Summary
Her presenterer vi en protokoll for bygging av en celle kultur kammer laget for å avsløre celler til ulike typer elektrisk stimulering, og dens bruk i behandling av mesenchymal stamceller for å forbedre osteogenic differensiering.
Abstract
Mesenchymal stammen/stromal celler (MSCs) har blitt brukt mye å fremme bein helbredelse i vev utvikling tilnærminger. Elektrisk stimulering (EStim) har vist seg å øke MSC osteogenic differensiering i vitro og fremme bein i klinisk innstillinger. Beskriver her vi byggingen av en EStim celle kultur kammer og dens bruk i behandling av rotte bein margtransplantasjon-avledet MSC å forbedre osteogenic differensiering. Vi fant at behandle MSCs med EStim for 7 dager resulterer i en betydelig økning i osteogenic differensiering, og viktigst, denne pro-osteogenic effekten fortsetter lenge etter (7 dager) EStim er avviklet. Denne tilnærmingen av pretreating MSCs med EStim å forbedre osteogenic differensiering kan brukes til å optimalisere benvev engineering behandlingsresultatene, og dermed hjelpe dem å oppnå full terapeutiske potensialet. I tillegg til dette programmet, kan denne EStim celle kultur kammer og protokollen også brukes til å undersøke andre EStim-sensitive celle atferd, som overføring, spredning, apoptose og stillaset vedlegg.
Introduction
En økning i traumer og/eller sykdom-indusert bein mangler behandles med forskjellige kombinasjoner av cellen terapi og regenerativ medisin teknologier. MSCs er cellen valgfrihet i slike behandlinger, grunnet deres relativt høy osteogenic aktivitet, isolasjon og utvidelse effektivitet og sikkerhet1. For å maksimere deres osteogenic aktivitet, og dermed optimalisere terapeutisk effektiviteten, har flere metoder blitt introdusert for å manipulere MSCs før deres bruk i disse behandlingene (som vurderes av Mauney et al.2). En slik metode er EStim, som har vist seg å forbedre MSC osteogenic differensiering i vitro3 og fremme bein healing i vivo4. Til tross for økende antall studier med fokus på behandle MSCs med EStim, en optimale diett for å maksimere Estim's pro-osteogenic effekt på ennå defineres.
Andre i vitro metoder å bruke EStim benytte salt broer nedsenket i kultur medium, som skiller celler fra metallisk elektroder5. Fordelen med dette er at levere EStim gjennom salt broer eliminerer innføring av kjemiske biprodukter (f.eks, korrosjon av metallisk elektroder) som kan være cytotoksisk. Til tross for denne fordelen, salt broer er tungvint å arbeide med, og EStim de skiller seg fra de leveres i i vivo modellene, gjør det vanskelig å korrelere resultater ved å bruke de to systemene. Oppsett som leverer EStim metallisk eller karbon elektroder fast inni cellen kultur brønnene simulere (som vurderes av Hronik-Tupaj og Kaplan6) bedre enheter i vivo; men disse enhetene er vanskelig å rengjøre/sterilisere mellom bruker og antall celler som kan studeres per forsøk er begrenset. Vi har utformet EStim kammeret presenteres her spesielt for å møte begrensningene for disse andre oppsett. Mens de fleste av vår erfaring med denne EStim kammer har vært med 2D og 3D kulturer som inneholder benmarg og liggende under adipose-vev-avledede MSCs3,4, en stor fordel med denne kammer er at det er allsidig, og med mindre relativt endringer kan tilpasses å studere andre celletyper under en rekke ulike forhold.
Her beskriver vi byggingen av en EStim celle kultur kammer; deretter viser vi bruken av behandlende MSCs med forskjellige regimer EStim og måle den resulterende effekten på osteogenic differensiering. MSC osteogenic differensiering vurderes via kalsium deponering, alkalisk fosfatase aktivitet og osteogenic markør genuttrykk. Viktigere, observerte i siste eksperimenter som brukes dette oppsettet, vi at disse pro-osteogenic effektene vedvare lenge etter EStim behandling ble avviklet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bygging av elektrisk stimulering celle kultur kammer
- For å bygge EStim kammeret, samle to lokkene på standard 6-vel celle kultur platene. 99,99% platina ledninger, 60 cm i lengde med en diameter på 0,5-1 mm; sølv-belagt av kobbertråd, 70 cm i lengde med en diameter på 0,6 mm; Avbitertang; lodding jern kit; en tube superconductive lim; en wire terminalblokken kontakt, seks små 2.2 V lysdioder (valgfritt); en tube med noncorrosive silikon lim coating (valgfritt); en rull med svart elektrisk isolasjon tape; standard, fleksibel, isolert elektrisk kobbertråd (0,14 mm2), 2 meter i lengde (tabell av materialer).
- 6-vel plate lokk, merke og deretter bore to hull (med en diameter på ~ 1 mm) brønnene 25 mm fra hverandre, nær den ytre kanten av hver av seks (12 hull totalt), som vist i figur 1A, B.
- Skjær tolv 5 cm lengder av platina wire med Avbitertang. Bend hver av ledningene manuelt i en L-form, forlater ene 3 cm lange og de andre 2 cm. klipp sølv-belagt wire i to 35 cm lengder.
- Sett den lengre (3 cm) bøyd enden av en platina wire (fra innsiden til ut) i hvert boret hull, forlater 1-2 mm stikker ut fra utsiden av lokket, bøy den ved hjelp av pinsett. Sikre platina ledninger i lokket hullene med superconductive lim og la det tørke rundt 6 h.
- Loddetinn tips av alle seks platina ledninger (som senere tjene som katoder, se figur 1A) stikker fra lokkene til en av sølv-belagt ledningene. Gjenta samme, lodding de resterende seks platina ledningene (som senere skal fungere som anoder) til andre sølv-belagt ledningen.
- Legg lysdioder i krets mellom hvert av de seks anode katode platina elektrode, bekrefte funksjonaliteten under eksperimenter (valgfritt). Plass et svart isolasjon bånd under hver LED å hindre utsette cellene i kultur platene til LED-lys (figur 1 c).
- Lime wire terminalblokken koblingen til øvre venstre hjørne av 6-vel plate lokket og koble begge sølv-belagt ledninger til inngangsterminalene, som vist i figur 1 c.
- Klipp ut en 20 x 20 mm delen fra øverst til venstre i andre 6-vel plate lokk (figur 1B, lokket Nr. 2) til terminalblokken kontakten på første lokket. Dekker første lokket, utstyrt med elektrodene, med andre lokket og tape dem sammen med teip.
- For å forbedre liming av to lokkene, bruke silikon lim coating (valgfritt). Gjør dekke lokket med sølv elektrodene med en 3-5 mm laget av silikon og dekke det med andre lokk, slik at 12t for limet tørke.
- Koble en ende av to standard isolert kobber ledninger til utgangsterminaler tråders og andre endene til banan hankontakter (4 mm).
Merk: Lengden på disse trådene, avhengig av avstanden fra sokkelen i inkubator, der cellene vil bli holdt til strømforsyningen, utenfor inkubator (figur 1 d). - Justere doseringen (voltage) og diett av EStim levert til cellene ved å regulere DC strømforsyning.
- Slå på strømforsyningen ved å trykke på På/av -knappen på frontpanelet. Aktivere kanal 1 ved å trykke knappen 1.
- Trykk knappen Nr. 4 (V-sett) til å angi spenning. Trykk knapper 2, . og 5 angi laste utdataene til 2,5 V. Trykk på Enter.
- At Last utdataene for 2.5 V (2500 mV) tilsvarer en EStim 100 mV/mm, ifølge følgende, forenklet ligningen.
V EStim =
; eller
V = VEStim × d
Her, V = nettspenningen utgang i millivolt; d = avstanden mellom elektrodene i millimeter; V EStim = stimulering spenningen i millivolt per millimeter.
Merk: Denne forenklingen gjelder bare ved konstant DC spenning. Motstanden mellom medium og cellene er ubetydelig som elektrodene ikke er i direkte kontakt med celler. i stedet leveres EStim til cellene til mediet.
; eller2. mesenchymal stamceller kultur i osteogenic medium
- Kjøp og lagre kommersielt tilgjengelig rotte MSCs (se Tabell for materiale) i flytende nitrogen til dagen av eksperimentet. Alternativt kan du publisert isolere MSCs fra andre dyr i henhold til protokoller andre steder7,8 i henhold til lokale institusjonelle regler for bruk av forsøksdyr.
- På dagen for eksperimentet, fjerne en flaske (1 x 106 celler) av MSCs fra flytende nitrogen oppbevaring og raskt (innen 1 min) tine cellene i et vannbad forvarmet til 37 ° C.
- Under sterile forhold i laminær strømning hette Pipetter medisinglass innholdet i et 50 mL falcon rør og legge til 9 mL av normal medium (NM) prewarmed 37 ° c, bestående av Dulbeccos endret Eagle's medium (DMEM, 1 x) med 10% inaktivert fosterets bovin serum (FBS) og 1% penicillin/streptomycin løsning. Pellets celler for 5 min med sentrifugering på 300 x g.
- Laminær strømning hette, fjerne nedbryting og nøye resuspend celle pellet i 12 mL NM prewarmed til 37 ° C. Overføre resuspended cellene til en T-75 celle kultur kolbe.
- Kultur cellene på 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 til de når en 80-90% samløpet (etter ca 3-5 dager).
- Passasje cellene.
Merk: Utføre alle operasjoner unntatt sentrifugering og inkubasjon under sterile forhold i laminær strømning hette.- Etter å ha nådd en 80-90% samløpet, hente cellene med cellen avdeling løsning. Sug opp cellen kultur medium, vask 2 x med 1 x fosfat-bufret saltvann (PBS), legge til 5 mL 1 x cell avdeling løsningen og returnere cellene til inkubator for 5 min.
- Når cellene er koblet fra, kan du legge til en lik mengde kultur medium å deaktivere avdeling løsningen. Samle inn cellene i et 50 mL falcon rør og spinne dem 300 x g i 5 min.
- Forkast mediet og resuspend celler i 1 mL av fersk normal medium. Vurdere antall levedyktig celler med trypan blå flekken.
- Frø 1 x 106 celler i en ny T-75 kolbe med 12 mL prewarmed NM. Kultur cellene på 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 til de når en 80-90% samløpet.
Merk: Cellen passaging (trinn 2.4.1–2.4.4) kan gjentas som et par ganger til nødvendig antall celler er oppnådd. Ikke bruk cellene eldre enn passering 8.
- Frø 9 x 104 celler i 3 mL NM (10% inaktivert fosterets bovin serum, 1% penicillin/streptomycin, DMEM) i hver brønn av en 6-brønnen plate. Inkuber cellene for 1 dag på 37 ° C, 5% CO2, 5% O2.
- Neste dag, Sug opp kultur medium og bruke 3 mL osteogenic differensiering medium (OM, normal medium med 10-7 M deksametason 10 mM β-glycerophosphate og 0.05 mM askorbinsyre-2-fosfat).
- Plasser 6-vel platen med celler i kuvøse og ruge på 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 over natten.
3. behandle MSCs med EStim
- På dagen cellene behandles med EStim sterilisere elektrodene i 70% etanol løsning for 30 min; deretter tørkes under UV-lys i en trygghet kabinett for en ytterligere 30 min.
- Laminær strømning hette, dekker 6-vel platen med de kultiverte MSCs lokket utstyrt med elektrodene, sørge for at elektrodene er helt neddykket i medium (eventuelt legge medium). Overføre dekket 6-vel platen (EStim kammer) med celler til inkubatoren og koble deres ledninger til strømforsyningen.
- Angi strømforsyningen til 2,5 V laste ut og behandle celler med EStim for 1t3,9.
- Etter stimulering, koble til strømforsyningen og fjerne EStim kammeret settefiskanlegg. Under sterile forhold, utveksle lokket utstyrt med elektroder med standard 6-vel plate lokk.
- Tilbake cellene til inkubator, og la dem over natten. Rengjør elektrodene, først med PBS og deretter med 70% etanol løsning. Rengjør akkumulert korrosjon produktene fra elektrode overflaten med fine sandpapir.
- Gjenta trinn 3.1-3.5 for 6 dager. På dag 4, før du installerer EStim og sterile vilkår, endre kultur medium ved aspirating 1,5 mL av medium og erstatte den med 1,5 mL av prewarmed frisk OM.
- Etter anvender EStim for 7 dager, opprettholde cellene i kultur for ytterligere 7 dager, utveksle mediet hver 3-4 dager.
4. osteogenic differensiering målinger
- Analysere cellen morfologi endringer under et mikroskop.
- Å vurdere effekten av EStim på MSC osteogenic differensiering, måle kalsium deponering, alkalisk fosfatase aktivitet og osteogenic markør genuttrykk, som beskrevet andre steder3,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å evaluere effekten av 100 mV/mm av EStim på osteogenic differensiering av MSCs, cellene behandlet med EStim for 3, ble 7 og 14 dager eller nontreated (kontroll) analysert på dag 14 av dyrking av vurdere morfologiske endringer og kalsium deponering (figur 2 ). Dette ble gjort av imaging celler ved hjelp av lys-feltet mikroskopi (morfologi endringer) eller ved å feste cellene i 4% paraformaldehyde løsning, farging dem med 0,02% alizarin rød løsning og deretter imaging dem med lyse-feltet mikroskopi (kalsium deponering analyse).
En detaljert analyse av osteogenic markør gene expression endringer ble utført på dager 3, 7 og 14 i dyrking (Figur 3). Dette ble gjort ved å måle den relative uttrykket av gener RunX2, Collagen jeg, Osteopontinog Osterix RT-qPCR og komparativ deltaet Ct (syklus terskelverdier) metoden10, der housekeeping gener Rplp1 og Ywhaz11 ble brukt for normalisering.
Utsette MSCs til 100 mV/mm av EStim for 3 dager (1 time per dag) hadde ingen effekt; men resulterte 7 dager etter eksponering i en økning i osteogenic differensiering, som bestemmes av morfologi endringer (figur 2A-C), kalsium deponering (figur 2E-G) og osteogenic markør gene expression endringer ( Figur 3) i forhold til en tid-matchet kontroll uten EStim. Langvarig EStim eksponering (14 dager) ikke ytterligere styrke differensiering osteogenic utover det sett etter 7 dager behandling (figur 2DH og Figur 3).
Som vist i figur 2, cellene behandlet med EStim for 7 og 14 dager dukket opp mer komprimert (figur 2CD) enn de behandlet med EStim i 3 dager eller nontreated celler (figur 2AB) og viste en økt kalsium avsetning (figur 2 gH) sammenlignet med de behandlet for bare 3 dager eller nontreated kontroller ()figur 2EF). Analyse av osteogenic markør uttrykket etter 3, 7 og 14 dagers dyrking bekreftet forbedret osteogenic differensiering i cellene behandlet med EStim 7 og 14 dager (Figur 3). Det uttrykk for osteogenic-differensiering-relaterte markør gener12RunX2, Collagen jeg, Osteopontinog Osterix var høyest i cellene behandlet med EStim i 7 dager.
Figur 1: EStim celle kultur kammeret. (A) elektrisk koblingsskjema EStim kammer viser anoder (svart), katoder (rød) og LED koblet til DC strømforsyning. (B) bilde av merket 6-vel plate lokk og L-formet platina elektroder (nedenfra) innlemmet i 6-vel plate lokket. (C) samlet EStim kammer (ovenfra) med tråders, lysdioder og elektrisk isolasjon bånd som beskytter cellene fra LED-lys (piler). (D) EStim celle behandlingen oppsett med EStim kammeret i inkubator koblet til likestrøm, på utsiden. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: effekten av EStim på MSC morfologi og kalsium deponering. Celler i osteogenic kultur medium, utsatt og ikke utsatt (kontroller) til 100 mV/mm av EStim for 3, 7 og 14 dager (1 h/dag). (A-D) Morfologi og (E-H) kalsium deponering (alizarin røde flekker) på dag 14 av dyrking. Betydelige endringer i celle morfologi og kalsium innskudd var synlige i cellene behandlet med EStim for (C og G) 7 og (D og H) 14 dager (10 x forstørrelse; baren skala = 200 µm). Dette tallet ble endret fra Eischen-Loges et al. 9. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Effekten av EStim på MSC osteogenic markør genuttrykk. Den osteogenic markør genuttrykk (målt med RT-qPCR dager 3, 7 og 14 i dyrking) i cellene behandlet med EStim 3, 7 og 14 dager eller nontreated. (A) på dag 7 av dyrking, RunX2 uttrykket var betydelig høyere i cellene behandlet med EStim i 7 dager. (B) ColIa1 uttrykk var betydelig høyere i cellene behandles i 7 dager, målt på dag 14 av dyrking. (C) uttrykk for Osteopontin var betydelig økt i EStim-behandlet celler dager 3, 7 og 14 i dyrking. (D) Osterix uttrykk var fraværende kontroll celler hele tiden poeng og ble sett bare på 7 til 14 dager av kultur i celler utsatt for EStim. Forskjellige bokstaver på barer indikere betydelig (p < 0,05) forskjeller mellom grupper på samme tid punkt. Stjernen angir signifikant (p < 0,05) forskjellene mellom tidspunkt innen samme gruppe. Dette tallet ble endret fra Eischen-Loges et al.9. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi byggingen av et kammer og en metode for behandling av mesenchymal stamceller med EStim som gir forbedret osteogenic differensiering.
EStim oppsettet presentert krever ikke spesiell utstyr/kunnskap og kan utføres i et standard stamcelleforskningen biologi/biokjemi laboratorium av junior forskere. Når bygge og bruke EStim kammeret, må imidlertid spesiell omsorg tas i noen viktige skritt. Ved håndtering av platina elektrodene, må ekstra hensyn tas som dette metallet svært formbare og delikat. Mens andre metaller som stål eller tungsten, kan brukes, anbefales dette ikke som de er utsatt for korrosjon, som kan være cytotoksiske13. Også må rengjøring/sterilisering lokket med elektrodene utføres som nøyaktig som beskrevet i protokollen siden denne metoden har blitt testet flere ganger og funnet for å være effektiv i å eliminere problemer med forurensning. Endelig, mens denne kammer kan brukes til å studere andre EStim-sensitive celle aktiviteter som migrasjon14,15, spredning, apoptose16, cellemembranen spenninger17, og stillas vedheft19, den EStim protokollen beskriver vi her (100 mV/mm, 1 døgnet, 7 dager) fokuserte bare på osteogenic differensiering i rotte MSCs. spesiell oppmerksomhet bør gis dersom høyere spenninger (≥150 mV/mm) og/eller lengre varighet for EStim (> 4-5 h) brukes siden cytotoksiske produkter som følge av elektrolyse kan akkumuleres i mediet. Mediet må i dette tilfellet overvåkes nøye og utvekslet tilsvarende. For å studere andre parametere og/eller andre celletyper og betingelser, anbefaler vi at skille dosering (voltage) og diett titrering studier utføres fordi disse endringene kan påvirke hvordan cellene reagerer EStim.
Mulig feil i EStim kammeret kan skyldes pauser i elektriske kretsene etter gjentatt bruk og kan overvåkes via lagt LED lamper. I tilfelle brudd (angitt med nonilluminated LED light[s]), lokket kan fjernes og demontere og reparere pause. I tillegg gjør det enkle utformingen av EStim kammeret det enkelt å endre det i henhold til behovene til ulike eksperimentelle oppsett og metoder for analyse. Eksempler inkluderer bruk av forskjellige størrelser av celle kultur plater, ved å bare variere lengden på og avstanden mellom elektrodene eller legge til annen (3D) kultur forhold med keramiske stillaset materiale4 eller ledende underlag18, av å plassere disse materialer seeded cellene mellom elektrodene.
Som i alle in vitro eksperimenter, celle atferd og funksjoner er observert/indusert i EStim kammeret ikke alltid direkte overførbar i vivo modeller. Følgelig tolkingen EStim-indusert celle atferd/funksjoner i kammeret, må forskere alltid ta hensyn til.
Oppsett og metoden som presenteres her har mange fordeler fremfor andre i vitro metoder brukes til å eksponere cellene EStim (systemer med salt broer5 ) og systemer med elektroder i celle kultur brønner19. En viktig fordel med systemet beskrevet her er at siden cellene er kultivert i standard 6-og plater, de kan brukes etter EStim behandling protokoller i vivo eller i vitro. I tillegg gjør det faktum at elektrodene er løst på lokket av 6-vel plate det enkelt å vaske og sterilisere enheten mellom eksperimenter og bruke den. Til slutt gir muligheten til å samtidig stimulere celler i seks brønnene rikelig materiale for analyse og reproduserbarhet.
For å få en bedre forståelse av mekanismer på mobilnettet membran nivå som påvirker EStim celle aktiviteter i pågående studier med kammeret beskrevet her, Utforsker vi forholdet mellom eksternt leverte EStim og celle membran potensielle (Vmem)17. I tillegg vil basert på tidligere funn9i fremtiden studier, vi pretreat cellene med EStim i kammeret, alene og av ulike 3D stillaser og med ledende underlag, å stimulere bestemt celle funksjoner; deretter vil vi implantatet dem i dyr modeller for å bestemme om beholde de observerte forbedrede funksjonene i vivo. Disse studiene vil bidra til den økende mengde informasjon om mekanismer av hvilke EStim regulere celle-funksjonen, og dermed bidra til å optimalisere cellen terapi tilnærminger i regenerativ medisin og vev-utvikling-baserte behandlinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet var støttes delvis av en AO Foundation oppstart stipend (S-14-03 H) og Friedrichsheim Foundation (Stiftung Friedrichsheim) basert i Frankfurt am Main, Tyskland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Estim fabrication | |||
| Banana connector/Jack adaptor | Poppstars | 1008554 | 2 pieces |
| Cutting pliers | Knipex | 78 03 125 | |
| DC power supply (0-30V/0-3A) | B&K Precision | Model 9130B | Any simular model could be used |
| Insulated flexible wires (0.14 mm2) | Conrad Electronic International | 604794, 604093 | 2 pieces |
| Non-corrosive silicone rubber | Dow Corning | 3140 RTV | *could be purchased by many stores |
| Platinum Wire (999,5/1000; 1mm ø) | Junker Edelmetalle | 00D-3010 | 0.6 m needed for 1 Estim chamber |
| 70% Ethanol solution | any | Sterilisation of Estim chamber | |
| Silver coated copper wire (0.6 mm ø) | Conrad Electronic International | 409334 - 62 | ≈70 cm needed for 1 Estim device |
| Soldering iron Set | Conrad Electronic International | 1611410 - 62 | Any simular model could be used |
| TPP 6-well plate lid | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | 2 lids for Estim chamber |
| 2.2V wired circular LEDs | Conrad Electronic International | 599525 - 62 | 6 pieces |
| UHU Super glue | UHU GmbH & Co. KG | n/a | *could be purchased by many stores |
| MSC culture | |||
| β-Glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G9422 | osteogenic cell culture |
| DMEM, low glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Thermo-Fischer Scientific | 21885025 | cell culture |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo-Fischer Scientific | 14190144 | cell culture |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | osteogenic cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo-Fischer Scientific | 10500064 | cell culture |
| 50 ml Falcon tube | Sarstedt | 62,547,004 | cell culture |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | osteogenic cell culture |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fischer Scientific | 15140122 | cell culture |
| Sprague-Dawley (SD) rat mesenchymal stem cells, bone marrow origin | Cyagen | RASMX-01001 | cell culture |
| Cell detachment solution | Thermo-Fischer Scientific | A1110501 | cell culture, cell detachment |
| TC Flask, T75 | Sarstedt | 833911302 | cell culture |
| TPP 6-well plates | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | cell culture |
| Trypan Blue Dye, 0.4% solution | Bio-Rad | 1450021 | cell count |
References
- Oryan, A., Kamali, A., Moshiri, A., Baghaban Eslaminejad, M. Role of Mesenchymal Stem Cells in Bone Regenerative Medicine: What Is the Evidence? Cells, Tissues, Organs. 204 (2), 59-83 (2017).
- Mauney, J. R., Volloch, V., Kaplan, D. L. Role of Adult Mesenchymal Stem Cells in Bone Tissue Engineering Applications: Current Status and Future Prospects. Tissue Engineering. 11 (5-6), 787-802 (2005).
- Mobini, S., Leppik, L., Thottakkattumana Parameswaran, V., Barker, J. H. In vitro effect of direct current electrical stimulation on rat mesenchymal stem cells. PeerJ. 5, e2821 (2017).
- Leppik, L., et al. Combining electrical stimulation and tissue engineering to treat large bone defects in a rat model. Scientific Reports. 8 (1), S1 (2018).
- Song, B., et al. Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo. Nature Protocols. 2 (6), 1479-1489 (2007).
- Hronik-Tupaj, M., Kaplan, D. L. A review of the responses of two- and three-dimensional engineered tissues to electric fields. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 18 (3), 167-180 (2012).
- Huang, S., et al. An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. Journal of Orthopaedic Translation. 3 (1), 26-33 (2015).
- Nau, C., et al. Tissue engineered vascularized periosteal flap enriched with MSC/EPCs for the treatment of large bone defects in rats. International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 907-917 (2017).
- Eischen-Loges, M., Oliveira, K. M. C., Bhavsar, M. B., Barker, J. H., Leppik, L. Pretreating mesenchymal stem cells with electrical stimulation causes sustained long-lasting pro-osteogenic effects. PeerJ. 6, 4959 (2018).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), San Diego, CA. 402-408 (2001).
- Curtis, K. M., et al. EF1alpha and RPL13a represent normalization genes suitable for RT-qPCR analysis of bone marrow derived mesenchymal stem cells. BMC Molecular Biology. 11, 61 (2010).
- Wang, L., Li, Z. -y, Wang, Y. -p, Wu, Z. -h, Yu, B. Dynamic Expression Profiles of Marker Genes in Osteogenic Differentiation of Human Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells. Chinese Medical Sciences Journal (Chung-kuo i hsueh k'o hsueh tsa chih). 30 (2), 108-113 (2015).
- Kim, H. B., Ahn, S., Jang, H. J., Sim, S. B., Kim, K. W. Evaluation of corrosion behaviors and surface profiles of platinum-coated electrodes by electrochemistry and complementary microscopy: biomedical implications for anticancer therapy. Micron. 38 (7), Oxford, UK. 747-753 (2007).
- Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer. Molecular Biology of the Cell. , mbcE18010077 (2018).
- Tai, G., Tai, M., Zhao, M. Electrically stimulated cell migration and its contribution to wound healing. Burns & Trauma. 6, 20 (2018).
- Love, M. R., Palee, S., Chattipakorn, S. C., Chattipakorn, N. Effects of electrical stimulation on cell proliferation and apoptosis. Journal of Cellular Physiology. 233 (3), 1860-1876 (2018).
- Adams, D. S., Levin, M. General principles for measuring resting membrane potential and ion concentration using fluorescent bioelectricity reporters. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 385-397 (2012).
- Jin, G., Li, K. The electrically conductive scaffold as the skeleton of stem cell niche in regenerative medicine. Materials Science & Engineering. C, Materials for Biological Applications. 45, 671-681 (2014).
- Hronik-Tupaj, M., Rice, W. L., Cronin-Golomb, M., Kaplan, D. L., Georgakoudi, I. Osteoblastic differentiation and stress response of human mesenchymal stem cells exposed to alternating current electric fields. Biomedical Engineering Online. 10, 9 (2011).
