Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Een Muriene model van dengue virus-geïnduceerde acute virale encefalitis-achtige ziekte

doi: 10.3791/59132 Published: April 28, 2019

Summary

Hier presenteren we een protocol voor het creëren van een immunocompetente ICR (Institute of Cancer Research) Murine model van infectie van het centrale zenuwstelsel om de ontwikkeling van neuropathie weer te geven. Monitoring van acute virale encefalitische stoornissen door identieke ziekte scores kan worden uitgevoerd voor het tonen van Denguevirus-geïnduceerde neuropathie in vivo.

Abstract

Dengue virus, een door arthropod overgedragen virus dat door muggen wordt overgebracht, kan de ernstige ziekte die bekend staat als dengue hemorragische koorts, die wordt gekenmerkt door dodelijke complicaties als gevolg van plasma lekkage, ascites, pleurale effusie, ademnood, ernstige bloedingen en orgaanstoornis. Een paar gevallen van DENV infectie aanwezig neurologische manifestaties; echter, studies hebben niet onderzocht DENV-geïnduceerde neuropathogenese verder. In deze studie presenteren we een protocol voor het gebruik van een immunocompetente buitengefokte ICR (Institute of Cancer Research) Mouse voor het onderzoeken van de inductie van infectie van het centrale zenuwstelsel (CZS) met DENV, gevolgd door de progressie van acute virale encefalitis-achtige Ziekte.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

DENV, een geleedpotigen virus van de familie Flaviviridae , bevat een positief-Sense RNA-genoom dat drie virale structurele eiwitten codeert (capsid, premembraan en envelop) en zeven virale niet-structurele eiwitten (ns1, NS2A, NS2B, ns3, NS4A, NS4B en NS5). De vier serotypes van DENV (DENV1-4), die jaarlijks ongeveer 390.000.000 mensen infecteren, veroorzaken een wereldwijde last, ook al hebben overheden substantiële inspanningen gericht op muggen vector en Ziektecontrole1. Momenteel zijn beschermende vaccins en therapeutische antivirale geneesmiddelen in ontwikkeling en vereisen verdere validatie op lange termijn2. In de klinische praktijk, hoewel een dengue patiënt met CZS-infectie zeldzaam is, moet het verder worden onderzocht om de diversiteit van dengue-ziekte ontwikkeling3te begrijpen. Verder onderzoek en validering zijn noodzakelijk; met name de World Health Organization (WHO) heeft de betrokkenheid van CZS-stoornissen, zoals cognitieve stoornissen, convulsies, encefalopathie en encefalitis, opgenomen in de classificatie van ernstige dengue3,4. Het bouwen van diermodellen van DENV-infectie is onmisbaar voor het verkennen van de neuro pathogenese van DENV-infectie.

Voor het genereren van CNS infectie door DENV, verschillende studies hebben verschillende routes van DENV infectie uitgevoerd, met inbegrip van (1) intracerebrale inoculatie van C57BL/6 muizen die 4 x 103 plaque-vormende eenheden (Pfu) van niet-aangepaste DENV35kregen, 6, (2) intraperitoneale inoculatie van Balb/c-muizen die 7 x 104 Pfu kregen van in vitro neuroaangepaste DENV47, (3) intracerebrale inoculatie van Zwitserse muizen die 1 x 105 Pfu kregen van in vivo neuroaangepast DENV18en (4) intracerebrale en intraperitoneale co-inoculatie van ICR speen muizen die 1 x 106 Pfu van niet-aangepaste DENV29ontvingen. Volgens de bevindingen van deze onderzoeken5,6,7,8,9, denv infectie in muizen resulteren in virale replicatie in de hersenen, wat leidt tot acute virale encefalitis-achtige syndromen, gedragsveranderingen gepaard met verlamming van de ledematen en orthostatische instabiliteit, CNS neurotoxiciteit en ontsteking, algemene en gelokaliseerde plasma lekkage door de bloed-hersen barrière (BBB), en letaliteit. Alle resultaten van deze onderzoeken5,6,7,8,9 hebben aangetoond dat denv het CZS heeft kunnen infecteren en de inductie van acute virale encefalitis-achtige ziekte na infectie.

Op basis van onze huidige bevindingen9,10,11,12,13,14,15, hebben we een Murine model van denv-infectie gemaakt als een in vivo platform om de therapeutische werkzaamheid van gerichte agenten/factoren tegen virale replicatie te onderzoeken, evenals neurotoxiciteit. Hier rapporteren we het protocol dat wordt gebruikt om een immunocompetente outbred ICR-muis te maken om CZS-infectie te bestuderen en de ontwikkeling van neuropathieën met verschillende ernstcategorieën te monitoren die worden veroorzaakt door denv. De resultaten tonen de significante progressie van encefalitis-achtige ziekte bij met DENV geïnfecteerde muizen in een tijdafhankelijke manier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Experimentele protocollen van dierlijke studie werden goedgekeurd door de institutionele Dierenzorg en gebruikerscomité van het National Defense Medical Center (IACUC Number: 16-261), volgens de richtlijnen vastgesteld door het ministerie van wetenschap en technologie, Taiwan.

1. infectie procedure

  1. Bereid niet-aangepaste DENV2 (stam PL046) voorraden9 (oorspronkelijk verkregen uit de centra voor Ziektecontrole in Taiwan, variërend van 2,5 x 107 tot 1 x 109 Pfu/ml).
  2. Verdun het virus bestand tot 1 x 106 Pfu met Roswell Park Memorial Institute (rpmi) 1640 medium tot een totaal volume van 40 μL.
  3. Vul één Injectieflacon van 0,3 mL met een naald van 30 G met 10 μL (2,5 x 105 Pfu) van het verdunde virus en vul een andere injectieflacon van 0,3 ml met een 30 g naald met 30 μl (7,5 x 105 Pfu) verdund virus.
  4. Houd de 7-daagse ICR speen Mouse vast en voer de volgende stappen uit.
    1. Voor de intracerebrale injectie, houd de muis in een liggende positie door het indrukken van de oorschelp tussen de wijsvinger en duim, en intracerebrally injecteren 10 μL verdund virus in het Lambda-gebied, het punt op de kruising van het sagittale en lambdoïde hechtdraad 16.
    2. Na de intracerebrale injectie, houd de muis in een liggende positie met behulp van de wijsvinger en duim en intraperitoneaal Injecteer 30 μL verdund virus zachtjes in de Murine abdomenl.
      Opmerking: om kannibalisme te voorkomen, wordt 75% alcohol gebruikt om een tijdelijk verlies van de olfactorische sensatie van de moeder te creëren. Daarnaast wordt voorgesteld om de nesten met de ontlasting en urine van hun moeder te bedekken.
  5. Leg de speen muizen terug in hun kooien en wacht 5 minuten om hun veiligheids poststimulatie te controleren met de avidity van muizen, inclusief wandelen en moedermelk zuigen.
    Opmerking: Meestal tonen muizen een normale activiteit poststimulatie en er lijken geen schadelijke effecten te zijn na de technische uitdaging. Tijdens dit experiment werden de dieren onderhouden door het institutioneel Dierenzorg-en gebruikerscomité van het National Defense Medical Center, Taiwan.
  6. Evalueer de dagelijkse voortgang van de muizen in termen van lichaamsgewicht (door gebruik te maken van een microgram balans), acute virale encefalitis-achtige ziekte (door het scoren van ziekten zoals beschreven in rubriek 2) en overlevingspercentage9,10,11 ,12,13,14,15.

2. ziekte Score

  1. Controleer de graad van acute virale encefalitis-achtige ziekten. Wijs een Score van 0 toe aan gezonde muizen; 1 aan muizen met lichte ziektesymptomen, met inbegrip van gewichtsverlies, verminderde mobiliteit, en de oriëntatie van de klokkenluider lichaam; 2 aan muizen die een limbisch beslag vertonen; 3 aan muizen de tentoonstelling limbische zwakte, met inbegrip van bewegen met moeilijkheden en voorste ledematen of zwakte van de achterste ledematen; 4 voor verlamming; 5 voor de dood.
    Opmerking: Zodra de score 3 bereikt, worden de symptomen van de ziekte geacht snel te evolueren.
  2. Plot de scoring van de ziekte, volgens stap 2,1, voor elke dag als een curve-gebaseerd cijfer met behulp van de gemiddelde ± SD van de dagelijkse testscores in elke groep.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ernstige dengue-geassocieerde neurologische complicaties zijn gemeld bij patiënten voor dengue-pathogenese4. Hoewel deze gevallen zeldzaam zijn in de kliniek, kan het creëren van een immunocompetente muriene model van DENV-infectie niet alleen worden gebruikt voor het bestuderen van immunopathogenese, maar ook voor het verkennen van de CZS-infectie, neuro ontsteking, neurotoxiciteit en acute virale encefalitis-achtige ziekte. In deze studie werden volgens onze huidige model9,10,11,12,13,14,15, 7 dag-oude ICR speen muizen geënt gelijktijdig met DENV2 via een intracerebrale micro injectie (2,5 x 105 Pfu) en een intraperitoneale injectie (7,5 x 105 Pfu) (Figuur 1). Na infectie voerden we tal van analyses uit om de aanwezigheid van dsRNA-replicatie, virale eiwit expressie en virus afgifte in de met denv geïnfecteerde hersenen te laten zien9,10,11,12 ,13,14,15. Deze experimenten toonden aan dat er een succesvol in vivo model van DENV-infectie, replicatie en vrijgave is vastgesteld.

Om de inductie van acute virale encefalitis-achtige ziekten9,10,11,12,13,14,15te evalueren, hebben we de veranderingen gemonitord in lichaamsgewicht bij met DENV geïnfecteerde muizen. Vergeleken met de veranderingen in het lichaamsgewicht in de mock-groep (waarbij de muizen alleen met RPMI-medium werden geënt), toont Figuur 2 een toename van de mock-groep, maar een significante (P < 0,01) afname van het lichaamsgewicht in de geïnfecteerde muizen. Volgens de symptomen van encefalitis-achtige ziekten, waaronder de houding van de klokkenluider, limbische inbeslagneming, limbische zwakte, verlamming en overlijden, zoals gemanifesteerd in denv-geïnfecteerde muizen, toont Figuur 3 een significant (P < 0,05) toename in klinische Score in de met DENV geïnfecteerde muizen. De overlevings test in Figuur 4 toont een tijdsafhankelijke vermindering van de overlevingskans (P < 0,001) van de met denv geïnfecteerde muizen. De gegevens duiden op de oprichting van een infectieuze model van DENV in het CZS, dat de progressie van acute virale encefalitis-achtige ziekten toont.

Figure 1
Figuur 1: experimenteel ontwerp voor dengue-virus (DENV) infectie bij speen muizen. Zeven dagen oude ICR-speen muizen werden geënt met DENV2 PL046 door gelijktijdige intracraniële en intraperitoneale injecties. We hebben veranderingen in lichaamsgewicht, ziekte Score en sterfte gemeten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: het lichaamsgewicht van de speen muizen tijdens een dengue-virus (DENV) infectie. In DENV2 geïnfecteerde ICR speen muizen (n = 12) werden veranderingen in lichaamsgewicht per dag gemeten. Na een ondertekende Wilcoxon-rang test worden de waarden weergegeven als de gemiddelde ± SD. * *p < 0,01. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: de encefalitische ziekte Score bij speen muizen tijdens een Denguevirus (DENV) infectie. Na DENV2 infectie in ICR speen muizen (n = 12), werden tijdkinetische veranderingen in klinische scores voor de klokkenluider houding (Score 1), limbisch Insult (Score 2), limbische zwakte (Score 3), verlamming (Score 4) en overlijden (Score 5) gemeten. Na een ondertekende Wilcoxon-rang test worden de waarden weergegeven als de gemiddelde ± SD. *p < 0,05. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: de overlevingskans bij speen muizen tijdens een Denguevirus (DENV) infectie. Tijdkinetische veranderingen in de overlevingspercentages werden gemeten in DENV2 geïnfecteerde ICR-speen muizen (n = 12). Na een log-Rank test worden de waarden weergegeven als de gemiddelde ± SD. * * *p < 0,001. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denv-infectie is aangetroffen in het CZS van ernstige dengue-patiënten3,17, wat suggereert dat de mogelijkheid van de manifestatie van acute virale encefalitis optrad tijdens dengue-pathogenese. Hier rapporteren we een in vivo muriene model van DENV-infectie voor het bestuderen van de betrokkenheid van CZS dysfunctie in ernstige dengue, vooral met een focus op DENV-geïnduceerde acute virale encefalitis-achtige ziekten. In vergelijking met de vorige modellen, in het bijzonder voor één-route infectie (alleen intraveneus, intraperitoneaal alleen of intracerebrale), wordt een extreem hoge titer (1 x 108 Pfu) van denv gebruikt in immunocompetente muizen. Bij immuungecompromitteerde muizen kan echter een relatief lage maar variant titer (1 x 105 tot 1 x 108 Pfu) van denv18,19,20worden uitgevoerd. In deze studie, we gebruikten twee-route infectie voor het induceren van gelijktijdige CNS en systemische infectie met een lage titer (intracraniële: 2,5 x 105 Pfu; intraperitoneale: 7,5 x 105 Pfu) van denv in immunocompetente ICR speen muizen. De progressie van encefalitis-achtige ziekte is volledig reproduceerbaar9,10,11,12,13,14,15 . De mogelijke beperking van deze studie is, daarom, verzacht met behulp van een gelijktijdige intracraniële en intraperitoneale injectie. Hoewel het kunstmatig is-echter, consistent met eerdere werken door anderen5,6,7,8 en u.s.9,10,11, 12,13,14,15-denv wordt actief gerepliceerd in de experimentele Murine hersenen9,10,11, 12 , 13 , 14 , 15, en de mogelijke effecten van virale factoren en gastheer reacties op neuro ontsteking, evenals neurotoxiciteit, zijn daarom van belang.

Voor neuro pathogenese wordt de stimulatie van neuronale cel apoptosis veroorzaakt door DENV-infectie en CNS-ontsteking, zoals microgliale celactivering gevolgd door proinflammatoire cytokine tumor necrose factor-α (TNF-α) productie8, 12,15. Directe neurotoxiciteit veroorzaakt door DENV-infectie en indirecte neuro ontsteking geïnitieerd door gastheer immuunresponsen worden gespeculeerd om betrokken te zijn bij dengue encefalitis. Acute virale encefalitis wordt veroorzaakt door virus-geïnduceerde CNS ontsteking van de hersenen3,21. Gemeenschappelijke klinische symptomen zijn een hoge koorts, hoofdpijn, stijve nek en rug, braken, en verwarring, terwijl ernstige gevallen ook aanvallen te ontwikkelen, verlamming, en coma21. Door het monitoren van de veranderingen in scores met klokkenluider houding, limbische inbeslagneming, limbische zwakte, verlamming, en de dood, de ontwikkeling van deze ziekten toont de progressie van acute virale encefalitis-achtige ziekte in denv-geïnfecteerde muizen9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. in het algemeen evolueerde deze met denv geïnfecteerde muizen met een Score van 3 (volgens de in het protocol gepresenteerde ziekte scoringsmethode) snel tot verlamming en dood. De pathogene mechanismen die deze ziekten veroorzaken, vereisen verder onderzoek; echter, er wordt gespecerd dat neuronale disfunctie gevolgd door neuropathie inductie is betrokken21. Gericht op virale replicatie, evenals TNF-α-gemedieerde CNS ontsteking10,11,12,13,14, ten minste gedeeltelijk, verleent therapeutische effecten tegen de progressie van dengue-geassocieerde acute virale encefalitis-achtige ziekte. Het Protocol van deze studie kan worden gebruikt voor het maken van een encefalitis-achtige pathologische model van DENV-infectie.

Sommige studies hebben beschreven de inductie van intracerebrale bloeding geïnduceerd door denv infectie in de hersenen22,23. We toonden eerder de inductie van BBB-verstoring bij met DENV geïnfecteerde muizen9. Hoewel denv niet wordt herkend als een trope virus, kan denv een effectieve infectie veroorzaken in neuronale cellen in vivo en in vitro8,11. Dopamine D2-receptor (D2R) wordt gespeculeerd als een neuronale receptor voor DENV-infectie, en farmacologisch gericht D2R vermindert effectief DENV-infectie in neuronale cellen in vivo en in vitro, evenals DENV-geïnduceerde encefalitische aandoeningen11, 24. Mogelijke therapeutische strategieën tegen acute virale encefalitis zijn belangrijk om te ontwikkelen, zodat ernstige dengue gevallen met neurologische complicaties kunnen worden behandeld. Voor de toekomstige toepassing, dit Protocol van een ziekte model met behulp van DENV infectie in de hersenen kan worden een in vivo platform om niet alleen de virale en gastheerfactoren die verband houden met Neuro pathogenese, maar ook mogelijk antivirale en anti-encefalitische drugs te schermen. Met betrekking tot de incidentie van variant neurologische aandoeningen veroorzaakt door DENV-infectie25 door dit gevestigde protocol, is het verschil tussen de variabele types en/of stammen van denv voor het veroorzaken van neurologische disfunctie nodig voor validatie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Deze studie werd gesteund door subsidies van het ministerie van wetenschap en technologie (MOST107-2321-B-038-001) en de intramurale financiering 106TMU-CIT-01-2, Taipei, Taiwan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI) Gibco 11875-085 Diluting virus
0.3 mL Insulin Syringe  BD Ultra-Fine­II 328838 Intracerebral and intraperitoneal injection
Microbalance METTLER TOLEDO's LabX AL104 Weight mouse
Non-adapted DENV2 (strain PL046) The Centers for Disease Control of Taiwan - Infect mouse
Institute of Cancer Research (ICR) suckling mouse BioLASCO Taiwan Co., Ltd - Our murine model

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guzman, M. G., Gubler, D. J., Izquierdo, A., Martinez, E., Halstead, S. B. Dengue infection. Nature Reviews Disease Primers. 2, 16055 (2016).
  2. Katzelnick, L. C., Coloma, J., Harris, E. Dengue: knowledge gaps, unmet needs, and research priorities. Lancet Infectious Diseases. 17, (3), e88-e100 (2017).
  3. Carod-Artal, F. J., Wichmann, O., Farrar, J., Gascon, J. Neurological complications of dengue virus infection. Lancet Neurology. 12, (9), 906-919 (2013).
  4. Geneva: World Health Organization. Dengue: Guidelines for Diagnosis, Treatment, Prevention and Control: New Edition. WHO Guidelines Approved by the Guidelines Review Committee (2009).
  5. Amaral, D. C., et al. Intracerebral infection with dengue-3 virus induces meningoencephalitis and behavioral changes that precede lethality in mice. Journal of Neuroinflammation. 8, 23 (2011).
  6. de Miranda, A. S., et al. Dengue-3 encephalitis promotes anxiety-like behavior in mice. Behavioural Brain Research. 230, (1), 237-242 (2012).
  7. Velandia-Romero, M. L., Acosta-Losada, O., Castellanos, J. E. In vivo infection by a neuroinvasive neurovirulent dengue virus. Journal of Neurovirology. 18, (5), 374-387 (2012).
  8. Despres, P., Frenkiel, M. P., Ceccaldi, P. E., Duarte Dos Santos, C., Deubel, V. Apoptosis in the mouse central nervous system in response to infection with mouse-neurovirulent dengue viruses. Journal of Virology. 72, (1), 823-829 (1998).
  9. Tsai, T. T., et al. Microglia retard dengue virus-induced acute viral encephalitis. Scientific Reports. 6, 27670 (2016).
  10. Cheng, Y. L., et al. Activation of Nrf2 by the dengue virus causes an increase in CLEC5A, which enhances TNF-alpha production by mononuclear phagocytes. Scientific Reports. 6, 32000 (2016).
  11. Ho, M. R., et al. Blockade of dengue virus infection and viral cytotoxicity in neuronal cells in vitro and in vivo by targeting endocytic pathways. Scientific Reports. 7, (1), 6910 (2017).
  12. Jhan, M. K., et al. Anti-TNF-alpha restricts dengue virus-induced neuropathy. Journal of Leukocyte Biology. 104, (5), 961-968 (2018).
  13. Kao, J. C., et al. The antiparasitic drug niclosamide inhibits dengue virus infection by interfering with endosomal acidification independent of mTOR. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12, (8), e0006715 (2018).
  14. Tsai, T. T., Chen, C. L., Tsai, C. C., Lin, C. F. Targeting heat shock factor 1 as an antiviral strategy against dengue virus replication in vitro and in vivo. Antiviral Research. 145, 44-53 (2017).
  15. Jhan, M. K., et al. Dengue virus infection increases microglial cell migration. Scientific Reports. 7, (1), 91 (2017).
  16. Benskey, M. J., Manfredsson, F. P. Intraparenchymal Stereotaxic Delivery of rAAV and Special Considerations in Vector Handling. Methods in Molecular Biology. 199-215 (2016).
  17. Fong, C. Y., et al. Mild encephalitis/encephalopathy with reversible splenial lesion (MERS) due to dengue virus. Journal of Clinical Neuroscience. 36, 73-75 (2017).
  18. Sarathy, V. V., et al. A lethal murine infection model for dengue virus 3 in AG129 mice deficient in type I and II interferon receptors leads to systemic disease. Journal of Virology. 89, (2), 1254-1266 (2015).
  19. Schul, W., Liu, W., Xu, H. Y., Flamand, M., Vasudevan, S. G. A dengue fever viremia model in mice shows reduction in viral replication and suppression of the inflammatory response after treatment with antiviral drugs. The Journal of Infectious Diseases. 195, (5), 665-674 (2007).
  20. Tyler, K. L. Acute Viral Encephalitis. New England Journal of Medicine. 379, (6), 557-566 (2018).
  21. Yauch, L. E., Shresta, S. Mouse models of dengue virus infection and disease. Antiviral Research. 80, (2), 87-93 (2008).
  22. Assir, M. Z., Jawa, A., Ahmed, H. I. Expanded dengue syndrome: subacute thyroiditis and intracerebral hemorrhage. BMC Infectious Diseases. 12, 240 (2012).
  23. Kumar, R., Prakash, O., Sharma, B. S. Intracranial hemorrhage in dengue fever: management and outcome: a series of 5 cases and review of literature. Surgical Neurology. 72, (4), 429-433 (2009).
  24. Simanjuntak, Y., Liang, J. J., Lee, Y. L., Lin, Y. L. Repurposing of prochlorperazine for use against dengue virus infection. Journal of Infectious Diseases. 211, (3), 394-404 (2015).
  25. Rocha, B. A. M., et al. Dengue-specific serotype related to clinical severity during the 2012/2013 epidemic in centre of Brazil. Infectious Disease Poverty. 6, (1), 116 (2017).
Een Muriene model van dengue virus-geïnduceerde acute virale encefalitis-achtige ziekte
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shen, T. J., Jhan, M. K., Kao, J. C., Ho, M. R., Tsai, T. T., Tseng, P. C., Wang, Y. T., Lin, C. F. A Murine Model of Dengue Virus-induced Acute Viral Encephalitis-like Disease. J. Vis. Exp. (146), e59132, doi:10.3791/59132 (2019).More

Shen, T. J., Jhan, M. K., Kao, J. C., Ho, M. R., Tsai, T. T., Tseng, P. C., Wang, Y. T., Lin, C. F. A Murine Model of Dengue Virus-induced Acute Viral Encephalitis-like Disease. J. Vis. Exp. (146), e59132, doi:10.3791/59132 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter