Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

En dyb-sekventering-assisteret, spontane Suppressor skærm i Fission gær Schizosaccharomyces pombe

Published: March 7, 2019 doi: 10.3791/59133
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1Department of Biology, Wake Forest University, 2Center for Molecular Communication and Signaling, Wake Forest University

Summary

Vi præsenterer en enkel suppressor skærmen protokol i fission gær. Denne metode er effektiv, mutagen-fri og selektiv for mutationer, der ofte opstår i en enkelt genomisk locus.  Protokollen er velegnet til isolering af undertrykkerne, der lindre vækst defekter i flydende kultur, der er forårsaget af en mutation eller et lægemiddel.

Abstract

En genetisk skærm for mutante alleler, der undertrykker fænotypiske defekter forårsaget af en mutation er en kraftfuld metode til at identificere gener, der tilhører nærtbeslægtede biokemiske veje. Tidligere metoder såsom syntetiske genetiske matrix (SGA) analyse og tilfældig mutagenese teknikker ved hjælp af ultraviolet (UV) eller kemikalier som ethyl methanesulfonate (EMS) eller N-ethyl-N-nitrosourea (ENU), har været udbredt men er ofte dyre og besværlige. Disse mutagen-baseret screening-metoder er også ofte forbundet med alvorlige bivirkninger på organismen, inducerende flere mutationer, som føjer til kompleksiteten af afsondrethed undertrykkerne. Her præsenterer vi en enkel og effektiv protokol for at identificere suppressor mutationer i mutanter, der giver en vækst defekt i Schizosaccharomyces pombe. Fitness af celler med en vækst mangel hos standard rige flydende medier eller syntetiske flydende medier kan overvåges for genopretning ved hjælp af en automatiseret 96-brønd Pladelæser over en længere periode. Når en celle erhverver en suppressor mutation i kulturen, outcompete sine efterkommere dem af forældrenes celler. De gendannede celler, der har en konkurrencedygtig vækst fordel over forældrenes cellerne kan derefter isoleret og backcrossed med forældrenes celler. Suppressor mutationer er derefter identificeres ved hjælp af hele-genome sequencing. Brug denne fremgangsmåde, har vi med held isoleret flere undertrykkere, at afhjælpe de alvorlige vækst defekter forårsaget af tab af Elf1, en AAA + familie ATPase, der er vigtigt i nukleare mRNA transport og vedligeholdelse af genomisk stabilitet. Der er i øjeblikket over 400 gener i S. pombe med mutanter giver en vækst defekt. Som mange af disse gener er uncharacterized, foreslår vi, at vores metode vil fremskynde identifikationen af roman funktionel interaktioner med denne brugervenlige og høj overførselshastighed tilgang.

Introduction

Grundlag i forståelsen af funktionelle forbindelser mellem gener er afhængig af evnen til at identificere de molekylære mekanismer som komplekse genetiske egenskaber afviger for at producere forskellige fænotyper1. I fission gær, Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), er fleste af protein-kodning gener undværes for levedygtighed2. Dette resultat taler ikke til unimportance af disse gener, men snarere at de indviklede kompenserende mekanismer bag de biokemiske veje, hvortil hører sådanne gener. Dissekere disse kompenserende mekanismer har genereret epistasis kort, som har afsløret omfattende genetiske interaktioner og udvidet vores forståelse af funktionelle biokemiske veje3,4.

Høj overførselshastighed metoder (fx syntetisk genetiske matrix analyse eller SGA) er blevet udviklet for at identificere genome-wide genetiske interaktioner i spirende gær, og er blevet udvidet til brug i fission gær5,6. Sådanne tilgange er ofte afhængige af et bibliotek af stammer, der indeholder alle levedygtige enkelt protein-kodning gen sletninger (omkring 3.300 haploide sletning mutanter dækker over 92% af fission gær genom), og kræver en robotarm til at udføre de genetiske krydsninger mellem de stamme af interesse og alle mulige stammer i library6. Yderligere, SGA teknikker afhænger bibliotek stammer evne til at have ordentlig og effektiv parring, en fænotype, der er unormalt at 444 i øjeblikket kendetegnet gener i S. pombe2.

På trods af kompleksiteten af genetiske interaktioner, sammenligne Fænotypen af en stamme bærer mutationer i to gener på fænotype af to stammer transporterer enkelte mutationer af hvert gen kan have en af to bemærkelsesværdige resultater: 1) dobbelt mutant fænotype er værre end den forventede multiplikativ forældrene fænotyper i form af sygdom eller i de mest ekstreme tilfælde, dødelighed. Dette omtales som en negativ genetiske interaktion, og er generelt et tegn på, at de to gener handle i parallelle biologiske veje. 2) dobbelt mutant fænotype er bedre end den forventede kombination af forældrenes fænotyper, også kendt som en positiv genetiske interaktion. En positiv genetiske interaktion er særlig interessant, fordi det angiver, at disse gener fungerer i den samme proces. To positivt interagerende gener har tre potentielle relationer: en mutant gen kan op-regulere udtryk af genet i et parallelt forløb, de to gener kan arbejde i koncerten inden for den samme vej nedstrøms af hinanden eller de to gener indkode proteiner, der interagerer direkte med hinanden. Derfor kan positivt genetisk interaktioner bruges til at knytte gen administrative knudepunkter og klassificere uncharacterized gener i biokemiske veje7,8.

En suppressor er en mutation, der kan lindre sygdom Fænotypen af mutation af et andet gen, der typisk repræsenterer en positiv genetiske interaktion mellem to gener9,10. Suppressor mutationer på en anderledes locus fra, af de undertrykke-mutationen er kendt som extragenic undertrykkere. De er særligt værdifulde i at studere ikke-levedygtige genetiske mutationer af syntetisk redning dødbringende fænotype (også kendt som Lazarus effekten)11. De har også potentielle terapeutiske anvendelser i behandling af arvelige sygdomme12,13.

Af alle disse grunde, har identifikation af suppressor mutationer i forskellige modelorganismer udnyttet bredt for at lette forståelsen af forskellige biokemiske veje14,15,16. Screening for undertrykkerne er normalt baseret på Fænotypen af den pågældende mutation og kræver udførelse tilfældig mutagenese for at isolere de mutationer, der ville afhjælpe fænotype. Næsten alle modelorganismer har etableret tilfældig mutagenese metoder. For eksempel, N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) og ethylmethanesulfonate (EMS), to mutagener, der er i stand til at inducere punkt mutationer i DNA, er almindeligt anvendt i forskellige modeller fra bakterier til mus17,18,19 . Derudover har mangan chlorid længe været anvendt i gær for mangan kation evne til at hæmme DNA reparation veje20. En anden fælles tilgang er UV-induceret mutagenese, som genererer genome-wide mutagene pyrimidin dimerer21,22.

Udnyttelse af kemiske mutagenese at identificere suppressor mutationer har været populære, har metoden mange ulemper, herunder brugen af farlige kemikalier, meget varierende succes satser og indførelsen af ekstra konfunderende variabler præsenteret af de negative bivirkninger af mutagen på flere cellulære processer23,24. Derudover inducerer kemiske mutagenese ofte flere mutationer i genomet, som tilføjer kompleksitet ved hjælp af genetiske og sekventering teknikker til at identificere den nøjagtige mutation, der tillægges suppressor fænotype i organismen25.

For at afhjælpe manglerne i nuværende mutagenese tilgange, præsenterer vi en metode til skærmen for spontan suppressor mutationer i fission gær, der ikke stole på nogen mutagene eller en sletning bibliotek. Metoden isolerer overspændingsbeskyttere gennem en positiv markering assay. Princippet om denne metode er baseret på vækst fordel af muterede suppressor delpopulation i den flydende kultur, som kan blive overvåget af en automatiseret pladelæseren. Mating og meiose bruges kun, hvis man gerne vil rydde op i den genetiske baggrund eller bekræfte tilstedeværelsen af monogene alleler af undertrykkerne før hele-genome sequencing. Hvis den undertrykkelse fænotype er forårsaget af en enkelt mutation, adskille suppressor fænotype 2:2 efter tilbagekrydsning med forældrenes stammer. Suppressor mutationer kan derefter identificeres ved hjælp af hele-genome sequencing. Vi foreslår, at denne metode kan anvendes til screening undertrykkere i alle mikroorganismer, der kan vokse til en stor befolkningsgruppe i flydende kultur.

Protocol

1. strain konstruktion og forberedelse

  1. Generere en mutation eller en sletning af genet (yfm, din favorit mutation) ved hjælp af standard site-directed mutagenese (SDM), som tidligere beskrevet26.
  2. Før du starter skærmen, backcross (optimalt) mutantstammen med en wild-type belastning at rengøre den genetiske baggrund og generere frisk-født muterede celler som de parental stammer. Stribe af forældrenes stamme til enkelte kolonier på standard rig medier plader. Tilfældigt vælge otte til seksten uafhængige kolonier (biologiske replikater) med de ønskede mutationer for plade læser analysen (jf. punkt 3.1).
    Bemærk: Denne protokol er effektiv, når de parental stammer har en vækst defekt i flydende medier (minimal eller rige, med eller uden narkotika eller med temperatur Skift, der forårsager vækst defekt). Alle forældre stammer bør haploide og således kunne være genetisk krydset med andre haploide stammer med en supplerende parring type.

2. plade læser assay

  1. Med en steril applikator, tage en lille mængde af hver af de kolonier, der er udarbejdet i trin 1.1 (ingen nøjagtige beløb skal podes start kultur) og placere i en 96-brønd polystyren mikrotiterplade. Suspendere hver af kolonier i 200 µL af passende flydende medier (rig eller minimal, med eller uden narkotika). Omfatte en blindprøvebrønd for hver række på pladen som indeholder 200 µL af de samme medier (ingen celler).
  2. Kør følgende protokol på en plade læser afsløring software tilsluttet en automatiseret mikrotiterplade-læser: sætte en kinetisk program for 24 h og temperatur på 30 ° C, med kontinuerlig hurtigt orbital ryster (425 cpm, 3 mm amplitude). Sæt de optisk læser at måle lysspredningen ved en bølgelængde på 600nm for optisk tæthed, og sæt lys at læse fra under pladen med en læsning hyppighed på 2 min (721 samlede læsninger over en 24-h periode pr. brønd).
  3. Efter 24 timer, registrerer de endelige blændede absorbansaflæsningerne (blændede OD600) og brug følgende formel til at bestemme lydstyrken for at udvande hver af prøverne til OD = 0,1:
    Equation
    Bemærk: Eksportere data fra plade reader-software og bruge et regneark software indsætte ovenstående formel, som en funktion til batch behandle fortyndingsvolumen skal anvendes fra hver eksperimentelle brønd.
  4. Hver 24 h, fortyndes hver af prøverne ved hjælp af de samme medier som dag 0 til OD = 0,1 (ca 1.5 x 106 celler/mL) ved hjælp af formlen er angivet i trin 2.3. Gem alle vækst kurver genereres dagligt og Bemærk eventuelle individuelle koloni, der viser en øget vækstrate, bedømt ved en afsluttende OD, som er betydeligt højere end resten af kohorten med den samme genetiske baggrund eller en vækstkurve, der svarer til den Wild-type kolonier.
    Bemærk: Denne analyse tager normalt omkring 7-14 dage. Udfør alle trin under sterile forhold.

3. udvælgelse af suppressor kolonier og bekræftelse af fænotype.

  1. Fra den sidste dag i plade læser assay (trin 2.4), gemme de flydende kulturer, der har en mærkbart gendannede vækstrate, formentlig ved at få en suppressor mutation, der kan afhjælpe Fænotypen af forældrenes mutationen. Overføre og bland 250 µL flydende kultur til en cryotube, der indeholder 250 µL af 50% glycerol. Flash fryser cellerne i flydende nitrogen og gemme stammer i - 80oC på ubestemt tid.
  2. For at bekræfte, at suppressor mutation er en genetisk arvelig element, bruge standard genetiske passage metoder for at krydse yfm Pedersen (for forældreorlov, stammen, der bruges i begyndelsen af pladen læser analysen) med yfm S (for suppressor, den stamme, der er gemt i slutningen af plade læser analysen). Hvis suppressor mutation er en genetisk arvelig element, bør yfm P × yfm S give firklange hvor to kolonier har sygdom Fænotypen af forældrenes stammen og to kolonier har den gendannede vækstrate for suppressor stamme.
  3. Fra tværs af trin 3.2, vælge tre kolonier med suppressor fænotype (S stamme) og tre kolonier med forældrenes fænotype (P stamme) fra den samme genetiske cross (3 biologiske flergangsbestemmelser for hver), og Fortsæt med den genomisk DNA-ekstraktion og sekventering trin nedenfor.
    Bemærk: Trin 3.2 og 3.3 er stærkt anbefales, men kræves ikke. Alternativt kan en spredt gendannede flydende kultur indsamlet fra 3.1 på rigt medie til enkelt kolonier, så tilfældigt vælge tre kolonier som biologiske tre for hele-genome sequencing uden yderligere genetisk bekræftelse. I dette tilfælde bør tre biologiske tre af forældrenes stamme anvendes for genomisk sekventering sammenligning.

4. genomisk DNA udvinding, bibliotek produktion og sekventering.

  1. For DNA udvinding, bibliotek forberedelse og sekventering, tilfældigt vælge tre biologiske replikater pr. yfm P stamme, og tre biologiske replikater af hver individuelt opstået yfm S stammer fra de genetiske Kors (trin 3.2) eller fra den plader, der er blevet spredt for at opnå indre kolonier af S-stamme (trin 3.3 note).
  2. Vokse stammer i 10 mL kulturer i rige medier til midten log fase (OD = 0,5-0,8, om 0,75-1,2 x 107 celler/mL), og bruge en rystende inkubator til at vokse flydende kulturer ved 30 ° C under konstant omrystning ved 250 omdrejninger i minuttet. Indsamle celler ved centrifugering ved 4 ° C i 5 min ved 1000 x g.
  3. Suspendere pelleted celler i 400 µL DNA ekstraktionsbuffer (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl (pH 8.0), 1 mM Na2-EDTA), derefter tilføje 400 µL af glasperler og 400 µL 25:24:1 phenol: chloroform: isoamyl alkohol. Vortex kraftigt i 2 min. ved 4 ° C.
  4. Tilføje en ekstra 200 µL DNA ekstraktionsbuffer og blandes ved at vende flere gange. Der centrifugeres i 5 min. ved 4 ° C på 20.000 x g.
  5. Overføre den vandige fase til en ren rør, tilføje 20 µg af RNase A/T1 mix, og der inkuberes ved 37 ° C i 15 min.
  6. Tilføje et lige saa stort volumen af 25:24:1 phenol: chloroform: isoamyl alkohol, spin i 5 min. ved 4 ° C på 20.000 x g, derefter overføre den vandige fase til en ren rør.
  7. Tilføje et lige saa stort volumen af chloroform, blandes ved at vende flere gange, så spin i 5 min. ved 4 ° C på 20.000 x g, så overføre den vandige fase til en ren rør.
  8. Bundfald DNA med to bind af 100% ethanol plus 10% volumen af 3 M NaOAC (pH 4.3) ved-20 ° C i mindst 2 timer, derefter spin i 5 min. ved 4 ° C på 20.000 x g og indsamle pelleten.
  9. Vaske pellet (udfældet DNA) to gange med kølet 70% ethanol (Centrifuge på 20.000 x g, 5 min, 4 ° C) og suspendere pellet i 50 µL af 10 mM Tris Buffer (pH 7,4).
  10. Brug en bibliotek prep kit (Se Tabel af materialer) pr fabrikantens anvisninger til at forberede det hele-genome sequencing bibliotek.
    Bemærk: Vi anbefaler det kit, der er anført i Tabel af materialer , fordi det giver mulighed for opførelsen af det genomiske biblioteket uden PCR-amplifikation, som minimerer fejl mutationer genereret under PCR-amplifikation. Derudover forberedelsen genomiske biblioteket ikke tillade perler til fuldt tør ved at forkorte perle tørretid til 1-2 min.
  11. For klipning parametre under udarbejdelsen, bibliotek, bruge en fokuseret sonikator (Se Tabel af materialer) og sæt pligt faktor til 20%, spidseffekt til 175 W, med 200 cykler pr. brast, og frekvens fejende mode ved 5.5oC til 6 ° C til 45 s. Alternativt, skal du bruge en DNA og chomatin klipning system (Se Tabel af materialer) med følgende indstillinger: 50% amplitude ved 4 ° C med pulse mode, 15 s på og 15 s off i 10 min, med en samlede behandlingstid på 20 min.
  12. Det er vigtigt at håndtere farlige materialer i dette trin med omhu. Konsultere de relevante sikkerhedsdatablade og institutionens miljø og sundhed og sikkerhed kontor for håndtering af NaOAC, ethanol, 25:24:1 phenol: chloroform: isoamyl alkohol og chloroform.
  13. Sekvens de resulterende genomisk biblioteker. Hele sekventering læser bør dække mindst tre gange af den hele genom med opløsning på en enkelt nukleotid rækkevidde. Parret-ended sekventering (eller nyeste teknologi) anbefales.

5. Bioinformatik analyse til identifikation af suppressor mutationer

  1. Udføre Bioinformatik analyse at fokusere på de genomiske ændringer, der er konsekvent blevet identificeret mellem forældre og undertrykt yfm stammer i alle biologiske replikater.
    Bemærk: Den komplette pipeline proces er beskrevet nedenfor, men derudover to klartekst BASH-script filer, fastq_to_vcf.sh og vcfprocess.sh, medtages som supplerende materiale til at vise eksempler på arbejdsprocessen fra forarbejdning af læser til VCF variant filer og forarbejdning og skæringspunktet mellem VCF filer, henholdsvis.
  2. Trim kort-læser ved hjælp af SHEAR (https://github.com/jbpease/shear) følgende kommandolinjer (alle andre indstillinger standard):
    shear.py--fq1 $FASTQ1--fq2 $FASTQ2--out1 $OUTFQ1--out2 $OUTFQ2 \
    --barcodes1 $BARCODE--platform TruSeq--trimqual 20:20 \
    --trimpolyat 0--trimambig--filterlength 50 - filterunpaired
  3. Kort læser til S. pombe reference genom v2.30 fremstillet af PomBase (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/pombase/pombe/Chromosome_Dumps/fasta/) ved hjælp af BWA v0.7.1527. Brug følgende kommando linje (alle andre indstillinger standard):
    BWA mem -t 8 $GENOME $OUTFQ1 $OUTFQ2 > $SAM1
  4. Sætte justering SAM filer gennem GATK pipeline bedste praksis28 til variant kald ved hjælp af GATK v3.629, PicardTools v2.5.0 (http://broadinstitute.github.io/picard) og SAMtools v1.3.130. Brug følgende kommandolinjer og parametre (alle andre indstillinger standard):
    Java-Xmx30g-jar picard.jar AddOrReplaceReadGroups INPUT = $SAM1 \
    OUTPUT = $BAMMARKED RGID = 1 RGLB = lib01 RGPL = illumina \
    RGPU = $BARCODE RGSM = $SAMPLENUMBER
    samtools fixmate - O bam $BAMMARKED $BAMFIXED
    samtools sortere - O bam -o $BAMSORTED -T /home/peasejb/tmp $BAMFIXED
    samtools indeks $BAMSORTED
    Java-Xmx30g-jar GenomeAnalysisTK.jar -T HaplotypeCaller \
    -R $GENOME-jeg $BAMSORTED--genotyping_mode opdagelse \
    -stand_emit_conf 10 - stand_call_conf 30 -o $VCFRAW
  5. Komprimere og indeks VCF filer ved hjælp af tabix:
    bgzip $VCFRAW.vcf
    tabix $VCFRAW.vcf.gz
  6. Sammenlign VCF filer blandt forældre og suppressor stammer sekventering replikater ved hjælp af BCFtools v1.3.127. Brug følgende kommandolinjer og parametre (alle andre indstillinger venstre standard):
    bcftools isec - n + 1 $VCFPARENTAL1.gz $VCFPARENTAL2.gz $VCFPARENTAL3.gz \
    $VCFMUTANT1.gz $VCFMUTANT2.gz $VCFMUTANT3.gz > common_variants.list
    Bemærk: Denne kommando givet en fil kodet med binære mønstre hvor sekvens varianter vises i den første mutant kun ville være binær-kodet som "000100", den anden mutant kun som "000010", alle tre mutanter som "000111," osv. Disse filer blev oprettet for hvert sæt af forældrenes og mutant replikere VCF filer.
  7. Kompilere filerne variant skæringspunktet liste fil navn føjes til hver linje ved hjælp af UNIX grep kommandoen:
    GREP "." *.list > all.list
  8. Sammenholde den fuldstændige variant liste med den nuværende GFF3 anmærkning fil (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/pombase/pombe/Chromosome_Dumps/gff3/schizosacchar omyces_pombe.chr.gff3) ved hjælp af en brugerdefineret Python script (variant_characterize.py) at identificere konsistente SNP websteder i protein-kodende regioner (synonym og ikke-synonymt), 5 ' og 3 ' UTRs og ncRNA.
    python3 variant_characterize.py--liste common_variants.list \
    --gff schizosaccharomyces_pombe.chr.gff3 \
    --fasta Schizosaccharomyces_pombe. ASM294v2.30.DNA.Genome.FA \
    --mønster 000100 - ud all.list.filter.000100
    Gentag dette script ændre--mønster og suffikset for output-fil (--ud) ved hjælp af binært
    mønstre: 000010, 000001, 000110, 000011, 000101 og 000111
  9. Kombinere output fra alle disse script kører i en tabulatorsepareret fil, skal ses som et regneark. Tabellen kommenteret af varianter omfatter dem, der vises i én eller begge mutant stammen eller stammerne i forhold til baggrunden. Den binære flagfelt angiver enten udseende i en enkelt mutant stamme (000100, 000010, 000001), to mutantstammen (000011, 000101, 000110), eller alle tre mutantstammen (000111).
  10. Analysere output kommenteret lister over varianter blev ikke fundet i forældrenes prøverne, men fundet i en, to eller alle tre mutant prøver. Anmærkningen betegner både genomisk placering og klasse af variant (synonym/ikke-synonymt i et kodende region, 3' / 5' UTR, ikke-kodende, osv.). Fra denne liste over kandidat mutationer, kan et eksempel på en stærkt relevante kandidater være en ikke-synonym kodning variant optræder konsekvent i alle tre stammer. En anden type af stærk kandidat ville være en ophobning af forskellige ikke-synonym eller formodede regulerende mutationer i mutantstammen opført tæt på hinanden eller inden for den samme gen.

Representative Results

Langsomt voksende mutanter Vis fænotypiske opsving i flydende kultur
Vi valgte tre mutanter involveret i en bred vifte af biologiske veje med en syg, langsomt voksende, fænotype: AAA familie ATPase Elf1, Histon Deacetylase Clr6 og Exon Junction kompleks komponent Fal1. Et wild-type belastning og stammer bærer mutationer af disse tre gener, der havde været backcrossed med vildtype stammer var stribede til enkelte kolonier, og 16 enkelt kolonier var tilfældigt udvalgt til at blive kulturperler i rige flydende medier ved hjælp af 96-brønd plade som beskrevet ovenfor. Vækstkurver af enkelte kolonier blev indspillet for det oprindelige tidspunkt (dag 0) og 6 dage med kontinuerlig overvågning ved hjælp af i pladelæseren. Som forventet, viser wild-type kolonier ingen mærkbare ændringer i deres vækstkurver hele eksperimentet31 (figur 1). Navnlig viser fire kolonier med elf1∆ baggrund og en fal1∆ koloni en dramatisk skift i vækst fra langsomt voksende til nogle varierende niveauer af vækst lignende eller tæt på wild-type kolonier. Alle clr6-1 mutanter vis dramatisk, en konsekvent fænotypiske opsving, vokser i et hurtigere tempo i slutningen af assay31 (figur 1). For at karakterisere de forskellige fænotyper, henviser vi til de oprindelige stammer, der er langsomt voksende som "P stammer" (eller forældrenes stammer) og stammer viser fænotypiske recovery som "S stammer" (eller undertrykt stammer). Bemærk venligst at figur 1 er et eksempel på en runde af screening eksperiment, og repræsenterer ikke de samlede ikke-supplerende overspændingsbeskyttere identificeret og sekventeret i følgende repræsentative resultater.

Fænotypisk opsving tilskrives arvelige træk
S. pombe kan vokse som en haploide i rige medier, men to haploide stammer med supplerende parring typer mate under kvælstof sult. Meiose i fission gær indebærer en runde af dobbeltarbejde efterfulgt af to runder af celledeling. Den seksuelle cyklus resulterer i dannelsen af fire haploide sporer transporterer det genetiske materiale fra den parental stamme med 2:2 adskillelse af genetiske egenskaber efter reglerne i klassisk mendelske genetik (figur 2A). Når der dyrkes på den samme plade for den samme mængde tid, bekræftet vi 2:2 adskillelse, når back-krydser alle undertrykt stammer (S stammer) med deres forældre stammer (P stammer), hvilket resulterede i 2 små (vækst defekt) og 2 store (suppressor fænotype) kolonier. Enkelte eksempler for undertrykt celler, elf1∆, clr6-1 og fal1∆ er vist i figur 2B. Vi har bekræftet, at alle isolerede S stammer bære en monogene genetiske element, der undertrykker den langsomt voksende Fænotypen af deres P stammer (data ikke vist).

Hele-genome sequencing identificerer korrekt suppressor mutationer
Som et eksempel anvendte vi parret-end hele genom sekventering til at identificere de genetiske elementer, der er ansvarlig for de fænotypiske opsving i elf1∆ S stammer. En mere fyldestgørende beskrivelse af dataanalyse er tilgængelige online31. Kort, vi ansat biologiske tre af to uafhængigt genererede elf1∆ P stammer og biologiske dubletter af fem ikke-supplerende grupper af elf1∆ S stammer, hvoraf hver indeholder forskellige undertrykkere. Efter vi fremstillet Bioinformatik analyse (6.1-10) en liste over kommenteret varianter, prioriteret vi visse klasser af varianter, der var relevante for vores analyse. Vi fokuserede på identifikation af konsekvent genomisk ændringer, der var identiske i alle de biologiske replikater af individuelle elf1∆ S stammer sammenlignet med deres forældre elf1∆ P stammer (fig. 3 og supplerende tabeller 1-4 ). Vi identificeret fem nonsynonymous ændringer på cd'er regioner i alle fem forskellige elf1∆ S stammer, herunder rli1 +, SPBPJ4664.02, cue2 + rpl2702 +. Både S-A1 og S-A2 indeholder muterede SPBPJ4664.02, selvom mutationerne opstår på forskellige aminosyrer. Fordi SPBPJ4664.02 er en lang gen (11,916 nukleotider) med hundredvis af gentagelser, har mutationerne ikke kunnet bekræftes ved at udføre PCR efterfulgt af sekventering. S-A3 indeholder en sletning mutant i rli1 , der er ensartet i begge biologiske dubletter. Men muterede ikke Co adskille med S fænotype i elf1∆ baggrund. Vi identificerede en cue2 mutant (cue2-1) i S-B1, med aminosyrer 396-400 mangler. S-B2 indeholder en rpl2702 mutant (rpl2702-1), som ændrer aminosyre startposition 45 fra glycin til aspartat31. Cue2-1 og rpl2702-1 blev bekræftet som elf1∆ undertrykkere, som vist nedenfor.

Genetisk bekræftelse af identificerede suppressor mutationer kontrollerer arveligheden af recovery fænotype
To af de identificerede nonsynonymous ændringer, cue2-1 og rpl2702-1, blev rekonstrueret i lab bruger standardprotokoller til site-directed mutagenese. Dobbelt mutant stammer cue2-1 elf1∆ Pedersen og rpl2702-1 elf1∆ P blev krydset med den gratis elf1∆ P stamme31 (figur 4). Hvis de nonsynonymous mutationer, identificeret gennem dette skærmbillede, var tilstrækkelige til at undertrykke elf1∆ Pedersen, ville derefter de resulterende firklange vise en 2:2 små til store forholdet i kolonierne som følge af de 4 sporer i hver tetrad. Faktisk, genetiske passage viste at de identificerede suppressor mutationer har succes med at undertrykke den langsomt voksende Fænotypen af elf1∆ Pedersen og er arvelige.

Figure 1
Figur 1: fænotypiske recovery kan overvåges ved at optage vækstkurver i en pladelæseren. Seksten enkelt kolonier af wild-type (WT), elf1∆, clr6-1og fal1∆ blev placeret i en 96-brønd plade. Vækstkurver blev indspillet over en periode på 24-Hansen og kolonier blev igen fortyndet dagligt i rige medier. Vækst defekt fremgår af den lave absorbans (OD) i slutningen af perioden 24 h dag 0. Fænotype gendannede stammer er dem, der viser en vækstkurve lignende, eller tæt på, at af vildtype perioden 24-h på dag 6. Fire kolonier af elf1∆, en koloni af fal1∆, og alle kolonier af clr6-1 viste forskellige niveauer af fænotypiske opsving efter 6 dage. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: genetiske passage kan bekræfte at de fænotypiske opsving tilskrives en enkelt arvelige allel. (A) når fission gær celler er udsat kvælstof sulter, to haploide celler med en supplerende parring type kan generere en zygote, som sporulates til at generere en tetrad af 4 sporer. Til forældrenes genetiske materiale vil adskille under meiose efter reglerne i mendelske genetik. (B) fænotype inddrives kolonier (mærket S, for undertrykt) med angivet forældrenes genotyper var back-krydset med deres gratis forældrenes koloni (som viser ingen fænotypiske opsving, mærket P, for forældrekontrol). Genetiske Kors viser 2:2 små (dårlig fitness) til store (gendannede fitness) kolonier demonstrere at de fænotypiske opsving er arvelige og kan tilskrives en enkelt genetiske element. Røde bokse er kolonier med suppressor allel, og blå bokse er kolonier med forældrekontrol-allel. Dette tal er blevet ændret fra Marayati et al., 201831. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: analyse af genome-wide sequencing data til at identificere genetiske elementer ansvarlig fænotypiske opsving. Tre biologiske replikater af to forældre "P" stammer (P-A og P-B), og to biologiske replikater af fem fænotype inddrives skiftede "S" stammer (S-A1, S-A2 og S - A3 inddrives fra P-A; S-B1 og S-B2 fra P-B), blev sekventeret og mutationerne var organiseret som en liste over hver enkelt mutation i den gendannede stamme i forhold til forældrenes stamme genom det stammer fra (f.eks. P-A vs. S-A1, osv.). Det samlede antal fundne mutationer på tværs af hele genomet af alle sådanne parvise sammenligninger var 660. Ialt 44 mutationer var identificeret når kun mutationer, der forekommer i begge biologiske replikater af samme "S" stamme blev valgt. Ud af 44 mutationer var 12 mutationer indsættelse/sletning (INDEL) eller ikke - synonym mutationer. Ud af 12 INDEL eller ikke-synonym mutationer, fem opstod i det protein kodende sekvens. De fem mutationer potentielt korrelerer med enkelt genetiske element ansvarlig for de fænotype gendannede stammer: en ikke-synonym mutation i SPBPJ4664.02 fundet i S-A1 og S-A2, INDEL i rli1 fundet i S-A3, INDEL i cue2 fundet i S-B1, og ikke-synonym mutationer i rpl2702 fundet i S-B2. Detaljerede sekvens oplysninger på mutationerne og filtrerede baggrunden er inkluderet i supplerende tabeller 1-4. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: bekræftelse af undertrykkerne identificeret gennem hele-genome sequencing. Resultater fra hele-genome sequencing blev bekræftet ved selvstændigt generering af mutationer og udføre genetiske krydser for at bekræfte fænotypiske inddrivelse ved at krydse en elf1∆ cue2-1 stamme med en elf1∆ P stamme, og elf1∆ rpl2702-1 med elf1∆ P stamme. Tre repræsentative lodret firklange er vist. Røde bokse er dobbelt-mutant kolonier (elf1 cue2-1, eller elf1 rpl2702-1); blå kasser er elf1∆ kolonier. Dette tal er blevet ændret fra Marayati et al., 201831. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende tabel 1. Venligst klik her for at downloade denne tabel. 

Supplerende tabel 2 . Venligst klik her for at downloade denne tabel. 

Supplerende tabel 3 . Venligst klik her for at downloade denne tabel. 

Supplerende tabel 4 . Venligst klik her for at downloade denne tabel. 

Supplerende kodning filer . Venligst klik her for at downloade filer. 

Discussion

Protokollen beskrevet her repræsenterer en roman og simpel skærm for spontan suppressor mutationer kan påvises gennem fænotypiske inddrivelse af mutationer giver langsom vækst i fission gær, en fænotype karakteristiske af over 400 gener i S. pombe, den funktion af mange af dem forbliver ukendt2,32. Tidligere metoder har taget andre tilgange til at screene for suppressor mutationer i mikroorganismer, herunder brugen af mutagener21, eller anvendelsen af et temperatur skift i temperatur-følsomme mutant baggrunde33. Derimod viser denne protokol, fænotypiske nyttiggørelsen sker uden yderligere miljømæssige/kemiske indblanding og fremhæver fitness fordel af stigende undertrykkelse mutationer i sidste ende at overtage de ressourcer til rådighed i væske kultur. Denne skærm lader isolering af både bypass overspændingsbeskyttere eller interaktion undertrykkerne, fordi det er effektivt til både tab af funktion mutationer som elf1∆ eller fal1∆ og punktmutationer såsom clr6-1, så længe mutanterne demonstrere fitness defekter i flydende kultur.

Hidtil har alle gendannede S stammer, som vi har undersøgt demonstreret varierende grader af fænotypiske opsving. Som registreret gennem genetisk passage, den gendannede fænotype tilskrives en enkelt genetisk element og er arvelige (eksempler vist i figur 2). Dette er en af de mest betydningsfulde fordele ved denne metode i forhold til kemikalie- eller UV-baserede suppressor skærme, som ofte målrette flere genomisk loci. Det er almindeligt at observere én eller to kolonier inddrives ud af 16 kolonier/stamme (omkring 10%) inden for en uge. Vi bemærkede imidlertid, at visse mutanter, såsom tab af funktion af Rrp6, nuklear-specifikke exosome underenheden, aldrig gendannet til den næsten vildtype vækstrate observeret i elf1Δ celler31. Det er sandsynligt, at funktionen af Rrp6 kun kan blive delvist opvejet af undertrykkerne, i modsætning til funktionen i andre mutanter testet, herunder fal1∆, som blev vist sig at forårsage en alvorlig meiotiske fejl gennem sin vigtige funktion i lovgivningsmæssige splejsning34. Vi mener, at alternative suppressor screening-metoder ville være underlagt det samme problem, når yfg er unikke, ikke-udskiftelig rolle i cellevækst.

Før du udfører genomisk sekventering, er det optimale til back-cross fænotype gendannede kolonierne, identificeret fra Pladelæser, med de forældre stammer til at klare den genetiske baggrund og få biologiske replikater. Derudover identificerer dybt hele-genome sequencing hundredvis af enkelt nucleotid ændringer, hvoraf de fleste ikke er ens mellem biologiske replikater, der er af begrænset interesse for screening. For eksempel, fandt vi i alt 660 genomisk ændringer på tværs af alle tre kromosomer mellem de to elf1Δ P og de fem forskellige S stammer (figur 3). Vi ikke almindeligt observere identiske mutationer mellem sekventeret biologiske replikater af hver stamme, tyder på, at enten nye mutationer kan opstå under dyrkning af elf1Δ celler før genomiske biblioteket konstruktion eller tilfældige fejl kan være indført under den bibliotek opbygning og sekventering. Derfor er isolerer mutationer, der er konsistent på tværs af biologiske replikater et vigtigt aspekt i den succesfulde identifikation af undertrykkerne bruger hele-genome sequencing.

Vi identificerede og bekræftet to undertrykkere i cd'er regioner i fem sekventeret S stammer. Selv om mutationer i SPBPJ4664.02 blev fundet i både S-A1 og S-A2 stammer, er det usandsynligt, at SPBPJ4664.02 er en gyldig suppressor, fordi S-A1 og S-A2 ikke indeholder en suppressor på samme gen som den ikke supplerende med hinanden ( data ikke vist). Vi også ikke bekræfte rli1 i S-A3, hvilket ikke Co adskille med S fænotype når backcrossed med elf1Δ. Alternativt, fandt vi specifikke mutationer i ikke-kodende regioner i S-A1, S-A2 og S-A3. Det er muligt, at disse ændrede ikke-kodende genomisk regioner afhjælpe elf1Δ fænotype, som vil blive behandlet i vores fremtidige undersøgelser. I forhold til traditionelle metoder såsom en kobling, analyse, som kan tage år at kortlægge en genetisk mutation, identificeret vi to overspændingsbeskyttere senest to måneder efter at have bekræftet, at en monogene element forårsaget S fænotype. Med den hurtige udvikling af hele-genome sequencing technology er vi optimistiske, at denne metode vil være mere effektivt at identificere konsistente genetiske mutationer i en overskuelig fremtid.

I Resumé giver denne protokol trinvise anvisninger for at med held identificere suppressor mutationer for enhver gene af interesse med en langsomt voksende defekt i flydende kultur. Enkelheden i dette assay tillader for den omfattende screening af flere genetiske baggrunde af interesse med lidt hands-on træning. Der er plads til yderligere automatisere processen ved hjælp af en flydende håndtering robot til at udføre de daglige fortyndinger. Da laboratoriet manipulation af mikroorganismer kræver nødvendigvis vækst i flydende kultur, en proces, der er i sagens natur selektiv til fitness, foreslår vi, at denne protokol kan anvendes bredt til andre store befolkning modelorganismer som bakterier og andre gær arter.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen angivelser af producenterne af de instrumenter, der anvendes i denne metode, og ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af den nationale Institute General Medical Sciences, tilskud 1R15GM119105-01-K.Z. Vi takker alle korrekturlæsere for indsigtsfulde kommentarer. Vi takker også James Tucker, Alicia Anderson, Elizabeth sort og Glen Marrs for diskussion og kommentarer på dette håndskrift.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenine, Powder Acros Organics 147441000 Use at 75 mg/L to make liquid and solid rich media (YEA)
Bacteriology Petri Dish Corning, Falcon C351029 100 ×15 mm, use to grow strains to single colonies on solid rich media
D-Glucose Anhydrous, Powder Fisher Chemical D16-1 Use at 30 g/L to make liquid and solid rich media (YEA)
Difco Agar, Granuated Becton, Dickinson and Co. 214530 Use at 20 g/L to make solid rich media (YEA)
DNA extraction buffer 2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl (pH 8.0), 1mM Na2-EDTA
Focused-ultrasonicator Covaris Inc. S220 Alternatively, use QSonica Q800R sonicator/DNA and chromatin shearing system
Gen5 Data Collection and Analysis Software Biotek, Inc. GEN5SECURE Or equivalent, must be compatible with the micro-plate reader, use to export data readings from the micro-plate reader
Hydrochloric Acid 1N, Liquid Fisher Chemical SA48-4 Use to adjust pH to 5.5 in liquid and solid rich media
Liquid Rich Media (liquid YEA) 30 g/L D-Glucose, 5 g/L Yeast Extract, 75 mg/L Adenine, pH adjusted to 5.5 with 1 M HCl
Microplate Reader, Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Reader Biotek, Inc. BTH1MG Or equivalent, must read visible light at 600 nm wavelength range
Rich Media agar plates (YEA plates) 30 g/L D-Glucose, 5 g/L Yeast Extract, 75 mg/L Adenine, 20 g/L Agar, pH adjusted to 5.5 with 1 M HCl.
RNase A/T1 mix Thermo Fisher Scientific EN0551 Use according to manufacturer recommendation
Sterile Polystyrene Inoculating Loop Corning, Inc. OS101 Or equivalent, use to transfer colonies from agar plates to 96-well plate
Sterile workspace and burners
Tissue Culture Plate, 96-well Optical Flat Bottom with Low Evaporation Lid Corning, Falcon C353072 Or equivalent, must have optical flat bottom for micro-plate ready
TruSeq DNA PCR-Free LT/HT Library Prep Kit Illumina, Inc. 20015962 Use to prepare the whole-genome sequencing library
Yeast Extract, Powder Fisher Chemical BP1422-500 Use at 5 g/L to make liquid and solid rich media (YEA)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McKay, J. K., Latta, R. G. Adaptive population divergence: Markers, QTL and traits. Trends in Ecology and Evolution. 17 (6), 285-291 (2002).
  2. Wood, V., Harris, M. A., et al. PomBase: A comprehensive online resource for fission yeast. Nucleic Acids Research. 40 (D1), (2012).
  3. de Visser, J. A. G. M., Cooper, T. F., Elena, S. F. The causes of epistasis. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 278 (1725), 3617-3624 (2011).
  4. Sailer, Z. R., Harms, M. J. Detecting high-order epistasis in nonlinear genotype-phenotype maps. Genetics. 205 (3), 107911088 (2017).
  5. Kuzmin, E., Costanzo, M., Andrews, B., Boone, C. Synthetic genetic arrays: Automation of yeast genetics. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (4), 326-332 (2016).
  6. Tong, A. H. Y., Boone, C. Synthetic genetic array analysis in Saccharomyces cerevisiae. Methods in Molecular Biology. 313 (1), 171-192 (2006).
  7. Dixon, S. J., Costanzo, M., Baryshnikova, A., Andrews, B., Boone, C. Systematic Mapping of Genetic Interaction Networks. Annual Review of Genetics. 43 (1), 601-625 (2009).
  8. Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. Exploring genetic interactions and networks with yeast. Nature Reviews Genetics. 8 (6), 437-449 (2007).
  9. Bai, X., Yang, Z., Jiang, H., Lin, S., Zon, L. I. Genetic suppressor screens in haploids. Methods in Cell Biology. , 129-136 (2011).
  10. Manson, M. D. Allele-specific suppression as a tool to study protein-protein interactions in bacteria. Methods. 20 (1), 18-34 (2000).
  11. Motter, A. E., Gulbahce, N., Almaas, E., Barabási, A. L. Predicting synthetic rescues in metabolic networks. Molecular Systems Biology. 4, 168 (2008).
  12. Peterson, R. T., Shaw, S. Y., et al. Chemical suppression of a genetic mutation in a zebrafish model of aortic coarctation. Nature Biotechnology. 22 (5), 595-599 (2004).
  13. Giorgini, F., Guidetti, P., Nguyen, Q., Bennett, S. C., Muchowski, P. J. A genomic screen in yeast implicates kynurenine 3-monooxygenase as a therapeutic target for Huntington disease. Nature Genetics. 37 (5), 526-531 (2005).
  14. Forsburg, S. L., Patton, E., et al. The art and design of genetic screens. Nature reviews. Genetics. 2 (9), 659-668 (2001).
  15. Johnston, D. S. The art and design of genetic screens. Genetics. 3 (March), 176-188 (2002).
  16. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: Caenorhabditis elegans. Nature Reviews Genetics. 3 (5), 356-369 (2002).
  17. Gocke, E., Müller, L. In vivo studies in the mouse to define a threshold for the genotoxicity of EMS and ENU. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 678 (2), 101-107 (2009).
  18. Suzuki, T., Hayashi, M., et al. A comparison of the genotoxicity of ethylnitrosourea and ethyl methanesulfonate in lacZ transgenic mice (Muta(TM)Mouse). Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 395 (1), 75-82 (1997).
  19. Uttam, J., Alberico, C., De Stasio, E. ENU Mutagenesis. International C. elegans Meeting. , (1995).
  20. Putrament, A., Baranowska, H., Ejchart, A., Prazmo, W. Manganese Mutagenesis in Yeast. Methods in Cell Biology. 20, 25-34 (1978).
  21. Bose, J. L. Chemical and UV mutagenesis. Methods in Molecular Biology. 1373, 111-115 (2016).
  22. Ikehata, H., Ono, T. The Mechanisms of UV Mutagenesis. Journal of Radiation Research. 52 (2), 115-125 (2011).
  23. Shrivastav, N., Li, D., Essigmann, J. M. Chemical biology of mutagenesis and DNA repair: cellular responses to DNA alkylation. Carcinogenesis. 31 (1), 59-70 (2010).
  24. De Stasio, E. A., Dorman, S. Optimization of ENU mutagenesis of Caenorhabditis elegans. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 495 (1-2), 81-88 (2001).
  25. Probst, F. J., Justice, M. J. Mouse mutagenesis with the chemical supermutagen ENU. Methods in Enzymology. 477 (C), 297-312 (2010).
  26. Bähler, J., Wu, J. Q., et al. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).
  27. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows – Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
  28. Van der Auwera, G. A., Carneiro, M. O., et al. From fastQ data to high-confidence variant calls: The genome analysis toolkit best practices pipeline. Current Protocols in Bioinformatics. 43, 11.10.1-11.10.33 (2013).
  29. Mckenna, A., Hanna, M., et al. The Genome Analysis Toolkit: A MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Research. 20, 1297-1303 (2010).
  30. Li, H., Handsaker, B., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  31. Marayati, B. F., Drayton, A. L., et al. Loss of Elongation-Like Factor 1 Spontaneously Induces Diverse, RNase H-Related Suppressor Mutations in Schizosaccharomyces pombe. Genetics. 209 (4), 967-981 (2018).
  32. Harris, M. A., Lock, A., Bähler, J., Oliver, S. G., Wood, V. FYPO: The fission yeast phenotype ontology. Bioinformatics. 29 (13), 1671-1678 (2013).
  33. Xu, X., Wang, L., Yanagida, M. Whole-Genome Sequencing of Suppressor DNA Mixtures Identifies Pathways That Compensate for Chromosome Segregation Defects in Schizosaccharomyces pombe. G3: Genes|Genomes|Genetics. 8 (3), 1031-1038 (2018).
  34. Marayati, B. F., Hoskins, V., et al. The fission yeast MTREC and EJC orthologs ensure the maturation of meiotic transcripts during meiosis. RNA. 22 (9), 1349-1359 (2016).

Tags

Genetik sag 145 suppressor mutation genetiske interaktion spontane fænotypiske opsving hele-genome sequencing Bioinformatik analyse fission gær
En dyb-sekventering-assisteret, spontane Suppressor skærm i Fission gær <em>Schizosaccharomyces pombe</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marayati, B. F., Pease, J. B.,… More

Marayati, B. F., Pease, J. B., Zhang, K. A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe. J. Vis. Exp. (145), e59133, doi:10.3791/59133 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter