Summary
在这里, 我们提出了一个协议, 用于构建一个细胞培养室, 旨在将细胞暴露在各种类型的电刺激中, 并将其用于治疗间充质干细胞, 以增强成骨分化。
Abstract
间充质干细胞 (mscs) 在组织工程方法中被广泛用于促进骨愈合。电刺激 (estim) 已被证明可以提高 msc 在体外的成骨分化, 并促进临床环境中的骨愈合。本文介绍了 estim 细胞培养室的结构及其在治疗大鼠骨髓源性 msc 中的应用, 以提高成骨分化。我们发现, 用 estim 治疗骨髓间充质干细胞7天可显著增加成骨分化, 重要的是, 这种支持成骨的作用在 (7天) estim 停止后长期存在。这种用 estim 预处理骨髓间充质干细胞以增强成骨分化的方法可用于优化骨组织工程治疗结果, 从而帮助其充分发挥治疗潜力。除了这种应用外, 此 estim 细胞培养室和协议还可用于研究其他 estim-shie 敏感细胞行为, 如迁移、增殖、凋亡和支架附着。
Introduction
创伤和疾病引起的骨缺损的增加正在使用不同的细胞治疗和再生医学技术的组合进行治疗。骨髓间充质干细胞是此类治疗的首选细胞, 因为它们具有相对较高的成骨活性、隔离和扩张效率以及安全性1。为了最大限度地提高其成骨活性, 从而优化其治疗效果, 已采用了几种方法来操作骨髓间充质干细胞, 然后再将其用于这些治疗 (如 mauney 等人2所述)。其中一种方法是 estim, 它已被证明可以提高 msc 在体外的成骨分化, 并促进体内骨愈合4。尽管越来越多的研究侧重于使用 estim 治疗骨髓间充质干细胞, 但最大限度地提高 estim 的原生骨效应的最佳方案尚未确定。
使用 estim 的其他体外方法利用淹没在培养基中的盐桥, 将细胞与金属电极分离5。这样做的好处是, 通过盐桥输送 estim 可消除可能具有细胞毒性的化学副产品 (例如金属电极腐蚀) 的引入。尽管有这一优势, 盐桥的工作很繁琐, 而且它们提供的 estim 与在体内模型中提供的东西不同, 因此在使用这两个系统时很难将获得的结果关联起来。通过固定在细胞培养井内的金属或碳电极提供 estim 的设置 (由 Hronik-Tupaj 和 kaplan6审查), 更好地模拟在体内使用的设备;然而, 这些设备很难在使用之间进行消毒, 每次实验可以研究的细胞数量有限。我们设计了这里介绍的 estim 室, 专门针对这些其他设置的局限性。虽然我们使用这个 estim 室的经验大多是2d 和3d 培养包含骨骨髓和脂肪组织衍生的 mscs 3, 4,这个室的一个主要好处是它是多才多艺, 相对较小变化, 可以适应研究其他细胞类型下的各种不同条件。
在这里, 我们描述了一个 estim 细胞培养室的建设;然后, 我们通过不同的 estim 方案治疗骨髓间充质干细胞并测量其对成骨分化的影响来证明其应用。msc 成骨分化是通过钙沉积、碱性磷酸酶活性和成骨标记基因表达进行评估的。重要的是, 在过去使用这种设置的实验中, 我们观察到, 在 estim 治疗停止后很久, 这些有利于成骨的效果依然存在。
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Protocol
1. 电刺激细胞培养室的构建
- 建立 estim 腔, 收集两个盖的标准6井细胞培养板;99.99 的铂金线, 长度60厘米, 直径 0.5-1 毫米;镀银铜丝, 长度70厘米, 直径0.6 毫米;切割钳;焊铁套件;一管超导胶;一个线端子端子连接器, 六个 2.2 v 小 led (可选);一管无腐蚀性硅胶涂层 (可选);一卷黑色电气绝缘胶带;标准、柔性、绝缘铜线 (0.14mm 2), 长度2米 (材料表)。
- 在6井板盖中, 标记并钻两个孔 (直径约为1毫米), 相距25毫米, 靠近六个井的外缘 (共12个孔), 如图 1a. b 所示。
- 切割 12 5 厘米长的铂金线与切割钳。将每根电线手动弯曲成 l 形, 使一端长3厘米, 另一端长2厘米. 将镀银的电线切割成两个35厘米长的电线。
- 将一根铂金金属丝 (从内到外) 的较长 (3 厘米) 弯曲端插入每个钻孔, 使从盖子外部突出1-2 毫米, 用钳子弯曲。用超导胶将盖子孔中的铂金线固定起来, 使其干燥约6小时。
- 焊接所有六根铂金线的尖端 (后来将作为阴极, 见图 1a) 从盖子突出到镀银电线之一。重复同样的步骤, 将剩余的6条铂金线 (后来将用作阳极) 焊接到其他镀银线上。
- 在六个阳极阴极铂电极对之间的电路中添加 led, 以确认实验期间的功能 (可选)。在每个 led 下方放置一块黑色绝缘胶带, 以防止将培养板中的电池暴露在 led 灯下 (图 1c)。
- 将接线端子接头粘附到6井板盖的左上角, 并将两条镀银电线连接到输入端子, 如图 1 c 所示。
- 从第二个6井板盖的左上角剪下一个20毫米 x 20 毫米的部分 (图 1 b, lid nr. 2), 以容纳第一个盖上的端子块连接器。盖上第一个盖子, 上面装有电极, 用第二个盖子, 用胶带把它们粘在一起。
- 为了改善两个盖板的粘合, 请使用有机硅粘合剂涂层 (可选)。为此, 请用 3-5 mm 的硅胶层覆盖盖子, 并用另一层硅胶覆盖盖子, 使胶粘剂干燥12小时。
- 将两个标准绝缘铜线的一端连接到电线连接器的输出端子, 将另一端连接到香蕉男性连接器 (4 mm)。
注: 这些电线的长度取决于从孵化器中的架子 (细胞将被存放的地方) 到孵化器外的电源的距离 (图 1d)。 - 通过调节直流电源, 调整提供给电池的 estim 的剂量 (电压) 和方案。
- 按前面板上的on/off按钮, 打开电源。按下按钮1激活通道1。
- 按下按钮 nr . 4 (v 组) 以设置电压。按按钮2和 5将负载输出设置为 2.5 v. enter.
- 根据下面的简化方程, 确保 2.5 v (2, 500 mv) 的负载输出与 100 mvm 的 estim 相对应。
v 型estim =
;或
v = vestim xd
在这里, v = 电源电压输出以毫伏为单位;d = 电极之间的距离 (毫米);v 型estim = 每毫米毫伏的刺激电压。
注: 此简化仅适用于直流电压恒定的情况。介质和电池之间的电阻可以忽略不计, 因为电极与电池没有直接接触;相反, estim 通过培养基传递到细胞。
;或2. 成骨培养基中的间充质干细胞培养
- 在实验当天之前, 购买和储存商业上可用的液氮大鼠 mscs (见材料表)。或者, 根据其他地方公布的协议, 根据当地的实验动物使用法规, 将骨髓间充质干细胞与其他动物隔离开来。
- 在实验当天, 从液氮储存中取出一个小瓶 (1 x10 6 细胞) 的骨髓间充质干细胞, 并在预热至37°c 的水浴中快速 (1分钟内) 解冻细胞。
- 在层流罩的无菌条件下, 将小瓶含量移入50毫升猎鹰管, 并加入9毫升的正常培养基 (nm) 预热至 37°c, 其中包括 dulbecco 改性的 eagle 培养基 (dmem; 1x), 其中含有10% 的热灭活胎牛血清 (fbs) 和1%青霉素/链霉素溶液。用离心离心法将细胞颗粒状 5分钟, 在 300 x g处进行。
- 在层流罩中, 取出上清液, 并在 nm 预热至37°c 的12毫升中仔细地重新悬浮细胞颗粒。将重新悬浮的细胞转移到 t-75 细胞培养瓶中。
- 在 37°c, 5% co 2, 5% o2培养细胞, 直到它们达到 80%-90% 的融合 (大约3-5天后)。
- 通过细胞。
注: 在层流罩中进行所有操作, 但在无菌条件下进行离心和孵育。- 达到80–90% 的融合后, 用细胞分离溶液回收细胞。吸入细胞培养基, 用1x 磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 清洗 2倍, 加入1x 细胞分离溶液5毫升, 并将细胞返回孵化器5分钟。
- 一旦细胞被分离, 添加相同数量的培养基来停用分离溶液。收集细胞在一个50毫升猎鹰管, 并旋转他们在 300 x克 5分钟。
- 丢弃培养基, 在新鲜正常培养基1毫升中重新悬浮细胞。用色氨酸蓝染色评估活细胞的数量。
- 种子 1 x 106细胞在一个新的 t-75 烧瓶与12毫升预热 nm。在 37°c, 5% co 2, 5% o2 培养细胞,直到它们达到 80%-90% 的融合。
注: 单元格通过 (步骤 2.4.1 2.4.4) 可以重复几次, 直到获得所需的单元数。不要使用早于通道8的细胞。
- 种子 9 x 10 4 细胞在3毫升 nm (10% 热灭活的胎儿牛血清, 1% 青霉素/链霉素, dmem) 在每个井的6井培养板。在37°c、5% co2、5% o2 下将细胞培养 1天.
- 第二天, 抽吸培养基, 应用3毫升成骨分化培养基 (om; 正常培养基补充 10-7 mm 地塞米松, 10 mm β-甘油磷酸盐, 0.05 mm 抗坏血酸-2-磷酸).
- 将6孔板与细胞放在孵化器中, 在37°c、5% co2、5% o2 处孵育.
3. 用 estim 治疗骨髓间充质干细胞
- 在细胞进行 estim 处理的当天, 在70% 乙醇溶液中对电极进行30分钟的灭菌;然后, 在安全柜中的 uv 光下将其干燥30分钟。
- 在层流罩中, 盖上6孔板, 其中包含带电极盖的培养的 mscs, 确保电极完全淹没在介质中 (如有必要, 添加介质)。将覆盖的6井板 (estim 腔) 与电池转移到孵化器, 并将其电线连接到电源上。
- 将电源设置为 2.5 v 负载输出, 并用 estim 处理1小时 3,9的电池。
- 刺激后, 断开电源, 并从孵化器中取出 estim 腔。在无菌条件下, 更换带有标准6井板盖电极的盖子。
- 将细胞送回孵化器, 让它们过夜。首先用 pbs 清洁电极, 然后用70% 的乙醇溶液清洗电极。用细砂纸清洗电极表面积累的腐蚀产物。
- 连续6天重复步骤3.1–3.5。第4天, 在施用 estim 之前, 在无菌条件下, 通过吸气 1.5 ml 培养基, 用 1.5 ml 的预热新鲜 om 取代培养基, 改变培养基。
- 连续应用 estim 7天后, 将培养中的细胞保持7天以上, 每3-4天更换一次培养基。
4. 成骨分化测量
- 在显微镜下分析细胞形态的变化。
- 评估 estim 对 msc 成骨分化的影响, 测量钙沉积、碱性磷酸酶活性和成骨标记基因表达, 如其他 3,9所述。
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Representative Results
为了评价 100 mV/mm 对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响, 通过对形态变化和钙沉积的评估, 在培养的第14天对经过3、7、14天或未经处理 (对照) 的细胞进行了分析 (图 2)).这是通过使用明亮的场显微镜 (形态变化) 或固定4% 的聚甲醛溶液中的细胞, 用0.02% 的 alizarin 红色溶液对其进行成像的, 然后用明亮场显微镜 (钙沉积) 对其进行成像分析)。
在培养的第3天、第7天和第14天对成骨标记基因表达的变化进行了详细分析 (图 3)。这是通过测量基因runx2,胶原蛋白 i, 骨桥蛋白和奥斯特里克里克的相对表达通过 rt-qpcr 和比较三角洲 ct (阈值) 方法10, 其中将家务基因 rplp1和ywhaz11 用于归一化。
将骨髓间充质干细胞暴露在 100 mV/mm estim 上 3天 (每天 1小时) 没有效果;然而, 7天的接触导致成骨分化的增加, 这取决于形态的变化 (图 2a-c)、钙沉积 (图 2e-g) 和成骨标记基因的表达变化 (图2e-g)图 3)与没有 estim 的时间匹配的控制相比。长期暴露 estim (14天) 并没有进一步增强治疗后7天的成骨分化 (图 2d、h和图 3)。
如图 2所示, 使用 estim 处理7天和14天的细胞比使用 estim 治疗3天或未经处理的细胞 (图 2a, b) 的细胞出现更多的浓缩 (图 2A, d), 并显示钙增加沉积 (图 2g, h) 与仅经过3天处理或未经处理的对照(图 2G, f) 相比。对3、7和14天培养过程中成骨标记表达的分析证实, 在使用 estim 治疗的细胞中, 7 天和14天的成骨分化增强 (图 3)。在 estim 治疗7天的细胞中, 12runx2、 i 型胶原蛋白、骨桥蛋白和oster物的表达最高。
图1:estim 细胞培养室.(a) estim 腔的电气电路图, 显示连接到直流电源的阳极 (黑色)、阴极 (红色) 和 led。(b) 6 井板盖和 l 形铂电极 (底视图) 的图像, 包括在6井板盖中。(c) 将 estim 室 (顶视图) 与电线连接器、led 和电气绝缘胶带组装, 以保护电池不受 led 灯 (箭头) 的影响。(d) estim 细胞处理设置与 estim 室在孵化器连接到直流电源, 在外部。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: estim 对 msc 形态和钙沉积的影响.成骨培养基中的细胞, 暴露和不暴露 (对照) 100 mvmm 的 estim 3, 7, 和 14天 (1 h 天)。(A–D)培养第14天的形态和 (e–h) 钙沉积 (利沙林红染色)。在用 estim 处理的 (c和 g) 7 和 (d 和h) 14天 (10倍放大倍率; 刻度柱 = 200μm) 的细胞中, 细胞形态和钙沉积发生了显著变化。这一数字是由 eesen-loges 等人修改的.9.请点击此处查看此图的较大版本.
图 3:estim 对 msc 成骨标记基因表达的影响.在经过 estim 处理3、7和14天或未经处理的细胞中, 成骨标记基因表达 (在培养第3天、第7天和第14天用 rt-qpcr 测量)。(a) 在培养第7天, 在使用 estim 治疗7天的细胞中, runx2的表达明显高于其他细胞。(b) 在培养第14天测量的7天处理的细胞中, colia1的表达明显较高。(c) 骨桥蛋白在培养第3、第7和14天的培养中, 在estin 处理的细胞中的表达显著增加。(d) 在所有时间点的控制细胞中都没有osterix表达, 在暴露于 estim 的细胞中只在7天和14天的培养时间内看到。柱线上的不同字母表明各组在同一时间点存在显著差异 (p < 0.05)。星号表示同一组中时间点之间的显著差异 (p < 0.05)。这一数字是由 eechen-loges 等人修改的。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
在这里, 我们描述了一个房间的结构和方法, 治疗间充质干细胞与 estim, 导致增强成骨分化。
所介绍的 estim 设置不需要特殊的设备知识, 可以由初级研究人员在标准的干细胞生物学-生物化学实验室中进行。然而, 在建造和使用 estim 室时, 必须在几个关键步骤中采取特别谨慎措施。在处理铂金电极时, 必须格外小心, 因为这种金属具有很强的延展性和细腻性。虽然可以使用其他金属, 如钢或钨, 但不建议使用这些金属, 因为它们容易腐蚀, 而腐蚀可能是细胞毒性的 13。此外, 使用电极对盖子进行清洗必须按照协议中所述的精确进行, 因为这种方法已反复测试, 并被发现对消除污染问题有效。最后, 虽然这个室可以用来研究其他环境敏感的细胞活动, 如迁移14,15, 增殖, 凋亡16, 细胞膜电压17, 和支架粘附19,我们在这里描述的 estim 协议 (100 mv/mm, 1天, 7天) 只关注大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化. 如果使用较高的电压 (≥150 mv/mm) 和/或更长的周期 (& gt;
estim 室可能出现的故障可能是由于反复使用后电路中断造成的, 并且可以通过添加的 led 灯进行监测。在破损的情况下 (由非照明 led 灯指示), 盖子可以被拆除, 并容易拆卸, 以识别和修复破损。此外, estim 室的简单设计使其易于根据不同实验设置的需要和分析方法进行修改。例如, 使用不同尺寸的细胞培养板, 只需改变电极的长度和距离, 或使用陶瓷支架材料4或导电基板18添加不同的 (3d) 培养条件, 通过只需将这些材料与电池一起播种在电极之间即可。
与所有体外实验一样, 在 estim 腔中观察到的细胞行为和功能并不总是直接转移到体内模型中。因此, 在解释室内 estime 诱导的细胞行为时, 研究人员必须始终考虑到这一点。
与其他用于将细胞暴露在 estim 中的体外方法 (具有盐桥5的系统和细胞培养井中包含电极的系统 19) 相比, 这里介绍的设置和方法有许多优势。这里描述的系统的一个重要优点是, 由于细胞是在标准的6孔板中培养的, 因此可以在其他体内或体外协议中的 estim 治疗后使用。此外, 电极固定在6井板的盖子上, 使得在实验之间对设备进行清洗和消毒并进行再利用也很容易。最后, 同时刺激六口井细胞的能力为分析和重现性提供了充足的材料。
为了更好地了解在细胞膜水平上 estim 影响细胞活动的机制, 在正在进行的研究中使用这里描述的腔, 我们正在探索外部提供的 estim 和细胞膜之间的关系电位 (vmem)17。此外, 根据前面的研究结果9, 在今后的研究中, 我们将在室内使用 estim、单独和使用不同的三维支架以及导电基板对细胞进行预处理, 以刺激特定的细胞功能;然后, 我们将它们植入动物模型, 以确定它们是否在体内保留观察到的增强功能。这些研究将有助于越来越多的信息体, 这些信息涉及 estim 调节细胞功能的机制, 并在此过程中有助于优化再生医学和组织工程的细胞治疗方法治疗。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了总部设在德国法兰克福/美因河畔的 ao 基金会启动赠款 (s-14-03h) 和弗里德里希希希林基金会 (stiftung friedrichsheim) 的部分支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Estim fabrication | |||
| Banana connector/Jack adaptor | Poppstars | 1008554 | 2 pieces |
| Cutting pliers | Knipex | 78 03 125 | |
| DC power supply (0-30V/0-3A) | B&K Precision | Model 9130B | Any simular model could be used |
| Insulated flexible wires (0.14 mm2) | Conrad Electronic International | 604794, 604093 | 2 pieces |
| Non-corrosive silicone rubber | Dow Corning | 3140 RTV | *could be purchased by many stores |
| Platinum Wire (999,5/1000; 1mm ø) | Junker Edelmetalle | 00D-3010 | 0.6 m needed for 1 Estim chamber |
| 70% Ethanol solution | any | Sterilisation of Estim chamber | |
| Silver coated copper wire (0.6 mm ø) | Conrad Electronic International | 409334 - 62 | ≈70 cm needed for 1 Estim device |
| Soldering iron Set | Conrad Electronic International | 1611410 - 62 | Any simular model could be used |
| TPP 6-well plate lid | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | 2 lids for Estim chamber |
| 2.2V wired circular LEDs | Conrad Electronic International | 599525 - 62 | 6 pieces |
| UHU Super glue | UHU GmbH & Co. KG | n/a | *could be purchased by many stores |
| MSC culture | |||
| β-Glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G9422 | osteogenic cell culture |
| DMEM, low glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Thermo-Fischer Scientific | 21885025 | cell culture |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo-Fischer Scientific | 14190144 | cell culture |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | osteogenic cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo-Fischer Scientific | 10500064 | cell culture |
| 50 ml Falcon tube | Sarstedt | 62,547,004 | cell culture |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | osteogenic cell culture |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fischer Scientific | 15140122 | cell culture |
| Sprague-Dawley (SD) rat mesenchymal stem cells, bone marrow origin | Cyagen | RASMX-01001 | cell culture |
| Cell detachment solution | Thermo-Fischer Scientific | A1110501 | cell culture, cell detachment |
| TC Flask, T75 | Sarstedt | 833911302 | cell culture |
| TPP 6-well plates | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | cell culture |
| Trypan Blue Dye, 0.4% solution | Bio-Rad | 1450021 | cell count |
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