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Bioengineering

Construcción y uso de una cámara de estimulación eléctrica para mejorar la diferenciación osteogénica de células madre mesenquimales, estromales In Vitro

Published: January 31, 2019 doi: 10.3791/59127

Summary

Aquí presentamos un protocolo para la construcción de una cámara de cultivo celular diseñada para exponer distintos tipos de estimulación eléctrica y su uso en el tratamiento de células madre mesenquimales para realzar la diferenciación osteogénica de las células.

Abstract

Células madre/estromales mesenquimales (MSCs) se han utilizado extensivamente para promover el hueso curativo en enfoques de ingeniería de tejidos. Estimulación eléctrica (EStim) se ha demostrado para aumentar la diferenciación osteogénica de MSC in vitro y promover hueso curativo en ajustes clínicos. Aquí describimos la construcción de una cámara de cultivo celular de EStim y su uso en el tratamiento de MSC de médula ósea para mejorar la diferenciación osteogénica de la rata. Se encontró que el tratamiento de MSCs con EStim durante 7 días da lugar a un aumento significativo en la diferenciación osteogénica, y lo importante, este efecto osteogénico pro persiste mucho tiempo después (7 días) EStim. Este enfoque de pretratamiento de MSCs con EStim para mejorar la diferenciación osteogénica podría utilizarse para optimizar los resultados del tratamiento de recreando el tejido del hueso y, así, ayudarles a alcanzar su potencial completo terapéutico. Además de esta aplicación, esta EStim compartimiento de la cultura de célula y protocolo pueden también utilizar para investigar otros comportamientos de célula EStim-sensibles, tales como la migración, proliferación, apoptosis y accesorio del andamio.

Introduction

Un aumento de traumas o defectos óseos inducidos por la enfermedad son tratados con diferentes combinaciones de tecnologías de la medicina regenerativa y terapia celular. MSCs son la célula de elección en estos tratamientos, debido a su relativamente alta actividad osteogénica, aislamiento y eficiencia de expansión y seguridad1. Para maximizar su actividad osteogénica y, así, optimizar su eficacia terapéutica, se han introducido varios métodos para manipular MSCs antes de su uso en estos tratamientos (ya revisado por Mauney et al.2). Un tal método es EStim, que se ha demostrado para mejorar la diferenciación osteogénica de MSC en vitro3 y promover hueso curativo en vivo4. A pesar del creciente número de estudios centrados en el tratamiento de MSCs con EStim, un régimen óptimo para maximizar el efecto pro-osteogénica de EStim todavía tiene que definirse.

Otros métodos in vitro utilizando EStim utilizan puentes de sal sumergidos en el medio de cultivo, que separa las células de electrodos metálicos5. La ventaja es que entrega EStim a través de puentes de sal elimina la introducción de subproductos químicos (por ejemplo, corrosión de los electrodos metálicos) que pueden ser citotóxicos. A pesar de esta ventaja, puentes de sal son engorrosos para trabajar con, y EStim que difiere de la que en los modelos in vivo, lo que es difícil correlacionar los resultados obtenidos al utilizar los dos sistemas. Configuraciones que EStim vía los electrodos metálicos o carbono fijados dentro de los pozos de la cultura de célula (ya revisado por Tupaj Hronik y Kaplan6) simulan mejor los dispositivos usados en vivo; sin embargo, estos dispositivos son difíciles de limpiar/esterilizar entre los usos y el número de células que pueden ser estudiados por experimento está limitado. Diseñamos la cámara EStim presentada específicamente para hacer frente a las limitaciones de estas otras configuraciones. Aunque la mayor parte de nuestra experiencia con esta cámara EStim ha sido con 2D y 3D culturas que contiene médula ósea adiposo-tejido-derivadas y MSCs3,4, una gran ventaja de esta cámara es es versátil y, con relativamente menores cambios, pueden ser adaptados a otros tipos celulares bajo una variedad de diferentes condiciones de estudio.

Aquí describimos la construcción de una sala de cultura de célula EStim; Luego, se demuestra su uso por MSCs tratando con diferentes regímenes de EStim y medir el efecto resultante sobre la diferenciación osteogénica. Diferenciación osteogénica MSC es evaluada a través de la deposición de calcio, actividad de la fosfatasa alcalina y expresión génica de marcadores osteogénicos. Lo importante, más allá de experimentos que utilizan esta configuración, observamos que estos efectos pro-osteogénica persisten mucho después de que se suspendió el tratamiento de EStim.

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Protocol

1. construcción del compartimiento de la cultura de la estimulación eléctrica de la célula

  1. Para construir la cámara EStim, recoger dos tapas de placas de cultivo estándar celular 6-bien; cable 99.99% platino, 60 cm de longitud con un diámetro de 0,5 a 1 mm; alambre de cobre recubierto de plata, 70 cm de longitud con un diámetro de 0,6 mm; alicates de corte; kit de soldador; un tubo de pegamento superconductor; conector del bloque de terminal de un cable, pequeño seis 2,2 V LED (opcional); un tubo de pegamento de silicón no corrosivo capa (opcional); un rollo de cinta aisladora negra; estándar, flexible, con aislamiento cables eléctricos cobre (0,14 mm2), 2 m de largo (tabla de materiales).
  2. En una tapa de placa de 6 pozos, marca y luego perfore dos agujeros (con un diámetro de ~ 1 mm), 25 mm., cerca del borde externo de cada uno de los seis pozos (12 agujeros en total), como se muestra en la figura 1A, B.
  3. Cortar 12 tiras de 5 cm de alambre de platino con alicates de corte. Cada uno de los cables manualmente en forma de L, dejando 3 cm de largo uno de los extremos de la curva y los otros 2 cm. Corte el cable revestido de plata en dos longitudes de 35 cm.
  4. Inserte el extremo doblado del más largo (3 cm) de un alambre de platino (de dentro hacia fuera) en cada orificio taladrado, dejando 1-2 mm que sobresale de la parte exterior de la tapa, lo doble con unas pinzas. Asegure los alambres de platino en los agujeros de la tapa con pegamento de superconductor y dejarlo secar por alrededor de 6 horas.
  5. Las puntas de los alambres de platino seis (que más tarde servirá de cátodos, ver figura 1A) de la soldadura que sobresale de la tapa a uno de los cables recubiertos de plata. Repita el mismo procedimiento, soldar los cables de platino seis restantes (que más tarde servirá de ánodos) al otro cable revestido de plata.
    1. Añadir LEDs en el circuito entre cada uno de los seis pares de electrodo de platino de ánodo-cátodo, para confirmar la funcionalidad durante los experimentos (opcionales). Coloque un pedazo de cinta negra debajo de cada LED para evitar exponer a las células en las placas de la cultura a la luz de LED (figura 1).
  6. Pegar el cable conector del bloque terminal en la esquina superior izquierda de la tapa de placa de 6 pozos y Conecte ambos cables recubiertos de plata a los terminales de entrada, como se muestra en la figura 1.
  7. Corte una sección de 20 x 20 mm de la esquina superior izquierda de una segunda tapa de placa de 6 pozos (figura 1B, la tapa no. 2) para el conector del bloque de terminal en la primera tapa. Cubre la primera tapa, equipada con electrodos, con la segunda tapa y pegarlas con cinta adhesiva.
    1. Para mejorar la vinculación de las dos tapas, use adhesivo de silicona capa (opcional). Para ello, cubra la tapa con los electrodos de plata con una capa de 3-5 mm de silicona adhesivo y cubrir con la tapa, permitiendo a 12 h para que el adhesivo se seque.
  8. Conecte un extremo de los dos cables de cobre aislados estándar para los terminales de salida del conector del cable y los otros extremos a conectores macho banana (4 mm).
    Nota: La longitud de los cables depende de la distancia de la plataforma en la incubadora, donde las células se mantendrá, a la alimentación, fuera de la incubadora (figura 1).
  9. Ajustar la dosis (voltaje) y régimen de EStim entregado a las células mediante la regulación de la fuente de alimentación.
    1. Encienda la alimentación presionando el botón ON/OFF en el panel frontal. Activa canal 1 pulsando el botón 1.
    2. Pulse la tecla nº 4 (V-set) para ajustar la tensión. Pulse botones de 2, . y 5 para ajustar la salida de carga en 2.5 V. Oprima Enter.
    3. Asegurar que la salida de carga de 2,5 V (2.500 mV) corresponde a un EStim de 100 mV/mm, según la ecuación siguiente, simplificada.
      V EStim = Equation ; o
      V = VEStim × d
      Aquí V = el voltaje de alimentación de la salida de milivoltios; d = distancia entre electrodos en milímetros; V EStim = el voltaje de estimulación en milivolts por milímetro.
      Nota: Esta simplificación se aplica sólo en caso de voltaje de DC constante. La resistencia entre el medio y las células es insignificante ya que los electrodos no están en contacto directo con las células; en cambio, EStim se entrega a las células a través del medio.

2. mesenquimatosas células cultura en medio osteogénico

  1. Comprar y almacenar MSCs rata comercialmente disponibles (véase Tabla de materiales) en nitrógeno líquido hasta el día del experimento. Por otra parte, aislamiento MSCs de otros animales según protocolos había publicado7,8 según la normativa institucional local para el uso de animales de experimentación.
  2. En el día del experimento, saque el almacenamiento de nitrógeno líquido de un frasco (1 x 106 células) de MSCs y rápidamente (dentro de 1 min) descongelar las células en un baño de agua precalentada a 37 ° C.
    1. Bajo condiciones estériles en campana de flujo laminar, pipetee el contenido del frasco en un tubo falcon de 50 mL y añadir 9 mL de medio normal (NM) precalentado a 37 ° C, que consiste en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM; 1 x) con 10% inactivado con calor suero bovino fetal (FBS) y 1% solución de penicilina/estreptomicina. Sedimenten las células durante 5 min mediante centrifugación a 300 x g.
    2. En campana de flujo laminar, quite el sobrenadante y con cuidado Resuspender el precipitado de células en 12 mL de NM precalentada a 37 ° C. Transferir las células resuspendidas a un matraz de cultivo de células T-75.
  3. Las células a 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 de la cultura hasta llegar a una confluencia del 80% – 90% (después de aproximadamente 3 a 5 días).
  4. Las células de paso.
    Nota: Realice todas las operaciones excepto la centrifugación e incubación en condiciones estériles en campana de flujo laminar.
    1. Después de alcanzar una confluencia del 80% – 90%, recuperar las células con solución de separación celular. Aspirar el medio de cultivo celular, lavar 2 x 1 x tampón fosfato solución salina (PBS), añadir 5 mL de solución de separación celular 1 x y vuelva las células a la incubadora durante 5 minutos.
    2. Una vez que las células son separadas, añadir una cantidad igual de medio de cultivo para inactivar la solución de la separación. Recoger las células en un tubo falcon de 50 mL y centrifugado a 300 x g durante 5 minutos.
    3. Descartar el medio y resuspender las células en 1 mL de medio fresco normal. Evaluar el número de células viables con el colorante azul de trypan.
    4. Semilla 1 x 106 células en un nuevo frasco de T-75 con 12 mL de NM precalentada. Las células a 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 de la cultura hasta llegar a un 80% – 90% de confluencia.
      Nota: Celular pases (medidas 2.4.1–2.4.4) se puede repetir varias veces hasta obtener la cantidad necesaria de células. No utilice las células mayores de paso 8.
  5. 4 células de semilla 9 x 10 3 ml de NM (10% suero bovino fetal inactivado con calor, 1% de penicilina/estreptomicina, DMEM) en cada pocillo de una placa de cultivo de 6 pozos. Incube las células durante 1 día a 37 ° C, 5% CO2, 5% O2.
  6. Al día siguiente, aspirar el medio de cultivo y aplicar 3 mL de medio de diferenciación osteogénica (OM; normal suplementado con 10-7 M de dexametasona, glicerofosfato-β de 10 mM y 0.05 mM de ácido ascórbico 2-fosfato).
  7. Coloque la placa de 6 pozos con células en la incubadora e incubar a 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 durante la noche.

3. tratamiento de MSCs con EStim

  1. El día que las células se tratan con EStim, esterilizar los electrodos en solución de etanol 70% durante 30 minutos; Luego, secar bajo la luz en un gabinete durante una 30 minutos adicionales de seguridad UV.
  2. En campana de flujo laminar, cubra la placa de 6 pozos con MSCs cultivadas con tapa equipada con electrodos, asegurándose de que los electrodos estén completamente sumergidos en el medio (si es necesario, añadir medio). La placa de 6 pozos cubierta (EStim cámara) con las células de transferencia a la incubadora y conecte sus cables a la fuente de alimentación.
  3. Establecer la fuente de alimentación a la salida de carga de 2,5 V y tratar las células con EStim para 1 h3,9.
  4. Después de la estimulación, desconecte la alimentación y extraiga la cámara EStim de la incubadora. Bajo condiciones estériles, intercambiar la tapa consta de electrodos con una tapa estándar placa de 6 pozos.
  5. Vuelva las células a la incubadora y dejar toda la noche. Limpiar los electrodos, primero con el PBS y luego con solución de etanol al 70%. Limpiar los productos de corrosión acumulados desde la superficie del electrodo con papel de lija fino.
  6. Repita los pasos 3.1 a 3.5 durante 6 días consecutivos. El día 4, antes de aplicar EStim y bajo condiciones estériles, cambiar el medio de cultivo por aspiración 1,5 mL de medio y reemplazarlo con 1,5 mL de OM. fresco precalentado
  7. Después de aplicar EStim durante 7 días consecutivos, mantener las células en cultivo por un adicional de 7 días, cambiar el medio cada 3-4 días.

4. medidas de diferenciación osteogénica

  1. Analizar cambios de morfología de la célula bajo el microscopio.
  2. Para evaluar el efecto de EStim en MSC Diferenciación osteogénica medida deposición de calcio, actividad de la fosfatasa alcalina y expresión génica de marcadores osteogénicos, como describe en otra parte3,9.

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Representative Results

Para evaluar el efecto de 100 mV/mm de EStim en la diferenciación osteogénica de MSCs, las células tratadas con EStim para 3, 7 y 14 días o no tratada (control) fueron analizadas en el día 14 de cultivo mediante la evaluación de cambios morfológicos y la deposición de calcio (figura 2 ). Esto fue hecha por las células mediante microscopía de campo brillante (cambios de morfología) la proyección de imagen o por fijación de células en solución de paraformaldehído al 4%, tinción con solución de rojo de alizarina de 0.02% y luego la proyección de imagen les mediante microscopía de campo brillante (deposición de calcio Análisis).

Se realizó un análisis detallado de los cambios de expresión de genes marcadores osteogénicos en los días 3, 7 y 14 del cultivo (figura 3). Esto se hizo mediante la medición de la expresión relativa de genes RunX2, colágeno I, osteopontinay Osterix mediante RT-qPCR y el delta comparativo Ct (valores del ciclo umbral) método10, donde los genes Housekeeping Rplp1 y Ywhaz11 fueron utilizados para la normalización.

Exposición de MSCs a 100 mV/mm de EStim para 3 días (1 h al día) no tuvo ningún efecto; sin embargo, 7 días de la exposición dio lugar a un aumento en la diferenciación osteogénica, cambios de morfología (figura 2A-C), deposición de calcio (Figura 2E– G) y () marcador osteogénico gene expresión cambios Figura 3) en comparación con un control de tiempo comparable sin EStim. Exposición de EStim prolongada (14 días) no mejorar aún más la diferenciación osteogénica más allá de eso después de 7 días de tratamiento (Figura 2DH y figura 3).

Como se muestra en la figura 2, células trataron con EStim para 7 y 14 días más condensada (figura 2D) que aquellos tratados con EStim para 3 días o células no tratadas (figura 2AB) y mostraron un incremento del calcio deposición (figura 2h) en comparación con aquellos tratados por solamente 3 días o controles no tratados ()Figura 2EF). El análisis de la expresión de marcadores osteogénicos en 3, 7 y 14 días de cultivo confirmó la mayor diferenciación osteogénica de las células tratadas con EStim para 7 y 14 días (figura 3). La expresión de genes relacionados con la diferenciación osteogénica marcador12RunX2, colágeno , osteopontinay Osterix fueron las más altas en las células tratadas con EStim por 7 días.

Figure 1
Figura 1: compartimiento de la cultura de EStim celular. (A) diagrama de circuito eléctrico de la cámara de EStim que los ánodos cátodos (negros), (rojo) y LEDs conectados a la fuente de alimentación. (B) imagen de la tapa de placa de 6 pozos marcada y electrodos de platino en forma de L (vista inferior) incorporado en la tapa de placa de 6 pozos. (C) montado EStim cámara (vista desde arriba) con conector, LED y cinta de aislamiento eléctrico que protege las células de la luz (flechas). (D) EStim instalación de tratamiento con la cámara EStim en la incubadora conectada a la fuente de alimentación de DC, en la parte exterior de la célula. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: efecto de EStim en la deposición de calcio y morfología de la MSC. Células en osteogénico medio de cultivo, expuestas y no expuestos (controles) a 100 mV/mm de EStim para 3, 7 y 14 días (1 h/día). (AD) Morfología y (EH) deposición del calcio (tinción rojo de alizarina) el día 14 de cultivo. Cambios significativos en los depósitos de calcio y morfología celular eran visibles en las células trataron con EStim (C y G) 7 y (D y H) 14 días (aumento de x 10, la barra de escala = 200 μm). Esta figura fue modificada de Eischen-Loges et al. 9. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Efecto de EStim en la expresión de genes marcadores osteogénicos MSC. La expresión de genes de marcadores osteogénicos (medida con RT-qPCR a los días 3, 7 y 14 de cultivo) en las células tratadas con EStim para 3, 7 y 14 días, o no tratada. (A) en el día 7 de cultivo, la expresión de RunX2 fue significativamente mayor en las células tratadas con EStim por 7 días. (B) del ColIa1 expresión fue significativamente mayor en las células tratadas por 7 días, medido en el día 14 de cultivo. (C) la expresión de osteopontina aumentó significativamente en células tratadas con EStim a los días 3, 7 y 14 de cultivo. (D) el Osterix expresión estuvo ausente en el control de las células en todos puntos de tiempo y fue visto solamente en los días 7 y 14 de la cultura en las células expuestas a EStim. Letras diferentes sobre las barras indican importantes diferencias (p < 0.05) entre grupos al mismo tiempo el punto. El asterisco indica importantes diferencias (p < 0.05) entre puntos de tiempo dentro del mismo grupo. Esta figura fue modificada de Eischen-Loges et al9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Aquí describimos la construcción de una cámara y un método para el tratamiento de células madre mesenquimales con EStim que se traduce en mayor diferenciación osteogénica.

La configuración de EStim presentada no requiere equipo especial/conocimientos y se puede realizar en un laboratorio de Biología/Bioquímica de la célula de vástago estándar por jóvenes investigadores. Sin embargo, al construir y utilizar la cámara EStim, especial debe tener cuidado en algunos pasos críticos. Al manipular los electrodos de platino, adicional debe tener cuidado ya que este metal es muy maleable y delicada. Aunque pueden utilizarse otros metales, como acero o tungsteno, estos no son recomendados ya que son propensos a la corrosión, que puede ser citotóxicos13. También, la limpieza/esterilización de la tapa con los electrodos deberán realizarse como precisamente como se describe en el protocolo, puesto que este método ha sido probado varias veces y encontrado para ser eficaz en la eliminación de problemas de contaminación. Finalmente, mientras que esta cámara podría utilizarse para estudiar otras EStim-sensible células actividades como migración14,15, proliferación, apoptosis16, tensiones de membrana de la célula17y andamio adhesión19, el Protocolo de EStim que Describimos aquí (100 mV/m, 1 h/día, 7 días) se centró sólo en diferenciación osteogénica en rata MSCs. especial atención debe prestarse si es mayor tensiones (≥150 mV/mm) o más larga duración de EStim (> 4-5 h) se aplican desde productos citotóxicos resultantes de la electrólisis pueden acumularse en el medio. En este caso, el medio debe ser cuidadosamente monitoreado e intercambiado por consiguiente. Para estudiar otros parámetros y otras tipos celulares y condiciones, le recomendamos que separe dosificación (voltaje) y llevar a cabo estudios de valoración de régimen como estos cambios pueden afectar cómo las células responden a EStim.

Posible mal funcionamiento de la cámara de EStim puede deberse a roturas en el circuito eléctrico después de uso repetido y puede controlarse a través de las lámparas de LED adicionales. En caso de rotura (indicado por letreros LED light[s]), la tapa puede ser quitada y desensamblada fácilmente para identificar y reparar la rotura. Además, el diseño simple de la cámara de EStim facilita modificar según las necesidades de diferentes configuraciones experimentales y métodos del análisis. Los ejemplos incluyen el uso de diferentes tamaños de placas de cultivo celular, variando simplemente la longitud de y la distancia entre los electrodos o agregar condiciones de otra cultura (3D) con material de cerámica andamio4 o substratos conductivos18, por simplemente colocando estos materiales sembrado con células entre los electrodos.

Como en todos los experimentos in vitro, comportamientos de la célula y funciones observadas, inducido en la cámara de EStim no siempre son directamente transferible a los modelos en vivo. En consecuencia, al interpretar el celular inducida por EStim comportamientos y funciones de la cámara, investigadores deben siempre tener esto en consideración.

La instalación y el método presentado aquí tienen muchas ventajas sobre otros métodos in vitro que se utiliza para exponer las células a EStim (sistemas con puentes de sal5 ) y con los electrodos incorporados en cultura de célula pozos19. Una ventaja importante del sistema descrito aquí es que, puesto que las células se cultivan en placas de 6 pocillos estándar, pueden utilizarse después del tratamiento de EStim en otros protocolos in vivo o in vitro. Además, el hecho de que los electrodos se fijan en la tapa de la placa de la pozo 6 hace fácil de limpiar y esterilizar el dispositivo entre experimentos y reutilizarla. Por último, la capacidad de estimular simultáneamente las células de seis pozos proporciona amplio material para el análisis y la reproducibilidad.

Para obtener una mejor comprensión de los mecanismos en el nivel de la membrana celular por el cual EStim afecta actividades de la célula en estudios en curso con la cámara que se describe aquí, estamos explorando la relación entre externamente entregado EStim y membrana de la célula potencial (Vmem)17. Además, basado en anteriores hallazgos9, en el futuro los estudios, se trate previamente las células con EStim en la cámara, solo y con diferentes andamios 3D y con los substratos conductivos, que estimulan las funciones celulares específicas; Luego, implantará los en modelos animales para determinar si conservan las funciones mejoradas observadas in vivo. Estos estudios contribuirán al creciente cuerpo de información sobre los mecanismos por los que EStim regulan la función celular y, al hacerlo, podría contribuir a la optimización de métodos de terapia celular en medicina regenerativa y basado en la ingeniería de tejidos tratamientos.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado en parte por una subvención de puesta en marcha de la Fundación AO (S-14-03 H) y la Fundación de Friedrichsheim (Stiftung Friedrichsheim) con sede en Fráncfort del Meno, Alemania.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Estim fabrication
Banana connector/Jack adaptor Poppstars 1008554 2 pieces
Cutting pliers Knipex 78 03 125
DC power supply (0-30V/0-3A) B&K Precision Model 9130B Any simular model could be used
Insulated flexible wires (0.14 mm2) Conrad Electronic International 604794, 604093 2 pieces
Non-corrosive silicone rubber Dow Corning 3140 RTV *could be purchased by many stores
Platinum Wire (999,5/1000; 1mm ø) Junker Edelmetalle 00D-3010 0.6 m needed for 1 Estim chamber
70% Ethanol solution any Sterilisation of Estim chamber
Silver coated copper wire (0.6 mm ø) Conrad Electronic International 409334 - 62 ≈70 cm needed for 1 Estim device
Soldering iron Set Conrad Electronic International 1611410 - 62 Any simular model could be used
TPP 6-well plate lid Sigma-Aldrich Z707759-126EA 2 lids for Estim chamber
2.2V wired circular LEDs Conrad Electronic International 599525 - 62 6 pieces
UHU Super glue UHU GmbH & Co. KG n/a *could be purchased by many stores
MSC culture
β-Glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma-Aldrich G9422 osteogenic cell culture
DMEM, low glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate Thermo-Fischer Scientific 21885025 cell culture
DPBS, no calcium, no magnesium Thermo-Fischer Scientific 14190144 cell culture
Dexamethasone Sigma-Aldrich D4902 osteogenic cell culture
Fetal Bovine Serum Thermo-Fischer Scientific 10500064 cell culture
50 ml Falcon tube Sarstedt 62,547,004 cell culture
L-Ascorbic acid Sigma-Aldrich A4544 osteogenic cell culture
Penicillin/Streptomycin Thermo-Fischer Scientific 15140122 cell culture
Sprague-Dawley (SD) rat mesenchymal stem cells, bone marrow origin Cyagen RASMX-01001 cell culture
Cell detachment solution Thermo-Fischer Scientific A1110501 cell culture, cell detachment
TC Flask, T75 Sarstedt 833911302 cell culture
TPP 6-well plates Sigma-Aldrich Z707759-126EA cell culture
Trypan Blue Dye, 0.4% solution Bio-Rad 1450021 cell count

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Número 143 cámara de estimulación eléctrica bioingeniería cultivo celular MSC diferenciación osteogénica corriente directa placa de 6 pozos
Construcción y uso de una cámara de estimulación eléctrica para mejorar la diferenciación osteogénica de células madre mesenquimales, estromales In Vitro
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Leppik, L., Bhavsar, M. B.,More

Leppik, L., Bhavsar, M. B., Oliveira, K. M. C., Eischen-Loges, M., Mobini, S., Barker, J. H. Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro. J. Vis. Exp. (143), e59127, doi:10.3791/59127 (2019).

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