Summary
Здесь мы представляем протокол для создания иммунокомпетентной Модели МЦР (Институт онкологических исследований) моринической модели инфекции центральной нервной системы для отображения развития невропатии. Мониторинг острых вирусных энцефалитических расстройств с одинаковыми показателями заболеваний может быть выполнен для показа вирусной нейропатии, вызванной вирусом денге in vivo.
Abstract
Вирус денге (ДЕНВ), членистоногий вирус, передаваемый комарами, может вызывать тяжелое заболевание, известное как геморрагическая лихорадка денге, которая характеризуется смертельными осложнениями из-за утечки плазмы, асцита, плеврального выпота, дыхательного дистресса, сильное кровотечение и нарушение состояния органов. Несколько случаев заражения ДЕНВ представляют неврологические проявления; однако, исследования не исследовали DENV-индуцированный нейропатогенез далее. В этом исследовании мы представляем протокол для использования иммунокомпетентных выведенных МЦР (Институт исследований рака) мыши для исследования индукции центральной нервной системы (ЦНС) инфекции с DENV, а затем прогрессирование острого вирусного энцефалита, как Болезни.
Introduction
DENV, членистоногий вирус семейства Flaviviridae, содержит геном РНК с положительным чувством, который кодирует три вирусных структурных белка (капсид, премембран и конверт) и семь вирусных неструктурных белков (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B , и NS5). Четыре серотипа DENV (DENV1-4), которые заражают около 390 миллионов человек ежегодно, вызывают глобальное бремя, хотя правительства направили значительные усилия на переносчика комаров и борьбы с болезнями1. В настоящее время защитные вакцины и терапевтические противовирусные препараты находятся в стадии разработки и требуют дальнейшей долгосрочной проверки2. В клинической практике, хотя пациент денге с инфекцией ЦНС встречается редко, его необходимо дополнительно изучить, чтобы понять разнообразие развития болезни денге3. Необходимы дальнейшие исследования и проверки; в частности, Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) включила участие ЦНС нарушения, такие как когнитивные нарушения, судороги, энцефалопатия, и энцефалит, в классификации тяжелой денге3,4. Построение животных моделей инфекции DENV необходимо для изучения нейропатогенеза инфекции DENV.
Для генерации инфекции ЦНС DENV, несколько исследований выполнили различные маршруты инфекции DENV, в том числе (1) внутримозговая прививка C57BL/6 мышей, которые получили 4 х 103 бляшки формирования единиц (PFU) неадаптированных DENV35, 6, (2) интраперитонеальная прививка BALB/c мышей, которые получили 7 х 104 PFU в пробирке нейроадаптированных DENV47, (3) внутримозговая прививка швейцарских мышей, которые получили 1 х 105 PFU in vivo нейроадаптированных DENV1, 8, и (4) внутримозговая и интраперитонеальная ко-прививка МЦР сосание мышей, которые получили 1 х 106 PFU неадаптированных DENV29. Согласно выводам этих исследований5,6,7,8,9, DENV инфекции у мышей привести к вирусной репликации в головном мозге, что приводит к острой вирусной энцефалит-подобные синдромы, поведенческие изменения, сопровождающиеся параличом конечностей и постуральной нестабильностью, нейротоксичность ЦНС и воспаление, общая и локализованная утечка плазмы через гематоэнцефалический барьер (BBB), и летальность. Все результаты этих исследований5,6,7,8,9 показали способность DENV заразить ЦНС и индукции острого вирусного энцефалита, как болезни после инфекции.
Основываясь на наших текущих выводах9,10,11,12,13,14,15, мы создали модель мурин инфекции DENV как in vivo платформы для изучения терапевтической эффективности целевых агентов / факторов против репликации вируса, а также нейротоксичности. Здесь мы сообщаем протокол, используемый для создания иммунокомпетентной выведенной мыши ICR для изучения инфекции ЦНС и мониторинга развития невропатий с различными разрывами, вызванными DENV. Результаты показывают значительное прогрессирование энцефалита, как болезнь в DENV-инфицированных мышей в зависимости от времени образом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Экспериментальные протоколы исследования животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и пользователями Национального оборонного медицинского центра (IACUC номер: 16-261), в соответствии с руководящими принципами, установленными Министерством науки и техники, Тайвань.
1. Процедура заражения
- Подготовка неадаптированных DENV2 (напряжение PL046) запасы9 (первоначально полученные из Центров по контролю заболеваний в Тайване, начиная от 2,5 х 107 до 1 х 109 PFU/mL).
- Разбавить вирусный запас до 1 х 106 PFU с Розуэлл Парк Мемориальный институт (RPMI) 1640 средних до общего объема 40 Зл.
- Заполните один шприц 0,3 мл, оснащенный иглой 30 Г с 10 л (2,5 х 105 ПФУ) разбавленного вируса, и заполните еще 0,3 мл шприца, оснащенного 30 G иглой с 30 Л (7,5 х 105 PFU) разбавленного вируса.
-
Держите 7-дневную мышь ICR сосание и провести следующие шаги.
- Для внутримозговой инъекции держите мышь в склонном положении, нажав на ушную раковину между указательным пальцем и большим пальцем, и интрацерально впрысните 10 л. разбавленного вируса в область лямбды, точку на пересечении сагитального и лягчитедного шва 16.
- После внутримозговой инъекции держите мышь в положении на спине, используя указательный палец и большой палец и интраперитонеально впрысните 30 л разбавленного вируса в брюшную полость.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать каннибализма, 75% алкоголя используется для создания временной потери обонятельных ощущений матери. Дополнительно, покрывать пометы с табуретом их мати и мочой предложено.
- Положите сосание мышей обратно в клетки и ждать 5 минут, чтобы проверить их безопасности постстимуляции с жадностью мышей, в том числе ходьба и материнское молоко сосание.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чаще всего, мыши демонстрируют нормальную активность постстимуляции и, кажется, не будет каких-либо вредных эффектов после технической проблемы. В ходе этого эксперимента, животные были поддержаны институционального ухода за животными и пользователей комитета Национального медицинского центра обороны, Тайвань. - Оцените ежедневный прогресс мышей с точки зрения массы тела (с помощью баланса микрограмма), острой вирусной энцефалита, как болезнь (по болезни скоринга, как описано в разделе 2), и выживаемость9,10,11 ,12,13,14,15.
2. Оценка болезней
- Мониторинг класса острых вирусных энцефалитных заболеваний. Назначить счет 0 для здоровых мышей; 1 для мышей с незначительными симптомами болезни, включая потерю веса, снижение подвижности, и ориентация горбуна тела; 2 для мышей, которые проявляют лимбический припадок; 3 для мышей выставки лимбической слабости, в том числе перемещение с трудом и передней конечности или задней слабости конечностей; 4 для паралича; 5 за смерть.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как только оценка достигает 3, симптомы болезни считаются быстро развивается. - Участок скоринга болезни, в соответствии с шагом 2.1, для каждого дня, как кривая на основе фигуры, используя среднее SD ежедневных тестов в каждой группе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Тяжелые денге связанных неврологических осложнений были зарегистрированы у пациентов с денге патогенеза4. Хотя эти случаи редки в клинике, создание иммунокомпетентной модели минина инфекции DENV может быть использовано не только для изучения иммунопатогенеза, но и для изучения инфекции ЦНС, нейровоспаления, нейротоксичности и острой вирусной энцефалит-подобное заболевание. В этом исследовании, в соответствии с нашей текущей модели9,10,11,12,13,14,15, 7-дневный МЦР сосание мышей были привиты одновременно с DENV2 через внутримозговую микроинъекцию (2,5 х 105 ПФУ) и интраперитонеальную инъекцию (7,5 х 105 ПФУ) (рисунок1). После заражения, мы провели многочисленные анализы, чтобы показать наличие репликации dsRNA, экспрессии вирусного белка, и высвобождение вируса в DENV-инфицированных мозга9,10,11,12 ,13,14,15. Эти эксперименты показали, что успешная модель in vivo, разработанная denV-инфекция, репликация и высвобождение.
Для оценки индукции острых вирусныхэнцефалитных заболеваний 9,10,11,12,13,14,15,мы наблюдали за изменениями в весе тела у инфицированных DENV мышей. По сравнению с изменениями массы тела в группе макета (где мыши были привиты только с RPMI среды), Рисунок 2 показывает увеличение в группе макета, но значительное (P lt; 0.01) снижение массы тела у инфицированных мышей. В соответствии с симптомами энцефалита, как болезни, в том числе горбун осанки, лимбический припадок, лимбическая слабость, паралич, и смерть, как проявляется в DENV-инфицированных мышей, Рисунок 3 показывает значительное (P lt; 0,05) увеличение клинический балл у инфицированных DENV мышей. На рисунке 4 показано временное снижение выживаемости(P qlt; 0.001) инфицированных ДЕНВ мышей. Данные свидетельствуют о создании инфекционной модели ДЕНВ в ЦНС, которая показывает прогрессирование острых вирусных энцефалитовидных заболеваний.
Рисунок 1: Экспериментальный дизайн для вируса денге (DENV) инфекции в сосание мышей. Семь дневных мцизирующих мышей были привиты DENV2 PL046 одновременными внутричерепными и внутриперитонезными инъекциями. Мы измерили изменения массы тела, оценки заболеваний и смертности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Вес тела при сосании мышей во время инфекции вируса денге (ДЕНВ). В DENV2-инфицированных МЦР сосание мышей (n No 12), изменения в весе тела были измерены в день. После теста с подписью Уилкоксона значения преподносятся в виде среднего значения SD.p slt; 0.01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Энцефалитная болезнь оценка в сосание мышей во время вируса денге (ДЕНВ) инфекции. После DENV2 инфекции в ICR сосание мышей(n No 12), время-кинетические изменения в клинических оценках для горбатой осанки (оценка 1), лимбический припадок (оценка 2), лимбической слабости (оценка 3), паралич (оценка 4), и смерть (оценка 5) были измерены. После теста с подписью Уилкоксона значения преподносятся в виде среднего значения SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Выживаемость у мышей, сосущих во время инфекции вируса денге (ДЕНВ). Временно-кинетические изменения в выживаемости были измерены в DENV2-инфицированных МЦР сосание мышей(n No 12). После теста ранга журнала значения преподносятся как средние значения SD. pslt; 0.001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ДенВ-инфекция была обнаружена в ЦНС тяжелых пациентов денге3,17, что свидетельствует о возможности проявления острого вирусного энцефалита произошло во время патогенеза денге. Здесь мы сообщаем о модели in vivo murine инфекции ДЕНВ для изучения участия дисфункции ЦНС в тяжелой денге, особенно с акцентом на ДЕНВ-индуцированных острых вирусных энцефалитов, как болезни. По сравнению с предыдущими моделями, особенно при одномаршрутной инфекции (только для внутривенных, внутрикишечных только или внутримозговых), чрезвычайно высокий титр (1 х 108 ПФУ) ДЕНВ используется у иммунокомпетентных мышей. Тем не менее, в иммунокомпромиссных мышей, относительно низкий, но вариант титр (1 х 105 до 1 х 1х 108 PFU) из DENV может быть выполнена18,19,20. В этом исследовании, мы использовали два маршрута инфекции, чтобы вызвать одновременные ЦНС и системной инфекции с низким титер (внутричерепный: 2,5 х 105 PFU; интраперитонеальный: 7,5 х 105 PFU) из DENV в иммунокомпетентных ICR сосание мышей. Прогрессирование энцефалита, как болезнь полностьювоспроизводимый 9,10,11,12,13,14,15 . Таким образом, возможное ограничение этого исследования смягчается с помощью одновременных внутричерепных и внутричерепных инъекций. Хотя это искусственно-однако, в соответствии с предыдущими работами других5,6,7,8 и нам9,10,11, 12,13,14,15-DENV активно реплицируется в экспериментальном мозге мурин9,10,11, 12 Лет , 13 Год , 14 Год , 15, и возможные последствия вирусных факторов и принимающих реакций на нейровоспаление, а также нейротоксичности, поэтому, представляют интерес.
Для нейропатогенеза, стимуляция нейрональных клеток апоптоза вызвана денв-инфекции, а также воспаление ЦНС, таких как активация микроглиальных клеток с последующим провоспалительным цитокиновый фактор некроза опухоли некроза-З (TNF-я) производство8, 12,15. Прямая нейротоксичность, вызванная инфекцией ДЕНВ и косвенным нейровоспалением, инициированным иммунными реакциями хозяина, предполагается, что она участвует в энцефалите денге. Острый вирусный энцефалит вызывается вызванным вызванным вирусом воспалением ЦНС головного мозга3,21. Общие клинические симптомы высокая температура, головная боль, ригидность шеи и спины, рвота, и путаница, в то время как тяжелые случаи также развиваются судороги, паралич, и кома21. Путем контролировать изменения в счетах с государной осадой, лимбическим припадком, лимбической слабостью, параличом, и смертью, развитие этих заболеваний показывает прогрессирование акутового вирусного энцефалита-подобного заболевания в DENV-инфицированных мышах9, 10 Лет , 11 Год , 12 Лет , 13 Год , 14 Год , 15. Вообще, те DENV-инфицированные мыши с счетом 3 (согласно методу скоринга заболевания представленным в протоколе) быстро развивались до паралича и смерти. Патогенные механизмы, вызывающие эти заболевания, требуют дальнейшего изучения; Однако, он предположил, что дисфункция нейронов следуют индукции невропатии участвует21. Ориентация на репликацию вирусов, а также воспаление ЦНС, опосредовано ЕНП10,11,12,13,14,по крайней мере частично, придает терапевтические эффекты прогрессирование связанных с денге острой вирусной энцефалитом, как болезнь. Протокол этого исследования может быть использован для создания энцефалита, как патологическая модель инфекции DENV.
Некоторые исследования описали индукции внутримозгового кровоизлияния, вызванного денв-инфекции в головном мозге22,23. Ранее мы показали индукцию BBB нарушения в DENV-инфицированных мышей9. Хотя DENV не признается в качестве нейротропного вируса, DENV может производить эффективную инфекцию в нейрональных клетках in vivo и in vitro8,11. Допамин D2 рецептор (D2R) предполагается, что нейронный рецептор для инфекции DENV, и фармакологически ориентации D2R эффективно снижает ДЕНВ-инфекции в нейронных клетках в vivo и in vitro, а также DENV-индуцированных энцефалических заболеваний11, 24. Возможные терапевтические стратегии борьбы с острым вирусным энцефалитом имеют важное значение для разработки, с тем чтобы тяжелые случаи денге с неврологическими осложнениями можно лечить. Для его будущего применения, этот протокол модели болезни с использованием ДЕНВ-инфекции в головном мозге может стать платформой in vivo для проверки не только вирусных и принимающих факторов, связанных с нейропатогенезом, но и возможных противовирусных и антиэнцефалитных препаратов. Что касается частоты вариантов неврологических расстройств, вызванных ДЕНВ-инфекции25 этим установленным протоколом, разница между переменными типами и / или штаммов DENV для причинения неврологической дисфункции необходимо для проверки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано грантами Министерства науки и техники (MOST107-2321-B-038-001) и интрамуральным финансированием 106TMU-CIT-01-2, Тайбэй, Тайвань.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI) | Gibco | 11875-085 | Diluting virus |
| 0.3 mL Insulin Syringe | BD Ultra-FineII | 328838 | Intracerebral and intraperitoneal injection |
| Microbalance | METTLER TOLEDO's LabX | AL104 | Weight mouse |
| Non-adapted DENV2 (strain PL046) | The Centers for Disease Control of Taiwan | - | Infect mouse |
| Institute of Cancer Research (ICR) suckling mouse | BioLASCO Taiwan Co., Ltd | - | Our murine model |
References
- Guzman, M. G., Gubler, D. J., Izquierdo, A., Martinez, E., Halstead, S. B. Dengue infection. Nature Reviews Disease Primers. 2, 16055 (2016).
- Katzelnick, L. C., Coloma, J., Harris, E. Dengue: knowledge gaps, unmet needs, and research priorities. Lancet Infectious Diseases. 17 (3), e88-e100 (2017).
- Carod-Artal, F. J., Wichmann, O., Farrar, J., Gascon, J. Neurological complications of dengue virus infection. Lancet Neurology. 12 (9), 906-919 (2013).
- Geneva: World Health Organization. Dengue: Guidelines for Diagnosis, Treatment, Prevention and Control: New Edition. , WHO Guidelines Approved by the Guidelines Review Committee (2009).
- Amaral, D. C., et al. Intracerebral infection with dengue-3 virus induces meningoencephalitis and behavioral changes that precede lethality in mice. Journal of Neuroinflammation. 8, 23 (2011).
- de Miranda, A. S., et al. Dengue-3 encephalitis promotes anxiety-like behavior in mice. Behavioural Brain Research. 230 (1), 237-242 (2012).
- Velandia-Romero, M. L., Acosta-Losada, O., Castellanos, J. E. In vivo infection by a neuroinvasive neurovirulent dengue virus. Journal of Neurovirology. 18 (5), 374-387 (2012).
- Despres, P., Frenkiel, M. P., Ceccaldi, P. E., Duarte Dos Santos, C., Deubel, V. Apoptosis in the mouse central nervous system in response to infection with mouse-neurovirulent dengue viruses. Journal of Virology. 72 (1), 823-829 (1998).
- Tsai, T. T., et al. Microglia retard dengue virus-induced acute viral encephalitis. Scientific Reports. 6, 27670 (2016).
- Cheng, Y. L., et al. Activation of Nrf2 by the dengue virus causes an increase in CLEC5A, which enhances TNF-alpha production by mononuclear phagocytes. Scientific Reports. 6, 32000 (2016).
- Ho, M. R., et al. Blockade of dengue virus infection and viral cytotoxicity in neuronal cells in vitro and in vivo by targeting endocytic pathways. Scientific Reports. 7 (1), 6910 (2017).
- Jhan, M. K., et al. Anti-TNF-alpha restricts dengue virus-induced neuropathy. Journal of Leukocyte Biology. 104 (5), 961-968 (2018).
- Kao, J. C., et al. The antiparasitic drug niclosamide inhibits dengue virus infection by interfering with endosomal acidification independent of mTOR. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (8), e0006715 (2018).
- Tsai, T. T., Chen, C. L., Tsai, C. C., Lin, C. F. Targeting heat shock factor 1 as an antiviral strategy against dengue virus replication in vitro and in vivo. Antiviral Research. 145, 44-53 (2017).
- Jhan, M. K., et al. Dengue virus infection increases microglial cell migration. Scientific Reports. 7 (1), 91 (2017).
- Benskey, M. J., Manfredsson, F. P. Intraparenchymal Stereotaxic Delivery of rAAV and Special Considerations in Vector Handling. Methods in Molecular Biology. , 199-215 (2016).
- Fong, C. Y., et al. Mild encephalitis/encephalopathy with reversible splenial lesion (MERS) due to dengue virus. Journal of Clinical Neuroscience. 36, 73-75 (2017).
- Sarathy, V. V., et al. A lethal murine infection model for dengue virus 3 in AG129 mice deficient in type I and II interferon receptors leads to systemic disease. Journal of Virology. 89 (2), 1254-1266 (2015).
- Schul, W., Liu, W., Xu, H. Y., Flamand, M., Vasudevan, S. G. A dengue fever viremia model in mice shows reduction in viral replication and suppression of the inflammatory response after treatment with antiviral drugs. The Journal of Infectious Diseases. 195 (5), 665-674 (2007).
- Tyler, K. L. Acute Viral Encephalitis. New England Journal of Medicine. 379 (6), 557-566 (2018).
- Yauch, L. E., Shresta, S. Mouse models of dengue virus infection and disease. Antiviral Research. 80 (2), 87-93 (2008).
- Assir, M. Z., Jawa, A., Ahmed, H. I. Expanded dengue syndrome: subacute thyroiditis and intracerebral hemorrhage. BMC Infectious Diseases. 12, 240 (2012).
- Kumar, R., Prakash, O., Sharma, B. S. Intracranial hemorrhage in dengue fever: management and outcome: a series of 5 cases and review of literature. Surgical Neurology. 72 (4), 429-433 (2009).
- Simanjuntak, Y., Liang, J. J., Lee, Y. L., Lin, Y. L. Repurposing of prochlorperazine for use against dengue virus infection. Journal of Infectious Diseases. 211 (3), 394-404 (2015).
- Rocha, B. A. M., et al. Dengue-specific serotype related to clinical severity during the 2012/2013 epidemic in centre of Brazil. Infectious Disease Poverty. 6 (1), 116 (2017).
