Summary
여기 우리는 다양 한 유형의 전기 자극 및 osteogenic 차별화를 향상 시키기 위해 중간 엽 줄기 세포를 치료에 사용 하는 셀을 표시 하도록 셀 문화 챔버의 건설에 대 한 프로토콜을 제시.
Abstract
중간 엽 줄기/stromal 세포 (MSCs) 뼈 조직 공학 접근에에서 치유를 촉진 하 광범위 하 게 사용 되었습니다. 전기 자극 (EStim) MSC osteogenic 차별화 생체 외에서 증가 하 여 뼈 임상 설정에서 치유를 촉진 입증 되었습니다. 여기 우리가 EStim 셀 문화 챔버의 건설을 설명 하 고 치료에 사용 쥐 뼈 골 수 유래 MSC osteogenic 차별화를 강화 하. 우리는 osteogenic 분화에 상당한 증가 결과 MSCs EStim와 7 일 동안 치료 하 고이 프로 osteogenic 효과 (7 일) EStim 단종 후에 오랫동안 지속 되는 중요 한 것은, 발견. 이 이렇게 pretreating EStim osteogenic 차별화를 강화 하기 위하여와 MSCs의 뼈 조직 공학 치료 결과 최적화 하 고, 따라서, 그들의 전체 치료 잠재력을 달성 하는 데 도움이 사용 될 수 있습니다. 이 응용 프로그램 뿐 아니라이 EStim 셀 문화 실과 프로토콜 또한 사용할 수 있습니다 다른 EStim 민감한 셀 동작, 마이그레이션, 확산, apoptosis, 비 계 첨부 파일 등을 조사 하.
Introduction
외상 또는 질병 유발 뼈 결함 증가 세포 치료 및 재생 의학 기술의 다양 한 조합을 사용 하 여 치료를 받고 있다. MSCs 이러한 치료 그들의 상대적으로 높은 osteogenic 활동, 격리 및 확장, 효율과 안전1때문에 선택의 셀입니다. Osteogenic 그들의 활동을 극대화 하 고, 따라서 그들의 치료 효과 최적화, 여러 가지 방법은 조작 하 MSCs 이러한 치료에 그들의 사용에 앞서 (Mauney 외.2검토) 도입 되었습니다. 하나 이러한 방법은 EStim 시험관3 MSC osteogenic 차별화를 강화 하 고 뼈 vivo에서4치유 촉진을 보여줘 왔다. MSCs EStim와 치료에 집중 하는 연구의 증가도 불구 하 고 EStim의 프로 osteogenic 효과 극대화 하기 위한 최적의 처방 아직 정의할 수 있다.
EStim를 사용 하 여 다른 생체 외 방법 금속 전극5에서 세포를 분리 배양에 빠져들 소금 다리를 이용 한다. 이것의 장점은 EStim 소금 다리를 통해 제공 세포 독성 수 있습니다 화학 부산물 (예를 들면, 금속 전극의 부식)의 도입을 없앤다. 이 장점에도 불구 하 고 소금 교량 작업할 복잡 고 제공 EStim 어려운 두 시스템을 사용할 때 얻은 결과 연결 하 고 그 전달된에 vivo에서 모델에서 다릅니다. 셀 문화 우물 안에 고정 하는 금속 또는 탄소 전극을 통해 EStim 제공 하는 설정 (Hronik-Tupaj와 카 플 란6검토)으로 더 나은 시뮬레이션 한다 vivo;에 사용 되는 장치 그러나,이 소자 들은 어려운 사용 하는 사이 청소/소독 하 고 실험 당 공부 될 수 있다 셀 수는 제한 됩니다. 우리는 여기에 이러한 다른 설정의 한계를 해결 하기 위해 구체적으로 제시 EStim 챔버 설계. 반면이 EStim 챔버를 사용 하 여 우리의 경험의 대부분은 2d 되었습니다 이며 골 수 및 지방-조직-파생 MSCs3,4포함 된 3D 문화,이 챔버의 주요 장점은 그것 다목적 이며, 상대적으로 사소한 변경, 다양 한 다른 조건에서 다른 세포 유형 공부를 적용할 수 있습니다.
여기 우리가 EStim 셀 문화 챔버;의 건설을 설명 다음, 우리 EStim osteogenic 차별화에 효과 측정의 다른 식이요법으로 치료 MSCs에서 그것의 사용을 보여 줍니다. MSC osteogenic 차별화 칼슘 증 착, 알칼리 성 인산 가수분해 효소 활동, 및 osteogenic 마커 유전자 발현을 통해 평가 됩니다. 중요 한 것은,에이 설치를 사용 하는 실험 과거 관찰 이러한 프로 osteogenic 효과 EStim 치료 중단 후에 오랫동안 지속 합니다.
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Protocol
1. 전기 자극 세포 문화 챔버의 건설
- 표준 6-잘 세포 배양 배지;의 두 뚜껑 수집 EStim 챔버를 빌드하려면 99.99% 백 금 철사, 직경 0.5-1의 길이 60 cm m m; 코팅 구리 와이어, 0.6 m m;의 직경을 가진 길이에서 70 cm 건설 클램프; 납땜 장비; 초전도 접착제;의 한 관 1 와이어 터미널 블록 커넥터, 6 개의 작은 2.2 V Led (옵션); 스테인레스 실리콘 접착제 (선택 사항); 코팅의 1 개의 관 검은 절연 테이프;의 한 롤 표준, 유연한, 절연 구리 전선 (0.14 m m2), 2 m 길이 (자료의 테이블).
- 6 잘 플레이트 뚜껑, 마크와 다음 드릴 두 구멍 (~ 1 m m의 직경), 25 m m 6의 각각의 외부 가장자리 근처에 떨어져 우물 (총에서 12 구멍), 1A, B 그림에서 같이.
- 클램프와 백 금 철사의 12 5 cm 길이 잘라. L-모양, 한쪽 길이 3 m를 떠나으로 수동으로 전선의 각 구 부하 고는 다른 2 cm. 두 35 cm 길이에 실버 코팅 와이어를 잘라.
- 1 개의 백 금 철사의 더 긴 (3 cm) 구부러진 끝 (에서 밖으로 내부) 각 드릴된 구멍에 1-2 m m, 뚜껑의 외부에서 튀어나와 떠나 구 부 집게를 사용 하 여. 초전도 접착제 뚜껑 구멍에 백 금 철사를 장악 하 고 약 6 h 동안 건조를 두고.
- (그는 나중에 음극 역할 참조 하십시오 그림 1A) 모든 6 개의 백 금 철사의 팁 솔더 실버 코팅 와이어 중 뚜껑에서 튀어나와. 다른 실버 코팅 와이어를 (그는 나중에 역할을 양극) 나머지 6 개의 백 금 철사를 납땜 하는 동일한 절차를 반복 합니다.
- (선택 사항) 실험 동안 기능을 확인 하려면 6 양극-음극 백 금 전극 쌍 사이 회로에 Led를 추가 합니다. 각 LED 빛 (그림 1C) 문화 접시에 있는 세포를 노출 방지 하기 위해 주도 아래 검은 절연 테이프의 조각을 넣으십시오.
- 와이어 터미널 블록 커넥터 6 잘 플레이트 뚜껑의 왼쪽된 위 모퉁이를 접착제와 두 실버 코팅 와이어 그림 1C에서 같이 입력된 단자에 연결 하십시오.
- (그림 1B, 뚜껑 Nr. 2) 첫 번째 뚜껑에 터미널 블록 커넥터에 맞게 두 번째 6 잘 플레이트 뚜껑의 왼쪽된 위 모퉁이에서 20 m m x 20 m m 섹션을 잘라. 전극, 두 번째 뚜껑을 갖춘 첫 번째 뚜껑을 커버 하 고 접착 테이프와 함께 테이프.
- 를 개선 하기 위해 두 개의 뚜껑의 접합 실리콘 접착제 코팅 (선택 사항)을 사용 합니다. 이렇게 하려면 실리콘 접착제의 3-5 m m 층은 전극으로 뚜껑을 커버 하 고 다른 뚜껑, 12 h 건조 접착제에 대 한 수 있도록 그것을 커버.
- 와이어 커넥터와 바나나 남성 커넥터 (4 mm)을 다른 끝의 출력 단자를 2 개의 표준 절연된 구리 철사의 한쪽 끝을 연결 합니다.
참고:이 전선의 길이 어디 셀 지켜질 것 이다, 인큐베이터 (그림 1D) 외부 전원 공급 장치에는 인큐베이터에 선반에서 거리에 따라 달라 집니다. - (전압) 복용량을 조정 하 고 처방 EStim의 DC 전원 공급 장치를 조절 하 여 세포에 전달.
- 전면 패널에 ON/OFF 버튼을 눌러 전원 공급 장치를 켭니다. 버튼 1을 누르면 채널 1을 활성화 합니다.
- 버튼 Nr. 4 (V-집합) 전압 설정을 누릅니다. 프레스 버튼 2, . 2.5 V. 프레스 Enter에 부하 출력 설정 5 .
- 2.5 V의 출력 로드 되도록 (2500 mV) 다음, 단순화 된 방정식에 따라 100 mV/mm의 EStim에 해당.
V EStim =
; 또는
V = VEStim × d
여기, V = 밀리; 출력 전원 공급 전압 d = 밀리미터; 전극 사이의 거리 V EStim 밀리미터 당 밀리에 자극 전압 =.
참고:이 단순화 일정 DC 전압의 경우에 적용 됩니다. 매체와 세포 사이의 저항 전극 셀;와 직접 접촉에서 하지 않습니다 무시할 수는 대신, EStim 매체를 통해 세포에 전달 된다.
; 또는2. 중간 엽 줄기 세포 문화 osteogenic 매체에
- 구입 하 고 실험의 날까지 액체 질소에 상용 쥐 MSCs ( 재료의 표참조)를 저장 합니다. 또는 프로토콜에 따라 다른 동물에서 MSCs 분리 실험 동물의 사용에 대 한 지역 기관 규정7,8 다른 곳에서 출판.
- 실험 당일, 액체 질소 저장에서 MSCs의 한 유리병 (1 x 106 세포)를 제거 하 고 신속 하 게 (1 분) 이내 37 ° c.에 preheated 물 욕조에 세포를 해 동
- 층 류 흐름 후드에서 무 균 조건 하에서 50 mL 팔 콘 튜브로 유리병 콘텐츠를 플라스틱 고 정상 매체 (NM) 37 ° c, Dulbecco의 수정된이 글의 중간 (DMEM; 1 x)으로 구성 된 prewarmed의 9 mL 10% 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 추가 페니실린/스 솔루션입니다. 300 x g에서 원심 분리 하 여 5 분에 대 한 셀을 펠 렛.
- 층 류 두건에는 상쾌한을 제거 하 고 신중 하 게 37 ° c.에 prewarmed NM의 12 mL에서 셀 펠 릿 resuspend Resuspended 셀 T-75 세포 배양 플라스 크를 전송 합니다.
- (약 3-5 일 후)는 80%-90%의 합류를 도달할 때까지 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 에 셀 문화.
- 셀 통로
참고: 층 류 두건에 원심 분리 및 무 균 조건 하에서 부 화를 제외 하 고 모든 작업을 수행 합니다.- 도달 후 80%-90% 합류, 세포 분리 솔루션으로 셀을 검색 합니다. 세포 배양 매체 발음, 세척 2 x 1 x 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS), 세포 분리 솔루션, x 1의 5 mL을 추가 하 고 5 분 동안 인큐베이터에 셀을 반환.
- 일단 셀 분리는 분리 솔루션 비활성화 문화 매체의 동일한 금액을 추가 합니다. 50 mL 팔 콘 튜브에 세포를 수집 하 고 5 분 동안 300 x g 에서 그들을 회전.
- 매체를 삭제 하 고 셀 신선한 일반 매체의 1 mL에 resuspend. Trypan 푸른 얼룩 가능한 셀의 개수를 평가 합니다.
- 씨앗 1 x 106 셀 prewarmed NM의 12 mL와 함께 새로운 T-75 플라스 크에. 80%-90%의 합류를 도달할 때까지 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 에 셀 문화.
참고: 셀 뿌리고 (단계 2.4.1–2.4.4) 반복할 수 있습니다 몇 번 셀의 필요한 수를 얻을 때까지. 통로 8 보다 오래 된 세포를 사용 하지 마십시오.
- 씨앗 9 x 10 NM (10% 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청, 1% 페니실린/스, DMEM) 문화 6 잘 플레이트의 각 잘에서 3 mL에4 셀. 37 ° C, 5% CO2, 5% O2에 1 일에 대 한 셀을 품 어.
- 다음 날, 문화 매체를 발음 하 고 osteogenic 차별화 매체 (OM, 일반 매체와 10-7 M dexamethasone, 10 m m β-glycerophosphate, 0.05 m m ascorbic 산-2-인산 보충)의 3 mL을 적용 합니다.
- 6 잘 플레이트 세포와 인큐베이터에 배치 하 고 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 에서 밤새 품 어.
3. 치료 EStim와 MSCs
- 셀 EStim 처리 됩니다 하루에 30 분;에 대 한 70% 에탄올 용액에서 전극 소독 그런 다음, 추가 30 분에 대 한 캐비닛 안전에 자외선에서 그들을 건조.
- 층 류 흐름 후드에서 커버 뚜껑 장착 전극, 전극 완전히 중간에 빠져들 다는 것을 확인 된 교양된 MSCs를 포함 6 잘 플레이트 (필요한 경우, 추가 매체). 인큐베이터에 셀으로 덮여 6 잘 플레이트 (EStim 챔버)를 전송 및 전원 공급 장치에는 와이어를 연결.
- 2.5 V 부하 출력 전원 공급 장치를 설정 하 고 1 h3,9EStim 셀 치료.
- 자극, 후 전원 공급 장치를 분리 하 고 인큐베이터에서 EStim 챔버를 제거 합니다. 무 균 조건 하에서 표준 6-잘 접시 뚜껑 전극 장착 뚜껑을 교환 합니다.
- 인큐베이터에 있는 셀을 반환 하 고 그들을 떠나 하룻밤. 전극, 먼저 PBS 그리고 70% 에탄올 솔루션을 청소. 정밀한 사 포로 전극 표면에서 축적 된 부식 제품을 청소.
- 6 일 연속 3.1-3.5 단계를 반복 합니다. 하루에 4, EStim를 적용 하기 전에 조건 하에서 무 균, 매체의 1.5 mL를 발음 하 고 prewarmed 신선한 OM.의 1.5 mL와 함께 그것을 대체 하 여 문화 매체 변경
- 7 일 연속 EStim를 적용 한 후 유지 문화에 셀 추가 7 일 교환 매체 매 3-4 일.
4. osteogenic 차별화 측정
- 현미경으로 세포 형태학 변화 분석.
- 으로 MSC osteogenic 차별화, 측정 칼슘 증 착, 알칼리 성 인산 가수분해 효소 활동, 및 osteogenic 마커 유전자 발현, EStim의 효과 평가 하기 위해3,9다른 곳에서 설명 합니다.
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Representative Results
100 mV/mm EStim의 MSCs, 셀 EStim 3에 대 한 치료의 osteogenic 차별화에의 효과 평가 하기 위해 7 그리고 14 일 또는 nontreated (제어) 형태학 상 변화 고 칼슘 증 착 (그림 2를 평가 하 여 경작의 14 날에 분석 되었다 ). 밝은 분야 현미경 검사 법 (형태 변화)를 사용 하 여 셀 이미징 하거나 4 %paraformaldehyde 솔루션에서 세포를 고정, 0.02% 알리자린 레드 솔루션 얼룩을 다음 이미징 그들은 이렇게 밝은 분야 현미경 검사 법 (칼슘 증 착을 사용 하 여 분석)입니다.
Osteogenic 마커 유전자 표현의 변화에 대 한 자세한 분석은 3, 7, 및 자란 (그림 3)의 14 일에 수행 되었다. 이 상대 유전자 RunX2의 콜라겐 나, Osteopontin, 표현과 실시간 정량 및 비교 델타 Ct (임계값 주기) 방법10, Osterix 를 측정 하 여 이루어졌다 어디 하우스키핑 유전자 Rplp1 와 Ywhaz11 정규화에 사용 되었다.
MSCs EStim의 100 mV/m m 3 일 (하루 1 시간) 동안 노출 했다 영향을 주지 않습니다; 그러나, 노출의 7 일 귀착되 었 다 결정 형태 변화 (그림 2A-C), (그림 2E-G), 칼슘 증 착 및 osteogenic 마커 유전자 식 변경 (osteogenic 차별화 증가 그림 3) 비해 EStim 없이 시간 일치 하는 컨트롤입니다. 장기간된 EStim 노출 (14 일) 치료 (그림 2DH 및 그림 3)의 7 일 후 본 넘어 osteogenic 차별화를 더 향상 되지 않았다.
그림 2에서처럼 셀 EStim 7에 대 한 치료와 14 일 더 압축 된 (그림 2CD) EStim 3 일 또는 nontreated 셀 (그림 2AB)에 대 한 치료 보다 나타나고 증가 칼슘을 보였다 증 착 (그림 2GH) 그 3 일 또는 nontreated 컨트롤 (그림 2EF에대 한 치료에 비해). 경작의 3, 7 및 14 일 osteogenic 마커 발현의 분석 확인 셀 EStim 7 ~ 14 일 (그림 3)에 대 한 치료에 향상 된 osteogenic 차별화를 했다. 표현 osteogenic 분화 관련 마커 유전자12RunX2의 콜라겐 나, Osteopontin, 그리고 Osterix EStim 7 일 동안 치료 하는 셀에 최고 했다.
그림 1: EStim 셀 문화 챔버. (A)는 양극 (검정), 음극 (빨간색), 보여주는 EStim 챔버 및 DC 전원 공급 장치에 연결 된 Led의 전기 회로 도표. (B)는 이미지 표시 6 잘 플레이트 뚜껑와 L-모양의 백 금 전극 (하단 보기) 6-잘 접시 뚜껑에 통합. (C) 조립 EStim 와이어 커넥터, Led와 LED 빛 (화살표)에서 세포를 보호 하는 전기 절연 테이프 (평면도) 챔버. (D) EStim 세포 외부에는 DC 전원 공급 장치에 연결 하는 인큐베이터에서 EStim 챔버와 처리 설치. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: MSC 형태 고 칼슘 증 착에 EStim의 효과. 세포 노출 osteogenic 문화 매체에 노출된 하지 (컨트롤) 100 mV/mm EStim의 3, 7, 및 14 일 (1 h/일). (A-D) 형태학과 (E-H) 경작의 14 날에 (알리자린 레드 얼룩) 칼슘 증 착. 셀 형태 및 칼슘 예금에 큰 변화에 보였다 세포 치료 EStim (C 및 G) 7과 (D 와 H) 14 일 (10 배 확대, 눈금 막대 = 200 µ m). 이 그림에서 Eischen로 외. 를 수정 했다 9. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 효과의 EStim MSC osteogenic 마커 유전자 발현에. 3, 7, 14 일, 또는 nontreated 셀에서 (3, 7, 및 경작의 14 일 실시간 정량 측정) osteogenic 마커 유전자 발현 EStim 처리. (A) 경작의 날 7, RunX2 식 셀 EStim 7 일에 대 한 치료에 훨씬 더 높은 했다. (B) ColIa1 식 세포 배양의 14 날에 측정 7 일에 대 한 치료에 상당히 높았다. (C) Osteopontin 표현 3, 7, 및 경작의 14 일 EStim 치료 세포에 크게 증가 되었다. (D) Osterix 표현 했다 결 석 컨트롤에 셀 모든 포인트 시간과 EStim에 노출 하는 셀에 문화의 7 및 14 일에만 보였다. 막대 다른 문자 나타냅니다 중요 한 같은 그룹 (p < 0.05) 차이 시간 포인트. 별표 나타냅니다 중요 한 그룹 내에서 동일한 시간 점 차이점 (p < 0.05). 이 그림은 Eischen로 외.9에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기 우리는 챔버와 향상 된 osteogenic 차별화 결과 EStim와 중간 엽 줄기 세포를 치료 하는 방법의 건설을 설명 합니다.
제시 EStim 설치 특수 장비/지식이 필요로 하지 않습니다 하 고 주니어 연구자에 의해 표준 줄기 세포 생물학/생화학 실험실에서 수행할 수 있습니다. 그러나, 건물 EStim 챔버를 사용 하는 경우에, 몇 가지 중요 한 단계에서 특별 한 배려를가지고 한다. 백 금 전극 처리,이 금속은 매우 유 순 하 고 섬세 한 여분 배려를가지고 한다. 다른 금속, 강철 또는 텅스텐, 사용할 수 있지만 이러한 세포 독성13수 있는 부식에 수 그리 다는 권장 하지 않습니다. 또한, 전극과 뚜껑 청소/살 균으로 때문에이 메서드를 반복적으로 테스트 하 고 문제 오염 제거에 효과가 있어야 발견 프로토콜에 설명 된 대로 정확 하 게 수행 되어야 합니다. 마지막으로,이 챔버 다른 공부 하는 데 사용 될 수 EStim 민감한 세포 활동 마이그레이션14,15, 확산, apoptosis16, 세포 막 전압17와 같은 접착19, 발판에 EStim 프로토콜 설명 여기 (100 mV/m m, 1 시간/일, 7 일) 더 높은 경우에 MSCs. 특별 한 주의 주어 쥐 osteogenic 차별화에만 초점을 맞춘 전압 (≥150 mV/mm) 또는 EStim의 더 긴 기간 (> 4-5 h) 세포 독성 제품부터 적용 됩니다 전기 분해에서 발생 하는 매체에 누적 될 수 있습니다. 이 경우에, 매체 신중 하 게 모니터링이 고 그에 따라 교환 있습니다. 공부 하 고 다른 매개 변수 및/또는 다른 세포 유형 및 조건, 복용량 (전압)을 분리 하는 것이 좋습니다 및 이러한 변경 셀 EStim에 응답 하는 방법에 영향을 미칠 수 있습니다 처방 적정 연구 실시.
가능한 고장 EStim 챔버의 반복된 사용 후 때문에 전기 회로 될 수 있으며 추가 LED 램프를 통해 모니터링할 수 있습니다. 파손의 경우 (nonilluminated LED light[s])로 표시, 뚜껑 수 있습니다 수 제거 하 고 쉽게 식별 하 고 휴식을 복구 분해. 또한, EStim 챔버의 심플한 디자인 쉽게 분석의 방법과 다른 실험 설정의 필요에 따라 수정할 수 있습니다. 예로 단순히 여의 길이 전극 또는 비 계 세라믹 소재4 또는 전도성 기판18, 추가 다른 (3D) 문화 조건 사이의 거리를 변화 하 여 세포 배양 배지의 다른 크기를 사용 하 여 전극 간 세포와 시드 단순히 이러한 재료를 배치.
모든 생체 외에서 실험, 셀 동작 및 기능 EStim 상공에 관찰/유도 되지 않습니다 항상 vivo에서 모델에 게 직접 양도할 수 없습니다. 따라서, 챔버에서 EStim 유발 셀 동작/기능 해석 때 연구원 해야 합니다 항상 고려이.
설치 및 여기에 제시 된 방법 셀 EStim (소금 교량5 시스템)와 전극 셀 문화 우물19에 통합 시스템을 제공 하는 데 사용 하는 다른 생체 외에서 방법에 비해 많은 이점이 있다. 여기서 설명 하는 시스템의 중요 한 장점은 셀 표준 6 잘 플레이트에 교양, 이후 그들은 다른 vivo에서 또는 생체 외에서 프로토콜에서 EStim 처리 후 사용할 수 있습니다,입니다. 또한, 전극 6-잘 접시의 뚜껑에는 사실 쉽게 청소 하 고 실험 사이 장치를 소독 하 고 다시 사용 합니다. 마지막으로, 동시에 6 개의 우물에서 세포를 자극 하는 기능 분석 및 재현성에 대 한 충분 한 자료를 제공 합니다.
EStim 여기 설명 된 챔버를 사용 하 여 지속적인 연구에서 세포 활동에 영향을 미치는 세포 막 수준 메커니즘의 더 나은 이해를 얻기 위하여 외부에서 배달 EStim와 세포 막 사이 관계를 탐구는 우리 잠재적인 (Vmem)17. 또한, 이전 결과9, 미래 연구에 따라 우리는 pretreat EStim 챔버, 혼자 그리고 다른 3D 건설 기계와 전도성 기판에에서 자극 특정 셀 기능; 하 셀 다음, 우리 그들은 관찰 된 향상 된 기능을 vivo에서 유지 동물 모델에 그들을 이식 합니다. 이러한 연구는 EStim에 의해 메커니즘에 대 한 정보 신체의 성장에 기여할 것입니다 세포 기능을 통제 하 고,이 과정에서 세포 치료 접근 재생 의학에서 및 조직 공학-기반 최적화에 기여할 수 있는 치료입니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 AO 기초 시작 그랜트 (S-14-03 H) 및 프랑크푸르트, 독일에에서 본사를 둔 Friedrichsheim 재단 (재단 Friedrichsheim) 부분에서 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Estim fabrication | |||
| Banana connector/Jack adaptor | Poppstars | 1008554 | 2 pieces |
| Cutting pliers | Knipex | 78 03 125 | |
| DC power supply (0-30V/0-3A) | B&K Precision | Model 9130B | Any simular model could be used |
| Insulated flexible wires (0.14 mm2) | Conrad Electronic International | 604794, 604093 | 2 pieces |
| Non-corrosive silicone rubber | Dow Corning | 3140 RTV | *could be purchased by many stores |
| Platinum Wire (999,5/1000; 1mm ø) | Junker Edelmetalle | 00D-3010 | 0.6 m needed for 1 Estim chamber |
| 70% Ethanol solution | any | Sterilisation of Estim chamber | |
| Silver coated copper wire (0.6 mm ø) | Conrad Electronic International | 409334 - 62 | ≈70 cm needed for 1 Estim device |
| Soldering iron Set | Conrad Electronic International | 1611410 - 62 | Any simular model could be used |
| TPP 6-well plate lid | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | 2 lids for Estim chamber |
| 2.2V wired circular LEDs | Conrad Electronic International | 599525 - 62 | 6 pieces |
| UHU Super glue | UHU GmbH & Co. KG | n/a | *could be purchased by many stores |
| MSC culture | |||
| β-Glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G9422 | osteogenic cell culture |
| DMEM, low glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Thermo-Fischer Scientific | 21885025 | cell culture |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo-Fischer Scientific | 14190144 | cell culture |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | osteogenic cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo-Fischer Scientific | 10500064 | cell culture |
| 50 ml Falcon tube | Sarstedt | 62,547,004 | cell culture |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | osteogenic cell culture |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fischer Scientific | 15140122 | cell culture |
| Sprague-Dawley (SD) rat mesenchymal stem cells, bone marrow origin | Cyagen | RASMX-01001 | cell culture |
| Cell detachment solution | Thermo-Fischer Scientific | A1110501 | cell culture, cell detachment |
| TC Flask, T75 | Sarstedt | 833911302 | cell culture |
| TPP 6-well plates | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | cell culture |
| Trypan Blue Dye, 0.4% solution | Bio-Rad | 1450021 | cell count |
References
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- Mauney, J. R., Volloch, V., Kaplan, D. L. Role of Adult Mesenchymal Stem Cells in Bone Tissue Engineering Applications: Current Status and Future Prospects. Tissue Engineering. 11 (5-6), 787-802 (2005).
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