Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo para a construção de uma câmara de cultura celular projetada para expor as células de vários tipos de estimulação elétrica e sua utilização no tratamento de células-tronco mesenquimais para realçar a diferenciação osteogênica.
Abstract
Células tronco mesenquimais/estromal (MSCs) têm sido amplamente utilizadas para promover a consolidação óssea em abordagens de engenharia de tecidos. Estimulação elétrica (EStim) tem demonstrada aumentar a diferenciação osteogênica de MSC in vitro e promover a consolidação óssea em situações clínicas. Aqui descrevemos a construção de uma câmara de cultura de células de EStim... e sua utilização no tratamento de rato osso-medula-derivado MSC para realçar a diferenciação osteogênica. Descobrimos que tratar MSCs com EStim durante 7 dias resulta em um aumento significativo na diferenciação osteogênica, e importante, este efeito pro-osteogênica persiste muito tempo depois (7 dias) EStim é descontinuado. Esta abordagem de pretreating MSCs com EStim para realçar a diferenciação osteogênica poderia ser usada para otimizar os resultados do tratamento de engenharia de tecido ósseo e, assim, ajudá-los a alcançar o seu potencial terapêutico completo. Além desta aplicação, esta câmara de cultura de células de EStim e protocolo também podem ser usados para investigar outros comportamentos de célula EStim-sensíveis, tais como a migração, proliferação, apoptose e acessório do andaime.
Introduction
Um aumento no trauma e/ou defeitos ósseos induzida por doença estão sendo tratados usando diferentes combinações de terapia celular e tecnologias de medicina regenerativa. MSCs são a célula de escolha em tais tratamentos, devido à sua relativamente alta atividade osteogênica, isolamento e expansão de eficiência e segurança1. Para maximizar sua atividade osteogênica e, assim, otimizar sua eficácia terapêutica, foram introduzidos vários métodos para manipular MSCs antes da sua utilização nestes tratamentos (como comentado por Mauney et al.2). Um tal método é EStim, que foi mostrado para aumentar a diferenciação osteogênica do MSC em vitro3 e promover a consolidação em vivo4. Apesar do crescente número de estudos com foco em tratamento MSCs com EStim, um regime ideal para maximizar o efeito de pro-osteogênica do EStim ainda tem de ser definido.
Outros métodos in vitro usando EStim utilizam sal pontes submergidas em meio de cultura, que separa as células dos eletrodos metálicos5. A vantagem desta é que entregar EStim através de pontes de sal elimina a introdução de subprodutos químicos (por exemplo, corrosão dos eletrodos metálicos) que podem ser citotóxicos. Apesar desta vantagem, pontes de sal são complicados para trabalhar com, e entregam a EStim difere que entregue em modelos in vivo, tornando difícil correlacionar os resultados obtidos ao utilizar os dois sistemas. Configurações que entregam EStim via eletrodos metálicos ou carbono fixados dentro dos poços de cultura celular (como revisto por Hronik-Tupaj e Kaplan6) melhor simulam dispositivos utilizados no vivo; no entanto, esses dispositivos são difíceis de limpar/esterilizar entre usos e o número de células que podem ser estudadas por experiência é limitado. Nós projetamos a câmara EStim apresentada aqui especificamente para resolver as limitações destas outras configurações. Enquanto a maioria da nossa experiência usando esta câmara EStim foi com 2D e 3D culturas contendo medula óssea e adiposo tecido-derivada de MSCs3,4, a principal vantagem desta câmara é que é versátil e, com menor relativamente alterações, pode ser adaptado para outros tipos de células sob uma variedade de diferentes condições de estudar.
Aqui descrevemos a construção de uma câmara de cultura de células de EStim; Então, vamos demonstrar a sua utilização por tratados MSCs com diferentes regimes de EStim e medir o efeito resultante na diferenciação osteogênica. Diferenciação osteogênica MSC é avaliada através de deposição de cálcio, atividade da fosfatase alcalina e expressão de gene marcador osteogênica. Importante, no passado experiências que usou esta configuração, observou-se que estes efeitos pro-osteogênica persistirem muito tempo depois foi descontinuado o tratamento de EStim.
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Protocol
1. construção da câmara de cultura de células de estimulação elétrica
- Para construir a câmara EStim, coletar duas tampas das placas de cultura padrão 6-poços de célula; fio de 99,99% de platina, 60 cm de comprimento com um diâmetro de 0,5 a 1 mm; fio de cobre revestido de prata, 70 cm de comprimento com um diâmetro de 0,6 mm; alicate de corte; kit de ferro de soldar; um tubo de cola supercondutor; conector de bloco de terminais de um fio, seis pequenos 2,2 V diodos emissores de luz (opcional); um tubo de adesivo de silicone não corrosivo do revestimento (opcional); um rolo de fita de isolamento eléctrico preto; padrão, flexível, isolado cobre fio elétrico (0,14 mm2), 2 m de comprimento (tabela de materiais).
- Em uma tampa de 6 placa, marca e em seguida faça dois furos (com um diâmetro de ~ 1 mm), 25 mm separado, perto da borda externa de cada um dos seis poços (12 furos no total), como mostrado na figura 1A, B.
- Corte 12 comprimentos de 5 cm de fio de platina com alicate de corte. Dobre cada um dos fios manualmente em uma L-forma, deixando uma ponta de 3 cm de comprimento e os outros 2 cm. cortar o fio de prata-revestido em dois comprimentos de 35 cm.
- Inserir a extremidade (3 cm) mais em de um fio de platina (de dentro para fora) em cada furo, deixando 1-2 mm salientes do lado de fora da tampa, dobrá-lo usando fórceps. Prenda os fios de platina nos furos da tampa com cola supercondutor e deixe-o secar por cerca de 6 h.
- Solde as pontas de todos os seis fios de platina (que mais tarde vai servir como catodos, ver figura 1A) salientes das tampas para um dos fios prata-revestido. Repita o mesmo procedimento, soldar os fios de platina seis restantes (que mais tarde servirá como ânodos) para o outro fio prata-revestido.
- Adicione LEDs no circuito entre cada um dos seis pares de eletrodo de platina de ânodo-cátodo, para confirmar a funcionalidade durante os experimentos (opcionais). Coloque um pedaço de fita de isolamento preto no âmbito de cada LED para evitar expor as células nas placas de cultura para o diodo emissor de luz (Figura 1).
- O conector de bloco terminal do fio para o canto superior esquerdo da tampa 6 placa de cola e conecte os dois fios de prata-revestido para os terminais de entrada, como mostrado na Figura 1.
- Corte uma seção de 20 x 20 mm do canto superior esquerdo de uma segunda tampa de 6 placa (figura 1B, tampa Nr. 2) para acomodar o conector de bloco terminal da tampa primeiro. Cubra a tampa primeira, equipada com os eléctrodos, com a segunda tampa e gravá-los em conjunto com fita adesiva.
- Para melhorar a ligação das duas tampas, use adesivo de silicone, revestimento (opcional). Para fazer isso, cobrir a tampa com os eletrodos de prata com uma camada de 3 a 5 mm de adesivo de silicone e cubra com a outra tampa, permitindo 12 h para a cola secar.
- Conecte uma extremidade das dois fios de cobre isolados padrão para os terminais de saída do conector de fio e outras extremidades com conectores machos de banana (4 mm).
Nota: O comprimento destes fios depende da distância da prateleira na incubadora, onde as células serão mantidas, a fonte de alimentação, fora da incubadora (Figura 1). - Ajustar a dosagem (tensão) e regime de EStim entregue para as células, regulando a alimentação de DC.
- Ligue o fornecimento de energia, pressionando o botão ON/OFF no painel frontal. Ative o canal 1, pressionando o botão 1.
- Pressione o botão Nr. 4 (V-set) para definir a tensão. Pressione botões 2, . e 5 para definir a saída de carga de 2,5 V. Pressione Enter.
- Certifique-se de que a saída de carga de 2,5 V (2.500 mV) corresponde a uma EStim de 100 mV/mm, de acordo com a equação seguinte, simplificada.
V EStim =
; ou
V = VEStim × d
Aqui, V = tensão de alimentação de saída em milivolts; d = distância entre os eléctrodos em milímetros; V EStim = a tensão de estimulação em milivolts por milímetro.
Nota: Esta simplificação aplica-se somente em caso de tensão DC constante. A resistência entre o meio e as células é insignificante como eletrodos não estão em contacto directo com as células; em vez disso, EStim é entregue para as células através do meio.
; ou2. mesenquimais de células estaminais cultura osteogênica médio
- Comprar e armazenar MSCs rato comercialmente disponíveis (ver Tabela de materiais) em nitrogênio líquido, até o dia do experimento. Alternativamente, MSCs de isolado de outros animais de acordo com protocolos publicados noutro local7,8 , em conformidade com os regulamentos institucionais locais para o uso de animais experimentais.
- No dia do experimento, remover (1 x 106 células), um frasco de MSCs do armazenamento de nitrogênio líquido e rapidamente (dentro de 1 min) descongelar as células em um banho de água pré-aquecida a 37 ° C.
- Sob condições estéreis de um capuz de fluxo laminar, pipetar o conteúdo do frasco para um tubo falcon de 50ml e adicionar 9 mL do meio normal (NM) pré-aquecido a 37 ° C, constituído por meio da águia modificados de Dulbecco (DMEM; 1 x) com 10% inactivadas pelo calor fetal de soro bovino (FBS) e 1% solução de penicilina/estreptomicina. Granule as células por 5 min por centrifugação a 300 x g.
- Em uma capa de fluxo laminar, remover o sobrenadante e cuidadosamente Ressuspender as células em 12 mL de NM pré-aquecido a 37 ° C. Transferi as células ressuspensa para um frasco de cultura de células T-75.
- Cultura de células em 37 ° C, 5% de CO2, 5% O2 até atingirem uma confluência de 80%-90% (aproximadamente após 3-5 dias).
- Passagem das células.
Nota: Realizar todas as operações exceto centrifugação e incubação em condições estéreis de um capuz de fluxo laminar.- Depois de atingir uma confluência de 80%-90%, recupere as células com solução de desprendimento de células. Aspire o meio de cultura celular, lave 2 x com 1 x fosfato salino (PBS), adicionar 5 mL de 1 x solução de desprendimento de célula e retornar as células para a incubadora por 5 min.
- Uma vez que as células são desanexadas, adicione uma quantidade igual de meio de cultura para inactivar a solução de desprendimento. Coletar as células em um tubo falcon de 50ml e girá-los a 300 x g por 5 min.
- Descartar o meio e ressuspender as células em 1 mL de meio fresco normal. Avalie o número de células viáveis com mancha azul trypan.
- Semente de 1 x 106 células em balão T-75 novo com 12 mL de NM escaldada. Cultura de células em 37 ° C, 5% de CO2, 5% O2 até atingirem uma confluência de 80%-90%.
Nota: Célula passagem (etapas 2.4.1–2.4.4) pode ser repetido várias vezes até o número necessário de células é obtido. Não use mais de passagem 8 células.
- Semente 9 x 104 células em 3 mL de NM (10% inactivadas pelo calor fetal de soro bovino, 1% penicilina/estreptomicina, DMEM) em cada poço de uma placa de cultura de 6-poços. Incube as celulas para 1 dia em 37 ° C, 5% de CO2, 5% O2.
- No dia seguinte, Aspire o meio de cultura e aplicar 3 mL de meio de diferenciação osteogênica (OM; normal suplementado com 10-7 M dexametasona, β-glicerofosfato de 10 mM e 0,05 mM de ácido ascórbico-2-fosfato).
- Coloque a placa de 6 com células na incubadora e incubar a 37 ° C, 5% de CO2, 5% O2 durante a noite.
3. tratamento de MSCs com EStim
- No dia em que as células são tratadas com EStim, esterilizar os eletrodos em solução de etanol 70% por 30 min; em seguida, seque-os à luz numa câmara de segurança para um adicional 30 min UV.
- Em uma capa de fluxo laminar, cobrir a placa de 6 contendo os MSCs cultivadas com a tampa equipada com os eléctrodos, certificando-se de que os eléctrodos estão completamente submersos no meio (se necessário, adicione médio). Transferir a placa 6-poços coberta (EStim câmara) com as células para a incubadora e conectar seus arames para fonte de alimentação.
- Definir a fonte de alimentação para saída de carga 2,5 V e tratar as células com EStim para 1h3,9.
- Após a estimulação, desconecte a fonte de alimentação e remova a câmara de EStim da incubadora. Sob condições estéreis, troca a tampa equipada com eléctrodos com uma tampa da placa padrão 6.
- Retorno das células para a incubadora e deixá-los durante a noite. Limpe os eléctrodos, primeiro com PBS e, em seguida, com solução de etanol a 70%. Limpe os produtos de corrosão acumulada da superfície do eletrodo com uma lixa fina.
- Repita as etapas 3.1-3.5 para 6 dias consecutivos. No dia 4, antes da aplicação EStim e sob condições estéreis, mudar o meio de cultura por 1,5 mL de meio de aspiração e substitui-lo com 1,5 mL de OM fresca escaldada
- Depois de aplicar EStim durante 7 dias consecutivos, manter as células em cultura por mais 7 dias, trocando a média a cada 3-4 dias.
4. medições de diferenciação osteogênica
- Analise as alterações de morfologia celular sob um microscópio.
- Para avaliar o efeito de EStim na diferenciação osteogênica MSC, medida deposição de cálcio, atividade da fosfatase alcalina e expressão de gene marcador osteogênica, como descrito em outra parte3,9.
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Representative Results
Para avaliar o efeito de 100 mV/mm de EStim na diferenciação osteogênica do MSCs, células tratadas com EStim para 3, 7 e 14 dias ou folhas (controle) foram analisados no dia 14 de cultivo avaliando alterações morfológicas e deposição de cálcio (Figura 2 ). Isto foi feito por imagem de células usando microscopia de campo claro (alterações de morfologia) ou pela fixação de células em solução de paraformaldeído 4%, manchando-os com solução de vermelho de alizarina 0,02% e em seguida por imagem-los usando microscopia de campo claro (deposição de cálcio análise).
Uma análise detalhada de mudanças de expressão de gene marcador osteogênica foi realizada no dias 3, 7 e 14 de cultivo (Figura 3). Isto foi feito medindo-se a expressão relativa dos genes RunX2, colágeno , Osteopontine Osterix por meio de RT-qPCR e o delta comparativa Ct (limiares ciclo) método10,onde genes de limpeza Rplp1 e Ywhaz11 foram usados para normalização.
Expor o MSCs a 100 mV/mm de EStim por 3 dias (1 h por dia) não teve nenhum efeito; no entanto, 7 dias de exposição resultou em um aumento na diferenciação osteogênica, conforme determinado pelas mudanças de morfologia (Figura 2A-C), deposição de cálcio (Figura 2E– G) e marcador osteogênica gene expressão alterações ( A Figura 3) em comparação com um controle de tempo de correspondência sem EStim. Exposição prolongada de EStim (14 dias) não aumentar ainda mais a diferenciação osteogênica além disso visto após 7 dias de tratamento (Figura 2DH e Figura 3).
Como mostrado na Figura 2, células tratadocom com EStim para 7 e 14 dias apareceram mais condensada (Figura 2D) do que aqueles tratados com EStim para 3 dias ou pilhas de folhas (Figura 2AB) e mostraram um aumento de cálcio deposição (Figura 2H) em comparação com aqueles tratados por apenas 3 dias ou folhas controles (,Figura 2EF). Análise da expressão osteogênica marcador aos 3, 7 e 14 dias de cultivo confirmou a diferenciação osteogênica reforçada nas células tratadas com EStim durante 7 a 14 dias (Figura 3). A expressão de genes de marcador de diferenciação osteogênica-relacionados12RunX2, colágeno , eu, Osteopontine Osterix foram os mais altos em células tratadas com EStim durante 7 dias.
Figura 1: câmara de cultura de células de EStim. (A) diagrama de circuito elétrico da câmara EStim mostrando os ânodos (pretos), catodos (vermelho) e os LEDs ligados à fonte de alimentação DC. (B) imagem dos eléctrodos de platina em forma de L (vista inferior) e tampas marcado 6 placa incorporada a tampa da placa 6. (C) montado EStim câmara (vista superior) com conector de fio, LEDs e fita de isolamento eléctrico que protege as células de luz LED (setas). (D) EStim celular configuração de tratamento com a câmara de EStim na incubadora conectada à fonte de alimentação DC, do lado de fora. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: efeito de EStim na deposição de morfologia e cálcio MSC. Células em meio de cultura osteogênico, expostos e não expostos (controles) para 100 mV/mm de EStim de 3, 7 e 14 dias (1h/dia). (-D) Morfologia e (E-H) deposição de cálcio (coloração de vermelho de alizarina) no dia 14 de cultivo. Mudanças significativas na célula morfologia e cálcio depósitos eram visíveis em células tratadocom com EStim para (C e G) 7 e (D e H) 14 dias (ampliação de 10x; a barra de escala = 200 µm). Esta figura foi modificada de Eischen-Loges et al.. 9. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Efeito de EStim na expressão do gene marcador osteogênica MSC. A expressão de gene marcador osteogênica (medida com RT-qPCR no dias 3, 7 e 14 de cultivo) em células tratadas com EStim por 3, 7 e 14 dias, ou folhas. (A) no dia 7 de cultivo, a expressão RunX2 foi significativamente maior em células tratadas com EStim durante 7 dias. (B) o ColIa1 expressão foi significativamente maior em células tratadas por 7 dias, medida no dia 14 de cultivo. (C) a expressão do Osteopontin aumentou significativamente em células EStim-tratada no dias 3, 7 e 14 de cultivo. (D) o Osterix expressão estava ausente no controle de células em todos os pontos e foi visto apenas em 7 a 14 dias de cultura nas células expostas a EStim. Letras diferentes nas barras indicam significativas diferenças (p < 0,05) entre os grupos ao mesmo tempo pontos. O asterisco indica significativas diferenças (p < 0,05) entre os pontos de tempo dentro do mesmo grupo. Esta figura foi modificada de Eischen-Loges et al.9. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui descrevemos a construção de uma câmara e um método para o tratamento de células-tronco mesenquimais com EStim que resulta em maior diferenciação osteogênica.
A configuração de EStim apresentada não requer equipamentos especial/conhecimento e pode ser realizada em um laboratório de biologia/bioquímica de células-tronco padrão por pesquisadores Júnior. No entanto, quando compilando e usando a câmara EStim, especial deve ter cuidado em algumas etapas críticas. Ao manusear os eléctrodos de platina, extra deve ter cuidado como este metal é muito maleável e delicado. Enquanto outros metais, como aço ou tungstênio, podem ser usados, estes não são recomendados como eles são propensos à corrosão, que pode ser citotóxico13. Também, a tampa com os eléctrodos de limpeza/esterilização deve ser realizada como precisamente conforme descrito no protocolo, desde que este método foi testado repetidamente e encontrado para ser eficaz na eliminação de problemas de contaminação. Finalmente, enquanto esta câmara pode ser usada para estudar outros EStim sensíveis à célula atividades como migração de14,15, proliferação, apoptose16, tensões de membrana celular17e andaime adesão19, o Protocolo de EStim descrevemos aqui (100 mV/mm, 1 h/dia, 7 dias) focado apenas na diferenciação osteogênica no rato MSCs. especial atenção deve ser dada se maior tensões (≥150 mV/mm) e/ou durações mais longas de EStim (> 4-5h) são aplicadas desde produtos citotóxicos resultantes da eletrólise podem se acumular no meio. Neste caso, o meio deve ser cuidadosamente monitorizado e trocado em conformidade. Para estudar outros parâmetros e/ou outros tipos de células e condições, recomendamos que separam a dosagem (tensão) e estudos de titulação regime ser conduzidas como essas mudanças podem afetar como células respondem para EStim.
Possível mau funcionamento da câmara EStim pode ser devido a quebras no circuito elétrico após uso repetido e pode ser monitorada através de lâmpadas de LED adicionadas. Em caso de ruptura (indicada pelo nonilluminated light[s]) de LED, a tampa pode ser removida e facilmente desmontada para identificar e reparar a fuga. Além disso, o design simples da câmara EStim facilita a modificá-lo de acordo com as necessidades de diferentes configurações experimentais e métodos de análise. Exemplos incluem o uso de diferentes tamanhos de placas de cultura de células, por simplesmente, variando o comprimento e a distância entre os eletrodos ou adicionando condições de cultura diferente (3D) com material de andaime cerâmica4 ou substratos condutores18, por simplesmente colocar estes materiais semeado com células entre os eletrodos.
Como em todos os experimentos in vitro, funções e comportamentos de célula observada/induzido na câmara EStim nem sempre são diretamente transferível para modelos in vivo. Nesse sentido, ao interpretar as celular induzida por EStim comportamentos/funções na câmara, pesquisadores devem sempre levar isso em consideração.
A instalação e o método apresentado aqui têm muitas vantagens sobre outros métodos in vitro usadas para expor as células para EStim (sistemas com pontes de sal5 ) e sistemas com eletrodos incorporados na célula cultura poços19. Uma vantagem importante do sistema descrito aqui é que, uma vez que as células são cultivadas em placas de padrão 6-bem, eles podem ser usados após o tratamento de EStim em outros protocolos in vivo ou in vitro. Além disso, o fato de que os eléctrodos são fixos na tampa da placa de 6-poços torna fácil de limpar e esterilizar o dispositivo entre experiências e reutilizá-lo. Finalmente, a capacidade de simultaneamente estimular células em seis poços fornece amplo material para análise e a reprodutibilidade.
Para obter uma melhor compreensão dos mecanismos a nível de membrana celular pelo qual EStim afeta atividades da célula em estudos em andamento usando a câmara descrita aqui, estamos explorando a relação entre externamente entregues EStim e membrana celular potenciais (Vmem)17. Além disso, com base em anteriores conclusões9, estudos, no futuro, nós vai pré-tratamento as células com EStim na câmara, sozinha e com andaimes 3D diferentes e com substratos condutoras, para estimular as funções celulares específicas; em seguida, será implantamos-los em modelos animais para determinar se eles retêm as funções aprimoradas observadas in vivo. Esses estudos contribuirão para o corpo crescente de informações sobre os mecanismos pelos qual EStim regulam a função celular e, ao fazê-lo, poderia contribuir para otimização de abordagens de terapia celular em medicina regenerativa e baseados em tecido-engenharia tratamentos.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado em parte por uma concessão de start-up AO Foundation (S-14-03 H) e a Fundação Friedrichsheim (Stiftung Friedrichsheim) com sede em Frankfurt am Main, Alemanha.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Estim fabrication | |||
| Banana connector/Jack adaptor | Poppstars | 1008554 | 2 pieces |
| Cutting pliers | Knipex | 78 03 125 | |
| DC power supply (0-30V/0-3A) | B&K Precision | Model 9130B | Any simular model could be used |
| Insulated flexible wires (0.14 mm2) | Conrad Electronic International | 604794, 604093 | 2 pieces |
| Non-corrosive silicone rubber | Dow Corning | 3140 RTV | *could be purchased by many stores |
| Platinum Wire (999,5/1000; 1mm ø) | Junker Edelmetalle | 00D-3010 | 0.6 m needed for 1 Estim chamber |
| 70% Ethanol solution | any | Sterilisation of Estim chamber | |
| Silver coated copper wire (0.6 mm ø) | Conrad Electronic International | 409334 - 62 | ≈70 cm needed for 1 Estim device |
| Soldering iron Set | Conrad Electronic International | 1611410 - 62 | Any simular model could be used |
| TPP 6-well plate lid | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | 2 lids for Estim chamber |
| 2.2V wired circular LEDs | Conrad Electronic International | 599525 - 62 | 6 pieces |
| UHU Super glue | UHU GmbH & Co. KG | n/a | *could be purchased by many stores |
| MSC culture | |||
| β-Glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G9422 | osteogenic cell culture |
| DMEM, low glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Thermo-Fischer Scientific | 21885025 | cell culture |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo-Fischer Scientific | 14190144 | cell culture |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | osteogenic cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo-Fischer Scientific | 10500064 | cell culture |
| 50 ml Falcon tube | Sarstedt | 62,547,004 | cell culture |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | osteogenic cell culture |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fischer Scientific | 15140122 | cell culture |
| Sprague-Dawley (SD) rat mesenchymal stem cells, bone marrow origin | Cyagen | RASMX-01001 | cell culture |
| Cell detachment solution | Thermo-Fischer Scientific | A1110501 | cell culture, cell detachment |
| TC Flask, T75 | Sarstedt | 833911302 | cell culture |
| TPP 6-well plates | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | cell culture |
| Trypan Blue Dye, 0.4% solution | Bio-Rad | 1450021 | cell count |
References
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