Summary
Burada, nöropati gelişimini görüntülemek için bir immünopetik ıCR (Kanser Araştırma Enstitüsü) merkezi sinir sistemi enfeksiyonu murine modeli oluşturmak için bir protokol sunuyoruz. Akut viral ensefalitik bozuklukların aynı hastalık puanları ile izlenmesi, Dang virüse bağlı nöropati içinde vivo göstermek için gerçekleştirilebilir.
Abstract
Ritim virüsü (DENV), sivrisinekler tarafından iletilen bir artthropod kaynaklı virüs,, plazma kaçağı nedeniyle ölümcül komplikasyonlar ile karakterize Dang Hemorajik ateş olarak bilinen şiddetli hastalığa neden olabilir, asit, plevral efüzyon, solunum sıkıntısı, şiddetli kanama ve organ bozukluğu. DENV enfeksiyonu birkaç olgu nörolojik belirtiler mevcut; Ancak çalışmalar DENV kaynaklı neuropathogenesis 'i daha fazla araştırmadı. Bu çalışmada, orta sinir sistemi (CNS) enfeksiyonu ile DENV indüksiyonu araştırılması için immünoteksel bir outbred ıCR (kanser araştırması Enstitüsü) fare kullanmak için bir protokol sunuyoruz, akut viral ensefalitis gibi progresyon takip Hastalığı.
Introduction
Flaviviridae ailesinin bir artthropod kaynaklı virüsü olan denv, üç viral yapısal proteini (capsid, premembran ve zarf) ve yedi viral yapısal olmayan PROTEINLERE (ns1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B) kodlayan pozıtıf anlamda RNA genomu içerir. ve NS5). Denv dört serotipleri (DENV1-4), hangi yaklaşık 390.000.000 kişi yıllık enfekte, hükümetler sivrisinek vektör ve hastalık kontrolü doğru önemli çabaları yönetmiş olsa bile küresel bir yük neden1. Şu anda, koruyucu aşılar ve terapötik antiviral ilaçlar geliştirilmesi altında ve daha uzun vadeli doğrulama gerektirir2. Klinik uygulamada, CNS enfeksiyonu olan bir Dang hastasıyla nadir olmasına rağmen, Dang hastalığı gelişiminin çeşitliliğini anlamak için daha fazla incelenmesi gerekir3. Daha fazla soruşturma ve doğrulama gereklidir; Özellikle, Dünya Sağlık Örgütü (WHO) ciddi Dang 'ın sınıflandırılmasında, bilişsel bozukluk, konvülsiyonlar, ensefalopati ve ensefalit gibi CNS bozukluğu katılımı dahil etti3,4. Denv enfeksiyonunun hayvan modellerini inşa etmek, DENV enfeksiyonu neuropathogenesis keşfetmek için vazgeçilmez.
Denv tarafından cns enfeksiyonu oluşturmak için, çeşitli çalışmalar denv enfeksiyon farklı yollar idam, dahil olmak üzere (1) C57BL/6 fareler intraserebral aşı 4 x 103 plak şekillendirme birimleri (PFU) adapte olmayan DENV35, 6, (2) alınan Balb/c fareler intraperitoneal inokülasyon 7 x 104 PFU in vitro nörouyarlanmış DENV47, (3) alınan İsviçre fareler intraserebral aşı 1 x 105 PFU In vivo nörouyarlanmış DENV18, ve (4) 1 x 106 PFU 'ya adapte olmayan DENV29' u alan ICR Suckling fareler intrakerebral ve intraperitoneal Co-inoculation. Bu çalışmaların bulgularınagöre5,6,7,8,9, farelerde denv enfeksiyonu beyin viral çoğaltma sonucu, akut viral yol ensefalit benzeri sendromlar, ekstremite felç ve postural istikrarsızlık, CNS nörotoksisite ve inflamasyon, genel ve lokalize plazma sızıntısı ile kan-beyin bariyeri (BBB), ve hırıllık eşliğinde davranışsal değişiklikler. Bu çalışmaların tüm sonuçları5,6,7,8,9 denv 'in CNS ve akut viral ensefalitis gibi indüksiyon enfekte yeteneği göstermiştir enfeksiyon aşağıdaki hastalık.
Mevcut bulgularımıza dayanarak9,10,11,12,13,14,15, biz bir in vivo olarak denv enfeksiyon bir murine modeli oluşturduk Platform/faktörler viral çoğaltma karşı hedeflenen ajanlar terapötik etkinliğini incelemek için, yanı sıra nörotoksisite. Burada, CNS enfeksiyonunu incelemek ve DENV 'in neden olduğu farklı önem dereceleri ile nöropatilerin gelişimini izlemek için immünoptikli bir outbred ıCR Mouse oluşturmak için kullanılan protokolü rapor ediyoruz. Sonuçları zaman bağımlı bir şekilde DENV-enfekte fareler ensefalit benzeri hastalığın önemli progresyonu gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan etüdünün deneysel protokolleri, Tayvan bilim ve Teknoloji Bakanlığı tarafından kurulan yönergelere göre, ulusal savunma Tıp Merkezi 'nin (ıAUC numarası: 16-261) Kurumsal hayvan bakımı ve Kullanıcı Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. enfeksiyon prosedürü
- Adapte olmayan DENV2 (strain PL046) stokları9 (aslen 2,5 x 107 ile 1 x 109 PFU/ml arasında değişen Tayvan 'da hastalık kontrolü merkezlerinden elde edilir).
- 1 x 106 PFU Ile Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) 1640 orta 40 μL toplam hacmine virüs stok seyreltmeli.
- 10 μL (2,5 x 105 PFU) seyreltilmiş virüs Ile 30 g iğne ile donatılmış bir 0,3 ml şırınga doldurun ve seyreltilmiş virüs 30 μl (7,5 x 105 PFU) ile 30 g iğne ile donatılmış başka bir 0,3 ml şırınga doldurun.
-
7 gün eski ıCR Suckling fareyi tutun ve aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
- İntraserebral enjeksiyon için, parmak ve başparmak arasında auricle basarak eğilimli bir konumda fareyi tutun ve intracerebrally lambda alanına seyreltilmiş virüs 10 μL enjekte, sagittal ve lambdoid sütür kesişiminde nokta 16 yaşında.
- İntraserebral enjeksiyon sonra, parmak ve başparmak kullanarak bir sırtüstü pozisyonda fareyi tutun ve intraperitoneal hafifçe murine ağının içine seyreltilmiş virüs 30 μL enjekte.
Not: yamyamlık önlemek Için, 75% alkol annenin koku hissi geçici bir kayıp oluşturmak için kullanılır. Ayrıca, annelerinin dışkı ve idrar ile çöp kapsayan önerilmektedir.
- Onların kafesleri geri Suckling fareler Lay ve 5 dakika için bekleme ve anne süt emme de dahil olmak üzere fareler, avidite ile güvenlik poststimulasyonu kontrol etmek için bekleyin.
Not: Çoğu zaman, fareler normal aktivite poststimulasyonu göstermek ve teknik zorluk aşağıdaki herhangi bir zararlı etkileri gibi görünmüyor. Bu deney sırasında hayvanlar, Tayvan Ulusal Savunma Tıp Merkezi 'nin kurumsal hayvan bakımı ve Kullanıcı Komitesi tarafından sürdürülmüştür. - Farelerin günlük ilerlemesini vücut ağırlığı (mikrogram dengesi kullanarak), Akut Viral ensefalit benzeri hastalık (Bölüm 2 ' de açıklandığı gibi hastalık skorlamasına göre) ve hayatta kalma oranı9,10,11 ile değerlendir ,12,13,14,15.
2. hastalık skorlama
- Akut viral ensefalitis benzeri hastalıkların notunu izleyin. Sağlıklı fareler için 0 puan atayın; 1 küçük hastalıklar belirtileri ile fareler, kilo kaybı dahil, hareketlilik azaltılmış, ve bir kambur vücut yönü; limbik nöbet sergileyen fareler 2; 3 fareler için sergi limbik zayıflık, zorluk ve anterior ekstremite veya posterior ekstremite zayıflık ile hareket dahil; 4 felç için; ölüm için 5.
Not: Puan 3 ulaştığında, hastalık belirtileri hızla gelişen olarak kabul edilir. - Her grupta günlük test puanlarının ortalama ± SD 'yi kullanarak, her gün eğri bazlı bir rakam olarak, adım 2,1 ' e göre hastalığın puanlamasını çizin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dang patogenezi için hastalarda şiddetli Dang humması ile ilişkili nörolojik komplikasyonlar bildirilmiştir4. Bu vakalar klinikte nadir olmasına rağmen, DENV enfeksiyonunun immünoyetenekli bir duvar modeli oluşturmak sadece immünopatogenezi incelemek için değil, aynı zamanda CNS enfeksiyonu, nöroinflamasyon, nörotoksisite ve akut viral ensefalitis benzeri bir hastalık. Bu çalışmada, mevcut modelimize göre9,10,11,12,13,14,15, 7 gün eski ICR Suckling fareler aşı edildi DENV2 ile aynı anda bir intraserebral mikroenjeksiyon (2,5 x 105 PFU) ve intraperitoneal enjeksiyon (7,5 x 105 PFU) (Şekil 1). Enfeksiyonun ardından, denv enfekte beyinde dsrna replikasyonu, viral protein ifadesi ve virüs salınmasının varlığını göstermek için sayısız analizler yaptık9,10,11,12 ,13,14,15. Bu deneyler, DENV enfeksiyon, çoğaltma ve Release başarılı bir in vivo modeli kuruldu göstermiştir.
Akut viral ensefalitis gibi hastalıkların indüksiyonu değerlendirmek için9,10,11,12,13,14,15, biz değişiklikleri izlenen DENV enfekte fareler vücut ağırlığı. Sahte grupta vücut ağırlığı değişimleri ile karşılaştırıldığında (fareler sadece RPMI orta ile aşı edildi), Şekil 2 taklit grubunda bir artış ancak önemli bir (P < 0,01) enfekte fareler vücut ağırlığı azalma gösterir. Ensefalit gibi hastalıkların semptomlarına göre, Kambur duruş dahil, limbik nöbet, limbik zayıflık, felç, ve ölüm, denv enfekte fareler içinde tezahür olarak, Şekil 3 önemli bir gösterir (P < 0,05) artış DENV enfekte fareler klinik puanı. Şekil 4 ' te hayatta kalma TAHLILI, denv enfekte farelerin hayatta kalma oranında (P < 0,001) zamana bağlı bir azalma gösterir. Veriler, akut viral ensefalitis benzeri hastalıkların ilerlemesini gösteren CNS 'de DENV 'in bulaşıcı bir modelinin kurulmasını gösterir.
Resim 1: Suckling fareler içinde Dang virüse (DENV) enfeksiyon Için deneysel tasarım. Yedi gün süren ICR Suckling fareler eşzamanlı intrakranial ve intraperitoneal enjeksiyonları ile DENV2 PL046 ile aşı edildi. Biz vücut ağırlığı, hastalık puanı ve mortalite değişiklikleri ölçülmüştür. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: Dang virüse (DENV) enfeksiyon sırasında süt farelerinde vücut ağırlığı. İçinde DENV2-enfekte ıCR Suckling fareler (n = 12), vücut ağırlığı değişiklikleri gün başına ölçüldü. Wilcoxon imzalı Rank testini takiben değerler ortalama ± SD olarak sunulur. * *p < 0,01. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: Dang humması (DENV) enfeksiyonunun içinde emziren farelerde ensefalitik hastalık puanı. ICR Suckling fareler (n = 12) içinde DENV2 enfeksiyonunun ardından, Kambur duruş için klinik puanlarında zaman kinetik değişiklikler (puan 1), limbik nöbet (skor 2), limbik zayıflık (skor 3), felç (skor 4), ve ölüm (skor 5) ölçülmüştür. Wilcoxon imzalı rütbe testini takiben, değerler ortalama ± SD olarak sunulur. *p < 0,05. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: Dang virüse (DENV) enfeksiyon sırasında süt farelerinde hayatta kalma oranı. Hayatta kalma oranlarında zaman kinetik değişiklikler DENV2-enfekte ıCR Suckling fareler (n = 12) olarak ölçülmüştür. Bir günlük Rank testi takiben, değerler ortalama ± SD olarak sunulur. * * *p < 0,001. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Şiddetli Dang hastalığı hastalarının CNS 'inde denv enfeksiyonu tespit edilmiştir3,17, Dang patogenezi sırasında akut viral ensefalitin tezahürü olasılığını düşündürmektedir. Burada, özellikle DENV kaynaklı akut viral ensefalitis benzeri hastalıklara odaklanarak, şiddetli Dang CNS disfonksiyonunun katılımı ile ilgili olarak DENV enfeksiyonunun bir in vivo murine modelini bildiriyoruz. Önceki modeller ile karşılaştırıldığında, özellikle tek rota enfeksiyonu için (sadece intravenöz, intraperitoneal sadece, ya da intrakerebral), son derece yüksek bir titresi (1 x 108 PFU) denv bağışıklık sistemi farelerde kullanılır. Ancak, bağışıklık güvenliği tehlikeye fare, nispeten düşük ama varyant titresi (1 x 105 için 1 x 108 PFU) denv yapılabilir18,19,20. Bu çalışmada, iki-rota enfeksiyon eşzamanlı CNS ve sistemik enfeksiyon için düşük bir titresi (intrakranial: 2,5 x 105 PFU; intraperitoneal: 7,5 x 105 PFU) denv için immunemsif ICR Suckling fareler ile neden kullanılır. Ensefalit benzeri hastalığın ilerlemesi tamamen tekrarlanabilir9,10,11,12,13,14,15 . Bu çalışmanın olası sınırlaması, eşzamanlı intrakranial ve intraperitoneal enjeksiyon kullanılarak azaltılır. Yapay olmasına rağmen-ancak, diğerleri tarafından önceki eserler ile tutarlı5,6,7,8 ve US9,10,11, 12,13,14,15-denv aktif deneysel murine beyin çoğaltılır9,10,11, 12 tane , 13 ' ü , 14 , 15, ve viral faktörlerin olası etkileri ve nöroinflamasyon ana tepkiler, yanı sıra nörotoksisite, bu nedenle, ilgi vardır.
Neuropathogenesis için, nöronal hücre apoptoz stimülasyon denv enfeksiyonu yanı sıra CNS inflamasyon tarafından tetiklenir, mikroglial Hücre aktivasyonu gibi proinflamatuar sitokin tümör nekroz Factor-α (TNF-α) üretim8, 12,15. DENV enfeksiyonunun neden olduğu doğrudan nörotoksisite ve ev sahibi immün tepkiler tarafından başlatılan dolaylı nöroinflamasyon, Dang ensefaliti içinde yer almak için spekülasyonudur. Akut viral ensefalitis beyin inflamasyon virüs kaynaklı CNS nedeniyle oluşur3,21. Yaygın klinik belirtiler yüksek ateş, baş ağrısı, sert boyun ve sırt, kusma, ve karışıklık, şiddetli durumlarda da nöbetler, felç ve koma21geliştirirken. Kambur duruş, limbik nöbet, limbik zayıflık, felç ve ölüm ile puanlarda değişiklikleri izleyerek, bu hastalıkların gelişimi denv-enfekte fareler akut viral ensefalitis benzeri hastalığın ilerlemesini gösterir9, 10 ' dan fazla , 11 ' i , 12 tane , 13 ' ü , 14 , 15. genel olarak, bu denv-enfekte fareler bir puan ile 3 (hastalığın Puanlama yöntemi protokolde sunulan göre) hızla felç ve ölüme ilerlemiştir. Bu hastalıklara neden olan patojenik mekanizmalar daha fazla soruşturma gerektirir; Ancak, nöropati indüksiyon takip nöronal disfonksiyon21dahil olduğunu spekülasyonlar. Viral çoğaltma hedefleme, yanı sıra TNF-α-aracılı CNS inflamasyon10,11,12,13,14, kısmen en azından, karşı terapötik etkileri confers Dang humması ile ilişkili akut viral ensefalitis benzeri hastalığın ilerlemesi. Bu çalışmanın protokolü, DENV enfeksiyonunun bir ensefalitis benzeri patolojik modeli oluşturmak için kullanılabilir.
Bazı çalışmalar beyinde denv enfeksiyonu ile indüklenen intrakerebral kanama indüksiyonu nitelendirdi22,23. Daha önce DENV enfekte fareler BBB bozulma indüksiyon gösterdi9. DENV bir nörootropik virüs olarak tanınmıyor olsa da, DENV in vivo ve in vitro8,11nöronal hücrelerde etkili bir enfeksiyon üretebilir. Dopamin D2 reseptörü (D2R) DENV enfeksiyonu için nöronal reseptör olarak spekülasyona ve farmakolojik hedefleme D2R etkili nöronal hücrelerde in vivo ve in vitro DENV enfeksiyonu azaltır, yanı sıra DENV kaynaklı ensefalitik hastalıklar11, 24oldu. Akut viral ensefalitlere karşı olası terapötik Stratejiler, nörolojik komplikasyonlara sahip şiddetli Dang humması vakalarının tedavi edilebilmesi için önemlidir. Gelecekteki uygulaması için, beyinde DENV enfeksiyonu kullanan bir hastalık modelinin bu protokolü sadece neuropathogenesis ile ilişkili viral ve ev sahibi faktörler değil, aynı zamanda olası antiviral ve anti-ensefalitik ilaçlar için bir in vivo platform haline gelebilir. DENV enfeksiyonu tarafından kaynaklanan varyant nörolojik bozukluklar insidansı ile ilgili25 bu kurulan protokol tarafından, değişken türleri ve/veya nörolojik disfonksiyon neden için denv suşları arasındaki fark doğrulama için gereklidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışmada bilim ve Teknoloji Bakanlığı (MOST107-2321-B-038-001) ve Intramural finansman 106TMU-CIT-01-2, Taipei, Tayvan hibe tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI) | Gibco | 11875-085 | Diluting virus |
| 0.3 mL Insulin Syringe | BD Ultra-FineII | 328838 | Intracerebral and intraperitoneal injection |
| Microbalance | METTLER TOLEDO's LabX | AL104 | Weight mouse |
| Non-adapted DENV2 (strain PL046) | The Centers for Disease Control of Taiwan | - | Infect mouse |
| Institute of Cancer Research (ICR) suckling mouse | BioLASCO Taiwan Co., Ltd | - | Our murine model |
References
- Guzman, M. G., Gubler, D. J., Izquierdo, A., Martinez, E., Halstead, S. B. Dengue infection. Nature Reviews Disease Primers. 2, 16055 (2016).
- Katzelnick, L. C., Coloma, J., Harris, E. Dengue: knowledge gaps, unmet needs, and research priorities. Lancet Infectious Diseases. 17 (3), e88-e100 (2017).
- Carod-Artal, F. J., Wichmann, O., Farrar, J., Gascon, J. Neurological complications of dengue virus infection. Lancet Neurology. 12 (9), 906-919 (2013).
- Geneva: World Health Organization. Dengue: Guidelines for Diagnosis, Treatment, Prevention and Control: New Edition. , WHO Guidelines Approved by the Guidelines Review Committee (2009).
- Amaral, D. C., et al. Intracerebral infection with dengue-3 virus induces meningoencephalitis and behavioral changes that precede lethality in mice. Journal of Neuroinflammation. 8, 23 (2011).
- de Miranda, A. S., et al. Dengue-3 encephalitis promotes anxiety-like behavior in mice. Behavioural Brain Research. 230 (1), 237-242 (2012).
- Velandia-Romero, M. L., Acosta-Losada, O., Castellanos, J. E. In vivo infection by a neuroinvasive neurovirulent dengue virus. Journal of Neurovirology. 18 (5), 374-387 (2012).
- Despres, P., Frenkiel, M. P., Ceccaldi, P. E., Duarte Dos Santos, C., Deubel, V. Apoptosis in the mouse central nervous system in response to infection with mouse-neurovirulent dengue viruses. Journal of Virology. 72 (1), 823-829 (1998).
- Tsai, T. T., et al. Microglia retard dengue virus-induced acute viral encephalitis. Scientific Reports. 6, 27670 (2016).
- Cheng, Y. L., et al. Activation of Nrf2 by the dengue virus causes an increase in CLEC5A, which enhances TNF-alpha production by mononuclear phagocytes. Scientific Reports. 6, 32000 (2016).
- Ho, M. R., et al. Blockade of dengue virus infection and viral cytotoxicity in neuronal cells in vitro and in vivo by targeting endocytic pathways. Scientific Reports. 7 (1), 6910 (2017).
- Jhan, M. K., et al. Anti-TNF-alpha restricts dengue virus-induced neuropathy. Journal of Leukocyte Biology. 104 (5), 961-968 (2018).
- Kao, J. C., et al. The antiparasitic drug niclosamide inhibits dengue virus infection by interfering with endosomal acidification independent of mTOR. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (8), e0006715 (2018).
- Tsai, T. T., Chen, C. L., Tsai, C. C., Lin, C. F. Targeting heat shock factor 1 as an antiviral strategy against dengue virus replication in vitro and in vivo. Antiviral Research. 145, 44-53 (2017).
- Jhan, M. K., et al. Dengue virus infection increases microglial cell migration. Scientific Reports. 7 (1), 91 (2017).
- Benskey, M. J., Manfredsson, F. P. Intraparenchymal Stereotaxic Delivery of rAAV and Special Considerations in Vector Handling. Methods in Molecular Biology. , 199-215 (2016).
- Fong, C. Y., et al. Mild encephalitis/encephalopathy with reversible splenial lesion (MERS) due to dengue virus. Journal of Clinical Neuroscience. 36, 73-75 (2017).
- Sarathy, V. V., et al. A lethal murine infection model for dengue virus 3 in AG129 mice deficient in type I and II interferon receptors leads to systemic disease. Journal of Virology. 89 (2), 1254-1266 (2015).
- Schul, W., Liu, W., Xu, H. Y., Flamand, M., Vasudevan, S. G. A dengue fever viremia model in mice shows reduction in viral replication and suppression of the inflammatory response after treatment with antiviral drugs. The Journal of Infectious Diseases. 195 (5), 665-674 (2007).
- Tyler, K. L. Acute Viral Encephalitis. New England Journal of Medicine. 379 (6), 557-566 (2018).
- Yauch, L. E., Shresta, S. Mouse models of dengue virus infection and disease. Antiviral Research. 80 (2), 87-93 (2008).
- Assir, M. Z., Jawa, A., Ahmed, H. I. Expanded dengue syndrome: subacute thyroiditis and intracerebral hemorrhage. BMC Infectious Diseases. 12, 240 (2012).
- Kumar, R., Prakash, O., Sharma, B. S. Intracranial hemorrhage in dengue fever: management and outcome: a series of 5 cases and review of literature. Surgical Neurology. 72 (4), 429-433 (2009).
- Simanjuntak, Y., Liang, J. J., Lee, Y. L., Lin, Y. L. Repurposing of prochlorperazine for use against dengue virus infection. Journal of Infectious Diseases. 211 (3), 394-404 (2015).
- Rocha, B. A. M., et al. Dengue-specific serotype related to clinical severity during the 2012/2013 epidemic in centre of Brazil. Infectious Disease Poverty. 6 (1), 116 (2017).
