनों पेश । लाइव सेल गेट में एमएचसी दाग के लिए mfi मान निरूपित संख्या दिखाया गया है । 5 स्वतंत्र प्रयोगों के डेटा प्रतिनिधि (ई) कोशिका सतह इंजीनियर antigen का उपयोग कर सेल लाइनों को पेश करने के लिए विशेष रूप से hla-A2 के खिलाफ एंटीबॉडी विशिष्ट की तरह-E183 पेप्टाइड पेश. लाइव सेल गेट में एमएचसी दाग के लिए mfi मान निरूपित संख्या दिखाया गया है । 5 स्वतंत्र प्रयोगों के डेटा प्रतिनिधि. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: सह-agonist pmhc की उपस्थिति बढ़ी साइटोकाइन उत्पादन और E183-hla-A2-विशिष्ट मानव सीडी 8 + ctl क्लोन के विकणीकरण. (A) इंट्राकोशिलर ifn-γ धुंधला hla-A2-विशिष्ट मानव सीडी 8 + ctl क्लोन के बाद 3h उत्तेजना के साथ संकेत इंजीनियर antigen प्रस्तुत कोशिकाओं । दिखाया संख्या ifn-γ धुंधला करने के लिए सकारात्मक प्रतिशत निरूपित । 3 स्वतंत्र प्रयोगों के डेटा प्रतिनिधि, प्रत्येक तकनीकी triplicates के साथ प्रदर्शन किया. (ख) सेल सतह hla-A2-विशिष्ट मानव सीडी 8 के दाग CD107a + ctl क्लोन संकेत इंजीनियर antigen कोशिकाओं को पेश करने के साथ 3h उत्तेजना के बाद । दिखाया संख्या CD107a धुंधला या सीडी 8 + टी सेल जनसंख्या के लिए CD107a mfi के लिए सकारात्मक प्रतिशत निरूपित । 3 स्वतंत्र प्रयोगों के डेटा प्रतिनिधि, प्रत्येक तकनीकी triplicates के साथ प्रदर्शन किया. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: सह-agonist-मध्यस्थता टी सेल सक्रियकरण वृद्धि सह agonist pmhc परिसर में बाध्यकारी tcr की आवश्यकता नहीं है । (क) अनुसूचित जाति E183-एचएलए-a2 में V152E उत्परिवर्तन E183-एचएलए-ए2-विशिष्ट मानव सीडी 8 + सीटीएल क्लोन के सक्रियण को abolishes । टी रेक्स चो wt या V152E उत्परिवर्ती अनुसूचित जाति E183-एचएलए-a2 के उच्च स्तर (टेट्रासाइक्लिन प्रेरण) व्यक्त करने के लिए E183-hla-a2-विशिष्ट मानव सीडी 8 + 3 एच के लिए ctl क्लोन को उत्तेजित करने के लिए इस्तेमाल किया गया । टी सेल सक्रियण इंट्रासेलर ifn-γ धुंधला का उपयोग कर मात्रा निर्धारित था । दिखाया संख्या ifn-γ धुंधला करने के लिए सकारात्मक प्रतिशत निरूपित । 3 स्वतंत्र प्रयोगों के डेटा प्रतिनिधि, प्रत्येक तकनीकी triplicates के साथ प्रदर्शन किया. (ख) एचएलए-A2 के पेप्टाइड बाइंडिंग नाली के भीतर V152E उत्परिवर्तन का स्थान. (ग) अनुसूचित जाति झूठ-hla-A2 सह-agonist pmhc परिसर पर V152E उत्परिवर्तन सह agonist-निर्भर सक्रियण वृद्धि समाप्त नहीं करता है । इंट्रासेलर ifn-γ का धुंधला hla-A2-विशिष्ट मानव सीडी 8 + ctl क्लोन के बाद 4h उत्तेजना के साथ संकेत इंजीनियर antigen प्रस्तुत कोशिकाओं । दिखाया संख्या ifn-γ धुंधला करने के लिए सकारात्मक प्रतिशत निरूपित । 3 स्वतंत्र प्रयोगों के डेटा प्रतिनिधि, प्रत्येक तकनीकी triplicates के साथ प्रदर्शन किया. (घ) अनुसूचित जाति झूठ-hla-A2 सह-agonist pmhc परिसर पर V152E उत्परिवर्तन सह agonist-निर्भर सक्रियण वृद्धि समाप्त नहीं करता है । सेल की सतह hla-A2-विशिष्ट मानव सीडी 8 + ctl क्लोन को संकेत इंजीनियर antigen के साथ कोशिकाओं को पेश करने के साथ 3h उत्तेजना के बाद CD107a धुंधला । दिखाया संख्या CD107a धुंधला या सीडी 8 + टी सेल जनसंख्या के लिए CD107a mfi के लिए सकारात्मक प्रतिशत निरूपित । 3 स्वतंत्र प्रयोगों के डेटा प्रतिनिधि, प्रत्येक तकनीकी triplicates के साथ प्रदर्शन किया. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Discussion

प्रस्तुत प्रोटोकॉल मानव सीडी 8 + T सेल सक्रियण के दौरान आणविक बातचीत की जांच के लिए एक मजबूत उपकरण प्रदान करता है । मानव टी सेल सक्रियण के दौरान सह-एगोनिज्म की जांच के लिए एक महत्वपूर्ण कदम एगोनिस्ट pmhc सेल सतह अभिव्यक्ति पर नियंत्रण के साथ या सह-एगोनिस्ट pmhc अभिव्यक्ति के बिना apcs पर बराबर एगोनिस्ट pmhc प्रस्तुति सुनिश्चित करने के लिए है । हमारे प्रयोगात्मक प्रणाली में, यह एक एकल सेल क्लोन का उपयोग करके हासिल की कम मात्रा में एगोनिस्ट pmhc, एक सह-एगोनिस्ट pmhc का निर्माण और एगोनिस्ट pmhc का उपयोग कर के साथ supertransfection द्वारा पीछा किया जाता है tcr-एंटीबॉडी की तरह10, ३२. के रूप में एगोनिस्ट sc pmhc अभिव्यक्ति समय के साथ बदल सकते हैं, यह tcr की तरह एंटीबॉडी का उपयोग कर प्रत्येक प्रयोग में इस्तेमाल किया apcs पर एगोनिस्ट pmhc सतह अभिव्यक्ति यों तो करने के लिए महत्वपूर्ण है. यदि कोई विशिष्ट tcr-एंटीबॉडी की तरह उपलब्ध है, एगोनिस्ट scmhc-मैं फ्लोरोसेंट प्रोटीन फ्यूजन के रूप में व्यक्त किया जा सकता है, और उसके सेल सतह अभिव्यक्ति तो कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के रूप में एक संवेदनशील माइक्रोस्कोपी विधि, का उपयोग कर मात्रा निर्धारित जा सकता है ३५ , ३६. इसके अलावा, सह-agonist pmhc की सेल सतह अभिव्यक्ति समय के साथ कम हो जाती है, के कारण methylation निर्भर और-स्वतंत्र cmv प्रवर्तक३७के मुंह बंद, और निगरानी की जानी चाहिए एंटीबॉडी धुंधला और प्रवाह cytometry विश्लेषण का उपयोग कर, के साथ दोहराया facs-छंटाई जब जरूरत है । हम अनुसूचित जाति pmhc अभिव्यक्ति के अपेक्षाकृत सीमित नुकसान के साथ 5 हफ्तों तक के लिए सुसंस्कृत चो कोशिकाओं है । हम अत्यधिक सुझा है चो कोशिकाओं को जल्दी ही चयन के बाद ठंड ज्ञात अनुसूचित जाति mhc अभिव्यक्ति के साथ कोशिकाओं का एक विश्वसनीय शेयर सुनिश्चित करने के लिए/

प्रस्तुत प्रोटोकॉल के कई कदम संशोधित किया जा सकता है, उपकरणों की उपलब्धता पर निर्भर करता है, या विशिष्ट अनुसंधान उद्देश्य पर निर्भर करता है । उदाहरण के लिए, pbmc प्रसार क्षमता हिचकते किया जा सकता (3.2.1 कदम) वैकल्पिक तरीकों कि एक गामा की आवश्यकता नहीं है का उपयोग कर (या एक्स-) irradiator, ऐसे मीतोमयसीं सी३८के साथ उपचार के रूप में. एक गैर enzymatic सेल वियोजन बफ़र्स धातु chelators३९ युक्त के बजाय कदम में scraping सेल 3.3.1 का इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अलावा, antigen पेश प्रणाली इसे और अधिक मानव ctl क्लोन अलग tcrs व्यक्त करने के लिए उपयुक्त बनाने के लिए संशोधित किया जा सकता है । चो कोशिकाओं हंसटर mhc वर्ग मैं अणुओं एक्सप्रेस, और यद्यपि इन ctl लाइन के लिए अप्रासंगिक है यहां का अध्ययन (चित्रा 2a और चित्रा 3a, हम कोई टी सेल प्रतिक्रियाओं को मनाया चो कोशिकाओं अनट्रांसफेक्टेड), वहां एक संभावना है कि अंय मानव tcrs कुछ xenoreactivity दिखा सकता है । उस मामले में, हैम्स्टर mhc वर्ग मैं अभिव्यक्ति हंसटर β2 दस्तक द्वारा कम किया जा सकता है-microglubulin या crispr का उपयोग कर नल/Cas9; या एक मानव apc लाइन crispr के बाद इस्तेमाल किया जा सकता/Cas9-mediated β2-microglubulin या ठोकर बाहर दस्तक ।

प्रायोगिक प्रणाली यहां प्रस्तुत tcr और mhc पूर्व परिभाषित पेप्टाइड्स पेश अणुओं के साथ सीडी 8 बातचीत के सटीक नियंत्रण की अनुमति देता है । उदाहरण के लिए, हम पहले से पता चला है कि परिवर्तन सीडी 8 बाध्यकारी coagonist pmhc को समाप्त करने के लिए coagonist-मध्यस्थता सक्रियण मुरीन और मानव सीडी 8 + T कोशिकाओं9,10में वृद्धि, जबकि tcr खत्म करने सह agonist pmhc के साथ इंटरेक्शन coagonist-मध्यस्थता सक्रियकरण10वृद्धि पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा । हालांकि, एकल श्रृंखला mhc constructs का उपयोग कई सीमाएं हैं । उदाहरण के लिए, यह समय और श्रम-उपभोक्ता इस प्रयोगात्मक प्रणाली का उपयोग कर कई सह-agonist पेप्टाइड दृश्यों का परीक्षण करने के लिए है, के रूप में यह विभिन्न पेप्टाइड्स के साथ अनुसूचित जाति mhc एंकोडिंग कई plasmids की पीढ़ी शामिल है, और बाद में transfections और सेल छँटाई. पहले, हम मूरीन नल की कमी सेल लाइन RMA-एस माउस टी सेल सक्रियकरण8,9में कई सह agonist पेप्टाइड्स परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया है, लेकिन इस दृष्टिकोण नल की कमी मानव T2 सेल लाइन10के साथ सफल नहीं था, सबसे अधिक संभावना नल की प्रस्तुति के कारण-स्वतंत्र पेप्टाइड्स४१. हमारे प्रयोगात्मक प्रणाली की एक और सीमा है कि सह-agonist pmhc टी सेल सक्रियण ट्रिगर करने के लिए आवश्यक की महत्वपूर्ण राशि का निर्धारण करने के प्रयोजन के लिए सह-agonist pmhc अणुओं की राशि में फेरबदल के लिए एक तेजी से विधि प्रदान नहीं करता है. इसके अलावा, टेट्रासाइक्लिन-प्रेरित प्रणाली का इस्तेमाल टेट्रासाइक्लिन एकाग्रता को बदलकर एकल सेल स्तर पर एगोनिस्ट pmhc मात्रा के अनुमापन की अनुमति नहीं देता है, क्योंकि अलग टेट्रासाइक्लिन एकाग्रता एचएलए-ए2 सकारात्मक कोशिकाओं के अनुपात को बदल देती है, सेल के आधार पर एचएलए-A2 के स्तर के बजाय । एक वैकल्पिक दृष्टिकोण है कि हम वर्तमान में जांच कर रहे है समर्थित लिपिड bilayers४२का उपयोग करने के लिए है, पहले से मुरीन सीडी4 + टी सेल सक्रियण के दौरान सह-agonism की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया या मोती एगोनिस्ट pmhc की निश्चित राशि पेश सह-agonist pmhc की बदलती मात्रा की उपस्थिति । जब यूवी-क्लीवेबल पेप्टाइड प्रौद्योगिकी के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया4,४३, इन वैकल्पिक प्रयोगात्मक प्रणालियों के साथ ही सह agonist pmhc के विभिन्न मात्रा में कई सह-agonist पेप्टाइड दृश्यों के तेजी से परीक्षण की अनुमति चाहिए .

अनुसूचित जाति mhc प्रौद्योगिकी भी मानव या murine सीडी 4 टी कोशिकाओं में सह-agonism की जांच करने के लिए लागू किया जा सकता है, के रूप में एकल श्रृंखला mhc वर्ग द्वितीय पेश अणुओं पूर्व निर्धारित पेप्टाइड्स सफलतापूर्वक स्तनधारी कोशिका सतहों४४पर व्यक्त किया गया है. इसके अलावा, एचएलए-ई जैसे गैर-शास्त्रीय एमएचसी अणुओं की जांच के लिए एससी एमएचसी प्रौद्योगिकी का उपयोग बढ़ाया जा सकता है । Sc hla-E से पहले वर्णित किया गया है, और इसकी अभिव्यक्ति मानव T सेल सक्रियण४५को बाधित करने के लिए दिखाया गया है । ब्याज की एक और गैर शास्त्रीय mhc अणु CD1 है, जो पेप्टाइड्स४६के बजाय लिपिड प्रस्तुत करता है । Sc ने CD1 हैवी चेन और β2-माइक्रोग्लोब्युलइन के साथ मिलकर सेल की सतह पर व्यक्त किया है और प्रासंगिक लिपिड लिगन्स४७को बाइंड करने के लिए दिखाया गया है । एकल श्रृंखला mhc प्रौद्योगिकी टी और nk सेल सक्रियण के दौरान आणविक बातचीत की जांच के लिए एक अनुसंधान उपकरण के रूप में महान क्षमता है.

Disclosures

लेखकों को कोई प्रतिस्पर्धा हितों की घोषणा ।

Acknowledgments

इस शोध को सिंगापुर के स्वास्थ्य मंत्रालय द्वारा अपने cbrg/0064/2014 के तहत n.r.j.g. को अपने R571-002-012-592 से स्पंद आयाम मॉडुलन तक, नेशनल रिसर्च फाउंडेशन अन्वेटरशिप R571-000-272-281 के तहत पी. ए. एम के द्वारा समर्थित किया गया । ., और एक सिंगापुर translational अनुसंधान द्वारा (स्टार) अन्वेषक पुरस्कार (nmrc/स्टार/013/2012) अटल बिहारी के लिए हम विशेषज्ञ सेल छंटाई के लिए NUS इम्यूनोलॉजी कार्यक्रम प्रवाह कोर सुविधा से डॉ पॉल hutchinson और श्री teo guo के लिए आभारी हैं । हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए एलिय्याह चेन के लिए आभारी हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aim-V (serum free media) Gibco 12055091
Blasticidin Gibco R21001
Cytofix/Cytoperm (fixation/permealibisation kit) BD 554714
F12 Gibco 10565-018
Fetal bovine serum (FBS) HyClone SH3007103
Geneticin Gibco 10131035
GolgiPlug (Brefeldin A) BD 555029
Human serum Sigma-Aldrich H4522
Hygromycin Gibco 10687010
Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA) Sigma-Aldrich L4144
Opti-MEM (low serum media) Bibco 31985070
10x PBS Vivantis PB0344 – 1L
Penicillin/Streptomycin HyClone SV30010
Polyethylenimine (PEI) Sigma-Aldrich 408727
Recombinant human IL2 R&D Systems 202-IL
Recombinant human IL7 R&D Systems 207-IL
Recombinant human IL15 R&D Systems 247-ILB
Tetracycline Sigma-Aldrich T7660
T-REx CHO cell line Thermo Fisher Scientific R71807
10 x Trypsin/EDTA Gibco 15400054
Antibodies
CD3 BD 347347 Clone SK7, RRID:AB_400287
CD8α BD 563795 Clone RPA-T8, RRID:AB_2722501
CD107a BD 566261 Clone H4A3, RRID:AB_2739639
HLA-A2 eBioscience 17-9876-41 Clone BB7.2, RRID:AB_11151522
IFN-γ eBioscience 12-7319-41 Clone 4S.B3, RRID:AB_1311250

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण मुद्दा १४४ एकल श्रृंखला mhc मानव टी सेल सक्रियकरण टी सेल antigen मांयता स्वयं पेप्टाइड स्थिर सेल लाइन इंजीनियर antigen प्रस्तुत कोशिकाओं pbmc अलगाव मानव टी सेल विकणीकरण परख मानव टी सेल साइटोकाइन उत्पादन
मानव सीडी 8 + T सेल सक्रियण में सह-एगोनिज्म की जांच करने के लिए एकल श्रृंखला एमएचसी प्रौद्योगिकी का उपयोग
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