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Immunology and Infection

登革热病毒诱发急性病毒性脑炎样疾病的鼠害模型

doi: 10.3791/59132 Published: April 28, 2019

Summary

在这里,我们提出了一个协议,创建一个免疫能力ICR(癌症研究所)的中枢神经系统感染的鼠模型,以显示神经病变的发展。通过相同的疾病评分监测急性病毒性脑病,可以显示体内登革热病毒引起的神经病变。

Abstract

登革热病毒(DENV)是一种由蚊子传播的节肢传播病毒,可引起称为登革热出血热的严重疾病,其特征是血浆泄漏、腹水、胸膜渗漏、呼吸窘迫等致命并发症,严重出血和器官损伤。少数DENV感染病例有神经表现;然而,研究没有进一步探讨DENV引起的神经发病机制。在这项研究中,我们提出了一个协议,使用免疫能力超种ICR(癌症研究所)小鼠来研究中枢神经系统(CNS)感染DENV的诱导,然后急性病毒性脑炎类似进展疾病。

Introduction

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DENV是Flaviviridae家族的节肢传播病毒,含有一个正义RNA基因组,该基因组编码三种病毒结构蛋白(细胞、前膜和包络)和七种病毒非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B),和 NS5)。DENV(DENV1-4)的四种血清型每年感染约3.9亿人,造成全球负担,尽管各国政府已大力控制蚊媒和疾病控制1。目前,保护性疫苗和治疗性抗病毒药物正在研制中,需要进一步的长期验证2。在临床实践中,虽然感染中枢神经系统的登革热患者很少,但还需要进一步探讨,以了解登革热发展的多样性。需要进一步调查和验证;值得注意的是,世界卫生组织(WHO)将中枢神经系统损伤(如认知障碍、抽搐、脑病和脑炎)纳入严重登革热3、4的分类。构建DENV感染的动物模型对于探索DENV感染的神经发病机制是必不可少的。

为了产生DENV的CNS感染,几项研究已经执行了不同的DENV感染途径,包括(1)接受4 x103斑块形成单位(PFU)的C57BL/6小鼠的脑内接种,6、 (2) 接受7 x 104 PFU的体外神经适应DENV47的BALB/c小鼠的腹腔内接种,(3)接受体内神经适应DENV18 1x 105 PFU的瑞士小鼠的脑内接种,以及(4)接受1 x 106 PFU的不适应DENV29的ICR吸吮小鼠的脑内和腹腔内共接种。根据这些研究的结果,小鼠的DENV感染导致病毒复制,导致急性病毒脑炎样综合征,行为变化伴随肢体瘫痪和姿势不稳定,中枢神经系统神经毒性和炎症,一般和局部血浆泄漏通过血脑屏障(BBB),和致命性。这些研究的所有结果5,6,7,8,9表明DENV感染CNS和诱导急性病毒性脑炎的能力感染后的疾病。

根据我们目前的发现9,10,11,12,13,14,15,我们已经创造了一个DENV感染的鼠模型作为体内平台,以检查靶向剂/因子对病毒复制的疗效,以及神经毒性。在这里,我们报告用于创建免疫能力的杂交ICR小鼠的协议,用于研究CNS感染,并监测由DENV引起的不同神经病变的发展。结果表明,在DENV感染的小鼠中,脑炎样疾病以时间依赖性的方式显著进展。

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Protocol

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根据台湾科技部制定的指导方针,动物研究实验规程经国防医学中心动物护理与用户委员会批准(IACUC编号:16-261)。

1. 感染程序

  1. 准备不适应的DENV2(应变PL046)库存9(最初从台湾疾病控制中心获得,范围从2.5 x 107到1 x 109 PFU/mL)。
  2. 与罗斯威尔公园纪念研究所 (RPMI) 1640 介质稀释至 1 x 106 PFU,总体积为 40 μL。
  3. 用10μL(2.5 x 105 PFU)稀释病毒填充一个装有30 G针头的0.3 mL注射器,用30G针头填充另一个0.3 mL注射器,并注射30μL(7.5 x 105 PFU)稀释病毒。
  4. 握住 7 天大的 ICR 吸吮鼠标,然后执行以下步骤。
    1. 对于脑内注射,通过按下食指和拇指之间的尿道,将小鼠置于易感位置,并将10 μL稀释的病毒注射到 lambda 区域,即下垂和羔羊缝合线的交点16.
    2. 脑内注射后,使用食指和拇指将小鼠置于苏平位置,并将30μL稀释的病毒轻轻注射到鼠腹。
      注意:为了避免食人,75%的酒精被用来造成母亲的嗅觉暂时丧失。此外,建议用母亲的粪便和尿液覆盖垃圾。
  5. 把吸吮的老鼠放回笼子里,等待5分钟,用老鼠的热心,包括散步和母奶吸吮来检查它们的安全刺激后。
    注:大多数情况下,小鼠在刺激后表现出正常活动,在技术挑战之后似乎没有任何有害影响。在这次实验中,这些动物由台湾国防医学中心动物护理和使用者委员会维护。
  6. 评估小鼠体重(使用微克平衡)、急性病毒性脑炎样疾病(按第2节所述的疾病评分)和存活率9、10、11的存活率的每日进展 ,12,13,14,15.

2. 疾病评分

  1. 监测急性病毒性脑炎样疾病的等级。为健康的小鼠分配 0 的分数;1对有轻微疾病症状的小鼠,包括体重减轻、行动不便和驼背身体方向;2对出现边缘性癫痫发作的小鼠;3小鼠显性边缘无力,包括行动困难和前肢或后肢无力;4表示瘫痪;5为死亡。
    注:一旦分数达到3,疾病症状被认为是迅速演变。
  2. 根据步骤 2.1,使用每组每日测试分数的平均值 + SD,将疾病评分绘制为基于曲线的数字。

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Representative Results

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登革热发病机制患者已报告出现严重的登革热相关神经并发症。虽然这些病例在临床上很少见,但创建 DENV 感染的免疫能力小鼠模型不仅可用于研究免疫发病机制,还可用于探索中枢神经系统感染、神经炎症、神经毒性和急性病毒脑炎样疾病。在这项研究中,根据我们目前的模型9,10,11,12,13,14,15,7天大的ICR吸吮小鼠接种通过脑内显微注射(2.5 x 105 PFU)和腹腔内注射(7.5 x 105 PFU)与DENV2同时使用(图1)。感染后,我们进行了许多分析,以显示DsRNA复制,病毒蛋白表达和病毒释放在DENV感染的大脑9,10,11,12 ,13,14,15.这些实验表明,已经建立了一个成功的DENV感染、复制和释放体内模型。

为了评估急性病毒性脑炎样疾病诱发 9,10,11,12,13,14,15,我们监测的变化在DENV感染小鼠的体重。与模拟组(仅用RPMI培养基接种小鼠)的体重增加相比,图2显示模拟组增加,但受感染小鼠的体重显著(P <0.01)下降。根据脑炎样疾病的症状,包括驼背姿势、边缘性发作、边缘无力、瘫痪和死亡,如在DENV感染小鼠中所表现的,图3显示(P<0.05)在在DENV感染小鼠的临床评分。图 4中的存活率测定显示受 DENV 感染的小鼠的存活率(P < 0.001) 随时间相关而降低。数据表明,在CNS中建立了DENV的传染性模型,显示了急性病毒性脑炎样疾病的进展。

Figure 1
图1:吸吮小鼠登革热病毒(DENV)感染的实验设计。通过同时注射颅内和腹内注射,用DENV2 PL046接种了7天大的ICR吸吮小鼠。我们测量了体重、疾病评分和死亡率的变化。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2:登革热病毒感染期间吸吮小鼠的体重。在DENV2感染的ICR吸吮小鼠(n = 12)中,每天测量体重的变化。 在 Wilcoxon 签名排名测试之后,这些值以平均值 = SD 显示。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3:登革热病毒(DENV)感染期间吸吮小鼠的脑病评分。在ICR吸吮小鼠(n = 12)感染DENV2后,测量了驼背姿势(得分1)、边缘性癫痫(得分2)、边缘虚弱(得分3)、瘫痪(得分4)和死亡(得分5)临床分数的时动力学变化。 在 Wilcoxon 签名排名测试之后,这些值以平均值 = SD=p < 0.05 表示。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图4:登革热病毒感染期间吸吮小鼠的存活率。在DENV2感染的ICR吸吮小鼠(n = 12)中测量了生存率的时动力学变化。在日志排名测试之后,这些值以平均值 = SD 显示。请点击此处查看此图的较大版本。

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Discussion

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在3、17日,在重症登革热患者中枢神经系统中检测到DENV感染,表明在登革热发病过程中出现急性病毒性脑炎的可能性。在这里,我们报告一个在体内的DENV感染模型,以研究中枢神经系统功能障碍在严重登革热的介入,特别是侧重于DENV引起的急性病毒性脑炎样疾病。与以前的模型相比,特别是单道感染(仅限静脉注射、仅限腹腔内或仅内脑),DENV 的极高滴度(1 x 108 PFU)用于免疫能力小鼠。然而,在免疫功能低下的小鼠中,DENV 的一个相对较低但变异的定位剂(1 x 105到 1 x 108 PFU)可以执行 18、19、20 。在这项研究中,我们使用双途径感染诱导与低皮托(颅内:2.5 x 105 PFU;腹内:7.5 x 105 PFU)的免疫能力ICR吸吮小鼠的DENV并发性CNS和全身感染。脑炎样疾病的进展是完全可重复的9,10,11,12,13,14,15.因此,通过使用并发颅内和腹内注射,可以减轻这项研究的可能局限性。虽然它是人为的,但是,与其他人以前的作品致5,6,7,8和我们9,10,11, 12,13,14,15-DENV是积极复制在实验鼠脑9,10,1112,13,14,15,以及病毒因子和宿主反应对神经炎症以及神经毒性的可能影响,因此是令人感兴趣的。

对于神经发病机制,神经元细胞凋亡的刺激由DENV感染以及CNS炎症触发,如微胶质细胞活化,然后是原炎细胞因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)生产8, 12,15.由DENV感染引起的直接神经毒性和宿主免疫反应引起的间接神经炎症推测与登革热脑炎有关。急性病毒性脑炎是由病毒引起的脑中枢神经系统炎症引起的3,21。常见的临床症状是高烧、头痛、颈部和背部僵硬、呕吐和混乱,而严重病例也出现癫痫发作、瘫痪和昏迷21。通过监测以驼背姿势、边缘性发作、边缘虚弱、瘫痪和死亡等分数变化,这些疾病的发展表明DENV感染小鼠急性病毒性脑炎疾病的进展9,10,11,12,13,14,15.一般来说,那些受DENV感染的小鼠得分为3(根据协议中提出的疾病评分方法)迅速走向瘫痪和死亡。引起这些疾病的致病机制需要进一步调查;然而,据推测,神经功能障碍后,神经病变诱导涉及21。靶向病毒复制,以及TNF-β介导的中枢中枢神经系统炎症10,11,12,13,14,至少部分,赋予治疗效果对登革热相关急性病毒性脑炎样疾病的进展。本研究的规程可用于创建DENV感染的脑炎样病理模型。

一些研究描述了由DENV感染引起的脑内出血的诱导22,23。我们之前在DENV感染的小鼠9中显示了BBB中断的诱导。虽然DENV不被认为是神经性病毒,但DENV可以在体内和体外8、11的神经元细胞中产生有效的感染。多巴胺D2受体(D2R)被推测为DENV感染的神经元受体,药理学靶向D2R有效地减少了体内和体外神经元细胞的DENV感染,以及DENV诱发的脑病11 24.急性病毒性脑炎的可能治疗策略对于发展非常重要,以便治疗神经并发症的严重登革热病例。对于它未来的应用,这种使用DENV感染在大脑中的疾病模型方案可能成为一个体内平台,不仅筛选与神经发病有关的病毒和宿主因素,而且还可能使用抗病毒和抗脑药物。关于由 DENV 感染25引起的变异性神经系统疾病的发生率,需要验证 DENV 的可变类型和/或菌株之间的差异,以便验证。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项研究得到了科技部(MOST107-2321-B-038-001)和106TMU-CIT-01-2助学金的支持, 台北,台湾。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI) Gibco 11875-085 Diluting virus
0.3 mL Insulin Syringe  BD Ultra-Fine­II 328838 Intracerebral and intraperitoneal injection
Microbalance METTLER TOLEDO's LabX AL104 Weight mouse
Non-adapted DENV2 (strain PL046) The Centers for Disease Control of Taiwan - Infect mouse
Institute of Cancer Research (ICR) suckling mouse BioLASCO Taiwan Co., Ltd - Our murine model

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