Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול להקמת תא התרבות תאים שנועדו לחשוף תאים לסוגים שונים של גירוי חשמלי, ושימוש בו בטיפול גזע mesenchymal כדי לשפר את הבידול osteogenic.
Abstract
תאי גזע mesenchymal/סטרומה (MSCs) נעשה שימוש נרחב כדי לקדם את עצם ריפוי ברקמות הנדסה גישות. גירוי חשמלי (EStim) הוכח להגדיל MSC בידול osteogenic במבחנה, לקדם את עצם ריפוי בהגדרות קליניים. כאן נתאר הקמת חדר תרבות תא EStim ואלשין השימוש בטיפול עצמות מח-נגזר MSC כדי לשפר את הבידול osteogenic. מצאנו כי בטיפול MSCs עם EStim במשך 7 ימים גורמת לעליה משמעותית הבידול osteogenic, חשוב, אפקט pro-osteogenic זה נמשכת זמן רב לאחר (7 ימים) EStim הוא הופסק. גישה זו של pretreating MSCs עם EStim כדי לשפר את הבידול osteogenic יכול לשמש כדי למטב את רקמת העצם הנדסה תוצאות הטיפול, לפיכך, לסייע להם לממש את הפוטנציאל הטיפולי מלאה שלהם. בנוסף יישום זה, הזה EStim תא תרבות קאמרית, פרוטוקול יכול לשמש גם כדי לחקור התנהגויות תא רגיש EStim אחרות, כגון העברה, התפשטות, אפופטוזיס מצורף לגרדום.
Introduction
עלייה טראומה ו/או פגמים הנוצרות על-ידי מחלת עצם מטופלים באמצעות צירופים שונים של טיפול בתאי וטכנולוגיות רפואה רגנרטיבית. MSCs הם התא לפי בחירה, טיפולים כאלה, בשל פעילות osteogenic יחסית גבוהה, בידוד, הרחבת והיעילות, בטיחות1. על מנת למקסם את הפעילות osteogenic שלהם, לכן, למטב את האפקטיביות הטיפולית שלהם, הוכנסו מספר שיטות לטיפול MSCs לפני השימוש בטיפולים אלה (כפי שנסקרו על ידי Mauney et al.2). שיטה אחת כזאת היא EStim, אשר הוכח לשפר MSC בידול osteogenic חוץ גופית3 ולקדם את עצם ריפוי ויוו4. למרות המספר הגדל והולך של לימודי התמקדות בטיפול MSCs עם EStim, משטר אופטימלית עבור למקסם את אפקט pro-osteogenic של EStim טרם מוגדר.
שיטות הפריה אחרות באמצעות EStim לנצל את גשרי מלח בתוך המדיום תרבות, המפריד בין תאים אלקטרודות מתכתי5. היתרון של זה היא כי אספקת EStim באמצעות גשרים מלח מבטלת המבוא של לוואי כימיות (למשל, קורוזיה של אלקטרודות מתכתי) שעשויים להיות ציטוטוקסיות. למרות יתרון זה, גשרי מלח הם מסורבלים כדי לעבוד עם, EStim הם מספקים שונה כי מודלים ויוו ונמסרו ב, ולכן קשה לתאם את התוצאות המתקבלות בעת שימוש את שתי המערכות. כיוונוני לספק EStim באמצעות אלקטרודות מתכתי או פחמן קבוע בתוך הבארות התרבות התא (כפי שנסקרו על ידי Hronik-Tupaj, קפלן6) כדאי לדמות התקנים המשמשים ויוו; עם זאת, התקנים אלה שקשה לנקות/לחטא בין שימושים, מספר התאים שניתן ללמוד לכל ניסוי מוגבל. תיכננו תא EStim המובאים כאן במיוחד כדי לטפל המגבלות של אלה כיוונונים אחרים. בעוד רוב הניסיון שלנו באמצעות לשכת EStim הזה כבר עם 2D ו 3D תרבויות המכיל מח עצם ושומן-רקמה-נגזר MSCs3,4, אחד היתרונות המרכזיים של החדר הזה זה תכליתי והוא, עם יחסית מינורי שינויים, ניתן להתאים ללמוד את סוגי תאים אחרים תחת מגוון תנאים שונים.
כאן נתאר את בניית חדר תרבות תא EStim; לאחר מכן, נדגים את השימוש בו על ידי MSCs בטיפול עם משטרי שונים של EStim ומדידת האפקט המתקבל על בידול osteogenic. בידול osteogenic MSC מוערך באמצעות התצהיר סידן פעילות פוספטאז אלקליין, ביטוי גנים סמן osteogenic. חשוב, ב עבר ניסויים בשימוש תוכנית התקנה זו, הבחנו כי השפעות פרו-osteogenic אלו נמשכות זמן רב לאחר הטיפול EStim הופסק.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. בנייה לשכת התרבות של גירוי חשמלי תא
- כדי לבנות תא EStim, לאסוף את העפעפיים שני לוחות תרבות תא 6-ובכן תקן; 99.99% פלטינה חוט, 60 ס"מ אורך בקוטר של 0.5-1 מ מ; חוט נחושת מצופה כסף, 70 ס מ אורך בקוטר 0.6 מ"מ; פלייר למהנדס חשמל; מלחם קיט; שפופרת אחת של דבק superconductive; חוט אחד מסוף לחסום מחבר, שישה קטנים 2.2 V נוריות (אופציונלי); שפופרת אחת של דבק סיליקון חלד ציפוי (אופציונלי); גליל אחד של סרט בידוד חשמלי שחור; תקן, גמיש, מבודדים נחושת חוט חשמלי (0.14 מ מ2), 2 מטר אורך (טבלה של חומרים).
- מכסה צלחת 6-ובכן, מארק, ואז תרגיל שני חורים (בקוטר של ~ 1 מ מ), 25 מ מ זו מזו, ליד הקצה החיצוני של כל אחד מששת בארות (12 חורים סה כ), כפי שמוצג איור 1A, B.
- חתך אורכי 12 5 ס מ של חוט פלטינה עם מגזריים. לכופף כל אחד החוטים ידנית לתוך צורת L, עוזב את קצה אחד ארוך 3 ס"מ וחותכים השני 2 ס מ. הכבל מצופים כסף לתוך שני אורכי 35 ס מ.
- להוסיף יותר זמן (3 ס"מ) כפוף סוף חוט פלטינה (מ פנימה להוציא) לתוך כל חור מסועף, להשאיר 1-2 מ מ בולטות מבחוץ של המכסה, לכופף אותו באמצעות מלקחיים. לאבטח את החוטים פלטינה החורים המכסה עם דבק superconductive ולהשאיר לו להתייבש במשך כ- 6 שעות.
- הלחמה קצות כל החוטים פלטינה 6 (זה מאוחר יותר לשמש cathodes, ראה איור 1A) מהעורקים עפעפיו לאחד החוטים מצופה כסף. חזור על הליך דומה הלחמה החוטים הנותרים פלטינה 6 (שישמש מאוחר יותר אנודות) לכבל אחרים מצופה כסף.
- הוסף נוריות במעגל בין כל אחת של שש אנודת-קטודה אלקטרודת פלטינה הזוגות, לאשר פונקציונליות במהלך הניסויים (אופציונלי). מניחים חתיכת סרט בידוד שחור תחת כל הוביל כדי למנוע חשיפת התאים צלחות תרבות נורית ה-LED (איור 1C).
- הדבק המחבר מסוף לחסום תיל כדי לפינה השמאלית העליונה של המכסה 6-ובכן צלחת וחבר שני חוטים מצופים כסף המסופים קלט, כפי שמוצג באיור 1C.
- לגזור מקטע 20 מ מ x 20 מ מ מהפינה השמאלית העליונה של מכסה 6-ובכן צלחת השני (איור 1B, המכסה Nr. 2) כדי להכיל את המחבר מסוף לחסום את המכסה הראשון. מכסה את המכסה הראשון, מצויד האלקטרודות, עם המכסה השני, להדביק אותם ביחד עם סרט דביק.
- כדי לשפר את התקשרות של הכיסוי שני, השתמש דבק סיליקון ציפוי (אופציונלי). כדי לעשות זאת, מכסה את המכסה עם האלקטרודות כסף עם 3-5 מ מ שכבה של דבק סיליקון, ולכסות המכסה אחרים, ומאפשר 12 שעות על הדבק להתייבש.
- חבר קצה אחד שני רגיל החוטים נחושת מבודד המסופים פלט של המחבר תיל ומסתיים אחרים למחברים זכר בננה (4 מ מ).
הערה: אורך החוטים האלה תלוי המרחק מן המדף בחממה, שבו התאים יישמר, לספק הכוח, מחוץ החממה (איור 1D). - להתאים את המינון (מתח), משטר של EStim להעביר התאים על ידי ויסות אספקת חשמל DC.
- הפעל את אספקת החשמל על-ידי לחיצה על כפתור ON/OFF בלוח הקדמי. להפעיל ערוץ 1 על ידי לחיצה על לחצן 1.
- הקש על לחצן Nr. 4 (V-set) כדי להגדיר את המתח. עיתונות כפתורים 2, . ו- 5 כדי להגדיר את הפלט טען ב- 2.5 (פ') הקש Enter.
- להבטיח כי הפלט עומס של 2.5 V (2,500 mV) מקביל EStim mV/מ"מ, לפי המשוואה הבאה, פשוטה.
V EStim =
; או
V = VEStim × d
. הנה, V = מתח פלט במילי-ואטים; d = המרחק בין האלקטרודות במילימטרים; V EStim = המתח גירוי במילי-ואטים לכל מילימטר.
הערה: פישוט זה חלה רק במקרה של מתח DC מתמדת. ההתנגדות בין המדיום לבין התאים הוא זניח כמו אלקטרודות שאינם נמצאים במגע ישיר עם התאים; במקום זאת, EStim מועבר לתאים דרך המדיום.
; או2. mesenchymal תא גזע תרבות osteogenic בינוני
- לרכוש ולאחסן MSCs עכברוש זמינים מסחרית (ראו טבלה של חומרים) בחנקן נוזלי עד היום של הניסוי. לחלופין, בידוד MSCs מבעלי חיים אחרים על פי פרוטוקולים שפורסם במקומות אחרים7,8 על פי תקנות מוסדיים מקומיים לשימוש של חיות ניסוי.
- ביום של הניסוי, להסיר את בקבוקון אחד (1 x 106 תאים) של MSCs האחסון חנקן נוזלי, במהירות (תוך 1 דקות) והפשרה של התאים בתוך אמבט מים טרופה על 37 מעלות צלזיוס.
- בתנאים סטריליים ב תא למינארי, pipette את התוכן המבחנה לתוך צינור בז ' 50 מל ' ולהוסיף 9 מיליליטר בינונית רגילה (ננומטר) prewarmed עד 37 ° C, המורכב בינוני הנשר של Dulbecco ששונתה (DMEM; 1 x) עם 10% לא פעיל חום העובר שור סרום (FBS) ו- 1% פתרון פניצילין/סטרפטומיצין. גלולה את התאים עבור 5 דקות על ידי צנטריפוגה ב x 300 גרם.
- תא למינארי, להסיר את תגובת שיקוע, בזהירות resuspend בגדר תא ב 12 מ של NM prewarmed ל- 37 מעלות צלזיוס. העבר את התאים resuspended בקבוקון התרבות של תאים T-75.
- התרבות התאים 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 עד שיגיעו למפגש של 80% – 90% (לאחר כ 3-5 ימים).
- המעבר את התאים.
הערה: ביצוע כל הפעולות מלבד צנטריפוגה הדגירה בתנאים סטריליים תא למינארי.- כשמגיעים זרימה של 80% – 90%, לאחזר את התאים עם פתרון ניתוק התא. תשאף המדיום התרבות תאים, לשטוף 2 x עם 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS), הוסף 5 מ של 1 x פתרון ניתוק התא, וחוזרים התאים החממה במשך 5 דקות.
- ברגע התאים מנותקים, להוסיף כמות שווה של תרבות בינוני כדי להשבית את הפתרון ניתוק. לאסוף את התאים בשפופרת בז 50 מ ל, לסובב אותם ב 300 x גרם במשך 5 דקות.
- למחוק את המדיום, resuspend תאים 1 מ"ל של מדיום נורמלי טריים. להעריך את מספר התאים קיימא עם הכתם trypan blue.
- זרע עונה 1 פרק 106 תאים בבקבוקון T-75 חדש עם 12 מ של prewarmed ננומטר. התרבות התאים 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 עד שיגיעו למפגש של 80% – 90%.
הערה: תא passaging (צעדים 2.4.1–2.4.4) יכול לחזור כמה פעמים עד המספר הדרוש של תאים מתקבל. אל תשתמש שגילן עולה על המעבר 8 תאים.
- זרע 9 x 104 תאים ב- 3 מ"ל של NM (10% לא פעיל חום העובר שור סרום, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, DMEM), כל טוב של צלחת 6-ובכן תרבות. דגירה התאים ליום 1-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, 5% O2.
- למחרת, תשאף תרבות בינוני ולהחיל 3 מ"ל של בידול osteogenic בינוני (אום; בינונית רגילה בתוספת 10-7 מ' דקסמטסון 10 מ מ β-glycerophosphate, מ מ 0.05 חומצה אסקורבית-2-פוספט).
- מקום 6-ובכן לצלחת עם תאים בחממה, דגירה 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 בן לילה.
3. טיפול MSCs עם EStim
- ביום שהתאים מטופלים עם EStim, לעקר את האלקטרודות בפתרון אתנול 70% למשך 30 דקות; לאחר מכן, יבש אותם תחת אולטרא סגול בבטיחות בארון למשך 30 דקות נוספות.
- ב תא למינארי, לכסות את הצלחת 6-ובכן המכיל את MSCs תרבותי עם המכסה מצויד האלקטרודות, מוודא כי האלקטרודות לחלוטין טובע בינוני (אם יש צורך, להוסיף בינוני). להעביר את הצלחת 6-ובכן מקורה (EStim קאמרית) עם תאי החממה וחבר שלה חוטים לספק הכוח.
- הגדר את אספקת החשמל 2.5 V פלט טעינה ולפנק את התאים עם EStim עבור 1 h3,9.
- לאחר גירוי, נתק את אספקת החשמל, להסיר את התא EStim החממה. תחת תנאים סטריליים, להחליף את המכסה מצויד עם אלקטרודות עם מכסה תקן 6-ובכן צלחת.
- להחזיר את התאים החממה ולהשאיר אותם בן לילה. לנקות את האלקטרודות, תחילה עם PBS ולאחר מכן עם 70% אתנול פתרון. לנקות את המוצרים קורוזיה שהצטברו מהמשטח אלקטרודה עם נייר זכוכית עדין.
- חזור על שלבים 3.1 – 3.5 6 ימים רצופים. יום 4, לפני החלת EStim, תחת תנאים סטריליים, לשנות המדיום תרבות על-ידי כ רפה בעברית 1.5 מיליליטר בינוני והחלפתו 1.5 מיליליטר המפרך טרי prewarmed
- לאחר החלת EStim 7 ימים רצופים, לשמר את התאים בתרבות 7 ימים נוספים, להחלפת המדיום כל 3-4 ימים.
4. מדידות בידול osteogenic
- לנתח את השינויים מורפולוגיה תאים במיקרוסקופ.
- כדי להעריך את השפעת EStim על MSC בידול osteogenic, מדד סידן התצהיר, פעילות פוספטאז אלקליין osteogenic סמן ביטוי גנים, כפי שתואר במקומות אחרים3,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי להעריך את ההשפעה של 100 mV/מ מ EStim על הבידול osteogenic של MSCs, תאים שטופלו EStim עבור 3, 7, ו 14 ימים או nontreated (בקרה) נותחו ביום 14 של culturing על-ידי הערכת שינויים מורפולוגיים ומשקעים סידן (איור 2 ). הדבר נעשה על-ידי הדמיה תאים באמצעות מיקרוסקופיית שדה בהיר (מורפולוגיה שינויים) או תיקון התאים בפתרון paraformaldehyde 4%, מכתימה אותם עם פתרון alizarin אדום 0.02%, לאחר מכן הדמיה אותם באמצעות מיקרוסקופיית שדה בהיר (סידן התצהיר ניתוח).
ניתוח מפורט של סמן osteogenic ג'ין ביטוי שינויים בוצעה ימים 3, 7 ו-14 culturing (איור 3). הדבר נעשה על ידי מדידת את הביטוי היחסי של הגנים RunX2 קולגן אני, Osteopontin, Osterix על-ידי RT-qPCR ודלתא השוואתית של Ct (מחזור ערכי הסף) שיטת10, היכן ניקיון הגנים Rplp1 ו- Ywhaz11 שימשו נורמליזציה.
חשיפת MSCs כדי 100 מ"מ/mV של EStim במשך 3 ימים (1h ליום) לא היתה השפעה; עם זאת, 7 ימים של חשיפה הביא לעלייה בידול osteogenic, כפי שנקבע על-ידי שינויים מורפולוגיה (איור 2 א– ג) בתצהיר סידן (2E איור– G), סמן osteogenic ג'ין ביטוי שינויים ( איור 3) בהשוואה פקד מתאימים-זמן ללא EStim. חשיפה ממושכת EStim (14 ימים) לא לשפר עוד יותר את הבידול osteogenic מעבר לכך ראיתי לאחר 7 ימי טיפול (איור דו-ממדיH , איור 3).
כפי שמוצג באיור2, תאים שטופלו EStim 7, 14 ימים הופיע מצומצמת יותר (איור 2CD) מאלה שטופלו EStim במשך 3 ימים או תאים nontreated (איור 2 אב') והראה של סידן מוגברת התצהיר (איור 2GH) בהשוואה לאלו שטופלו רק 3 ימים או פקדים nontreated (איור 2EF). ניתוח של הביטוי סמן osteogenic-3, 7 ו- 14 ימי culturing אישר את הבידול osteogenic משופרת תאים שטופלו EStim 7 ל 14 ימים (איור 3). הביטוי של גנים osteogenic בידול-הקשורות סמן12RunX2 קולגן אני, Osteopontin, Osterix היו הגבוהים ביותר ב תאים שטופלו EStim במשך 7 ימים.
איור 1: לשכת התרבות תא EStim. (א) דיאגרמת מעגל חשמלי של EStim קאמרית מציג אנודות (שחור), cathodes (אדום), וכן נוריות מחובר למקור הכוח DC. תמונה (B) של צלחת 6-ובכן מסומן העפעפיים, אלקטרודות הפלטינה בצורת L (התצוגה התחתונה) שולבו המכסה צלחת 6-. טוב. (ג) התכנסו EStim קאמרית (מבט מלמעלה) עם חוט מחבר, נוריות סרט בידוד חשמלי מגן תאים מן נורית ה-LED (חיצים). (ד) EStim תא טיפול ההתקנה עם תא EStim בחממה מחובר של אספקת החשמל של DC, מבחוץ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: השפעת EStim על התצהיר מורפולוגיה וסידן MSC. תאים osteogenic בינוני תרבות, חשופים, לא חשוף (שולטת) 100 mV/מ מ EStim עבור 3, 7, ו- 14 ימים (1 h/יום). (א-ד) (E-H) ומורפולוגיה התצהיר סידן (alizarin אדום צביעת) ביום 14 של culturing. שינויים משמעותיים במרבצי מורפולוגיה וסידן בתא היו גלויות ב תאים שטופלו EStim עבור (C ו- G) 7 (פיתוח , H) 14 ימים (10 x הגדלה; סרגל קנה מידה = מיקרומטר 200). איור זה שונה מ- Eischen-Loges et al. 9. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: אפקט של EStim על ביטוי גנים MSC סמן osteogenic. סמן osteogenic בביטוי הגן (נמדד עם RT-qPCR ימים 3, 7 ו-14 culturing) בתאים מטופלים עם EStim 3, 7 ו- 14 ימים, או nontreated. (א)-יום 7 של culturing, הביטוי RunX2 היה גבוה משמעותית בתאים שטופלו EStim במשך 7 ימים. הביטוי (ב') ColIa1 היה גבוה משמעותית בתאים שטופלו במשך 7 ימים, נמדד ביום 14 של culturing. (ג) הביטוי של Osteopontin היה משמעותי מוגברת בתאי שטופלו EStim ימים 3, 7 ו-14 culturing. (ד) Osterix ביטוי נעדר בשליטה בכלל נקודות זמן והתאים נראתה רק 7 ו 14 ימים של התרבות תאים נחשפת EStim. אותיות שונות על הסורגים לציין משמעותי (p < 0.05) הבדלים בין קבוצות באותו זמן נקודה. הכוכבית מציינת משמעותי (p < 0.05) ההבדלים בין נקודות זמן בתוך אותה קבוצה. איור זה שונה Eischen-Loges et al.9. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן נתאר הקמת תא, שיטה לטיפול בבעיות גזע mesenchymal עם EStim כי התוצאות התמיינות משופרת osteogenic.
הגדרת EStim שהוצגו לא דורשת ציוד/ידע מיוחד, יכול להתבצע בתוך מעבדה ביולוגיה/ביוכימיה סטנדרטי בתאי גזע על ידי החוקרים הצעירים. עם זאת, כאשר בונים ומפעילים תא EStim, טיפול מיוחד חייב להילקח מספר שלבים קריטיים. בעת טיפול האלקטרודות פלטינה, יש לקחת טיפול נוסף כמו המתכת הזאת הוא מאוד נזיל, עדין. בעוד מתכות אחרות, כגון פלדה או טונגסטן, יכול לשמש, אלה אינם מומלצים כפי שהם נוטים קורוזיה, אשר יכול להיות ציטוטוקסיות13. כמו כן, ניקוי/לחיטוי המכסה עם האלקטרודות חייב להתבצע כמו בדיוק כפי שמתואר הפרוטוקול מאז בשיטה זו יש נבדק שוב ושוב ונמצא יעיל בהפחתת בעיות זיהום. לבסוף, ואילו החדר הזה יכול לשמש כדי לחקור את השני רגיש EStim תא כמו הגירה14,15, התפשטות, אפופטוזיס16, קרום התא המתחים17, ופעילויות לגרדום אדהזיה19, פרוטוקול EStim נתאר כאן (100 מ"מ/mV, 1 h ביממה, 7 ימים) התמקדו רק בידול osteogenic בשנת החולדה תינתן תשומת לב מיוחדת MSCs. אם גבוה יותר מתח (mV ≥150/מ מ) ו/או משכי זמן ארוכים יותר של EStim (> h 4 – 5) מוחלים מאז מוצרים ציטוטוקסיות הנובע אלקטרוליזה יכולה להצטבר המדיום. במקרה זה, המדיום חייב להיות פיקוח ובזהירות החליפו בהתאם. ללמוד פרמטרים אחרים ו/או סוגי תאים ותנאים אחרים, מומלץ להפריד את המינון (מתח) משטר טיטור מחקרים להתנהל כמו שינויים אלה יכולים להשפיע על כיצד התאים מגיבים EStim.
תקלה אפשרית של התא EStim יכול לנבוע בהפסקות מעגל חשמלי לאחר שימוש חוזר ו ניתן לנטר באמצעות מנורות LED שנוספו. במקרה של שבירה (שצוין על-ידי nonilluminated LED light[s]), המכסה יכול להסיר, לפרק בקלות לזהות ולתקן את השבר. בנוסף, העיצוב פשוט של תא EStim קל יותר לשנות אותה על-פי הצרכים של כיוונונים ניסיוני שונים ושיטות של הניתוח. דוגמאות כוללות שימוש בגדלים שונים, לוחיות תרבות תא על-ידי פשוט משתנה האורך ואת המרחק בין אלקטרודות או הוספת תנאים תרבות אחרת (3D) עם חומרים קרמיים לגרדום4 או מצעים מוליך18, על ידי מיקום חומרים אלה נזרע עם תאים בין האלקטרודות.
כמו כל ניסויים במבחנה, התנהגויות תא ופונקציות נצפתה/המושרה בבית הבליעה EStim אינן תמיד ישירות ניתנות להעברה דגמי ויוו. בהתאם, בעת פירוש תא EStim-induced ההתנהגויות/הפונקציות בבית הבליעה, חוקרים יש תמיד לקחת זו בחשבון.
ההתקנה ואת השיטה המוצגת כאן יש יתרונות רבים על פני אחרים שיטות in vitro לחשיפת לתאים EStim (עם גשרים מלח5 ) ומערכות עם אלקטרודות שולבו תא תרבות בארות19. יתרון חשוב של המערכת המתוארת כאן היא כי, מאז התאים מתורבתים ב רגיל לוחות 6-ובכן, הם יכולים לשמש לאחר טיפול EStim פרוטוקולים אחרים ויוו או במבחנה. בנוסף, העובדה כי אלקטרודות קבועים על המכסה של צלחת 6-ובכן מקל כדי לנקות ולחטא את המכשיר בין ניסויים וכדי להשתמש בה. לבסוף, היכולת זמנית לעורר תאים בבארות שש מספק חומר בשפע עבור ניתוח ו הפארמצבטית.
כדי להשיג הבנה טובה יותר של מנגנוני ברמת הממברנה התאית שבו EStim משפיע על פעילויות תאי מחקרים מתמשכת באמצעות תא המתוארת כאן, אנו מגלים את הקשר בין EStim ונמסרו מבחוץ קרום התא פוטנציאל (Vmem)17. בנוסף, בהתבסס על הקודם ממצאים9, מחקרים עתידיים, אנחנו pretreat התאים עם EStim בחדר, לבד, עם פיגומים תלת-ממד שונה, ועם מצעים מוליך, לעורר תאים מסוים פונקציות; . אז, אנחנו להשתיל אותם לתוך מודלים בעלי חיים כדי לקבוע אם הם שומרים את פונקציות משופרות שנצפה ויוו. מחקרים אלו תתרום הגוף גדל והולך של מידע אודות המנגנונים על ידי איזה EStim לווסת את תפקוד התא, ובכך, יכול לתרום מיטוב תא גישות טיפול רפואה רגנרטיבית, המבוססות על רקמות-הנדסה טיפולים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמך בחלקה של אאו גרנט סטארט-אפ של קרן (S-14-03 H) ושל קרן Friedrichsheim (Stiftung Friedrichsheim) ב פרנקפורט, גרמניה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Estim fabrication | |||
| Banana connector/Jack adaptor | Poppstars | 1008554 | 2 pieces |
| Cutting pliers | Knipex | 78 03 125 | |
| DC power supply (0-30V/0-3A) | B&K Precision | Model 9130B | Any simular model could be used |
| Insulated flexible wires (0.14 mm2) | Conrad Electronic International | 604794, 604093 | 2 pieces |
| Non-corrosive silicone rubber | Dow Corning | 3140 RTV | *could be purchased by many stores |
| Platinum Wire (999,5/1000; 1mm ø) | Junker Edelmetalle | 00D-3010 | 0.6 m needed for 1 Estim chamber |
| 70% Ethanol solution | any | Sterilisation of Estim chamber | |
| Silver coated copper wire (0.6 mm ø) | Conrad Electronic International | 409334 - 62 | ≈70 cm needed for 1 Estim device |
| Soldering iron Set | Conrad Electronic International | 1611410 - 62 | Any simular model could be used |
| TPP 6-well plate lid | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | 2 lids for Estim chamber |
| 2.2V wired circular LEDs | Conrad Electronic International | 599525 - 62 | 6 pieces |
| UHU Super glue | UHU GmbH & Co. KG | n/a | *could be purchased by many stores |
| MSC culture | |||
| β-Glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G9422 | osteogenic cell culture |
| DMEM, low glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Thermo-Fischer Scientific | 21885025 | cell culture |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo-Fischer Scientific | 14190144 | cell culture |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | osteogenic cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo-Fischer Scientific | 10500064 | cell culture |
| 50 ml Falcon tube | Sarstedt | 62,547,004 | cell culture |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | osteogenic cell culture |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fischer Scientific | 15140122 | cell culture |
| Sprague-Dawley (SD) rat mesenchymal stem cells, bone marrow origin | Cyagen | RASMX-01001 | cell culture |
| Cell detachment solution | Thermo-Fischer Scientific | A1110501 | cell culture, cell detachment |
| TC Flask, T75 | Sarstedt | 833911302 | cell culture |
| TPP 6-well plates | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | cell culture |
| Trypan Blue Dye, 0.4% solution | Bio-Rad | 1450021 | cell count |
References
- Oryan, A., Kamali, A., Moshiri, A., Baghaban Eslaminejad, M. Role of Mesenchymal Stem Cells in Bone Regenerative Medicine: What Is the Evidence? Cells, Tissues, Organs. 204 (2), 59-83 (2017).
- Mauney, J. R., Volloch, V., Kaplan, D. L. Role of Adult Mesenchymal Stem Cells in Bone Tissue Engineering Applications: Current Status and Future Prospects. Tissue Engineering. 11 (5-6), 787-802 (2005).
- Mobini, S., Leppik, L., Thottakkattumana Parameswaran, V., Barker, J. H. In vitro effect of direct current electrical stimulation on rat mesenchymal stem cells. PeerJ. 5, e2821 (2017).
- Leppik, L., et al. Combining electrical stimulation and tissue engineering to treat large bone defects in a rat model. Scientific Reports. 8 (1), S1 (2018).
- Song, B., et al. Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo. Nature Protocols. 2 (6), 1479-1489 (2007).
- Hronik-Tupaj, M., Kaplan, D. L. A review of the responses of two- and three-dimensional engineered tissues to electric fields. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 18 (3), 167-180 (2012).
- Huang, S., et al. An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. Journal of Orthopaedic Translation. 3 (1), 26-33 (2015).
- Nau, C., et al. Tissue engineered vascularized periosteal flap enriched with MSC/EPCs for the treatment of large bone defects in rats. International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 907-917 (2017).
- Eischen-Loges, M., Oliveira, K. M. C., Bhavsar, M. B., Barker, J. H., Leppik, L. Pretreating mesenchymal stem cells with electrical stimulation causes sustained long-lasting pro-osteogenic effects. PeerJ. 6, 4959 (2018).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), San Diego, CA. 402-408 (2001).
- Curtis, K. M., et al. EF1alpha and RPL13a represent normalization genes suitable for RT-qPCR analysis of bone marrow derived mesenchymal stem cells. BMC Molecular Biology. 11, 61 (2010).
- Wang, L., Li, Z. -y, Wang, Y. -p, Wu, Z. -h, Yu, B. Dynamic Expression Profiles of Marker Genes in Osteogenic Differentiation of Human Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells. Chinese Medical Sciences Journal (Chung-kuo i hsueh k'o hsueh tsa chih). 30 (2), 108-113 (2015).
- Kim, H. B., Ahn, S., Jang, H. J., Sim, S. B., Kim, K. W. Evaluation of corrosion behaviors and surface profiles of platinum-coated electrodes by electrochemistry and complementary microscopy: biomedical implications for anticancer therapy. Micron. 38 (7), Oxford, UK. 747-753 (2007).
- Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer. Molecular Biology of the Cell. , mbcE18010077 (2018).
- Tai, G., Tai, M., Zhao, M. Electrically stimulated cell migration and its contribution to wound healing. Burns & Trauma. 6, 20 (2018).
- Love, M. R., Palee, S., Chattipakorn, S. C., Chattipakorn, N. Effects of electrical stimulation on cell proliferation and apoptosis. Journal of Cellular Physiology. 233 (3), 1860-1876 (2018).
- Adams, D. S., Levin, M. General principles for measuring resting membrane potential and ion concentration using fluorescent bioelectricity reporters. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 385-397 (2012).
- Jin, G., Li, K. The electrically conductive scaffold as the skeleton of stem cell niche in regenerative medicine. Materials Science & Engineering. C, Materials for Biological Applications. 45, 671-681 (2014).
- Hronik-Tupaj, M., Rice, W. L., Cronin-Golomb, M., Kaplan, D. L., Georgakoudi, I. Osteoblastic differentiation and stress response of human mesenchymal stem cells exposed to alternating current electric fields. Biomedical Engineering Online. 10, 9 (2011).
