Summary
여기에서, 우리는 신경병의 발달을 표시하기 위하여 중추 신경계 감염의 면역적격 ICR (암 연구 연구소) 뮤린 모형을 만들기위한 프로토콜을 제시합니다. 동일한 질병 점수에 의한 급성 바이러스 성 뇌질환 모니터링은 생체 내에서 뎅기열 바이러스 유발 신경병증을 나타내는 데 수행될 수 있었다.
Abstract
뎅기열 바이러스 (DENV), 모기에 의해 전달 되는 절지 동물 매개 바이러스, 뎅기열 출혈열로 알려진 심각한 질병을 일으킬 수 있습니다., 플라즈마 누출으로 인해 치명적인 합병증을 특징으로 하는, 복수, 흉막 삼출액, 호흡 곤란, 심한 출혈, 장기 장애. DENV 감염의 몇 가지 경우는 신경 학적 증상을 제시; 그러나, 연구는 DENV 유도된 신경 병증을 더 탐구하지 않았습니다. 본 연구에서, 우리는 DENV를 가진 중추 신경계 (CNS) 감염의 유도를 조사하기 위한 면역 적격 outbred ICR (암 연구 연구소) 마우스를 사용하는 프로토콜을 제시하고, 급성 바이러스성 뇌염의 진행에 선행됩니다 질병.
Introduction
FLAviviridae 가족의 절지 동물 매개 바이러스 인 DENV는 3 개의 바이러스 구조 단백질 (캡시드, 전막 및 봉투)과 7 개의 바이러스 성 비 구조적 단백질 (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B)을 암호화하는 양성 감각 RNA 게놈을 포함합니다. 및 NS5)를 참조하십시오. 매년 약 3억 9천만 명을 감염시키는 DENV(DENV1-4)의 4가지 혈청형은 정부가 모기 벡터 및질병 대조군 1을 향한 상당한 노력을 기울였음에도 불구하고 전 세계적인 부담을 야기한다. 현재, 보호 백신 및 치료 항 바이러스 약물은 개발중이며 추가적인 장기 검증이 필요합니다 2. 임상 사례에서, CNS 감염을 가진 뎅기열 환자는 드물더라도, 뎅기열 질병 발달의 다양성을 이해하기 위하여 더 탐구될 필요가있다3. 추가 조사 및 유효성 검사가 필요합니다. 특히, 세계보건기구(WHO)는 중증 뎅기열 3,4의분류에 인지 장애, 경련, 뇌병증 및 뇌염과 같은 CNS 장애의 참여를 포함하였다. DENV 감염의 동물 모델을 구축하는 것은 DENV 감염의 신경 병증을 탐구하는 데 필수적입니다.
DENV에 의한 CNS 감염을 생성하기 위해, 여러 연구는 (1) 적응되지 않은 DENV3 5의 4 x 103 플라크 형성 단위 (PFU)를 받은 C57BL/6 마우스의 내역 성 접종을 포함하여 DENV 감염의 다른 경로를 실행했습니다. 6,(2) 생체외 신경적응 DENV47,(3) 생체 내 신경 적응 DENV1 8의 1 x 105 PFU를 받은 스위스 마우스의 자궁 내 내 접종을 받은 BALB/c마우스의 복강 내 접종 적응되지 않은 DENV29의1 x 106 PFU를 받은 ICR 빨기 마우스의 인내뇌및 복강 내 공동 접종. 이러한 연구의 결과에 따르면5,6,7,8,9,DENV 감염은 뇌에서 바이러스 복제를 초래하여 급성 바이러스성으로 이어진다. 뇌염과 같은 증후군, 사지 마비와 자세 불안정을 동반 행동 변화, CNS 신경 독성 및 염증, 혈액 - 뇌 장벽을 통해 일반 및 국소 혈장 누출 (BBB), 및 치사. 이러한 연구의 모든결과 5,6,7,8, 9는 DENV가 CNS를 감염시키고 급성 바이러스성 뇌염과 같은 유도를 하는 능력을 보여주었다. 감염 다음 질병.
우리의 현재 사실인정에 근거하여 9,10,11,12,13,14,15,우리는 생체 내로 DENV 감염의 뮤린 모형을 만들었습니다 바이러스 복제에 대한 표적 제제 / 요인의 치료 효능뿐만 아니라 신경 독성을 검사하는 플랫폼. 여기에서, 우리는 CNS 감염을 공부하고 DENV에 기인한 다른 경벌을 가진 신경병의 발달을 감시하기 위하여 면역적격 outbred ICR 마우스를 만들기 위하여 이용된 프로토콜을 보고합니다. 결과는 DENV 감염마우스에서 뇌염과 같은 질병의 유의한 진행을 시간 의존적인 방식으로 보여준다.
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Protocol
동물 연구의 실험 프로토콜은 대만 과학기술부에 의해 수립 된 지침에 따라 국방 의료 센터의 기관 동물 관리 및 사용자위원회 (IACUC 번호 : 16-261)에 의해 승인되었습니다.
1. 감염 절차
- 적응되지 않은 DENV2 (변형 PL046) 주식9 (원래 대만 질병 통제 센터에서 얻은, 2.5 x 107 에서 1 x 109 PFU / mL).
- 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트(RPMI) 1640 배지를 사용하여 바이러스 스톡을 1 x 106 PFU로 총 부피 40 μL로 희석합니다.
- 희석 된 바이러스의 10 μL (2.5 x 105 PFU)와 30G 바늘이 장착 된 0.3 mL 주사기 하나를 채우고 희석 된 바이러스의 30 μL (7.5 x 105 PFU)로 30G 바늘이 장착 된 다른 0.3 mL 주사기를 채웁니다.
-
7일된 ICR 을 잡고 다음 단계를 수행합니다.
- 내뇌 주사의 경우, 집게 손가락과 엄지 손가락 사이의 주경을 눌러 경향이 있는 위치에 마우스를 잡고, 회골과 람도이드 봉합사의 교차점에 있는 람다 부위에 희석된 바이러스 10 μL을 무혐의로 주입합니다. 16.
- 내뇌 주사 후, 검지 손가락과 엄지손가락을 사용하여 마우스를 척추 위치에 잡고 복강 내 30 μL의 희석 바이러스를 무린 abdomenl에 부드럽게 주입합니다.
참고 : 식인 풍습을 피하기 위해 75 %의 알코올은 어머니의 후각 감각을 일시적으로 상실하는 데 사용됩니다. 또한, 그들의 어머니의 발판 및 소변으로 쓰레기를 덮는 것이 건의됩니다.
- 새장에 다시 빨기 마우스를 놓고 5 분 동안 기다린 후 걷기와 모유 빨기를 포함하여 쥐의 열렬함으로 안전 포스트 자극을 확인합니다.
참고: 대부분의 경우, 마우스는 정상적인 활동 게시물을 보여자극하고 기술적 인 도전 다음 유해한 효과가없는 것 같다. 이 실험 동안, 동물은 대만 국방 의료 센터의 기관 동물 관리 및 사용자 위원회에 의해 유지되었다. - 체중(마이크로그램 밸런스를 사용하여), 급성 바이러스성 뇌염 유사 질환(섹션 2에 설명된 대로 질병 점수 매기기), 생존율9,10,11의 관점에서 마우스의 일일 진행 상황을 평가합니다. ,12,13,14,15.
2. 질병 점수 매기기
- 급성 바이러스 성 뇌염과 같은 질병의 등급을 모니터링합니다. 건강한 마우스에 0의 점수를 할당; 1 경미한 질병 증상을 가진 마우스, 체중 감소를 포함 하 여, 감소 이동성, 그리고 hunchback 신체 방향; 2는 변연계 발작을 나타내는 마우스; 3 마우스에 난이도 및 전방 사지 또는 후방 사지 약점을 가진 이동을 포함하는 변연계 약점을 나타낸다; 마비에 대 한 4; 5 죽음.
참고: 점수가 3에 도달하면 질병 증상은 빠르게 진화하는 것으로 간주됩니다. - 2.1단계에 따라, 각 군의 일일 시험 점수의 평균 ±SD를 이용하여 곡선 기반 도면으로서 매일 질병의 스코어링을 플로팅한다.
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Representative Results
가혹한 뎅기열 관련 신경학상 합병증은 뎅기열 병인을 위한 환자에서 보고되었습니다4. 이러한 경우는 클리닉에서 드물지만 DENV 감염의 면역 적격 뮤린 모델을 만드는 것은 면역 요법 생성을 연구하는 데 뿐만 아니라 CNS 감염, 신경 염증, 신경 독성 및 급성 바이러스를 탐구하는 데에도 사용될 수 있습니다. 뇌염과 같은 질병. 본 연구에서, 우리의 현재모델 9에 따르면,10,11,12,13,14,15,7 일 된 ICR 빨기 마우스를 접종하였다. DENV2와 동시에 내뇌 미세 주입 (2.5 x 105 PFU) 및 복강 내 주사 (7.5 x 105 PFU) (그림 1). 감염 후, DENV감염 뇌9,10,11,12에서 dsRNA 복제, 바이러스 단백질 발현 및 바이러스 방출의 존재를 보여주기 위해 수많은 분석을 수행했습니다. ,13,14,15. 이러한 실험은 DENV 감염, 복제 및 방출의 성공적인 생체 내 모델이 확립되었음을 입증하였다.
급성 바이러스 성 뇌염과 같은 질병의 유도를 평가하기위해 9,10,11,12,13,14,15,우리는 변화를 모니터링 DENV 감염 마우스에서 체중에. 모의 그룹(마우스만으로 접종한 경우)의 체중 변화와 비교하여, 도 2는 감염된 마우스에서 체중이 현저한(P< 0.01) 감소하지만 모의 그룹의 증가를 나타낸다. DENV 감염 마우스에서 나타난 바와 같이, hunchback 자세, 변연계 발작, 변연계 발작, 마비 및 사망을 포함하는 뇌염과 같은 질병의 증상에 따르면, 그림 3은 유의한 (P < 0.05) 증가를 나타낸다. DENV 감염 마우스에서 임상 점수. 도 4에서 생존 분석은 DENV-감염된 마우스의 생존율(P&0.001)에서 시간 의존적 감소를 나타낸다. 데이터는 급성 바이러스성 뇌염 같이 질병의 진행을 보여주는 CNS에 있는 DENV의 전염하는 모형의 설치를 표시합니다.
그림 1: 뎅기열 바이러스(DENV) 감염에 대한 실험 설계를 빨아먹는 마우스에 있습니다. 7일된 ICR 빨기 마우스를 DENV2 PL046으로 동시 두개내 및 복강 내 주사로 접종하였다. 체중, 질병 점수 및 사망률의 변화를 측정했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 뎅기열 바이러스(DENV) 감염 동안 쥐를 빨아 먹는 체중. DENV2에 감염된 ICR 빨기 마우스(n=12)에서, 체중의 변화는 하루에 측정되었다. Wilcoxon 서명 순위 테스트 에 따라 값은 평균 ± SD. **p < 0.01로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 뎅기열 바이러스(DENV) 감염 동안 쥐를 빨아먹는 뇌질환 점수. ICR 빨기 마우스에서 DENV2 감염(n=12), hunchback 자세(점수 1), 변연계 발작(점수 2), 변연계 약점(점수 3), 마비(점수 4), 및 사망(점수 5)에 대한 임상 점수의 시간 역학 변화를 측정하였다. Wilcoxon 서명 순위 테스트에 따라 값은 평균 ± SD. *p < 0.05로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 뎅기열 바이러스(DENV) 감염 동안 쥐를 빨아 먹는 생존율. 생존율의 시간 운동 적 변화는 DENV2 감염 ICR 빨기 마우스 (n = 12)에서 측정되었다. 로그 랭크 테스트 에 이어 값은 평균 ± SD. ***p < 0.001로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
DENV 감염은 중증 뎅기열 환자3,17의CNS에서 검출되었으며, 뎅기열 병인 동안 급성 바이러스 성 뇌염의 발현 가능성을 시사한다. 여기에서, 우리는 가혹한 뎅기열에 있는 CNS 역기능의 관련을 공부를 위한 DENV 감염의 생체 내 murine 모형을 보고합니다, 특히 DENV 유도한 심각한 바이러스성 뇌염 같이 질병에 초점으로. 이전 모델과 비교하여, 특히 단일 경로 감염(정맥 내만, 복강 내만, 또는 내외만),DENV의 매우 높은 역가(1 x 108 PFU)는 면역적격 마우스에서 활용된다. 그러나, 면역손상 마우스에서, DENV의 비교적 낮지만 변이체 역가(1 x 105 1 x 108 PFU)는18,19,20을수행할 수 있다. 이 연구에서, 우리는 낮은 역가와 동시 CNS 및 전신 감염을 유도하기 위해 두 경로 감염을 사용 (2.5 x 105 PFU; 복강 내: 7.5 x 105 PFU) 면역 적격 ICR 빨기 마우스에서 DENV의. 뇌염과 같은 질병의 진행은 완전히 재현9,10,11,12,13,14,15 . 이 연구의 가능한 제한은, 따라서, 동시 두개내 및 복강 내 주입을 사용하여 완화. 그것은 인공이지만, 다른 사람에 의해 이전작품과 일치 5,6,7,8 그리고 우리9,10,11, 12,13,14,15-DENV는 실험용 뮤린 뇌9,10,11, 12세 , 13세 , 14세 , 도 15, 그리고 신경 염증에 대한 바이러스 인자 및 숙주 반응의 가능한 효과뿐만 아니라 신경 독성은 따라서 관심의.
신경병증의 경우, 신경세포 세포자멸의 자극은 DENV 감염뿐만 아니라 미세교세포 활성화와 같은 CNS 염증에 의해 유발되고, 그 다음에 전염증성 사이토카인 종양 괴사 인자-α(TNF-α) 생산8, 12,15. DENV 감염및 호스트 면역 반응에 의해 개시된 간접신경염증에 기인한 직접적인 신경독성은 뎅기열 뇌염에 관여하는 것으로 추측된다. 급성 바이러스성 뇌염은 뇌의 바이러스 유발 CNS 염증에 의해 발생3,21. 일반적인 임상 증상은 고열, 두통, 뻣뻣한 목 과 뒤, 구토 및 혼란, 심한 경우는 또한 발작을 개발하는 동안, 마비, 혼수 상태에21. hunchback 자세, 변연계 발작, 변연계 약점, 마비 및 죽음으로 점수의 변화를 모니터링함으로써, 이러한 질병의 발달은 DENV 감염 마우스에서 급성 바이러스 성 뇌염과 같은 질병의 진행을 보여줍니다9, 10개 , 11세 , 12세 , 13세 , 14세 , 15.일반적으로, 3의 점수를 가진 DENV 감염 마우스(프로토콜에 제시된 질병 채점 방법에 따라)는 마비 및 사망으로 급속히 진행되었다. 이러한 질병을 일으키는 병원 성 메커니즘 추가 조사를 필요로; 그러나, 신경병 유도에 선행된 신경 기능 장애가21에관여한다는 것은 추측된다. 표적화 바이러스 복제뿐만 아니라 TNF-α 매개 CNS 염증10,11,12,13,14,적어도 부분적으로는 치료 효과를 부여합니다. 뎅기열 관련 급성 바이러스 성 뇌염 같은 질병의 진행. 이 연구 결과의 프로토콜은 DENV 감염의 뇌염 같이 병리학 모형을 만들기를 위해 이용될 수 있었습니다.
일부 연구는 뇌의 DENV 감염에 의해 유도 된 뇌 중뇌 출혈의 유도를 설명했다22,23. 우리는 이전에 DENV 감염마우스 9에서 BBB 중단의유도를 보여주었습니다. DENV는 신경성 바이러스로 인식되지 않지만, DENV는 생체 내 및 시험관 내신경 세포에서 효과적인 감염을 생성할 수 있으며 8,11. 도파민 D2 수용체(D2R)는 DENV 감염을 위한 신경 수용체로 추측되며, 약리학적으로 D2R을 표적으로 하는 것은 생체외 및 시험관내 신경세포에서 DENV 감염을효과적으로 감소시키며, DENV 유발 뇌질환(11)은 24. 급성 바이러스 성 뇌염에 대 한 가능한 치료 전략은 신경 합병증을 가진 심한 뎅기열 경우 치료 될 수 있도록 개발 하는 것이 중요 하다. 향후 적용을 위해, 뇌에서 DENV 감염을 사용하는 질병 모델의 이 프로토콜은 신경병형성과 관련된 바이러스 및 숙주 인자뿐만 아니라 가능한 항바이러스 및 항뇌성 약물을 스크리핑하는 생체 내 플랫폼이 될 수 있다. 이 확립된 프로토콜에 의해 DENV 감염25에 기인한 이체성 신경 장애의 발생률에 대하여, 신경기능 장애를 일으키는 원인이 되기 위한 DENV의 가변 모형 및/또는 긴장의 다름은 유효성 검사를 위해 필요합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 연구는 과학기술부(MOST107-2321-B-038-001)의 보조금과 대만 타이베이의 교내 기금 106TMU-CIT-01-2의 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI) | Gibco | 11875-085 | Diluting virus |
| 0.3 mL Insulin Syringe | BD Ultra-FineII | 328838 | Intracerebral and intraperitoneal injection |
| Microbalance | METTLER TOLEDO's LabX | AL104 | Weight mouse |
| Non-adapted DENV2 (strain PL046) | The Centers for Disease Control of Taiwan | - | Infect mouse |
| Institute of Cancer Research (ICR) suckling mouse | BioLASCO Taiwan Co., Ltd | - | Our murine model |
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