Summary
Ici, nous présentons un protocole pour créer un modèle murine immunocompétent d'IC (Institut de recherche sur le cancer) de l'infection de système nerveux central pour montrer le développement de la neuropathie. La surveillance des désordres encéphalitiques virales aigues par des scores identiques de maladie pourrait être exécutée pour montrer la neuropathie virus-induite de dengue in vivo.
Abstract
Le virus de la dengue (DENV), un virus transmis par les arthropodes transmis par les moustiques, peut causer la maladie grave connue sous le nom de dengue hémorragique, qui se caractérise par des complications mortelles dues à des fuites de plasma, ascites, effusion pleurale, détresse respiratoire, saignements graves et une déficience des organes. Quelques cas d'infection de DENV présentent des manifestations neurologiques ; cependant, les études n'ont pas exploré la neuropathogenèse DENV-induite plus loin. Dans cette étude, nous présentons un protocole pour employer une souris d'IC (Institut de recherche sur le cancer) de surcapacité immunocompétente pour étudier l'induction de l'infection de système nerveux central (CNS) avec DENV, suivie de la progression de l'encéphalite virale aigue-comme maladie.
Introduction
DENV, un virus transmis par les arthropodes de la famille des Flaviviridae, contient un génome d'ARN à sens positif qui code trois protéines structurelles virales (capsid, prémembrane et enveloppe) et sept protéines virales non structurelles (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B , et NS5). Les quatre sérotypes de DENV (DENV1-4), qui infectent environ 390 millions de personnes par an, causent un fardeau mondial, même si les gouvernements ont orienté des efforts substantiels vers les moustiques vecteurs et la lutte contre les maladies1. À l'heure actuelle, des vaccins protecteurs et des médicaments antiviraux thérapeutiques sont en cours de développement et nécessitent une validation à long terme2. En pratique clinique, bien qu'un patient de dengue avec l'infection de CNSsoit rare, il doit être davantage exploré pour comprendre la diversité du développement de la dengue 3. Une enquête et une validation plus poussées sont nécessaires; notamment, l'Organisation mondiale de la Santé (OMS) a inclus la participation de l'affaiblissement du SNC, tels que les troubles cognitifs, les convulsions, l'encéphalopathie et l'encéphalite, dans la classification de la dengue sévère3,4. La construction de modèles animaux d'infection par le DENV est indispensable pour explorer la neuropathogenèse de l'infection à DENV.
Pour générer l'infection par DENV de CNS, plusieurs études ont exécuté différents itinéraires de l'infection de DENV, y compris (1) l'inoculation intracérébrale des souris de C57BL/6 qui ont reçu 4 x 103 unités de plaque-formation (PFU) de DENV3nonadapté, 6, (2) inoculation intrapéritonéale des souris BALB/c qui ont reçu 7 x 104 PFU de DENV4 neuroadapté in vitro7, (3) inoculation intracérébrale de souris suisses qui ont reçu 1 x 105 PFU de vivo neuroadapté DENV18, et (4) co-inoculation intracérébrale et intrapéritonéale des souris allaitantes iCR qui ont reçu 1 x 106 PFU de DENV2 non adapté9. Selon les résultats de ces études5,6,7,8,9, infection DENV chez les souris entraîner une réplication virale dans le cerveau, conduisant à des Syndromes d'encéphalite-comme, changements comportementaux accompagnés de la paralysie de membre et de l'instabilité posturale, neurotoxicité et inflammation de CNS, fuite générale et localisée de plasma par la barrière hémato-encéphalique (BBB), et létalité. Tous les résultats de ces études5,6,7,8,9 ont montré la capacité du DENV à infecter le SNC et l'induction d'une encéphalite virale aigue maladie à la suite d'une infection.
Sur la base de nos résultats actuels9,10,11,12,13,14,15, nous avons créé un modèle murine de l'infection DENV comme un in vivo plate-forme pour examiner l'efficacité thérapeutique des agents/facteurs ciblés contre la réplication virale, aussi bien que la neurotoxicité. Ici, nous rapportons le protocole utilisé pour créer une souris iCR hors-sang immunocompétente pour étudier l'infection de CNS et pour surveiller le développement des neuropathies avec différentes severities provoquées par DENV. Les résultats montrent la progression significative de la maladie encéphalite-comme chez les souris deDENV-infectées d'une manière dépendante du temps.
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Protocol
Les protocoles expérimentaux d'étude animale ont été approuvés par le Comité institutionnel de soins aux animaux et d'utilisation du National Defense Medical Center (numéro 16-261 de l'IACUC), selon les lignes directrices établies par le Ministère des sciences et de la technologie de Taïwan.
1. Procédure d'infection
- Préparer les stocks non adaptés de DENV2 (souche PL046)9 (obtenus à l'origine auprès des Centers for Disease Control de Taiwan, allant de 2,5 x 107 à 1 x 109 PFU/mL).
- Diluer le stock de virus à 1 x 106 PFU avec Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 moyen à un volume total de 40 L.
- Remplissez une seringue de 0,3 ml ml munie d'une aiguille de 30 G avec 10 l (2,5 x 105 PFU) de virus dilué et remplissez une autre seringue de 0,3 ml ml munie d'une aiguille de 30 G avec 30 l (7,5 x 105 PFU) de virus dilué.
-
Tenez la souris de titrage ICR de 7 jours et effectuez les étapes suivantes.
- Pour l'injection intracérébrale, maintenez la souris dans une position encline en appuyant sur l'auriculaire entre l'index et le pouce, et injectez intracérébralement 10 l de virus dilué dans la zone lambda, le point à l'intersection de la suture sagittale et lambdoid 16.
- Après l'injection intracérébrale, maintenez la souris en position de supine en utilisant l'index et le pouce et injectez par voie intrapéritone 30 l de virus dilué doucement dans l'abdomen murine.
REMARQUE : Pour éviter le cannibalisme, 75 % de l'alcool est utilisé pour créer une perte temporaire de la sensation olfactive de la mère. En outre, il est suggéré de recouvrir les portées avec les selles et l'urine de leur mère.
- Posez les souris allaitantes dans leurs cages et attendez 5 min pour vérifier leur poststimulation de sécurité avec l'avidité des souris, y compris la marche et la succion du lait maternel.
REMARQUE: Le plus souvent, les souris démontrent une poststimulation d'activité normale et il ne semble pas y avoir d'effets nocifs après le défi technique. Au cours de cette expérience, les animaux ont été maintenus par le Comité institutionnel de soins aux animaux et d'utilisateurs du National Defense Medical Center, Taiwan. - Évaluer les progrès quotidiens des souris en termes de poids corporel (en utilisant un bilan microgramme), d'encéphalite virale aigue (par la notation de la maladie telle que décrite dans la section 2), et le taux de survie9,10,11 ,12,13,14,15.
2. Notation de la maladie
- Surveillez le grade des maladies virales aigues semblables à l'encéphalite. Attribuez un score de 0 à des souris en bonne santé; 1 pour les souris présentant des symptômes de maladie mineure, y compris la perte de poids, la mobilité réduite, et une orientation de corps de bossu ; 2 aux souris qui présentent une crise limbique; 3 aux souris la faiblesse limbique d'exposition, y compris se déplaçant avec la difficulté et la faiblesse antérieure de membre ou postérieure ; 4 pour paralysie; 5 pour la mort.
REMARQUE: Une fois que le score atteint 3, les symptômes de la maladie sont considérés comme évoluant rapidement. - Tracer la notation de la maladie, selon l'étape 2.1, pour chaque jour comme une figure basée sur la courbe en utilisant la moyenne - SD des scores de test quotidiens dans chaque groupe.
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Representative Results
Des complications neurologiques graves associées à la dengue ont été signalées chez des patients atteints de pathogénie de la dengue4. Bien que ces cas soient rares dans la clinique, la création d'un modèle murine immunocompétent de l'infection de DENV peut être employée non seulement pour étudier l'immunopathogenèse mais également pour explorer l'infection de CNS, la neuroinflammation, la neurotoxicité, et le viral aigu maladie ressemblant à une maladie ressemblant à une encéphalite. Dans cette étude, selon notre modèle actuel9,10,11,12,13,14,15, 7 souris de lit de l'IC ont été inoculés en même temps que DENV2 par une microinjection intracérébrale (2,5 x 105 PFU) et une injection intrapéritonéale (7,5 x 105 PFU) (Figure 1). Après l'infection, nous avons effectué de nombreuses analyses pour montrer la présence de la réplication de dsRNA, l'expression virale de protéine, et la libération de virus dans le cerveau DENV-infecté9,10,11,12 ,13,14,15. Ces expériences ont démontré qu'un modèle in vivo réussi d'infection, de réplication et de libération de DENV a été établi.
Pour évaluer l'induction des maladies virales aigues de l'encéphalite9,10,11,12,13,14,15, nous avons suivi les changements dans le poids corporel chez les souris infectées par le DENV. Par rapport aux changements de poids corporel dans le groupe fictif (où les souris ont été inoculées avec le milieu RPMI seulement), la figure 2 montre une augmentation dans le groupe de faux, mais une diminution significative (P lt; 0,01) du poids corporel chez les souris infectées. Selon les symptômes de maladies semblables à l'encéphalite, y compris la posture du bossu, la crise des limbiques, la faiblesse des limbiques, la paralysie et la mort, comme cela se manifeste chez les souris infectées par le DENV, la figure 3 montre une augmentation significative (P lt; 0,05) score clinique chez les souris infectées par le DENV. L'analyse de survie de la figure 4 montre une réduction dépendante du temps du taux de survie (P et 0,001) des souris infectées par le DENV. Les données indiquent l'établissement d'un modèle infectieux de DENV dans le SNC, qui montre la progression des maladies virales aigues de type encéphalite.
Figure 1 : Conception expérimentale de l'infection par le virus de la dengue (DENV) chez les souris allaitantes. Sept souris de lait iCR d'un jour ont été inoculées avec DENV2 PL046 par des injections intracrâniennes et intrapéritonéales simultanées. Nous avons mesuré les changements dans le poids corporel, le score de la maladie et la mortalité. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Poids corporel chez les souris allaitantes pendant l'infection par le virus de la dengue (DENV). Chez les souris allaitantes infectées par le DENV2 (n - 12), des changements de poids corporel ont été mesurés par jour. À la suite d'un test de rang signé Wilcoxon, les valeurs sont présentées comme la moyenne de la dis . Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Le score de la maladie encéphalite chez les souris allaitantes pendant l'infection par le virus de la dengue (DENV). Après l'infection de DENV2 dans les souris allaitantes d'ICR (n - 12), les changements de temps-cinétique dans des scores cliniques pour la posture de bossu (score 1), la saisie limbique (score 2), la faiblesse limbique (score 3), la paralysie (score 4), et la mort (score 5) ont été mesurés. À la suite d'un test de rang signé Wilcoxon, les valeurs sont présentées comme la moyenne de la DD. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Taux de survie chez les souris allaitantes pendant l'infection par le virus de la dengue (DENV). Des changements de temps-cinétique des taux de survie ont été mesurés dans les souris de titrage DENV2-infectées d'ICR(n - 12). À la suite d'un test de classement des journaux, les valeurs sont présentées comme la moyenne de la dis . Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
L'infection de DENV a été détectée dansle CNS des patients graves de dengue 3,17,suggérant la possibilité de la manifestation de l'encéphalite virale aigue s'est produite pendant la pathogénie de dengue. Ici, nous rapportons un modèle murine in vivo de l'infection de DENV pour étudier la participation du dysfonctionnement de CNS dans la dengue grave, particulièrement avec un foyer sur DENV-induite maladies virales-comme. Par rapport aux modèles précédents, en particulier pour l'infection à une seule route (intraveineuse seulement, intrapéritonéale seulement, ou intracérébrale seulement), un titer extrêmement élevé (1 x 108 PFU) de DENV est utilisé chez les souris immunocompétentes. Cependant, chez les souris immunocompromised, un titre relativement bas mais variant (1 x 105 à 1 x 108 PFU) de DENV peut être exécuté18,19,20. Dans cette étude, nous avons employé l'infection de deux voies pour induire le CNS concomitant et l'infection systémique avec un tigre bas (intracranial : 2.5 x 105 PFU ; intraperitoneal : 7.5 x 105 PFU) de DENV dans les souris de lait d'ICR immunocompétentes. La progression de l'encéphalite-comme la maladie est complètement reproductible9,10,11,12,13,14,15 . La limitation possible de cette étude est, par conséquent, atténuée en utilisant une injection intracrânienne et intrapéritonéale simultanée. Bien qu'il soit artificiel-toutefois, compatible avec les travaux précédents par d'autres5,6,7,8 et nous9,10,11, 12,13,14,15-DENV est activement reproduit dans le cerveau murine expérimental9,10,11, 12 Ans, états-unis , 13 (en) , 14 (en) , 15, et les effets possibles des facteurs viraux et des réponses de l'hôte sur la neuroinflammation, ainsi que la neurotoxicité, sont, par conséquent, d'intérêt.
Pour la neuropathogenèse, la stimulation de l'apoptose neuronale de cellules est déclenchée par l'infection de DENV aussi bien que l'inflammation de CNS, telle que l'activation microglial de cellules suivie de la production proinflammatoryo-de ncœu de nécrose de tumeur de cytokine (TNF-)8, 12,15. On suppose que la neurotoxicité directe causée par l'infection à DENV et la neuroinflammation indirecte initiée par les réponses immunitaires de l'hôte est impliquée dans l'encéphalite à dengue. L'encéphalite virale aigue est causée par l'inflammation du SNC induite par le virus du cerveau3,21. Les symptômes cliniques communs sont une fièvre élevée, mal de tête, le cou et le dos raides, le vomissement, et la confusion, alors que les cas graves développent également des saisies, la paralysie, et le coma21. En surveillant les changements dans les scores avec la posture de bossu, la saisie limbique, la faiblesse limbique, la paralysie, et la mort, le développement de ces maladies montre la progression de l'encéphalite virale aigue-comme la maladie dans les souris DENV-infectées9, 10 Ans et plus , 11 Ans, états-unis ( , 12 Ans, états-unis , 13 (en) , 14 (en) , 15. En général, les souris infectées par le DENV avec un score de 3 (selon la méthode de notation de la maladie présentée dans le protocole) ont rapidement progressé à la paralysie et à la mort. Les mécanismes pathogènes à l'origine de ces maladies nécessitent une enquête plus approfondie; cependant, il est spéculé que le dysfonctionnement neuronal suivi de l'induction de neuropathie est impliqué21. Cibler la réplication virale, ainsi que l'inflammation du SNC médiée par TNF10,11,12,13,14, au moins en partie, confère des effets thérapeutiques contre la progression de la dengue-associée à une maladie virale de l'encéphalite.. Le protocole de cette étude pourrait être employé pour créer un modèle pathologique encéphalite-comme de l'infection de DENV.
Certaines études ont décrit l'induction d'hémorragie intracérébrale induite par l'infection de DENV dans le cerveau22,23. Nous avons précédemment montré l'induction de la perturbationde BBB dans les souris DENV-infectées 9. Bien que DENV n'est pas reconnu comme un virus neurotrope, DENV peut produire une infection efficace dans les cellules neuronales in vivo et in vitro8,11. Le récepteur de dopamine D2 (D2R) est spéculé pour être un récepteur neuronal pour l'infection de DENV, et pharmacologiquement ciblant D2R réduit effectivement l'infection de DENV dans les cellules neuronales in vivo et in vitro, aussi bien que des maladies encéphaliques DENV-induites11, 24. Des stratégies thérapeutiques possibles contre l'encéphalite virale aigue sont importantes à développer afin que les cas graves de dengue avec des complications neurologiques puissent être traités. Pour son application future, ce protocole d'un modèle de maladie utilisant l'infection de DENV dans le cerveau peut devenir une plate-forme in vivo pour dépister non seulement les facteurs viraux et d'hôte liés à la neuropathogenèse mais également les drogues antivirales et anti-encéphaliques possibles. En ce qui concerne l'incidence des désordres neurologiques variables provoqués par l'infection de DENV25 par ce protocole établi, la différence entre les types variables et/ou les souches de DENV pour causer le dysfonctionnement neurologique est nécessaire pour la validation.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Cette étude a été soutenue par des subventions du Ministère des sciences et de la technologie (MOST107-2321-B-038-001) et du financement intra-muros 106TMU-CIT-01-2, Taipei, Taiwan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI) | Gibco | 11875-085 | Diluting virus |
| 0.3 mL Insulin Syringe | BD Ultra-FineII | 328838 | Intracerebral and intraperitoneal injection |
| Microbalance | METTLER TOLEDO's LabX | AL104 | Weight mouse |
| Non-adapted DENV2 (strain PL046) | The Centers for Disease Control of Taiwan | - | Infect mouse |
| Institute of Cancer Research (ICR) suckling mouse | BioLASCO Taiwan Co., Ltd | - | Our murine model |
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