Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung der einzelnen Kette MHC Klasse I komplexe molekulare Interaktionen in menschliche CD8 + T-Zell-Aktivierung zu untersuchen: Generation von veränderter antigenpräsentierende Zellen mit dem Ausdruck einzelne Kette konstruiert, Kultur der menschlichen CD8 + T Zelle Klon und T-Zell-Aktivierung-Experimenten.
Selbst nicht-stimulierende Peptid-MHC (pMHC)-komplexe kein T-Zell-Aktivierung und Effektor-Funktionen auslösen, aber T-Zell-Antworten zu Agonist pMHC, durch einen Prozess bezeichnet co-Agonismus verbessern können. Dieses Protokoll beschreibt ein experimentelles System, co-Agonismus während menschliche CD8 + T-Zell-Aktivierung zu untersuchen, zum Ausdruck bringen menschliche MHC Klasse I Moleküle präsentieren vorab festgelegten Peptide als einziges Polypeptide (einzelne Kette MHC) in eine xenogene Zelllinie. Wir drückten einzelne Kette MHCs unter Bedingungen, wo niedrige Agonist einzelne Kette p-MHC-komplexe und hohes Maß an nicht-stimulierende einzelne Kette p-MHC-komplexe zum Ausdruck gebracht wurden. Dieses experimentelle System erlaubt uns CD8 + T-Zell-Antworten zu Agonist pMHC auf das Vorhandensein oder Fehlen von nicht-stimulierende pMHC vergleichen. Das Protokoll beschreibt Zelle Zeile Transfektion mit einzelnen Kette MHC-Konstrukten, Erzeugung von stabilen Zelle Linien, Kultur des Hepatitis B Virus-spezifische menschliche CD8 + T-Zellen und T-Zell-Aktivierung Experimente gleichzeitig quantifizieren Produktion von Zytokinen und Degranulation. Die vorgestellten Methoden können für die Forschung zu verschiedenen Aspekten der CD8 + T-Zell-Aktivierung in menschliche T-Zelle Systeme mit bekannten Peptid MHC Spezifität verwendet werden.
MHC Klasse I (MHC-ich) Moleküle präsentieren kurz (8 bis 10 Aminosäuren) Peptide Proteine synthetisiert durch jede Zelle abgeleitet. MHC-ich Moleküle auf gesunden Zellen präsentieren selbst Peptide von endogenen Proteinen abgeleitet. Virale Infektion führt zur Präsentation des nicht-ich Virus-abgeleitete Peptide auf MHC-ich, aber auch infizierte Zellen anwesend nicht-ich Peptide in Anwesenheit von großen Mengen an selbst-Peptid-MHC (pMHC). MHC-ich von der T-Zell-Rezeptor (TCR) und den CD8-Co-Rezeptor auf T-Zellen erkannt wird. TCR Bindungsaffinität zu Peptid pMHC ist stark abhängig von der Reihenfolge der präsentierten Peptide, während CD8 Bindung Peptid-unabhängig ist. TCR Bindung an nicht-ich Agonist pMHC Komplex führt zu T-Zell-Aktivierung und Effektor-Funktionen. Non-stimulierende selbst pMHC komplexe kein T-Zell-Aktivierung und Effektor-Funktionen auslösen, aber T-Zell-Antworten zu Agonist pMHC, durch einen Prozess bezeichnet co-Agonismus1,2,3verbessern können. Co-Agonismus ist beobachtet worden, in Maus CD4 + T Zellen4,5,6 sowie Maus und menschliche CD8 + T Zellen7,8,9,10, 11 , 12 , 13. unter physiologischen Bedingungen müssen T-Zellen erkennen, begrenzte Mengen von Agonist pMHC auf antigenpräsentierende Zellen (APCs) hohes Maß an nicht-stimulierende pMHC komplexe, was darauf hindeutet, dass co-Agonismus trägt zur optimalen T Co präsentieren in-vivo-Zell-Antworten. Gesamten Zelle Oberfläche MHC Klasse ich Ebenen sind häufig herunterreguliert bei Virusinfektionen14 und auf Tumoren15. Diese immun ausweichen Strategie verringert Agonist pMHC Präsentation, sondern verringert auch die Menge an Co-Agonist pMHC ich für T-Zell-Aktivierung-Erweiterung zur Verfügung. Darüber hinaus Klasse hohe Zelle Oberflächenexpression Ebenen des MHC I Molekül HLA-C haben gezeigt, dass korrelieren mit verbesserten HIV Control16, was eine kritische Rolle für total MHC Klasse ich Ausdruck in T-Zell-Aktivierung. Trotz die physiologische Bedeutung von co-Agonismus ist seine molekulare Mechanismus noch nicht vollständig verstanden. Dies ist vor allem auf technische Herausforderungen die Menge der dargestellten Co-Agonist pMHC experimentell zu kontrollieren, während Agonist pMHC konstant zu halten.
Wir entwickelten ein experimentelles System, co-Agonismus während menschliche CD8 + T-Zell-Aktivierung zu untersuchen, zum Ausdruck bringen menschliche MHC Klasse I Moleküle präsentieren vorab festgelegten Peptid als einzigen Polypeptid (einzelne Kette MHC-I, Abb. 1A) in einer xenogene Zelle Linie9,10. Einzelne Kette (sc) Agonist pMHC drückte sich unter Kontrolle von Tetracyclin-induzierbaren Promoter in die Hamster abgeleitet T-REx CHO Zellinie Tetracyclin Repressor zum Ausdruck zu bringen; Dies ermöglicht sehr geringe “undichte” Expression sc Agonist pMHC in Abwesenheit von Tetracyclin und hohe sc Agonist pMHC Ausdruck nach Zugabe von Tetracyclin (Abbildung 1 bC). Sc-Agonist pMHC exprimierenden T-REx CHO-Zellen wurden dann Supertransfected mit stimulierende, Co-Agonist-sc-pMHC-ich unter Kontrolle eines konstitutiv aktiven Promotors (Abbildung 1 bC). Dieses experimentelle System erlaubt uns CD8 + T-Zell-Antworten zu Agonist pMHC auf das Vorhandensein oder Fehlen der hohen nicht-stimulierende pMHC vergleichen. Kritisch, da Peptid und MHC-ich schwere Kette sind kovalent verknüpft, in der ScMHC-I-format, so dass Einführungen von Mutationen in MHC-Moleküle, die vorher festgelegten Peptide präsentieren. Verwendung von ScMHC-ich Technologie erlaubt uns, speziell TCR oder CD8-bindenden Eigenschaften der Agonist oder Co-Agonist pMHC modulieren so.
Co-Agonismus in CD8 + T-Zell-Aktivierung ist beobachtet worden, mit gereinigten MHC-ich komplexe Darstellung von Agonist und Co-Agonist Peptiden in Form von Heterodimere11,17 oder vorgestellt auf Quantum dots12,13. Frühwerk auf co-Agonismus in CD8 + T-Zell-Aktivierung im Rahmen der Agonist pMHC Anerkennung auf APC verwendet TAP2-defizienten Zelllinien als APCs. TAP ist erforderlich für Peptid-Transport von Zytoplasma nach dem endoplasmatischen Retikulum und TAP-Mangel stark reduziert den Pool der verfügbaren MHC-Klasse-Bindung Peptide. In Ermangelung von Peptiden, die im Entstehen begriffenen Anlage des MHC Klasse I schwere Kette und β2– Mikroglobulin ist instabil, was zu sehr geringen MHC-ich Zelle Oberflächenexpression. Zunächst, ergab Vergleich der T-Zellen stimuliert mit Antigen auf TAP-ausreichend und – mangelhaft Maus RMA und RMA-S Zelllinien, geladen bzw. als APCs, keine Beweise für das co-Agonismus während Maus T-Zell-Aktivierung-18. Dieses experimentelle System erlaubte jedoch nicht präzise Kontrolle über die Menge der Agonist pMHC unabhängig von nicht-stimulierende selbst pMHC vorgestellt. Darüber hinaus können diese beiden Zelllinien unterscheiden sich auch in andere Moleküle, die T-Zell-Aktivierung, wie Liganden an T-Zell-co-stimulatory oder hemmenden Rezeptoren modulieren oder Adhäsionsmoleküle Ausdruck.
Daraufhin entwickelten wir ein Protokoll für das Laden von RMA-S TAP2-defizienten Zellen mit exogenen Peptide, Präsentation eines Festbetrags Agonist pMHC in das Vorhandensein oder Fehlen von nicht-stimulierende pMHC zuzulassen. Wurde dies durch die folgenden: Inkubation von TAP2-defizienten RMA-S Zellen bei niedrigeren Temperaturen (28 ° C, statt der üblichen 37 ° C) zur Stabilisierung der leere MHC Klasse I schwere Kette/β2 Mikroglobulin komplexe19; Inkubation bei 28 ° C mit exogenen Agonisten Peptid; Inkubation bei 28 ° C in das Vorhandensein oder Fehlen von exogenen nicht-stimulierende Peptid; und Inkubation bei 37 ° C zu Zelle Oberflächenexpression von leere MHC Klasse I komplexe8,9. Verwendung von dieser Versuchsanordnung ergab, dass das Vorhandensein von nicht-stimulierende pMHC Aktivierung der Maus Thymozyten, naive peripheren CD8 + T-Zellen und CTLs8verbessert. Mechanistisch, das Vorhandensein von nicht-stimulierende pMHC CD8-Einstellung auf der T-Zelle: APC immun Synapse auch in Abwesenheit von Agonist pMHC auslösen kann, und nicht-stimulierende pMHC kann TCR Interaktion mit CD8 Coreceptor7,8erhöhen. Jedoch erlaubt dieses experimentelle System nicht die relativen Beiträge der TCR und CD8 Coreceptor Bindung an Agonist und Co-Agonist pMHC bei der Vermittlung der Aktivierung Erweiterung, als Änderungen verändern TCR oder CD8 Bindung an MHC-Klasse würde ich testen beeinflussen Sie alle MHC-Moleküle, unabhängig davon das präsentierte Peptid. Wir nutzten daher MHC Klasse ich einzelne Kette-Technologie, um dieses Problem zu überwinden.
Die einzige Kette (sc) MHC-Klasse, die ich formatieren wurde bevor zur Antigen pMHC Präsentation für therapeutische Strategien zu verbessern und beantworten grundlegende Fragen zu Mechanismen des TCR und NK-Zell-Rezeptor-Aktivierung und Funktion20,21 . ScMHC-I besteht aus Peptid, β2– Mikroglobulin und MHC-ich schweren Kette zusammen mit zwei flexiblen Serin, Glycin-reiche linker (Abbildung 1A), mehrere unterschiedliche Linker Sequenzen wurden entwickelt und getestet von22. ScMHC-ich kann unabhängig von den Hahn komplexe Falten und chaperone Proteine, die für konventionelle pMHC komplexen Baugruppe20erforderlich. ScMHC-ich habe, richtig, wie über Konformation-spezifischen Antikörper Färbung22 ermittelt und durch das lösen von sc-Struktur mit Röntgen-Kristallographie23Falten gezeigt wurde. Die grundlegende ScMHC-ich Design wurde geändert, um die Bindung geringe Affinität Peptide24,25zu verbessern.
Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von menschlichen ScMHC-I, co-Agonismus während menschliche CTL zu untersuchen-Klon Aktivierung. Das Protokoll ist für menschliche CTL-Klon, die spezifisch für ein Epitop des Hepatitis B-Virus (HBV) optimiert worden. HBV ist eine schwere medizinische Belastung weltweit, da gibt es 350 Millionen Menschen infiziert mit HBV und chronische HBV-Infektion zur Entwicklung eines hepatozellulären Karzinoms (HCC) führen können. HCC-Zellen infolge der HBV-Infektion können in der Regel HBV-abgeleitete Epitope präsentieren und durch bestimmte menschliche T-Zellen erkannt werden. HBV und HCC Clearance stützt sich auf die menschlichen T-Zell-Antworten26, aber HCC-Patienten leiden oft an T-Zell-Erschöpfung und reduzierte T-Zell-Antworten-27. Einführung von HBV-spezifische TCR in T-Zellen der HBV ist als mögliche Immuntherapie Strategie, chronische HBV-Infektion28zu beseitigen versucht worden. Es ist jedoch unbekannt, ob diese Methode in einer klinischen Einstellung, aufgrund der geringen Oberfläche MHC wirksam sein wird-ich in humanen Hepatozyten29. Daher kann Verständnis des Mechanismus der Coagonism alternative Perspektiven Immuntherapie des HBV, möglicherweise vorsehen, durch die Verbesserung der Präsentation des endogenen pMHC, co-Agonismus-vermittelten T-Zell-Antworten zu induzieren. Das Protokoll umfasst alle notwendigen Schritte für die Forschung an menschlichen co-Agonismus: Transfektion von T-REx CHO-Zellen mit Agonist und Co-Agonist sc pMHC, Erzeugung von stabilen T-REx CHO-Zell-Linien, Kultur der HBV-spezifische menschliche CTL CD8 + T-Zell-Linie und CTL-Aktivierung Experimente, die Produktion von Zytokinen und Degranulation in Reaktion auf T-REx CHO-Zellen zu quantifizieren. Obwohl wir konzentrieren uns auf mit der sc-MHC Klasse I Technologie, co-Agonismus bei HBV T-Zell-Aktivierung zu untersuchen, ist darauf hinzuweisen, dass die vorgestellten Methoden leicht in menschliche T-Zelle Systeme mit bekannten pMHC für Forschung zu anderen Aspekten der T-Zell-Aktivierung angepasst werden können-ich Spezifität.
Dieses Protokoll verwendet eine menschliche CD8 + CTL-Linie speziell für HBV-abgeleitete Peptide E183-91 (FLLTRILTI: “E183”)30 auf HLA-A2 vorgestellt. SC HLA-Moleküle bestehend aus einer Signalsequenz von menschlichen β2-Mikroglobulin, synthetisiert eine HLA-A2-Bindung-Peptid, Glycin/Serin Linker, ein menschlicher β2-Mikroglobulin, Glycin/Serin Linker und eine schwere Kette kommerziell sein kann A2 (Abbildung 1A ). Plasmide, die Codierung scA2 Konstrukte mit Agonist E183 Peptid oder Coagonist HIV GAG (SLYNTVATL)31 Peptide sind von den Autoren auf Anfrage erhältlich. Der Peptidsequenz kann mit Website gerichtet-Mutagenese geändert werden. PcDNA5/TO diente ein Tetracyclin-induzierbaren Vektor Agonist einzelne Kette HLA-A2 mit E183 Peptid (sc E183-HLA-A2) zum Ausdruck bringen. In Anwesenheit von Tetracyclin Repressor, der pcDNA5/TO Plasmid ermöglicht nur eine sehr geringe, “undichte” Ausdruck des Proteins des Interesses; hohen Ausdruck kann durch die Zugabe von Tetracyclin (Abbildung 1 bC) induziert werden. Verwendung von Tetracyclin-induzierbaren Expressionssystems ermöglicht Kontrolle über die Höhe der Zelle Oberfläche Agonist pMHC Ausdruck. Eine konstitutive Expression Plasmid pcDNA3.1 wurde verwendet, um auszudrücken Coagonist scA2 mit Knebel Peptid (sc GAG-HLA-A2). Der Tetracyclin-regulierten Ausdruck (T-REx) CHO Zelllinie (Hamster Zelllinie, keine endogenen menschlichen MHC) wurde verwendet, um auszudrücken Agonist und Co-Agonist sc-HLA-A2-Konstrukte. Dieses experimentelle System ermöglicht präzise Kontrolle über pMHC Präsentation (Abbildung 1): keine pMHC-Präsentation (untransfected T-REx), ein hohes Maß an Co-Agonist pMHC Präsentation (konstitutive sc GAG-HLA-A2 Ausdruck), eine geringe Menge an Agonist pMHC Präsentation (sc E183-HLA-A2 in Ermangelung von Tetracyclin), ein hohes Maß an Agonist pMHC Präsentation (sc E183-HLA-A2 in Anwesenheit von Tetracyclin), eine geringe Menge an Agonist pMHC Darstellung und hohe Ausdruck der Co-Agonist pMHC (sc E183-HLA-A2 in die Abwesenheit von Tetracyclin und konstitutive sc GAG-HLA-A2 Ausdruck). Dieses experimentelle System ermöglicht präzise Kontrolle der Zelle Oberfläche Mengen von Agonist und Coagonist pMHC.
Die vorgestellte Protokoll sieht ein robustes Werkzeug für die Untersuchung der molekularen Wechselwirkungen während menschliche CD8 + T-Zell-Aktivierung. Ein entscheidender Schritt für die Untersuchung der co-Agonismus während menschliche T-Zell-Aktivierung ist die Kontrolle der Agonist pMHC Zelle Oberflächenexpression gleich Agonist pMHC Vortrag über die APCs mit oder ohne Co-Agonist pMHC Ausdruck sicherzustellen. In unserem experimentellen System ist dies erreicht, indem eine einzelne Zelle Klon mit dem Ausdruck geringer Mengen an Agonist pMHC, gefolgt von Supertransfection mit einem Co-Agonist pMHC Konstrukt und Agonist pMHC Quantifizierung mit TCR-ähnliche Antikörper10, 32. als Agonist sc pMHC Ausdruck im Laufe der Zeit ändern kann, ist es wichtig, Agonist pMHC Oberflächenexpression auf APCs verwendet in jedem Experiment mit TCR-ähnliche Antikörper zu quantifizieren. Wenn keine spezifischen TCR-ähnliche Antikörper verfügbar ist Agonist-ScMHC-ich als fluoreszierende Protein Fusion ausgedrückt werden kann, und seine Zelle Oberflächenexpression kann dann mit einer sensiblen Mikroskopie-Methode, wie Totalreflexion Fluoreszenzmikroskopie quantifiziert werden 35 , 36. Darüber hinaus Zelle Oberflächenexpression von Co-Agonist pMHC verringert sich im Laufe der Zeit durch Methylierung-abhängige und -unabhängig von CMV Promotor37, zum Schweigen zu bringen und sollte überwacht werden, Antikörper Färbung und Flow Cytometry-Analyse, mit wiederholte FACS-Sortierung bei Bedarf. Wir haben für bis zu 5 Wochen mit relativ begrenzten Verlust des sc pMHC Ausdrucks CHO-Zellen kultiviert. Wir empfehlen die CHO-Zellen bald nach der Auswahl/Sortierung zu gewährleisten einen zuverlässigen Bestand von Zellen mit bekannten sc MHC Ausdruck einfrieren.
Mehrere Schritte der vorgestellten Protokolle können geändert werden, abhängig von der Verfügbarkeit von Geräten, oder je nach der spezifischen Forschungsziele. Z. B. PBMC Verbreitung potenzieller kann gehemmt (Schritt 3.2.1) verwenden alternative Methoden, die keine Gamma (oder X) benötigen Brutapparat, wie Behandlung mit Mitomycin C38. Ein nicht-enzymatische Zelle Dissoziation Puffer mit Metall Chelatoren39 können statt Kratzen im Schritt 3.3.1 Zelle verwendet werden. Darüber hinaus kann die antigenpräsentierende System geändert werden, um machen es besser geeignet für menschliche CTL-Klone, die mit dem Ausdruck verschiedener TCR. CHO Zellen ausdrückliche Hamster MHC Klasse I Moleküle, und obwohl diese sind irrelevant für die CTL-Linie hier studiert (Abb. 2A und Abbildung 3A, wir beobachteten keine T-Zell-Antworten zu untransfected CHO-Zellen), besteht die Möglichkeit, dass andere menschlichen TCRs einige Xenoreactivity zeigen können. In, dass Fall Hamster MHC Klasse I Ausdruck durch Ausschlagen Hamster β2-Microglubulin reduziert werden kann, oder tippen Sie auf mit CRISPR/Cas9; oder eine menschliche APC-Linie eingesetzt werden, nachdem CRISPR/Cas9-vermittelten β2-Microglubulin oder TAP ausknocken.
Die hier vorgestellten Experimentiersystem ermöglicht präzise Kontrolle des TCR und CD8 Interaktionen mit MHC-Molekülen präsentiert vordefinierten Peptide. Zum Beispiel haben wir bereits gezeigt, dass Mutationen, die Abschaffung der CD8 Bindung40 bis Coagonist pMHC Coagonist-vermittelte Aktivierung Verbesserung in murinen und menschliche CD8 + T Zellen9,10, beseitigt während TCR Aufhebung Interaktion mit Co-Agonist pMHC hatte keinen Einfluss auf Coagonist-vermittelte Aktivierung Erweiterung10. Die Verwendung von einzelnen Kette MHC Konstrukte hat jedoch einige Einschränkungen. Zum Beispiel, es ist Zeit und Arbeit verzehrenden testen Sie mehrere Co-Agonist Peptid Sequenzen mit diesem experimentellen System, da dies mehrere Plasmide Codierung sc MHC mit verschiedenen Peptiden und anschließende Transfektionen und Zellsortierung-Generation beinhaltet. Früher wir murine TAP-defizienten Zelllinie RMA-S verwendet, um mehrere Co-Agonist Peptide in Maus T-Zell-Aktivierung8,9testen, aber dieser Ansatz war nicht erfolgreich mit dem TAP-defizienten menschlichen T2 Zelle Zeile10, am ehesten durch Darstellung der TAP-unabhängige Peptide41. Eine weitere Einschränkung unseres experimentellen Systems ist bietet eine schnelle Methode zum Ändern der Anzahl der Co-Agonist pMHC Moleküle zum Zwecke der Bestimmung der kritischen Höhe der Co-Agonist pMHC erforderlich, um T-Zell-Aktivierung auszulösen. Darüber hinaus erlaubt das Tetracyclin-induzierbaren System verwendet Titration der Agonist pMHC Menge der Ebene der einzelnen Zelle nicht durch Ändern der Tetracyclin-Konzentration, wie unterschiedliche Tetracyclin-Konzentration ändert sich den Anteil der positiven Zellen HLA-A2, eher als HLA-A2-Level pro Zelle. Ein alternativer Ansatz, den wir derzeit untersuchen soll mithilfe von unterstützten Lipid Bilayer42, früher co-Agonismus während der murinen CD4 + T Zelle Aktivierung4 untersuchen oder Perlen präsentiert Festbetrag von Agonist pMHC in der Vorhandensein von unterschiedliche Mengen an Co-Agonist pMHC. Bei Verwendung in Verbindung mit UV-spaltbaren Peptid-Technologie4,43sollte diese alternative experimentelle Systeme ermöglichen schnelle Prüfung von mehreren Co-Agonist Peptid Sequenzen sowie unterschiedliche Mengen an Co-Agonist pMHC .
Die sc-MHC-Technologie kann auch auf Untersuchung der co-Agonismus in menschlichen oder murine CD4-T-Zellen, anwendbar, wie einzelne Kette MHC Klasse II-Moleküle präsentieren vorbestimmt, dass Peptide erfolgreich auf Säugetier-Zelle Oberflächen44zum Ausdruck gebracht wurden. Darüber hinaus die Verwendung von sc MHC-Technologie zur Untersuchung der nicht-klassischen MHC-Moleküle wie HLA-E. erweiterbar SC HLA-E vor beschrieben worden, und seinen Ausdruck hat gezeigt, dass menschliche T-Zelle Aktivierung45hemmen. Ein weiterer nicht-klassischen MHC-Molekül des Interesses ist CD1, die Lipide statt Peptide46präsentiert. SC-Konstrukte bestehend aus CD1 schwere Kette und β2-Mikroglobulin wurde gezeigt, auf der Zelloberfläche ausgedrückt werden und relevante Lipid Liganden47zu binden. Einzelne Kette MHC-Technologie hat ein großes Potenzial als Recherche-Tool für die Untersuchung von molekularer Interaktionen während der T- und NK-Zell-Aktivierung.
The authors have nothing to disclose.
Diese Forschung wurde Singapur Gesundheitsministeriums National Medical Research Council unter seiner CBRG/0064/2014 zu N.R.J.G., indem erstellen unter seiner R571-002-012-592, P.A.M., National Research Foundation Investigatorship R571-000-272-281, P.A.M unterstützt. ., und durch einen Singapur translationale Forschung (Stern) Investigator Award (NMRC/Sterne/013/2012), A.B. Wir sind dankbar, Dr. Paul Hutchinson und Herr Teo Guo Hui von NUS Immunologie Programm Flow Core Facility für die kompetente Zellsortierung. Wir sind dankbar für Elijah Chen für kritische Lektüre des Manuskripts.
Aim-V (serum free media) | Gibco | 12055091 | |
blasticidin | Gibco | R21001 | |
Cytofix/Cytoperm (fixation/permealibisation kit) | BD | 554714 | |
F12 | Gibco | 10565-018 | |
Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SH3007103 | |
geneticin | Gibco | 10131035 | |
GolgiPlug (Brefeldin A) | BD | 555029 | |
Human serum | Sigma-Aldrich | H4522 | |
hygromycin | Gibco | 10687010 | |
Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA) | Sigma-Aldrich | L4144 | |
Opti-MEM (low serum media) | Bibco | 31985070 | |
10 X PBS | Vivantis | PB0344 – 1L | |
Penicillin/Streptomycin | HyClone | SV30010 | |
polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 408727 | |
recombinant human IL2 | R&D Systems | 202-IL | |
recombinant human IL7 | R&D Systems | 207-IL | |
recombinant human IL15 | R&D Systems | 247-ILB | |
tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | |
T-REx CHO cell line | Thermo Fisher Scientific | R71807 | |
10 x Trypsin/EDTA | Gibco | 15400054 | |
Antibodies | |||
CD3 | BD | 347347 | Clone SK7, RRID:AB_400287 |
CD8α | BD | 563795 | Clone RPA-T8, RRID:AB_2722501 |
CD107a | BD | 566261 | Clone H4A3, RRID:AB_2739639 |
HLA-A2 | eBioscience | 17-9876-41 | Clone BB7.2, RRID:AB_11151522 |
IFN-γ | eBioscience | 12-7319-41 | Clone 4S.B3, RRID:AB_1311250 |