Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

استخدام تكنولوجيا MHC سلسلة واحدة للتحقيق في أجونيسم Co في البشرية CD8 + تي خلية التنشيط

Published: February 28, 2019 doi: 10.3791/59126
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 3, 4, 3, 1,2,5, 6, 1, 1,2,5
1Department of Microbiology and Immunology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2Immunology Programme, Life Sciences Institute, National University of Singapore, 3Emerging Infectious Diseases Program, Duke-NUS Graduate Medical School, 4Singapore Immunology Network, A*STAR, 5NUS Graduate School for Integrative Sciences and Engineering (NGS), National University of Singapore, 6Department of Immunology, Wright-Fleming Institute, Imperial College London

Summary

ويصف هذا البروتوكول الاستخدام سلسلة واحدة MHC الفئة الأولى مجمعات للتحقيق في التفاعلات الجزيئية في تنشيط الخلية CD8 + "تي" البشرية: يبني جيل مستضد هندسيا عرض الخلايا معربا عن سلسلة واحدة، ثقافة البشرية استنساخ الخلية CD8 + T وتجارب التنشيط خلية تي.

Abstract

الببتيد النفس عدم تنشيطية مجمعات MHC (الرهن العقاري) الحث على عدم مهام التنشيط والمستجيب خلية T، ولكن يمكن تعزيز استجابات الخلية T للرهن العقاري مؤثر، من خلال عملية تسمى أجونيسم co. يصف هذا البروتوكول التجريبي نظام التحقيق co-أجونيسم أثناء تنشيط الخلية CD8 + "تي" البشرية بالتعبير عن MHC البشرية الفئة الأولى تقديم الببتيدات سلفا كجزيئات مفردة البروتينية (واحد في سلسلة MHC) في خط خلية إكسينوجينيك. وأعربنا عن سلسلة واحدة مكس تحت ظروف حيث أعرب عن المستويات المنخفضة لمؤثر واحد في سلسلة MHC ف المجمعات ومستويات عالية من مجمعات MHC ف سلسلة واحدة غير محفزة. استخدام هذا النظام التجريبي سمح لنا بمقارنة CD8 + تي خلية الردود على الرهن العقاري مؤثر في وجود أو غياب للرهن العقاري غير محفزة. وصف البروتوكول تعداء خط الخلية مع ثوابت السلسلة واحدة MHC، خطوط جيل خلية مستقرة، الثقافة الخاصة بفيروس التهاب الكبد البائي البشرية CD8 + "تي" الخلايا وتنشيط خلية T تجارب إنتاج سيتوكين في الوقت نفسه تحديد و تحبب. يمكن استخدام طرق عرض للبحوث المتعلقة بجوانب مختلفة من CD8 + تي خلية التنشيط في النظم البشرية T الخلية مع خصوصية الببتيد المعروفة MHC.

Introduction

MHC الفئة الأولى (MHC--أنا) تقديم جزيئات الببتيدات قصيرة (8-10 الأحماض الأمينية) المستمدة من البروتينات تصنيعه من كل خلية. MHC--أنا الجزيئات في خلايا صحية تقدم النفس الببتيدات المستمدة من البروتينات الذاتية. التهاب فيروسي يؤدي إلى العرض تقديمي الببتيدات المشتقة من الفيروسات غير المتمتعة بالحكم الذاتي على MHC--أنا، ولكن الخلايا المصابة حتى هذه الببتيدات غير المتمتعة بالحكم الذاتي وجود كميات كبيرة من النفس الببتيد-MHC (الرهن العقاري). MHC-هو يقرها مستقبلات خلية تي (تكر) ومستقبلات CD8 المشارك في خلايا تي. تكر تقارب ملزمة للرهن العقاري الببتيد يعتمد اعتماداً كبيرا على تسلسل الببتيدات المقدمة، حين ملزمة CD8 الببتيد المستقلة. تكر ملزمة للرهن مؤثر غير المتمتعة بالحكم الذاتي مجمع يؤدي إلى وظائف الخلية تي التنشيط والمستجيب. المجمعات الرهن الذاتي تنشيطية عدم الحث على عدم مهام التنشيط والمستجيب خلية T، ولكن يمكن تعزيز استجابات الخلية T للرهن العقاري مؤثر، من خلال عملية تسمى شركة أجونيسم1،،من23. وقد لوحظ أجونيسم Co في الماوس CD4 + "تي" الخلايا4،،من56 فضلا عن الماوس والبشرية CD8 + "تي" الخلايا7،،من89،10، 11 , 12 , 13-تحت الظروف الفسيولوجية، خلايا تي بحاجة إلى الاعتراف بكميات محدودة للرهن العقاري مؤثر على مستضد تقديم الخلايا (Apc) شارك تقديم مستويات عالية من مجمعات الرهن غير محفزة، اقتراح يسهم ذلك co-أجونيسم تي الأمثل الخلية الحية في الردود. خلية الإجمالي سطح الطبقة MHC أنا المستويات كثيرا ما دوونريجولاتيد خلال14 من الالتهابات الفيروسية والأورام15. هذه الاستراتيجية محصنة ضد التهرب من إنقاص عرض الرهن العقاري مؤثر، ولكن أيضا يقلل من مقدار الرهن مؤثر المشارك أنا متاحة لتعزيز تنشيط خلية تي. وعلاوة على ذلك، الفئة الأولى خلية ارتفاع مستويات التعبير السطحي MHC جزيء ج هلا قد ثبت أن ترتبط مع تحسين فيروس نقص المناعة البشرية مراقبة16، مما يوحي دور حاسم لمجموع MHC class التعبير في تنشيط خلية تي. وعلى الرغم من أهمية فسيولوجية co-أجونيسم، لا يزال غير كامل المفهوم آليتها الجزيئية. هذا إلى حد كبير بسبب التحديات التقنية تجريبيا مراقبة مقدار الرهن مؤثر المشارك قدم مع إبقاء مؤثر ثابت الرهن العقاري.

قمنا بتطوير تجريبي نظام التحقيق co-أجونيسم أثناء تنشيط الخلية CD8 + "تي" البشرية بالتعبير عن MHC البشرية الفئة الأولى جزيئات تقديم الببتيد سلفا ببتيد واحد (واحد سلسلة MHC-الأول، الشكل 1A) في خلية إكسينوجينيك خط9،10. وأعرب الرهن مؤثر واحد في سلسلة (sc) تحت سيطرة المروج التتراسيكلين إيندوسيبلي في خط الخلية تشو تي ركس المستمدة من الهامستر الإعراب عن التتراسكلين قامع؛ يسمح هذا التعبير "راشح" منخفضة جداً لاتفاقية استكهولم مؤثر الرهن العقاري في غياب التتراسيكلين واتفاقية استكهولم ارتفاع مؤثر الرهن التعبير بعد إضافة التتراسيكلين (الشكل 1، ج). وكانت الزنزانات تشو تي ركس sc مؤثر معربا عن الرهن العقاري ثم سوبيرترانسفيكتيد مع مؤثر المشارك غير محفزة، اتفاقية استكهولم الرهن-الأول تحت سيطرة أحد المروجين مؤثرا النشطة (الشكل 1، ج). استخدام هذا النظام التجريبي سمح لنا بمقارنة CD8 + تي خلية الردود على الرهن العقاري مؤثر في وجود أو عدم وجود مستويات عالية للرهن العقاري غير محفزة. حاسمة، منذ الببتيد و MHC-أنا سلسلة ثقيلة ترتبط تساهميا في سكمهك-أنا تنسيق، وهذا يسمح مقدمات للطفرات إلى جزيئات MHC عرض الببتيدات سلفا. استخدام سمك--أنا التكنولوجيا مما أتاح لنا أن تعدل خصائص تكر أو CD8-ملزم للرهن العقاري مؤثر أو مؤثر المشارك على وجه التحديد.

Co-أجونيسم في تنشيط الخلية CD8 + T وقد لوحظ استخدام MHC المنقي-أنا مجمعات عرض مؤثر ومؤثر المشارك الببتيدات في شكل هيتيروديميرس11،17 أو عرضها على الكم ونقاط12،13. العمل في وقت مبكر في co-أجونيسم في تنشيط الخلية CD8 + "تي" في السياق الاعتراف بالرهن العقاري مؤثر في آسيا والمحيط الهادئ كخطوط الخلايا التي تفتقر إلى TAP2 ناقلات الجنود المدرعة. الصنبور مطلوب للنقل الببتيد من السيتوبلازم إلى هيولى، ونقص الاستفادة من شدة يقلل تجمع الطبقة MHC المتاحة-ربط الببتيدات. نظراً لغياب الببتيدات، مجمع الوليدة MHC الفئة الأولى سلسلة ثقيلة وبيتا2-ميكروجلوبولين غير مستقر، أسفر عن MHC منخفضة جداً--أنا خلية التعبير السطحي. في البداية، مقارنة بين خلايا تي حفزت مع مستضد محملة على الاستفادة الكافية والماوس ناقص الجيش الملكي المغربي والجيش الملكي المغربي-S خطوط الخلايا، على التوالي، كناقلات الجنود المدرعة، لم تكشف عن أي أدلة لشركة أجونيسم خلال الماوس تنشيط خلية T18. ومع ذلك، لم يسمح استخدام هذا النظام التجريبي دقة السيطرة على مقدار الرهن مؤثر قدم مستقلة عن الرهن الذاتي غير محفزة. وعلاوة على ذلك، قد تختلف هذه الخطوط الخلية اثنين أيضا في التعبير عن الجزيئات الأخرى التي تعدل تنشيط خلية T، مثل يغاندس لمستقبلات خلية تي كوستيمولاتوري أو المثبطة، أو جزيئات الالتصاق.

وفي وقت لاحق، علينا وضع بروتوكول لتحميل خلايا تفتقر إلى TAP2 الجيش الملكي المغربي-S مع الببتيدات خارجية للسماح بعرض مبلغ ثابت للرهن العقاري مؤثر في وجود أو غياب للرهن العقاري غير محفزة. وقد تحقق ذلك من خلال ما يلي: الحضانة للجيش الملكي المغربي التي تفتقر إلى TAP2-S الخلايا عند درجات حرارة منخفضة (28 درجة مئوية، بدلاً من المعتاد 37 درجة مئوية) لتحقيق استقرار MHC فارغة الفئة الأولى سلسلة ثقيلة/β2 microglobulin مجمعات19؛ الحضانة عند 28 درجة مئوية مع الببتيد مؤثر خارجية؛ الحضانة عند 28 درجة مئوية في وجود أو عدم وجود الببتيد غير محفزة خارجية؛ والحضانة عند 37 درجة مئوية للحد من الخلايا السطحية التعبير عن MHC فارغة الفئة الأولى المجمعات8،9. استخدام هذا الإعداد التجريبية كشفت أن تعزيز الوجود للرهن العقاري غير محفزة التنشيط الماوس الثيموسيه والسذاجة الطرفية CD8 + "تي" الخلايا CTLs8. ميتشانيستيكالي، يمكن أن تحفز وجود الرهن غير محفزة CD8 التجنيد الخلية: APC تي المشبك محصنة حتى في الغياب للرهن العقاري مؤثر، والرهن غير محفزة ويمكن تعزيز التفاعل تكر مع CD8 التمييز7،8. ومع ذلك، لا يسمح هذا النظام التجريبي اختبار المساهمة النسبية لربط التمييز تكر و CD8 للرهن العقاري مؤثر ومؤثر المشارك في التوسط في تعزيز التنشيط، كالتعديلات أي تغيير الربط تكر أو CD8 للطبقة MHC أود أن تؤثر على جميع جزيئات MHC، بغض النظر عن عرض الببتيد. ولذلك استخدمنا الطبقة MHC أخص بسلسلة التكنولوجيا للتغلب على هذه المشكلة.

وقد استخدمت الطبقة MHC سلسلة واحدة (sc) تنسيق أنا قبل لتحسين عرض الرهن مولده للاستراتيجيات العلاجية، وللإجابة على أسئلة أساسية على آليات لتفعيل مستقبلات الخلية تكر وناغورني-كاراباخ وتعمل20،21 . سمك-الأول يتألف من الببتيد، β2-ميكروجلوبولين و MHC--أنا سلسلة ثقيلة وانضم اثنان linkers سيرين/جليكاين-الأغنياء مرنة (الشكل 1A)، كانت عدة تسلسلات مختلفة رابط طورت واختبرت22. سمك--يمكن أن أمثال مستقل عن برنامج المشورة التقنية المعقدة والبروتينات اللازمة للرهن العقاري التقليدية المعقدة الجمعية20لكوصي. سكمهك-وقد أظهرت أن يطوي بشكل صحيح، كما تحدد باستخدام الأجسام المضادة الخاصة بتكيف تلطيخ22 وحل هيكل اتفاقية استكهولم مع23من البلورات بالأشعة السينية. سمك الأساسية--أنا تم تعديل التصميم لتحسين الربط تقارب منخفضة الببتيدات24،25.

يصف هذا البروتوكول استخدام سمك البشرية-الأول للتحقيق أجونيسم co أثناء CTL البشرية استنساخ التنشيط. تم تحسين البروتوكول لاستنساخ البشر CTL محددة حانمه فيروس التهاب الكبد B (HBV). HBV عبء الرعاية الصحية شديدة في جميع أنحاء العالم، كما أن هناك 350 مليون شخص مصاب بالتهاب وعدوى التهاب مزمنة يمكن أن تؤدي إلى تطوير سرطانه الخلية الكبدية (HCC). يمكن أن يقدم عادة [ابيتوبس] HBV-مشتقة الخلايا العقود الناجمة عن الإصابة بالتهاب ويمكن التعرف عليه بالخلايا التائية البشرية محددة. إزالة HBV والعقود يعتمد على ردود الخلية T البشرية26، لكن العقود المرضى الذين غالباً ما يعانون من استنفاد الخلايا T وانخفاض تي خلية الردود27. إدخال تكر HBV-خاصة في خلايا تي من HBV قد حوكم كاستراتيجية العلاج المناعي محتملة للقضاء على الإصابة بالتهاب مزمن28. بيد أنه غير معروف إذا كان هذا الأسلوب سوف تكون فعالة في إعداد سريرية، بسبب انخفاض مستويات MHC السطحية--أنا في خلايا الكبد البشري29. ولذلك، فهم إليه كواجونيسم قد توفر منظورات بديلة للعلاج المناعي HBV، ربما عن طريق تعزيز العرض التقديمي للرهن العقاري الذاتية للحث على ردود الخلية T co-أجونيسم-بوساطة. البروتوكول يغطي جميع الخطوات اللازمة للبحوث على البشرية co-أجونيسم: تعداء الخلايا تشو تي ركس مع الرهن العقاري اتفاقية استكهولم مؤثر ومؤثر المشارك، جيل خطوط الخلايا تشو تي ركس مستقرة، وثقافة محددة HBV البشرية CTL CD8 + "تي" خلية خط والتنشيط CTL تجارب قياس إنتاج سيتوكين وتحبب استجابة لخلايا تي ركس تشو. على الرغم من أن نركز على استخدام sc MHC الفئة الأولى تكنولوجيا للتحقيق أجونيسم co أثناء تنشيط خلية HBV T، وتجدر الإشارة إلى أن أساليب عرض يمكن تكييفها للبحوث المتعلقة بالجوانب الأخرى لتنشيط الخلية T بسهولة في النظم البشرية T الخلية مع الرهن العقاري معروفة--أنا خصوصية.

هذا البروتوكول يستخدم الإنسان CD8 + CTL خط محدد المستمدة من HBV الببتيد E183-91 (فلتريلتي: "E183")30 قدم على هلا-A2. اتفاقية استكهولم هلا جزيئات تتكون من تسلسل إشارة من البشر β2-microglobulin، ببتيد ملزم هلا-A2 الاهتمام ورابط جليكاين/سيرين، β2-ميكروجلوبولين بشرية، ورابط جليكاين/سيرين و A2 من السلسلة الثقيلة يمكن أن يكون تجارياً تصنيعه (الشكل 1A ). والبلازميدات ترميز ثوابت scA2 مع الببتيد E183 مؤثر، أو "فيروس نقص المناعة البشرية" (سلينتفاتل) اسكت كواجونيست31 الببتيدات متوفرة من المؤلفين عند الطلب. يمكن تغيير تسلسل الببتيد باستخدام الطفرات الموجهة على الموقع. ناقل التتراسيكلين إيندوسيبلي pcDNA5/استخدم للتعبير عن سلسلة واحدة مؤثر هلا-A2 مع E183 الببتيد (sc E183-هلا-A2). حضور قامع التتراسكلين، pcDNA5 وإلى بلازميد يتيح التعبير فقط منخفضة جداً، "راشح" من بروتين الاهتمام؛ يمكن أن يتسبب التعبير عالية بإضافة التتراسيكلين (الشكل 1، ج). يسمح استخدام نظام التعبير التتراسيكلين إيندوسيبلي للسيطرة على مقدار خلية مؤثر سطحي الرهن التعبير. PcDNA3.1 تأسيسي تعبير بلازميد استخدمت للتعبير عن scA2 كواجونيست مع هفوة الببتيد (sc هفوة-هلا-A2). التعبير ينظم التتراسيكلين تشو (تي ركس) الخلية خط (خط الخلية الهامستر، لا MHC البشرية الذاتية) استخدمت للتعبير عن نيات sc-هلا-A2 مؤثر ومؤثر المشارك. ويسمح هذا النظام التجريبي تحكماً دقيقا في تقديم الرهن العقاري (الشكل 1): لا تقديم الرهن العقاري (أونترانسفيكتيد تي ريكس)، وعلى كمية عالية من تقديم الرهن العقاري مؤثر المشارك (sc التأسيسي التعبير هفوة-هلا-A2)، مبلغاً ضئيلا للرهن العقاري مؤثر العرض التقديمي (sc E183-هلا-A2 في الغياب من التتراسيكلين)، وعلى كمية عالية من مؤثر الرهن العرض التقديمي (sc E183-هلا-A2 حضور التتراسيكلين)، كمية منخفضة من تقديم الرهن العقاري مؤثر والتعبير عالية للرهن العقاري مؤثر المشارك (sc E183-هلا-A2 في نظراً لغياب التتراسيكلين، واتفاقية استكهولم التأسيسي التعبير هفوة-هلا-A2). يتيح استخدام هذا النظام التجريبي مراقبة دقيقة لمبالغ الخلية السطحية مؤثر والرهن كواجونيست.

Protocol

ملاحظة: جميع الخطوات التي ينبغي أن يجري استخدام الخلايا الحية، وغير ثابت في غطاء السلامة الأحيائية، ويجب أن يتم تجاهل أي نفايات اوتوكلاف وفقا للوائح الصحة والسلامة المحلية.

1-تشو خلية تعداء وجيل من خطوط الخلايا شو مستقرة

  1. شو خلية تعداء
    ملاحظة:     هذا المقطع يصف شو تعداء الخلايا باستخدام بولييثيلينيميني (جزيرة الأمير إدوارد). ومع ذلك، يمكن استخدامها أساليب بديلة، كخلايا شو سهلة نسبيا ترانسفيكت باستخدام الكواشف تعداء الدهن المتاحة تجارياً.
    1. ثقافة تشو الخلايا F12 كاملة (cF12، F12 تستكمل مع 5% FBS والبنسلين يو/مليلتر 100، 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين وبلاستيسيدين 10 ميكروغرام/مل للحفاظ على التعبير عن قامع التتراسيكلين). مرور الخلايا كل 3-4 أيام في 01:10 نسبة.
    2. يوم واحد قبل تعداء، إعداد تعليق خلية تشو. شو يغسل خلايا في قارورة استخدام برنامج تلفزيوني (10 مل لبرنامج تلفزيوني لقارورة T75، 5 مل برنامج تلفزيوني لقارورة T25). إضافة 0.05% يدتا Trypsin/0.02% في برنامج تلفزيوني (2 مل لقارورة T75، 1 مل لقارورة T25) لقارورة واحتضان لمدة 5-10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). استخدام مجهر ضوء، تحقق فصل الخلايا، ووقف تريبسينيزيشن بإضافة cF12 إلى قارورة (8 مل لقارورة T75، 4 مل لقارورة T25).
    3. نقل تعليق خلية شو إلى أنبوب 15 مل، وأجهزة الطرد المركزي في 300-400 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية أو إزالة الرايت المادة طافية، وإعادة تعليق في cF12 (10 مل لقارورة T75، 5 مل لقارورة T25) والاعتماد هيموسيتوميتير باستخدام.
    4. ضبط تركيز الخلية إلى 60,000-100,000 شو خلايا/مل. إضافة 5 مل تعليق خلية شو (الخلايا شو 300,000-500,000) لكل بئر في صفيحة جيدا 6. تبني بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2.
    5. اليوم من تعداء، إضافة ميكروليتر 400 خالية من المصل وسائل الإعلام F12 أو وسائط المصل منخفضة إلى أنبوب 1.5 مل. إضافة 3 ميكروغرام من بلازميد إلى 400 ميكروليتر من وسائل الإعلام. مزيج من بيبيتينج. إضافة 6 ميكروغرام من بي (ميكروليتر 6 من الحل 1 ملغ/مل بي) إلى مزيج وسائل الإعلام/الحمض النووي، ودوامه فورا على 10 s.
    6. احتضان ميكس وسائل الإعلام/الحمض النووي/برينس في RT لمدة 10-15 دقيقة. خلال هذه الحضانة، يحل محل تشو خلية الإعلام في لوحة جيدا 6 مع 5 مل من وسائل الإعلام cF12 جديدة.
    7. إضافة حل الوسائط/الحمض النووي/برينس إلى خلايا تشو. إضافة الحل dropwise وبالتساوي على البئر. تبني بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2.
  2. جيل خطوط الخلايا شو مستقرة
    1. يوم واحد بعد تعداء، قم بإزالة الوسائط من الآبار، وإضافة 5 مل cF12 التي تحتوي على المضادات الحيوية الاختيار المناسب لكل بئر. استخدام هيجروميسين 0.3 ملغ/مل والبلازميدات المستندة إلى pcDNA5TO، وجينيتيسين 1 ملغ/مل والبلازميدات المستندة إلى pcDNA3.
    2. إذا كان نطاق الخلايا على أكثر من 90% كونفلوينسي في ح 24 وظيفة تعداء، تريبسينيزي الخلايا.
    3. غسل الآبار مع 1 مل من برنامج تلفزيوني في البئر، إضافة 1 مل trypsin/0.02% 0.05% أدتا في برنامج تلفزيوني واحتضانها لمدة 5-10 دقيقة في استخدام الرايت مجهر ضوء، والتحقق من فصل الخلايا، ووقف تريبسينيزيشن بإضافة 3-4 مل cF12 كل بئر.
    4. نقل تعليق خلية شو إلى أنبوب 15 مل، وأجهزة الطرد المركزي في 300-400 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية أو إزالة الرايت المادة طافية وإعادة تعليق في 10 مل cF12. إضافة 5 مل تعليق الخلية الواحدة وكذلك في لوحة جيدا 6. استخدام بئرين لتعظيم عائد الخلايا ترانسفيكتيد.
    5. احتضان 6 لوحات جيدا في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2. رصد موت الخلايا ونمو المستعمرات مقاومة استخدام مجهر ضوء. قم بإزالة الوسائط واستبدالها بالطازجة الوسائط التي تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة بعد 4-5 أيام، أو عندما يلاحظ موت الخلية كبيرة.
    6. بمجرد الوصول إلى خلايا مقاومة لأكثر من 70% التقاء، تريبسينيزي الخلايا كما هو موضح في الخطوة 1.2.2 ونقل إلى قارورة T25 للتوسع. اختيار المضادات الحيوية يأخذ 1-2 أسابيع.
    7. حالما تصل الخلايا شو المقاومة للمضادات الحيوية في قارورة T25 إلى التقاء 70-80%، أداء تلطيخ جسم للتحقق من الخلية التعبير السطحي من بنيات للفائدة. يوم واحد قبل تلطيخ جسم، تريبسينيزي الخلايا كما هو موضح في الخطوة 1.2.2 وضبط تركيز خلية إلى خلايا/مل 200,000، وإضافة 1 مل تعليق خلية إلى 12 لوحة جيدا. لاختبار نيات التتراسيكلين إيندوسيبلي، إضافة 50-60 نانوغرام/مليلتر من التتراسيكلين. تبني بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2.
    8. استخدام مكشطة خلية لفصل الخلايا تشو من قاع البئر. هذا الأسلوب الأفضل تريبسينيزيشن، كما أنه يقلل من خطر الإصابة بضرر حانمه نتيجة proteolytic الانقسام.
    9. نقل 1 مل الوسائط التي تحتوي على الخلايا تشو إلى أنبوب نظام مراقبة الأصول الميدانية. زيادة ونقصان لأسفل في 300-400 x ز، 4 درجة مئوية عن 5 دقيقة إعادة تعليق في 100 ميكروليتر من الأجسام المضادة-هلا المخفف في FWB. احتضان 30 دقيقة في 4 درجات مئوية على الجليد. أداء هذا تلطيخ مع الأجسام المضادة-A2 للكشف عن مجموع مستويات التعبير السطحي في الخلية A2، وتكر-مثل الأجسام المضادة المحددة ل A2 في المجمع مع الببتيد E183 للكشف عن الرهن مؤثر-أنا خلية مستويات التعبير السطحي.
    10. بعد التحقق من التعبير MHC، ونظام مراقبة الأصول الميدانية-فرز الخلايا الإيجابية، والحفاظ على خلايا تم فرزها في وسائل الإعلام مع المضادات الحيوية الحد من الخسائر في التحوير. للخلايا تشو معربا عن الرهن مؤثر، الفرز خلية مفردة يوصي، لضمان التعبير الرهن العقاري مع أو بدون سوبيرترانسفيكشن مع الرهن مؤثر المشارك مؤثر قابلة للمقارنة. 2-3 أسابيع مطلوبة من أجل نمو الخلايا شو بعد الفرز خلية مفردة.

2. الثقافة CTL HBV الخاصة

  1. إعداد ببمكس كمغذيات محددة HBV البشرية CTL إعادة تنشيط
    ملاحظة:     لاستنساخ CTL A2 E183-الخاصة، إعادة تنشيط مع ببمكس طازجة معزولة، بدلاً من ببمكس المذابة، يعطي أفضل النتائج.
    تنبيه: الحصول على جميع الموافقات اللازمة الأخلاقية قبل تجنيد المتطوعين للتبرع بالدم. غرض هذا العمل، جمعت ببمك من المتطوعين صحية في إطار البروتوكول الذي وافق عليه "الاتحاد الدولي للرجبى جامعة سنغافورة الوطنية". تم الحصول على موافقة مستنيرة من جميع الجهات المانحة. تتبع جميع الاحتياطات اللازمة عند التعامل مع الدم البشري للحد من خطر انتقال الأمراض المنقولة بالدم.
    1. قبل البدء، ضبط درجة حرارة الطرد المركزي في 19-20 درجة مئوية والحارة قبل التدرج الكثافة (مثلاً، فيكل) الرايت
    2. إضافة 15 مل من درجة حرارة الغرفة الكثافة المتدرجة إلى أنبوب 50 مل. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ز لمدة 5 دقائق في 19-20 درجة مئوية. وهذا لضمان وجود لا التدرج الكثافة على جانب الأنبوب.
    3. جمع 20 مل دم من جهة مانحة متطوعين صحية من خلال فينيبونكتوري. إضافة 15 مل من برنامج تلفزيوني إلى 20 مل دم في أنبوب 50 مل. مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
    4. ببطء، إضافة 35 مل الدم المخفف في برنامج تلفزيوني على رأس 15 مل من الكثافة المتدرجة من الخطوة 2.1.2. تأكد من أن لا تخلط الدم والتدرج الكثافة. الطرد المركزي هذه الأنابيب في 19 درجة مئوية، 1,200 س ز لمدة 20 دقيقة مع الفرامل قبالة.
    5. قم بإزالة حوالي 70% طبقة البلازما. نضح بعناية على الطبقة التي تحتوي على ببمك (غائم طبقة فوق طبقة التدرج في كثافة واضحة) استخدام باستور "الماصة؛" ووضعه في أنبوب 50 مل جديدة.
    6. إضافة برنامج تلفزيوني إلى ببمكس للحصول على إجمالي حجم 50 مل. الطرد المركزي أنبوب عند 4 درجة مئوية، 300-400 x ز للحد الأدنى 10 بعناية إزالة المادة طافية باستخدام الشافطة فراغ وزجاج معقمة ماصة باستور، أو عن طريق الصب.
    7. إعادة تعليق الخلايا في 50 مل من برنامج تلفزيوني. الطرد المركزي أنبوب عند 4 درجة مئوية، 300 x ز للحد الأدنى 10 بعناية إزالة المادة طافية باستخدام الشافطة فراغ وزجاج معقمة ماصة باستور، أو عن طريق الصب.
    8. إعادة تعليق الخلايا في 2 مل من الخلية تي البشرية الكامل وسائط الإعلام (مصل الوسائط الحرة التي تستكمل بالمصل البشري 2%). عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير. يعطي هذا البروتوكول في المتوسط 1-2 × 106 ببمكس كل 1 مل دم المستخدمة.
  2. CTL تحفيز إعادة استخدام ببمكس كتغذية الخلايا
    1. تشعيع ببمكس في 30 غراي تمنع انتشار استجابة للتحفيز اللاحقة.
      تنبيه: ضمان التدريب الكافي والامتثال للمختبر متطلبات السلامة عند استخدام في إيرادياتور.
    2. إعادة تعليق ببمكس المشع في وسائل الإعلام الخلية تي البشرية الكامل في 2 × 106 خلايا/مل. إضافة السيتوكينات ويكتين من الشائع فاصولياء (فا) لتحفيز CTL إعادة تركيز x 2 في تعليق ببمك. سيتوكين النهائي وتركيزات فا: 20 يو/مليلتر الماشوب البشري إيل-2، 10 نانوغرام/مل المؤتلف إيل-7، 10 نانوغرام/مل الماشوب البشري إيل-15 و 1.5 ملغ/مل فا.
    3. ذوبان الجليد القنينة CTL المجمدة في حمام مائي 37 درجة مئوية. نقل الخلايا المذابة في أنبوب 15 مل مع 10 مل من الخلية تي البشرية الكامل وسائط الإعلام. تدور إلى أسفل في 300-400 x ز عند 4 درجة مئوية للحد الأدنى 5 بعناية إزالة المادة طافية باستخدام الشافطة فراغ وزجاج معقمة ماصة باستور، أو عن طريق الصب.
    4. إعادة تعليق CTLs في 2 مل من الخلية تي البشرية الكامل وسائط الإعلام. عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير. إضافة وسائط الخلايا تي البشرية كاملة للحصول على تركيز خلية 106 خلايا/مل.
    5. في 24 لوحة جيدا، بإضافة 0.5 مل ببمكس المشع (106 خلايا) مع 2 x cytokines وفا (الخطوة 2.2.2)، و 0.5 مل من CTLs (0.5 × 106 خلايا) في البئر. يعتمد عدد الآبار المستخدمة في العدد الإجمالي ل CTLs أو ببمكس متاح. تبني على 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2.
    6. بعد 4-5 أيام، عندما الانفجارات CTL مرئية ووسائل الإعلام يصبح أصفر، نقل الثقافات في 6 لوحات جيدا، واستكمال وحدة التخزين الأولية 1 مل مع 4 مل الإعلام الخلية تي البشرية الكامل مع 20 يو/مليلتر إيل-2، 10 نانوغرام/مل 7 إيل و 10 نانوغرام/مل إيل-15 (لا فا).
    7. بعد 2-3 أيام، نقل الثقافات في قارورة T75 وإضافة 40 مل الإعلام الخلية تي البشرية الكامل مع السيتوكينات (الخطوة 2.2.2، لا فا) والثقافة في وضع رأسي.
    8. الحفاظ على CTLs بتركيز 1-2 × 106 خلايا/مل بإضافة وسائط جديدة تستكمل مع السيتوكينات (الخطوة 2.2.2، لا فا) في وحدة تخزين مساوية لحجم الثقافة الموجودة في كل يوم. CTLs يمكن استخدامها لإجراء التجارب على 7-14 يوما بعد إعادة تنشيط.

3. تجارب التنشيط T الخلية

ملاحظة: تجربة نموذجية يتطلب عدة خطوط تي-ريكستشو مختلفة: تشو تي ريكس أونترانسفيكتيد الخلايا (المراقبة السلبية)، شو تي ركس الخلايا إذ تعرب عن الرهن غير تنشيطية فقط (scA2-هفوة؛ المراقبة السلبية)، شو تي ركس الخلايا وإذ تعرب عن كميات منخفضة للرهن العقاري مؤثر-أنا ( scA2 الحياة الفطرية دون التتراسيكلين، عينة تجريبية)، تشو تي ركس الخلايا معربا عن كميات قليلة من الرهن مؤثر وكميات عالية للرهن العقاري مؤثر المشارك غير محفزة (scA2-الحياة الفطرية و scA2-اسكت، دون التتراسيكلين، العينة التجريبية)، والخلايا تشو تي ركس التعبير عن كميات عالية للرهن العقاري مؤثر-أنا الحياة الفطرية scA2 مع التتراسيكلين، مراقبة إيجابية)، كما هو موضح في الشكل 1، د.

  1. تصفيح شو الخلايا كخلايا مستضد تقديم
    1. ثقافة تشو الخلايا في قارورة T75، كما هو موضح في الخطوة 1.1.1. استخدام الخلايا في التقاء 70-90% للحصول على أفضل النتائج. تجربة يوم واحد قبل تنشيط خلية T، تريبسينيزي الخلايا كما هو موضح في القسم 1.1.2. وبعد تريبسينيزيشن، نقل تعليق خلية في أنبوب 15 مل، أجهزة الطرد المركزي في 400 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية أو RT، إزالة المادة طافية بيبيتينج أو الصب.
    2. إعادة تعليق بيليه الخلية في 5 مل cF12. شو عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير.
    3. ضبط تركيز الخلية إلى 2 × 105/mL باستخدام cF12. إضافة 50-60 نانوغرام/مليلتر من التتراسيكلين لمؤثر عينات فقط للحث على كميات عالية للرهن العقاري مؤثر-أنا التعبير كمراقبة إيجابية (الشكل 1). سوف تستقر الخلايا في أنابيب 15 مل، حتى تأكد شو مزجها بيبيتينج أو فورتيكسينج قبل الطلاء.
    4. لخلية تي التنشيط المقايسة، إضافة 100 ميكروليتر من تعليق شو الخلية الواحدة وكذلك إلى 96 يو-أسفل اللوحة جيدا، واستخدم تريبليكاتيس كل خط الخلية تشو. شو خلية مكافحة MHC تلطيخ، إضافة 1 مل تعليق خلية إلى 12 لوحة جيدا، واستخدم تريبليكاتيس كل خط الخلية. تبني بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2.
  2. تي خلية تنشيط الإنزيم
    ملاحظة:     هذا الإنزيم تنشيط خلية T يسمح الكمي المتزامن تحبب الخلية T (تلطيخ CD107a، مقياسا للخلية T سيتوتوكسيسيتي) وإنتاج سيتوكين.
    1. قبل التجربة، اليوم الطرد المركزي خلايا CTLs في 400 x g عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق والعد باستخدام هيموسيتوميتير وتعليق إعادة الخلايا في 106 خلايا/مل في وسائل الإعلام الخلية تي البشرية الكامل دون السيتوكينات أو فا. تبني على 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2. والغرض من هذه الخطوة بقية الحد من حساسية CTL، كما لاحظنا تفعيل أقصى استجابة لكميات قليلة من مستضد دون هذه الخطوة.
    2. في يوم التجربة، خلايا T للطرد المركزي في 400 x ز عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، إزالة المادة طافية بالصب أو بيبيتينج، وإعادة تعليق الخلايا الموجودة في الوسائط 2 مل كاملة خالية من المصل (بدون السيتوكينات أو فا). عد الخلايا تي حية باستخدام هيموسيتوميتير، وضبط تركيز خلية T إلى 106 يعيش خلايا/مل باستخدام وسائط الخلايا تي البشرية الكامل (دون السيتوكينات أو فا).
    3. إضافة جسم الإنسان لمكافحة CD107a في إضعاف 1: 100 (تركيز النهائي 2.5 ميكروغرام/مل)، وإضافة بريفالدين A في إضعاف 1: 1000 (تركيز النهائي 1 ميكروغرام/مل).
    4. قم بإزالة الوسائط من الخلايا تشو في لوحة جيدا 96 يسفط مع الزجاج ماصة باستور أو التحريك في اللوحة. كل بئر، إضافة 200 ميكروليتر خلية T تعليق (0.2 × 106 خلايا) التي تحتوي على مكافحة CD107a وبريفالدين أ ثقافة المشارك "تي" الخلايا مع خلايا شو ح 3-4.
    5. في نهاية ثقافة المشارك، أداء تلطيخ مستضد السطح خلية تي. تدور أسفل اللوحة جيدا في 300-400 x ز96، 5 دقيقة في 4 درجات مئوية، وإزالة المادة طافية يسفط أو التحريك. إضافة 2.5 ميكروليتر من CD3 وميكروليتر 2.5 CD8 الأجسام المضادة في 50 ميكروليتر من جيش صرب البوسنة 0.5% في برنامج تلفزيوني (تدفق المياه والصرف الصحي المخزن المؤقت، FWB) كل جيدا لتلطيخ مستضد سطح الخلية. احتضان العينات في الثلج لمدة 30 دقيقة في الظلام.
    6. تغسل العينات بإضافة 150 ميكروليتر من FWB كل بئر. تدور أسفل اللوحة جيدا في 300-400 x ز96، 5 دقيقة في 4 درجات مئوية، وإزالة المادة طافية يسفط أو التحريك.
    7. تنفيذ خطوات التثبيت/بيرميبيليزيشن باستخدام مجموعة أدوات تثبيت/بيرميبيليزيشن. إضافة 100 ميليلتر من حل التثبيت/بيرميبيليزيشن (من أدوات التثبيت/بيرميبيليزيشن) كل بئر، ومزيج من بيبيتينج. تبني على الجليد لمدة 20 دقيقة.
    8. الطرد المركزي في 300-400 x ز و 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وإزالة المادة طافية يسفط أو التحريك. إضافة 200 ميكروليتر 1 × بيرم/يغسل المخزن المؤقت (تمييع 10 × بيرم/يغسل العازلة الأسهم من قبل مجموعة أدوات لاستخدام) كل بئر. كرر هذه الخطوة.
    9. إعادة تعليق بيليه الخلية في 50 ميكروليتر من 1 x بيرم/يغسل العازلة التي تحتوي على الأجسام المضادة-IFN-γ في 0.3 ميكروغرام/مل. تبني على الجليد لمدة 30 دقيقة في الظلام.
    10. إضافة ميكروليتر 150 1 x بيرم/يغسل المخزن المؤقت. الطرد المركزي في 300-400 x ز لعند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وإزالة المادة طافية يسفط أو التحريك. إضافة 200 ميكروليتر 1 × بيرم/يغسل العازلة، الطرد المركزي 300-400 x ز لعند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وإزالة المادة طافية يسفط أو التحريك.
    11. إعادة تعليق كل عينة في 200 ميكروليتر من FWB. المضي قدما في تحليل تدفق سيتوميتريك.
  3. شو خلية MHC الفئة الأولى تلطيخ
    ملاحظة:     من الأهمية بمكان للتحقق من سمك--أنا خلية المستويات السطحية في الخلايا المستخدمة في كل تجربة، كما قد تفقد خطوط الخلايا التعبير التحوير. عند إعداد لوحة جيدا 96 لتحفيز خلايا تي، إعداد 12 لوحة جيدا لتلطيخ خلية تشو، كما هو مبين في القسم 3.1.4.
    1. استخدام مكشطة خلية لفصل الخلايا تشو من أسفل البئر. هذا الأسلوب الأفضل تريبسينيزيشن، كما أنه يقلل من خطر الإصابة بضرر حانمه نتيجة proteolytic الانقسام.
    2. نقل 1 مل الوسائط التي تحتوي على الخلايا تشو إلى أنبوب نظام مراقبة الأصول الميدانية. زيادة ونقصان لأسفل في 300-400 x ز في 4 درجات مئوية عن 5 دقيقة إعادة تعليق في 100 ميكروليتر من الأجسام المضادة-هلا المخفف في FWB. احتضان لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية على الجليد.
      1. أداء هذا تلطيخ مع الأجسام المضادة-A2 للكشف عن مجموع مستويات التعبير السطحي في الخلية A2، وتكر-مثل الأجسام المضادة المحددة ل A2 في المجمع مع E183 الببتيد32 للكشف عن الرهن مؤثر-أنا خلية مستويات التعبير السطحي.
    3. أضف 1 مل FWB لكل عينة شو وتدور إلى أسفل في 300-400 x ز، 4 درجة مئوية، مدة 5 دقائق، ثم إعادة تعليق العينة في 0.3 مل FWB. المضي قدما في تحليل التدفق الخلوي.

Representative Results

اتفاقية استكهولم MHC الفئة الأولى التكنولوجيا المستخدمة هنا يتيح مراقبة دقيقة للتعبير خلية سطح الطبقة MHC أنا مع الببتيدات المعروف، مرتبط تساهميا، للحث على تنشيط خلية تي. ونحن قد ولدت المهندسة إكسينوجينيك APC نظام (الشكل 1 أ، ب، ج) تسمح بالعرض التقديمي للمستويات المنخفضة للرهن العقاري مؤثر في وجود أو غياب للرهن العقاري مؤثر المشارك (الشكل 1، ه). نقديا، استخدمنا محدد مثل تكر جسم لهلا-A2 الببتيد E183 عرض لإظهار هذا العرض لاتفاقية استكهولم مؤثر ولا يتم تبديل E183-هلا-A2 بالتعبير المشارك لاتفاقية استكهولم مؤثر المشارك هفوة-هلا-A2 (الشكل 1E). ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن جسم مثل تكر محددة E183-هلا-A2 يظهر بعض ملزمة لهلا-A2 تقديم هفوة الببتيد (الشكل 1E). يمكن بناؤها مستضد هندسيا مماثلة تعرض الخلية نظم استخدام الببتيدات مختلفة أو جزيئات MHC للتحقيق في المتطلبات الجزيئية للتفاعلات تكر و/أو التمييز في خلايا تي البشرية مع خصوصيات مختلفة.

استخدمنا هذه المدرعة هندسيا لحفز E183-هلا-A2-محددة CD8 + تي خلية استنساخ البشر. واستخدمت ثلاثة عناصر سلبية: تي الخلايا خلايا تشو تي ركس فقط، أونترانسفيكتيد، وخلايا تي ركس تشو معربا عن كميات عالية من اتفاقية استكهولم مؤثر المشارك هفوة-هلا-A2 لاختبار T المحتملة خلية التنشيط بأي جزيئات أعرب في الخلايا تشو تي ريكس (تي ريكس أونترانسفيكتيد شو الخلايا بالمقارنة مع تي الخلية فقط)، ولتنشيط خلية T بمقرر اتفاقية استكهولم-اسكت-هلا-A2 (الخلايا تشو تي ركس معربا عن مستويات عالية من مقرر اتفاقية استكهولم-اسكت-هلا-A2 بالمقارنة مع أونترانسفيكتيد تشو تي ركس الخلايا). أونترانسفيكتيد شو تي ركس الخلايا أو الخلايا تي ركس تشو معربا عن اتفاقية استكهولم-اسكت-هلا-A2 عدم حمل التنشيط لاستنساخ CTL CD8 + E183-هلا-A2-محددة، كما يحددها التحديد الكمي لإنتاج IFN-γ والتعبير عن علامة تحبب CD107a كمقياس للخلية T سيتوتوكسيسيتي (الشكل 2 أ، ب). التعبير عن مستويات عالية من اتفاقية استكهولم مؤثر E183-هلا-A2، تستخدم كمراقبة إيجابية والمستحثه IFN-γ إنتاج فعالة جداً وتحبب (الشكل 2 أ، ب)، مما يدل على أن بناء هلا-A2 اتفاقية استكهولم يمكن التعرف عليه تكر محددة لتنشيط وظائف المستجيب الخلية t. التعبير عن المستويات المنخفضة لاتفاقية استكهولم E183-هلا-A2 الناجم عن انخفاض مستويات الإنتاج IFN-γ وتحبب، وهذا تم تعزيز وجود مؤثر المشارك sc هفوة-هلا-A2 (الشكل 2 أ، ب). تجدر الإشارة إلى أن نسب عالية جداً من الخلايا CD107a + T لوحظت حتى في استجابة لمستويات منخفضة من الرهن مستضدي (الشكل 2)، تتسق مع التقارير السابقة لمتطلبات منخفضة نسبيا مقدار الرهن مؤثر لتحريض الخلايا T سيتوتوكسيسيتي33. مؤسسة مونتانيار CD107a، تشير إلى مقدار تحبب على أساس خلية واحدة، يوفر أفضل مجموعة ديناميكية (الشكل 2). يسمح الإنزيم تنشيط خلية T تستخدم الكمي المتزامن لاثنين من المهام الرئيسية المستجيب: سيتوكين الإنتاج وسيتوتوكسيسيتي، ويقدم قراءات حساسة جداً مع مجموعة ديناميكية جيدة.

استخدمنا التكنولوجيا سلسلة واحدة لاختبار ما إذا كانت ملزمة تكر للرهن العقاري مؤثر المشارك المطلوبة لتعزيز تفعيل الرهن العقاري تعتمد على مؤثر المشارك. نحن تحور فالين في موقف 152 على الحافة الاخدود ملزمة الببتيد هلا-A2 (الشكل 3B) إلى حمض الجلوتاميك لإنشاء متحولة V152E، كما تم الإبلاغ عن هذه الطفرة إلغاء ربط تكر إلى A2 هلا34. ثم قمنا باختبار إذا كان يمكن إلغاء الطفرة V152E تكر ملزمة لاستنساخ CTL E183-هلا-A2 المستخدمة، من خلال إدخال هذه الطفرة في اتفاقية استكهولم مؤثر E183-هلا-A2 والإعراب عن بناء اتفاقية استكهولم مؤثر متحولة في الخلايا تشو تي ركس. اتفاقية استكهولم نوع البرية، ولكن لا V152E، E183-هلا-A2 التي يسببها التنشيط لاستنساخ CTL E183-هلا-A2-الخاصة بالمستخدم (الشكل 3A). تجدر الإشارة إلى أن أي طفرة تكر الملزمة على الطبقة MHC أنا يحتاج لفحصها بشكل منفصل لكل استنساخ تكر/T الخلية الفردية المستخدمة، كما سيتوقف تأثير الطفرة على التفاعلات الجزيئية الدقيقة بين تكر والرهن العقاري المعقدة، وهذه سوف تختلف بين تكرس مختلفة. على سبيل المثال، اختبرنا الطفرات الثمانية، أما ذكرت سابقا الطفرات تكر الملزمة أو الطفرات التي تنبأت بتعطيل الربط تكر دون إلغاء ربط الببتيد إلى هلا-A2. من هؤلاء، كان V152E الطفرة الوحيدة التي إلغاء التنشيط لاستنساخ الخلايا T E183 محددة تستخدم10. ثم عرض الطفرة V152E في اتفاقية استكهولم مؤثر المشارك هفوة-هلا-A2، والمشترك وأعرب sc WT أو V152E هفوة-هلا-A2 مع مستويات منخفضة من اتفاقية استكهولم مؤثر E183-هلا-A2. اتفاقية استكهولم WT و V152E المحسن هفوة-هلا-A2 الإنتاج IFN-γ وتحبب (الشكل 3د)، مما يوحي بأن تكر ملزمة للرهن العقاري مؤثر المشارك غير مطلوب لمؤثر المشارك تعتمد على الرهن العقاري CD8 + "تي" خلية التنشيط تعزيز. واحد في سلسلة MHC الفئة الأولى التكنولوجيا، كما عرضت هنا، ويمكن استخدامها لتعديل تكر و/أو التمييز ملزمة بفئة MHC أنا مع الببتيد المعروفة للتحقيق في متطلبات الجزيئي للخلية T مستضد الاعتراف والتنشيط.

Figure 1
رقم 1: واحدة سلسلة هلا-A2 بنيات المستخدمة للتحقيق المشارك مؤثر في تنشيط الخلية CD8 + "تي" البشرية. (أ) رسم تخطيطي لبناء سكلا-A2، تتألف من تساهمي إشارة تسلسل من تنصهر البشرية بيتا2 microglobulin، الببتيد الاختيار، رابط سيرين جليكاين مرنة (جججسجججس جججس)، والإنسان بيتا2 microglobulin، مرنة رابط جليكاين-سيرين وسلسلة ثقيلة هلا-A2. (ب) رسم تخطيطي والبلازميدات المستخدمة لتوليد مستضد هندستها تعرض الخلايا للتحقيق أجونيسم co في تنشيط الخلية CD8 + "تي" البشرية: قامع التتراسيكلين, sc مؤثر E183-هلا-A2 تحت سيطرة المروج التتراسيكلين إيندوسيبلي، sc مؤثر المشارك غير محفزة هفوة-هلا-A2 تحت سيطرة المروج النشط مؤثرا. (ج) رسم تخطيطي مستضد هندسيا عرض الخلايا المستخدمة للتحقيق co-أجونيسم: تشو تي ركس الخلايا (لا البشرية التعبير MHC)، والخلايا تي ركس تشو معربا عن مستويات عالية مؤثرا لاتفاقية استكهولم هفوة-هلا-A2 (مؤثر المشارك غير محفزة الرهن العقاري)، الخلايا خلايا تشو تي ركس معربا عن تدني مستويات "راشح" لاتفاقية استكهولم E183-هلا-A2 في غياب التتراسيكلين (تدني مستوى الببتيد مؤثر)، خلايا تي ركس تشو معربا عن مستويات عالية من اتفاقية استكهولم E183-هلا-A2 حضور التتراسيكلين (ارتفاع مستوى الببتيد مؤثر)، تشو تي ركس وإذ تعرب عن المستويات المنخفضة لاتفاقية استكهولم E183-هلا-A2 ومستويات عالية من اتفاقية استكهولم هفوة-هلا-A2 (تدني مستوى الببتيد مؤثر) وارتفاع مستوى الببتيد مؤثر المشارك. (د) الخلايا تلطيخ السطحية من مستضد هندسيا عرض خطوط الخلية باستخدام الأجسام المضادة-هلا-A2. الأرقام المعروضة تدل القيم مؤسسة مونتانيار لوصمة عار MHC في بوابة الخلية الحية. بيانات الممثل من التجارب المستقلة 5 (ﻫ) خلية تلطيخ السطحية من مستضد هندسيا عرض خطوط الخلية باستخدام جسم مثل تكر محددة ضد الببتيد E183 عرض هلا-A2. الأرقام المعروضة تدل القيم مؤسسة مونتانيار لوصمة عار MHC في بوابة الخلية الحية. بيانات الممثل 5 تجارب مستقلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: تعزيز الوجود للرهن العقاري مؤثر المشارك إنتاج سيتوكين وتحبب مستنسخ CTL CD8 + E183-هلا-A2-خاصة- (أ) داخل الخلايا IFN-γ تلطيخ هلا-A2-محددة CD8 + CTL مستنسخ بعد التحفيز ح 3 مع المشار إليه هندسيا مستضد عرض الخلايا. الأرقام المعروضة الدلالة الإيجابية النسبة المئوية لتلطيخ IFN-γ. بيانات الممثل 3 تجارب مستقلة، كل إجراء مع تريبليكاتيس التقنية. سطح الخلية (ب) CD107a تلطيخ هلا-A2-محددة CD8 + CTL مستنسخ بعد التحفيز ح 3 مع المشار إليه هندسيا مستضد عرض الخلايا. تدل الأرقام المعروضة نسبة إيجابية لتلوين CD107a أو CD107a مؤسسة مونتانيار للسكان الخلية CD8 + T. بيانات الممثل 3 تجارب مستقلة، كل إجراء مع تريبليكاتيس التقنية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: مؤثر المشارك – لا يتطلب تعزيز تفعيل وساطة T الخلية تكر ملزمة للرهن العقاري مؤثر المشارك المعقدة. (أ) V152E الطفرة في اتفاقية استكهولم E183-هلا-A2 يلغي تنشيط CD8 + CTL مستنسخ E183-هلا-A2-محددة. واستخدمت خلايا تي ركس تشو معربا عن مستويات عالية (التتراسيكلين التعريفي) من اتفاقية استكهولم متحولة WT أو V152E E183-هلا-A2 لتحفيز E183-هلا-A2-الخاصة باستنساخ CD8 + CTL البشرية ح 3. كان كمياً تنشيط الخلية تي استخدام تلطيخ IFN-γ داخل الخلايا. الأرقام المعروضة الدلالة الإيجابية النسبة المئوية لتلطيخ IFN-γ. بيانات الممثل 3 تجارب مستقلة، كل إجراء مع تريبليكاتيس التقنية. (ب) موقع الطفرة V152E داخل الاخدود ملزمة الببتيد من هلا-A2. (ج) طفرة V152E في اتفاقية استكهولم هفوة-هلا-A2 مؤثر المشارك الرهن معقدة لا إلغاء التنشيط المشارك agonist تعتمد على تعزيز. داخل الخلايا IFN-γ تلطيخ هلا-A2-محددة CD8 + CTL مستنسخ بعد التحفيز ح 4 مع المشار إليه هندسيا مستضد عرض الخلايا. الأرقام المعروضة الدلالة الإيجابية النسبة المئوية لتلطيخ IFN-γ. بيانات الممثل 3 تجارب مستقلة، كل إجراء مع تريبليكاتيس التقنية. (د) V152E الطفرة في اتفاقية استكهولم هفوة-هلا-A2 مؤثر المشارك الرهن معقدة لا إلغاء التنشيط المشارك agonist تعتمد على تعزيز. الخلايا السطحية CD107a تلطيخ هلا-A2-محددة CD8 + CTL مستنسخ بعد التحفيز ح 3 مع المشار إليه هندسيا مستضد عرض الخلايا. تدل الأرقام المعروضة نسبة إيجابية لتلوين CD107a أو CD107a مؤسسة مونتانيار للسكان الخلية CD8 + T. بيانات الممثل 3 تجارب مستقلة، كل إجراء مع تريبليكاتيس التقنية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

ينص البروتوكول على تقديم أداة قوية لتحقيق تفاعلات الجزيئية أثناء تنشيط الخلية CD8 + "تي" البشرية. خطوة حاسمة لتحقيق أجونيسم co أثناء تنشيط الخلية تي البشرية هو السيطرة على الرهن العقاري مؤثر خلية التعبير السطحية لضمان مؤثر متساوية العرض الرهن على ناقلات الجنود المدرعة مع أو بدون مؤثر المشارك الرهن التعبير. في نظامنا التجريبية، ويتحقق ذلك باستخدام استنساخ خلية مفردة التعبير عن كميات قليلة من الرهن مؤثر، تليها سوبيرترانسفيكتيون مع مؤثر المشارك الرهن بناء ومؤثر الرهن تحديد كمي باستخدام الأجسام المضادة مثل تكر10، 32-كمؤثر sc الرهن التعبير يمكن أن تتغير بمرور الوقت، من الأهمية بمكان تحديد مقدار الرهن مؤثر التعبير السطحي على ناقلات الجنود المدرعة المستخدمة في كل تجربة باستخدام الأجسام المضادة مثل تكر. إذا كان متوفراً، لا جسم مثل تكر محددة مؤثر سكمهك--يمكن أن تكون معبراً الانصهار بروتين فلوري، وإعرابها سطح الخلية يمكن ثم قياسها كمياً باستخدام أسلوب الفحص المجهري حساسة، مثل انعكاس الداخلية مجموع الأسفار مجهرية 35 , 36-وعلاوة على ذلك، التعبير الخلية السطحية للرهن العقاري مؤثر المشارك تتناقص بمرور الوقت بسبب تعتمد على مثلايشن والمستقله إسكات مروج CMV37، وينبغي رصد استخدام جسم تلطيخ والتدفق الخلوي التحليل، مع المتكررة نظام مراقبة الأصول الميدانية-الفرز عند الحاجة. ونحن قد مثقف شو الخلايا لمدة 5 أسابيع مع خسارة محدودة نسبيا للتعبير الرهن العقاري اتفاقية استكهولم. ونحن نوصي بشدة تجميد الخلايا تشو قريبا بعد اختيار/الفرز لضمان أسهم موثوقة للخلايا مع اتفاقية استكهولم المعروف MHC التعبير.

يمكن تعديل عدة خطوات للبروتوكولات المقدمة، رهنا بتوافر المعدات، أو اعتماداً على أهداف محددة للبحث. على سبيل المثال، ببمك الانتشار المحتملة يمكن أن تحول دون (الخطوة 3.2.1) باستخدام الطرق البديلة التي لا تتطلب غاما (أو X-) إيرادياتور، مثل المعاملة مع ميتوميسين ج38. يمكن استخدام المخازن مؤقتة تفكك خلية غير الانزيمية المحتوية على المعادن chelators39 بدلاً من خلية القشط في خطوة 3.3.1. وعلاوة على ذلك، يمكن تعديل مستضد تقديم النظام لجعله أكثر ملاءمة لاستنساخ الإنسان CTL الإعراب عن مختلف تكرس. شو الخلايا الهامستر التعبير عن MHC الفئة الأولى الجزيئات، وعلى الرغم من أن هذه ليست ذات صلة للسطر CTL درس هنا (الشكل 2A و الشكل 3 ألف، لاحظنا أية استجابات الخلية T إلى خلايا شو أونترانسفيكتيد)، هناك إمكانية أن تكرس البشرية الأخرى قد تظهر بعض إكسينوريكتيفيتي. في أن حالة، MHC الهامستر الفئة الأولى التعبير يمكن الحد من انقطاع الهامستر β2-ميكروجلوبولين أو الاستفادة من استخدام كريسبر/Cas9؛ أو يمكن استخدام خط APC بشرية بعد ضرب ميكروجلوبولين β2 كريسبر/Cas9-بوساطة أو الصنبور.

النظام التجريبي المقدمة هنا يتيح مراقبة دقيقة للتفاعلات تكر و CD8 مع جزيئات MHC عرض الببتيدات المعرفة مسبقاً. على سبيل المثال، نحن سابقا أظهرت أن الطفرات إلغاء CD8 ملزم40 للرهن العقاري كواجونيست القضاء على تعزيز تفعيل كواجونيست بوساطة في مورين والبشرية CD8 + "تي" الخلايا9،10، بينما يلغي تكر التفاعل مع الرهن مؤثر المشارك ليس أثر على تعزيز تفعيل وساطة كواجونيست10. ومع ذلك، قد استخدام ثوابت السلسلة واحدة MHC العديد من القيود. على سبيل المثال، أن الوقت قد حان والمستهلكة للعمل لاختبار متعددة المشارك مؤثر الببتيد تسلسل باستخدام هذا النظام التجريبي، كما يشمل هذا جيل البلازميدات متعددة ترميز sc MHC مع الببتيدات مختلفة، وترانسفيكشنز اللاحقة وفرز الخلايا. سابقا، استخدمنا خط الخلية تفتقر إلى الصنبور مورين RMA-S لاختبار متعددة الببتيدات مؤثر المشارك في الماوس تي خلية التنشيط8،9، ولكن هذا النهج لم يكن ناجحاً مع نقص الاستفادة البشرية T2 الخلية خط10، الأكثر احتمالاً بسبب عرض مستقلة عن الاستفادة من الببتيدات41. قيد آخر من نظامنا التجريبية أنها لا توفر طريقة سريعة لتغيير كمية الجزيئات الرهن مؤثر المشارك لغرض تحديد مقدار الرهن مؤثر المشارك المطلوبة لتشغيل تنشيط خلية T الحرجة. وعلاوة على ذلك، التتراسيكلين إيندوسيبلي المستخدمة لا يسمح النظام المعايرة لمؤثر كمية الرهن العقاري على مستوى الخلية الواحدة بتغيير تركيز التتراسيكلين، كما يغير متفاوتة تتراسكلين تركيز نسبة الخلايا A2 هلا إيجابية، وبدلاً من مستويات هلا-A2 على أساس كل خلية. نهج بديل ونحن نحقق حاليا هو استخدام الدهن معتمدة بليرس42، استخدمت سابقا للتحقيق أجونيسم co أثناء تنشيط الخلايا CD4 + T مورين4 أو الخرز تقديم مبلغ ثابت للرهن العقاري مؤثر في وجود كميات متفاوتة من الرهن مؤثر المشارك. عندما تستخدم بالاقتران مع التكنولوجيا الببتيد الأشعة فوق البنفسجية--كليفابل4،43، هذه النظم التجريبية البديلة ينبغي السماح باختبار سريع متعددة تسلسلات الببتيد مؤثر المشارك، فضلا عن مبالغ مختلفة للرهن العقاري مؤثر المشارك .

التكنولوجيا MHC اتفاقية استكهولم يمكن أن تكون أيضا تنطبق على التحقيق في أجونيسم co في خلايا CD4 تي البشرية أو مورين، واحد في سلسلة MHC class الثاني جزيئات تقديم تحدد مسبقاً الببتيدات عبرت بنجاح في خلايا الثدييات السطوح44. وعلاوة على ذلك، يمكن توسيع استخدام تكنولوجيا sc MHC لتحقيق جزيئات MHC غير الكلاسيكية مثل هلا-هاء- هلا Sc-ه قد وصفت قبل، والتعبير عنه قد ثبت أن تمنع تنشيط الخلية تي البشرية45. آخر جزيء MHC غير الكلاسيكية للاهتمام هو CD1، الذي يعرض الدهون بدلاً من الببتيدات46. اتفاقية استكهولم بنيات تتكون من سلسلة ثقيلة CD1 و β2-ميكروجلوبولين أظهرت أن يعبر على سطح الخلية وربط دهني ذات الصلة يغاندس47. واحد في سلسلة تكنولوجيا MHC إمكانات كبيرة كأداة بحث للتحقيق في التفاعلات الجزيئية أثناء تنشيط خلية تي وناغورني-كاراباخ.

Disclosures

الكتاب يعلن لا تضارب المصالح.

Acknowledgments

هذا البحث وأيده "مجلس البحوث الطبية الوطنية" سنغافورة التابعة لوزارة الصحة تحت كبرج/0064/2014 إلى N.R.J.G.، بإنشاء إطار به R571-002-012-592 إلى P.A.M.، "إينفيستيجاتورشيب مؤسسة البحوث الوطنية" R571-000-272-281 إلى P.A.M -، وعلى سنغافورة بحوث متعدية الجنسيات (STaR) محقق جائزة (نمرك/ستار/013/2012) إلى أتال بيهاري نحن ممتنون للدكتور بول هتشينسون، والسيد تيو قو هوي من المرافق "الأساسية تدفق البرنامج" اللائي يقبلن علم المناعة لفرز الخلايا الخبراء. ونحن ممتنون لتشن إيليا لقراءة نقدية من المخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aim-V (serum free media) Gibco 12055091
Blasticidin Gibco R21001
Cytofix/Cytoperm (fixation/permealibisation kit) BD 554714
F12 Gibco 10565-018
Fetal bovine serum (FBS) HyClone SH3007103
Geneticin Gibco 10131035
GolgiPlug (Brefeldin A) BD 555029
Human serum Sigma-Aldrich H4522
Hygromycin Gibco 10687010
Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA) Sigma-Aldrich L4144
Opti-MEM (low serum media) Bibco 31985070
10x PBS Vivantis PB0344 – 1L
Penicillin/Streptomycin HyClone SV30010
Polyethylenimine (PEI) Sigma-Aldrich 408727
Recombinant human IL2 R&D Systems 202-IL
Recombinant human IL7 R&D Systems 207-IL
Recombinant human IL15 R&D Systems 247-ILB
Tetracycline Sigma-Aldrich T7660
T-REx CHO cell line Thermo Fisher Scientific R71807
10 x Trypsin/EDTA Gibco 15400054
Antibodies
CD3 BD 347347 Clone SK7, RRID:AB_400287
CD8α BD 563795 Clone RPA-T8, RRID:AB_2722501
CD107a BD 566261 Clone H4A3, RRID:AB_2739639
HLA-A2 eBioscience 17-9876-41 Clone BB7.2, RRID:AB_11151522
IFN-γ eBioscience 12-7319-41 Clone 4S.B3, RRID:AB_1311250

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gascoigne, N. R. Do T cells need endogenous peptides for activation? Nature Reviews. Immunology. 8 (11), 895-900 (2008).
  2. Gascoigne, N. R., Zal, T., Yachi, P. P., Hoerter, J. A. Co-receptors and recognition of self at the immunological synapse. Current Topics in Microbiology and Immunology. 340, 171-189 (2010).
  3. Krogsgaard, M., Juang, J., Davis, M. M. A role for "self" in T-cell activation. Seminars in Immunology. 19 (4), 236-244 (2007).
  4. Krogsgaard, M., et al. Agonist/endogenous peptide-MHC heterodimers drive T cell activation and sensitivity. Nature. 434 (7030), 238-243 (2005).
  5. Ebert, P. J., Jiang, S., Xie, J., Li, Q. J., Davis, M. M. An endogenous positively selecting peptide enhances mature T cell responses and becomes an autoantigen in the absence of microRNA miR-181a. Nature Immunology. 10 (11), 1162-1169 (2009).
  6. Lo, W. L., et al. An endogenous peptide positively selects and augments the activation and survival of peripheral CD4+ T cells. Nature Immunology. 10 (11), 1155-1161 (2009).
  7. Yachi, P. P., Ampudia, J., Gascoigne, N. R., Zal, T. Nonstimulatory peptides contribute to antigen-induced CD8-T cell receptor interaction at the immunological synapse. Nature Immunology. 6 (8), 785-792 (2005).
  8. Yachi, P. P., Lotz, C., Ampudia, J., Gascoigne, N. R. T cell activation enhancement by endogenous pMHC acts for both weak and strong agonists but varies with differentiation state. The Journal of Experimental Medicine. 204 (11), 2747-2757 (2007).
  9. Hoerter, J. A., et al. Coreceptor affinity for MHC defines peptide specificity requirements for TCR interaction with coagonist peptide-MHC. The Journal of Experimental Medicine. 210 (9), 1807-1821 (2013).
  10. Zhao, X., et al. Nonstimulatory peptide-MHC enhances human T-cell antigen-specific responses by amplifying proximal TCR signaling. Nature Communications. 9 (1), 2716 (2018).
  11. Juang, J., et al. Peptide-MHC heterodimers show that thymic positive selection requires a more restricted set of self-peptides than negative selection. The Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1223-1234 (2010).
  12. Anikeeva, N., et al. Quantum dot/peptide-MHC biosensors reveal strong CD8-dependent cooperation between self and viral antigens that augment the T cell response. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (45), 16846-16851 (2006).
  13. Anikeeva, N., Gakamsky, D., Scholler, J., Sykulev, Y. Evidence that the density of self peptide-MHC ligands regulates T-cell receptor signaling. PloS One. 7 (8), e41466 (2012).
  14. Schuren, A. B., Costa, A. I., Wiertz, E. J. Recent advances in viral evasion of the MHC Class I processing pathway. Current Opinion in Immunology. 40, 43-50 (2016).
  15. Bubenik, J. MHC class I down regulation, tumour escape from immune surveillance and design of therapeutic strategies. Folia Biologica. 51 (1), 1-2 (2005).
  16. Apps, R., et al. Influence of HLA-C expression level on HIV control. Science. 340 (6128), New York, N.Y. 87-91 (2013).
  17. Cebecauer, M., et al. CD8+ cytotoxic T lymphocyte activation by soluble major histocompatibility complex-peptide dimers. The Journal of Biological Chemistry. 280 (25), 23820-23828 (2005).
  18. Sporri, R., Reis e Sousa, C. Self peptide/MHC class I complexes have a negligible effect on the response of some CD8+ T cells to foreign antigen. European Journal of Immunology. 32 (11), 3161-3170 (2002).
  19. Ljunggren, H. G., et al. Empty MHC class I molecules come out in the cold. Nature. 346 (6283), 476-480 (1990).
  20. Kotsiou, E., Brzostek, J., Gould, K. G. Properties and applications of single-chain major histocompatibility complex class I molecules. Antioxidants & Redox Signaling. 15 (3), 645-655 (2011).
  21. Hansen, T. H., Connolly, J. M., Gould, K. G., Fremont, D. H. Basic and translational applications of engineered MHC class I proteins. Trends in Immunology. 31 (10), 363-369 (2010).
  22. Yu, Y. Y., Netuschil, N., Lybarger, L., Connolly, J. M., Hansen, T. H. Cutting edge: single-chain trimers of MHC class I molecules form stable structures that potently stimulate antigen-specific T cells and B cells. Journal of Immunology. 168 (7), Baltimore, Md. 3145-3149 (2002).
  23. Mitaksov, V., et al. Structural engineering of pMHC reagents for T cell vaccines and diagnostics. Chemistry & Biology. 14 (8), 909-922 (2007).
  24. Truscott, S. M., et al. Disulfide bond engineering to trap peptides in the MHC class I binding groove. Journal of Immunology. 178 (10), Baltimore, Md. 6280-6289 (2007).
  25. Truscott, S. M., et al. Human major histocompatibility complex (MHC) class I molecules with disulfide traps secure disease-related antigenic peptides and exclude competitor peptides. The Journal of Biological Chemistry. 283 (12), 7480-7490 (2008).
  26. Bertoletti, A., Ferrari, C. Innate and adaptive immune responses in chronic hepatitis B virus infections: towards restoration of immune control of viral infection. Postgraduate Medical Journal. 89 (1051), 294-304 (2013).
  27. Boni, C., et al. Characterization of hepatitis B virus (HBV)-specific T-cell dysfunction in chronic HBV infection. Journal of Virology. 81 (8), 4215-4225 (2007).
  28. Gehring, A. J., et al. Engineering virus-specific T cells that target HBV infected hepatocytes and hepatocellular carcinoma cell lines. Journal of Hepatology. 55 (1), 103-110 (2011).
  29. Gehring, A. J., et al. The level of viral antigen presented by hepatocytes influences CD8 T-cell function. Journal of Virology. 81 (6), 2940-2949 (2007).
  30. Bertoni, R., et al. Human histocompatibility leukocyte antigen-binding supermotifs predict broadly cross-reactive cytotoxic T lymphocyte responses in patients with acute hepatitis. The Journal of Clinical Investigation. 100 (3), 503-513 (1997).
  31. Goulder, P. J., et al. Patterns of immunodominance in HIV-1-specific cytotoxic T lymphocyte responses in two human histocompatibility leukocyte antigens (HLA)-identical siblings with HLA-A*0201 are influenced by epitope mutation. The Journal of Experimental Medicine. 185 (8), 1423-1433 (1997).
  32. Sastry, K. S., et al. Targeting hepatitis B virus-infected cells with a T-cell receptor-like antibody. Journal of Virology. 85 (5), 1935-1942 (2011).
  33. vanden Berg, H. A., et al. Cellular-level versus receptor-level response threshold hierarchies in T-cell activation. Frontiers in Immunology. 4, 250 (2013).
  34. Moots, R. J., Matsui, M., Pazmany, L., McMichael, A. J., Frelinger, J. A. A cluster of mutations in HLA-A2 alpha 2 helix abolishes peptide recognition by T cells. Immunogenetics. 34 (3), 141-148 (1991).
  35. Crites, T. J., Chen, L., Varma, R. A TIRF microscopy technique for real-time, simultaneous imaging of the TCR and its associated signaling proteins. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
  36. Axmann, M., Schutz, G. J., Huppa, J. B. Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers. Journal of Visualized Experiments. (105), e53158 (2015).
  37. Mariati,, Koh, E. Y., Yeo, J. H., Ho, S. C., Yang, Y. Toward stable gene expression in CHO cells. Bioengineered. 5 (5), 340-345 (2014).
  38. Matsushita, S., Tanaka, Y., Matsuoka, T., Nakashima, T. Clonal expansion of freshly isolated CD4T cells by randomized peptides and identification of peptide ligands using combinatorial peptide libraries. European Journal of Immunology. 31 (8), 2395-2402 (2001).
  39. Heng, B. C., Cowan, C. M., Basu, S. Comparison of enzymatic and non-enzymatic means of dissociating adherent monolayers of mesenchymal stem cells. Biological Procedures Online. 11, 161-169 (2009).
  40. Smith, K., et al. Sensory adaptation in naive peripheral CD4 T cells. The Journal of Experimental Medicine. 194 (9), 1253-1261 (2001).
  41. Wei, M. L., Cresswell, P. HLA-A2 molecules in an antigen-processing mutant cell contain signal sequence-derived peptides. Nature. 356 (6368), 443-446 (1992).
  42. Vardhana, S., Dustin, M. Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse. Journal of Visualized Experiments. (19), (2008).
  43. Bakker, A. H., et al. Conditional MHC class I ligands and peptide exchange technology for the human MHC gene products HLA-A1, -A3, -A11, and -B7. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (10), 3825-3830 (2008).
  44. Rhode, P. R., et al. Single-chain MHC class II molecules induce T cell activation and apoptosis. Journal of Immunology. 157 (11), Baltimore, Md. 4885-4891 (1996).
  45. Crew, M. D., Cannon, M. J., Phanavanh, B., Garcia-Borges, C. N. An HLA-E single chain trimer inhibits human NK cell reactivity towards porcine cells. Molecular Immunology. 42 (10), 1205-1214 (2005).
  46. Van Kaer, L., Wu, L., Joyce, S. Mechanisms and Consequences of Antigen Presentation by CD1. Trends in Immunology. 37 (11), 738-754 (2016).
  47. Im, J. S., et al. Direct measurement of antigen binding properties of CD1 proteins using fluorescent lipid probes. The Journal of Biological Chemistry. 279 (1), 299-310 (2004).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 144، واحد في سلسلة MHC، تنشيط الخلية تي البشرية، الاعتراف مستضد الخلايا T، الببتيد النفس، مستقر خط الخلية، المهندسة مستضد تقديم الخلايا، عزل PBMC، المقايسة تحبب الخلية تي البشرية، وإنتاج سيتوكين الخلية تي البشرية
استخدام تكنولوجيا MHC سلسلة واحدة للتحقيق في أجونيسم Co في البشرية CD8 + تي خلية التنشيط
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, X., Hamidinia, M., Choo, J. A. … More

Zhao, X., Hamidinia, M., Choo, J. A. L., Too, C. T., Ho, Z. Z., Ren, E. C., Bertoletti, A., MacAry, P. A., Gould, K. G., Brzostek, J., Gascoigne, N. R. J. Use of Single Chain MHC Technology to Investigate Co-agonism in Human CD8+ T Cell Activation. J. Vis. Exp. (144), e59126, doi:10.3791/59126 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter