Summary
Aqui, nós apresentamos um protocolo para criar um modelo murino imuno-competente do ICR (Instituto do cancer da pesquisa) da infecção do sistema nervoso central para indicar o desenvolvimento da neuropatia. A monitoração de desordens encefalalitic virais agudas por contagens idênticas da doença podia ser executada mostrando a neuropatia vírus-induzida dengue in vivo.
Abstract
O vírus da dengue (DENV), um vírus transmitida por artrópodes transmitido por mosquitos, pode causar a doença grave conhecida como febre hemorrágica da dengue, que é caracterizada por complicações letais devido ao vazamento de plasma, ascite, derrame pleural, desconforto respiratório, hemorragia grave e comprometimento de órgãos. Alguns casos de infecção por DENV apresentam manifestações neurológicas; Entretanto, os estudos não exploraram mais a neuropatogénese DENV-induzida. Neste estudo, nós apresentamos um protocolo para usar um camundongo imunocompetente de ICR (Instituto de pesquisa do cancer) para investigar a indução da infecção do sistema nervoso central (CNS) com o DENV, seguido pela progressão da encefalite viral aguda-como Doença.
Introduction
O DENV, um vírus transmitido por artrópodes da família Flaviviridae , contém um GENOMA de RNA de sentido positivo que codifica três proteínas estruturais virais (capsídeo, pré-membrana e envelope) e sete proteínas não estruturais virais (ns1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B , e NS5). Os quatro sorotipos de DENV (DENV1-4), que infectam aproximadamente 390 milhões povos anualmente, causam uma carga global mesmo que os governos tenham dirigido esforços substanciais para o vetor do mosquito e o controle da doença1. Atualmente, vacinas protetoras e medicamentos antivirais terapêuticos estão em desenvolvimento e exigem mais validação a longo prazo2. Na prática clínica, embora um paciente com dengue com infecção do SNC seja raro, precisa ser mais explorado para compreender a diversidade do desenvolvimento da doença da dengue3. São necessárias mais investigações e validação; notavelmente, a Organização Mundial de saúde (OMS) incluiu o comprometimento do comprometimento do SNC, como comprometimento cognitivo, convulsões, encefalopatia e encefalite, na classificação da dengue grave3,4. Construir modelos animais da infecção de DENV é indispensável para explorar a neuropatogénese da infecção de DENV.
Para a geração de infecção do SNC por DENV, vários estudos têm executado diferentes vias de infecção por DENV, incluindo (1) inoculação intracerebral de camundongos C57BL/6 que receberam 4 x 103 unidades formadoras de placas (Pfu) de DENV35, 6, (2) inoculação intraperitoneal de camundongos Balb/c que receberam 7 x 104 Pfu de in vitro neuroadaptados DENV47, (3) inoculação intracerebral de camundongos suíços que receberam 1 x 105 Pfu de in vivo neuroadaptado DENV18, e (4) coinoculação intracerebral e intraperitoneal de camundongos amamentando ICR que receberam 1 x 106 Pfu de DENV29. De acordo com os achados desses estudos5,6,7,8,9, a infecção por DENV em camundongos resulta em replicação viral no cérebro, levando a infecções virais agudas encefalite-como síndromes, mudanças comportáveis acompanhadas da paralisia do membro e da instabilidade postural, do neurotoxicidade e da inflamação do CNS, do escapamento geral e localizado do plasma através da barreira do sangue-cérebro (BBB), e da letalidade. Todos os resultados destes estudos5,6,7,8,9 mostraram a capacidade de DENV para infectar o CNS e a indução de encefalite viral aguda-como doença após a infecção.
Com base em nossos achados atuais9,10,11,12,13,14,15, criamos um modelo murino de infecção por DENV como um in vivo plataforma para examinar a eficácia terapêutica de agentes/fatores alvejados de encontro à replicação viral, assim como a neurotoxicidade. Aqui, nós relatamos o protocolo utilizado para criar um rato exogâmica imuno-competente de ICR para estudar a infecção do CNS e para monitorar o desenvolvimento dos neuropatias com severties diferentes causados por DENV. Os resultados mostram a progressão significativa da encefalite-como a doença em ratos DENV-contaminados em uma maneira tempo-dependente.
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Protocol
Protocolos experimentais de estudo animal foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidado animal e usuário do centro médico de defesa nacional (número IACUC: 16-261), de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo Ministério da ciência e tecnologia, Taiwan.
1. procedimento de infecção
- Prepare os estoques DENV2 (Strain PL046) não adaptados9 (originalmente obtidos dos centros de controle de doenças em Taiwan, variando de 2,5 x 107 a 1 x 109 pfu/ml).
- Diluir o estoque de vírus para 1 x 106 Pfu com Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 médio para um volume total de 40 μl.
- Encha uma seringa de 0,3 mL equipada com uma agulha de 30 G com 10 μL (2,5 x 105 Pfu) de vírus diluído e encha outra seringa de 0,3 ml equipada com uma agulha de 30 g com 30 μl (7,5 x 105 Pfu) de vírus diluído.
-
Segure o 7 dia-velho ICR Leitão mouse e realizar os seguintes passos.
- Para a injeção intracerebral, segure o mouse em uma posição propensa pressionando a aurícula entre o dedo indicador e o polegar, e injetar intracerebralmente 10 μL de vírus diluído na área lambda, o ponto na interseção da sutura sagital e lambdóide a 16.
- Após a injeção intracerebral, segure o mouse em uma posição supina usando o dedo indicador e o polegar e injete intraperitonealmente 30 μL de vírus diluído suavemente no murino abdomenl.
Nota: para evitar o canibalismo, 75% álcool é usado para criar uma perda temporária da sensação olfativa da mãe. Adicionalmente, cobrindo as ninhadas com fezes de sua mãe e urina é sugerido.
- Coloque os ratos de sucção de volta em suas gaiolas e aguarde 5 minutos para verificar a sua segurança pós-estimulação com a avidez de camundongos, incluindo a caminhada e sucção do leite materno.
Nota: Na maioria das vezes, camundongos demonstram atividade normal pós-estimulação e não parece haver quaisquer efeitos nocivos após o desafio técnico. Durante este experimento, os animais foram mantidos pelo Comitê institucional de cuidado animal e usuário do centro médico de defesa nacional, Taiwan. - Avaliar o progresso diário dos camundongos em termos de peso corporal (usando um balanço de micrograma), doença viral aguda como encefalite (por escore de doença conforme descrito na seção 2) e taxa de sobrevida9,10,11 ,12,13,14,15.
2. pontuação da doença
- Monitore a classe de doenças virais agudas da encefalite-como. Atribua uma pontuação de 0 a camundongos saudáveis; 1 a camundongos com sintomas de doença menor, incluindo perda de peso, mobilidade reduzida e orientação do corpo corcunda; 2 a camundongos que exibem apreensão límbica; 3 a camundongos exibem fraqueza límbica, incluindo movimentação com dificuldade e fraqueza do membro anterior ou membro posterior; 4 para paralisia; 5 para a morte.
Nota: Uma vez que a pontuação atinge 3, os sintomas da doença são considerados evoluir rapidamente. - Traçar a pontuação da doença, de acordo com a etapa 2,1, para cada dia como uma figura baseada em curva usando a média ± DP dos escores de teste diários em cada grupo.
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Representative Results
As complicações neurológicas dengue-associadas severas foram relatadas nos pacientes para a patogénese4da dengue. Embora estes casos sejam raros na clínica, criar um modelo murino imuno-competente da infecção de DENV pode ser usado não somente para estudar o imunopatogênese mas igualmente para explorar a infecção do CNS, o neuroinflammation, a neurotoxicidade, e o viral agudo encefalite-como a doença. Neste estudo, de acordo com nosso modelo atual9,10,11,12,13,14,15, 7 camundongos de aleitamento de ICR diurnos foram inoculados concomitantemente com DENV2 através de uma microinjeção intracerebral (2,5 x 105 Pfu) e uma injeção intraperitoneal (7,5 x 105 Pfu) (Figura 1). Após a infecção, realizamos inúmeras análises para mostrar a presença de replicação de dsRNA, expressão de proteína viral e liberação de vírus no cérebro infectado por DENV9,10,11,12 ,13,14,15. Estas experiências demonstraram que um modelo in vivo bem sucedido da infecção, da duplicação, e da liberação de DENV foi estabelecido.
Para avaliar a indução de doenças agudas como a encefalite viral9,10,11,12,13,14,15, monitoramos as alterações no peso corporal em camundongos infectados com DENV. Comparado com as alterações do peso corporal no grupo simulado (onde os camundongos foram inoculados apenas com o meio RPMI), a Figura 2 mostra um aumento no grupo simulado, mas uma diminuição significativa (P < 0, 1) no peso corporal nos camundongos infectados. De acordo com os sintomas da encefalite-como doenças, incluindo a postura corcunda, a apreensão límbica, a fraqueza límbica, a paralisia, e a morte, como manifestada em ratos DENV-contaminados, a Figura 3 mostra um aumento significativo (P < 0, 5) no escore clínico nos camundongos infectados pelo DENV. O ensaio de sobrevida na Figura 4 mostra uma redução dependente do tempo na taxa de sobrevida (P < 0, 1) dos camundongos infectados pelo DENV. Os dados indicam o estabelecimento de um modelo infeccioso de DENV no CNS, que mostra a progressão de doenças virais agudas da encefalite-como.
Figura 1: delineamento experimental para infecção pelo vírus da dengue (DENV) em camundongos leiteiro. Sete ratos de Leitão Day-Old de ICR foram inoculados com DENV2 PL046 por injeções intracranial e intraperitoneal simultâneas. Foram mensuradas as alterações no peso corporal, escore da doença e mortalidade. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: o peso corporal em camundongos leiteiro durante a infecção pelo vírus da dengue (DENV). Em camundongos de aleitamento de ICR infectados com DENV2 (n = 12), as alterações no peso corporal foram mensuradas por dia. Após um teste de Wilcoxon assinado-Rank, os valores são apresentados como a média ± DP. * *p < 0, 1. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: escore da doença encefalítica em camundongos leiteiro durante a infecção pelo vírus da dengue (DENV). Após DENV2 infecção em camundongos leiteiro de ICR (n = 12), foram mensuradas alterações cinéticas no escore clínico para postura corcunda (escore 1), apreensão límbica (escore 2), fraqueza límbica (escore 3), paralisia (escore 4) e óbito (escore 5). Após um teste de Wilcoxon assinado-Rank, os valores são apresentados como a média ± DP. *p < 0, 5. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: a taxa de sobrevida em camundongos leiteiro durante a infecção pelo vírus da dengue (DENV). As mudanças tempo-cinéticas em taxas de sobrevivência foram medidas em ratos DENV2-contaminados do leitão de ICR (n = 12). Após um teste de log-rank, os valores são apresentados como a média ± DP. * * *p < 0, 1. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A infecção por DENV tem sido detectada no SNC de pacientes com dengue grave3,17, sugerindo a possibilidade de manifestação de encefalite viral aguda ocorrida durante a patogênese da dengue. Aqui, nós relatamos um modelo in vivo murino da infecção de DENV para estudar a participação da deficiência orgânica do CNS na dengue severa, particular com um foco em doenças virais agudas DENV-induzidas da encefalite-como. Em comparação com os modelos precedentes, particularmente para a infecção da um-rota (somente intravenoso, somente intraperitoneal, ou intracerebral somente), um Titer extremamente elevado (1 x 108 Pfu) de DENV é utilizado em ratos imuno-competentes. No entanto, em camundongos imunocomprometidos, um Titer relativamente baixo, mas variante (1 x 105 a 1x 108 Pfu) de DENV pode ser realizado18,19,20. Neste estudo, nós usamos a infecção Two-Route para induzir o CNS simultâneo e a infecção sistemática com um baixo Titer (intracranial: 2,5 x 105 Pfu; intraperitoneal: 7,5 x 105 Pfu) de DENV em ratos imuno-competentes do leitão de ICR. A progressão da doença tipo encefalite é completamente reprodutível9,10,11,12,13,14,15 . A limitação possível deste estudo é, conseqüentemente, atenuada usando uma injeção intracranial e intraperitoneal simultânea. Embora seja artificial-no entanto, consistente com obras anteriores de outros5,6,7,8 e US9,10,11, 12,13,14,15-DENV é ativamente replicado no cérebro murino experimental9,10,11, 12 anos de , 13 anos de , 14 anos de , 15, e os possíveis efeitos de fatores virais e respostas do hospedeiro sobre neuroinflamação, bem como neurotoxicidade, são, portanto, de interesse.
Para a neuropatogénese, a estimulação da apoptose neuronal da pilha é provocada pela infecção de DENV assim como a inflamação do CNS, tal como a ativação microglial da pilha seguida pela produção do fator de necrose do tumor da citocinas pró-inflammatory-α (TNF-α)8, 12,15. A neurotoxicidade direta causada pela infecção de DENV e pela neuroinflamação indireta iniciada por respostas imunes do anfitrião é especulada para ser envolvida na encefalite da dengue. A encefalite viral aguda é causada pela inflamação induzida pelo vírus do SNC do cérebro3,21. Os sintomas clínicos comuns são febre alta, cefaléia, pescoço duro e costas, vômitos e confusão, enquanto casos graves também desenvolvem convulsões, paralisia e coma21. Monitorando as mudanças nos escores com postura corcunda, apreensão límbica, fraqueza límbica, paralisia, e morte, o desenvolvimento destas doenças mostra a progressão da doença viral aguda da encefalite-como em ratos DENV-contaminados9, 10 de , 11 anos de , 12 anos de , 13 anos de , 14 anos de , 15. geralmente, os camundongos infectados com DENV com escore 3 (de acordo com o método de escore da doença apresentado no protocolo) progrediram rapidamente para paralisia e óbito. Os mecanismos patogénicos que causam estas doenças exigem uma investigação mais adicional; Entretanto, especia-se que a deficiência orgânica neuronal seguida pela indução da neuropatia é involvida21. Visando a replicação viral, bem como a inflamação do SNC mediada pelo TNF-α10,11,12,13,14, pelo menos em parte, confere efeitos terapêuticos contra a progressão da doença viral aguda dengue-associada da encefalite-como. O protocolo deste estudo poderia ser usado criando um modelo patológico encefalite-como da infecção de DENV.
Alguns estudos descreveram a indução da hemorragia intracerebral induzida pela infecção por DENV no cérebro22,23. Nós mostramos previamente a indução do rompimento de BBB em ratos DENV-contaminados9. Embora o DENV não seja reconhecido como um vírus neurotrópico, o DENV pode produzir uma infecção efetiva em células neuronais in vivo e in vitro8,11. O receptor do dopamine D2 (D2R) é especulado para ser um receptor neuronal para a infecção de DENV, e alvejar farmacologicamente D2R reduz eficazmente a infecção de DENV em pilhas neuronal in vivo e in vitro, assim como doenças encefalítica DENV-induzidas11, a 24. As estratégias terapêuticas possíveis de encontro à encefalite viral aguda são importantes desenvolver de modo que os casos severos da dengue com complicações neurológicas possam ser tratados. Para sua aplicação futura, este protocolo de um modelo da doença que usa a infecção de DENV no cérebro pode transformar-se uma plataforma in vivo para telar não somente os fatores virais e do anfitrião associados com a neuropatogénese mas igualmente a medicina antiviral e antiencefalítica possível. Em relação à incidência de distúrbios neurológicos variantes causados pela infecção por DENV25 por este protocolo estabelecido, a diferença entre os tipos de variáveis e/ou cepas de DENV para causar disfunção neurológica é necessária para validação.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado por subvenções do Ministério da ciência e tecnologia (MOST107-2321-B-038-001) e o financiamento intramural 106TMU-CIT-01-2, Taipei, Taiwan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI) | Gibco | 11875-085 | Diluting virus |
| 0.3 mL Insulin Syringe | BD Ultra-FineII | 328838 | Intracerebral and intraperitoneal injection |
| Microbalance | METTLER TOLEDO's LabX | AL104 | Weight mouse |
| Non-adapted DENV2 (strain PL046) | The Centers for Disease Control of Taiwan | - | Infect mouse |
| Institute of Cancer Research (ICR) suckling mouse | BioLASCO Taiwan Co., Ltd | - | Our murine model |
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