Summary
Vi presenterar ett protokoll för snabb screening av miljöprov för siderophore potential bidrar till mikronäringsämnen biotillgänglighet och omsättning i terrestra system.
Abstract
Sideroforer (lågmolekylärt metall kelaterande föreningar) är viktiga i olika ekologiska fenomen alltifrån järn (Fe) biogeokemiska cykling i jordar, till patogen konkurrens, växt tillväxtfrämjande och cross-rike signalering. Sideroforer är dessutom också kommersiella intresset bioupplösning och bioweathering av metall-bärande mineraler och malmer. En snabb, kostnadseffektiv och robust innebär att kvantitativt bedöma siderophore produktion i komplexa prover är nyckeln till att identifiera viktiga aspekter av ekologiska konsekvenserna av siderophore verksamhet, inklusive, roman siderophore producerar mikrober. Metoden presenteras här har utvecklats för att bedöma siderophore aktivitet i i-takt mikrobiomet gemenskaperna, miljöprov, såsom jord eller växt vävnader. Proverna var homogeniserad och utspädd i en modifierad M9 medium (utan Fe) och anrikning kulturer inkuberades i 3 dagar. Siderophore produktion bedömdes i prover vid 24, 48 och 72 timmar (h) med en roman 96 brunnar mikroplattan CAS (Chrome azurol sulphonate)-Fe agar assay, en anpassning av traditionellt tråkiga och tidskrävande kolorimetriska metoden för att bedöma siderophore verksamhet, som utförs på enskilda odlade mikrobiell isolat. Vi tillämpade vår metod till 4 olika genotyper/linjer av vete (Triticum aestivum L.), inklusive Lewjain, Madsen, och PI561725 och PI561727 som ofta odlas i inlandet Pacific Northwest. Siderophore produktionen påverkades helt klart av genotypen av vete, och i de särskilda typerna av växt vävnader observerades. Vi har framgångsrikt använt vår metod att snabbt skärmen för påverkan av växten genotyp på siderophore produktion, en nyckelfunktion i terrestra och akvatiska ekosystem. Vi producerade många tekniska replikat, ger mycket tillförlitliga statistiska skillnader i jordar och inom växt vävnader. Ännu viktigare, visar resultaten den föreslagna metoden kan användas för att snabbt behandla siderophore produktion i komplexa prover med en hög grad av tillförlitlighet, på ett sätt som gör att samhällen att bevaras för senare arbete att identifiera taxa och funktionella gener.
Introduction
Sideroforer är viktiga biomolekyler deltar främst i järn-kelering för biotillgänglighet, men med ett brett utbud av ytterligare syften i terrestra och akvatiska ekosystem alltifrån mikrobiell quorum sensing, signalering till mikrobiell växt-värdar, växternas tillväxtfrämjande, samarbete och konkurrens inom komplexa mikrobiella samhällen1,2. Sideroforer kan grovt delas enligt deras aktiva webbplatser och strukturella funktioner, att skapa fyra grundläggande typer: bildas, hydroxamate, catecholate, och blandade typer3,4. Många mikroorganismer klarar av att utsöndra mer än en typ av siderophore5 och i komplexa samhällen, en stor majoritet av organismer biosynthesize membran receptorerna så att upptaget av ett ännu bredare utbud av sideroforer1, 6. Senaste arbete visar att sideroforer är särskilt viktiga på gemenskapsnivå, och även i Inter kungariket kommunikation och biogeokemiska överföringar7,8,9,10 ,11.
Chrome azurol sulphonate (CAS) har använts i över 30 år som en kelatbildare binda järn (Fe) på ett sådant sätt att tillägget av ligander (dvs. sideroforer) kan resultera i dissociation av CAS-Fe komplexet, skapa en lätt identifierbar färg förändringar på medellång 12. När the CAS är bundna med Fe, färgen visas som en royal blå färg och som CAS-Fe komplexet dissocierar, medellång ändrar färg beroende på typ av liganden som används för att rensa de Fe13. Den inledande, vätskebaserade medium som grundades 1987, av Schwyn och Neilands har ändrats på många sätt att rymma ändra mikrobiell mål14, tillväxt vanor och begränsningar15, samt en mängd olika metaller förutom Fe, inklusive aluminium, mangan, kobolt, kadmium nickel, litium, zink16, koppar17och även arsenik18.
Många mänskliga patogener, samt som växt tillväxt att främja mikroorganismer (PGPM) har identifierats som siderophore-producerande organismer3,19,20, och viktiga odlingsbädden och Endofytisk PGPM ofta testa positivt för siderophore-produktion4. Den traditionella Fe-baserade flytande metoden har anpassats till mikrotiter testning av isolat i odling för siderophore produktion21. Dock dessa tekniker inte inser vikten av mikrobiell gemenskapen som helhet (mikrobiomet), i samarbete och potentiella reglering av siderophore produktion i jordar och växt system22. Därför har vi utvecklat en hög genomströmning gemenskapsnivå bedömning av siderophore produktion från en viss miljö, baserad på den traditionella CAS-analysen, men med replikering, enkel mätning, pålitlighet och repeterbarhet i en mikroplattan assay.
I denna studie presenteras en kostnadseffektiv, hög genomströmning CAS-Fe-analys för att upptäcka siderophore produktion för att bedöma anrikningen av siderophore produktion från komplexa prover (dvs, mark och anläggning vävnad homogenates). Bulk, löst bundna och tätt-bundna odlingsbädden jord (i termer av hur jorden var bunden till roten) erhölls tillsammans med korn, skjuta och roten vävnader från fyra distinkta vete (Triticum aestivum L.) genotyper: Lewjain, Madsen, PI561725, och PI561727. Det antogs att grundläggande skillnader i de vete genotyperna kan leda till skillnader i rekrytering och urval av siderophore producerar samhällen. Av särskilt intresse är skillnaden mellan mikrobiella samhällen är associerad med PI561725 syngena linjen, vilket är aluminium toleranta eftersom det äger ALMT1 (aluminium-aktiverad Malate transportören 1), jämfört med aluminium känsliga PI561727 syngena line, som äger en icke-aluminium responsiv form av genen, almt123,24,25,26. Det främsta syftet med studien var att utveckla en enkel, snabb metod för att kvantitativt bedöma siderophore produktion i siderophore anrikning kulturer av komplexa provtyper samtidigt bevara kulturer för det framtida arbetet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: Plats i fältet plats: Washington State University, växt patologi Farm (46 ° 46' 38,0 ”N 117 ° 04' 57,4” W). Frön såddes med en mekanisk plantageägare på 19 oktober 2017. Varje vete genotyp planterades i headrows, cirka 1 meter isär för att undvika överlappning av rotsystemet. Växt och jord prover samlades på 9 augusti 2018, när plantorna var redo för skörd. Prover samlades från tre replikat av fyra vete genotyper: PI561727, PI561725, Madsen, Lewjain.
1. beredning av modifierade M9 medium
- Användning Na2PO4∙7H2O (12,8 g/200 mL), KH2PO4 (0,3 g/200 mL), NaCl (0,5 g/200 mL) och NH4Cl (1 g/20 mL) reagens att förbereda M9 saltlösningen.
- Använda 18 g MgSO4∙7H2O i 100 mL dubbel avjoniserat vatten (ddH2O) för att förbereda 0,75 M MgSO4∙7H2O.
- Gör 1 M CaCl2∙2H2O genom att lägga till 14,7 g CaCl2∙2H2O med 100 mL ddH2O.
- Bereda buffertlösningen genom upplösning 6.048 g av rör till 156 mL ddH2O under omrörning. Justera pH till 6,8 med 5 M NaOH.
- Förbereda 20% glukos (glukosmonohydrat) genom upplösning 20 g glukos i 100 mL ddH2O.
- Bered lösningar och individuellt autoklav alla men glukos. Filter sterilisera glukoslösning för tillägg till M9 media efter autoklavering (0,22 µm).
- Förbered det modifierade M9 mediet genom att blanda 156 mL rör buffertlösning, 40 mL M9 salter lösning, 20 μL av CaCl2·2H2O lösning och 266 μL MgSO4·7H2O 4 mL 20% glukos lösningar tillsammans i biosäkerhet skåp, med steril teknik.
- För bevarandet av den modifierade M9, försegla containern, täck med aluminiumfolie att skydda från UV- och placera vid 4 ° C.
2. beredning av CAS-Fe-agarsubstrat
- Syra tvätta allt glas i 100 mM HCl/100 mM HNO3 i minst 2 h före utnyttjande i CAS-analysen.
- Förbereda en aluminium bakplåt fylld med laboratorium grade sand och täck den med aluminiumfolie. Autoklav vid 121 ° C i 30 min och ställ åt sidan.
- Förbereda HDTMA (hexadecyltrimethylammonium bromid) genom att lägga till 0.0365 g 20 mL ddH2O och placera lösningen vid 37 ° C att främja lösbarhet.
- Förbereda 10 mM HCl och generera 1 mM FeCl3·6H2O använda 10 mM HCl som lösningsmedel. Tillsätt 0.0302 g CAS till 25 mL ddH2O samtidigt försiktigt under omrörning med en steril magnetiska rör bar. Tillsätt sedan 5 mL av 1 mM FeCl3·6H2O (i 10 mM HCl) till 25 mL av CAS lösning samtidigt som du försiktigt rör (de lösning förvandlas till mörk rödaktig svart färg).
- Tillsätt långsamt den 20 mL HDTMA lösning medan försiktigt under omrörning, i Fe-CAS lösningen (detta ger en mörkblå lösning).
- Bereda buffertlösningen genom upplösning 15.12 g av rör till 375 mL ddH2O, med skonsam omrörning. Justera pH till 6,8 med 5 M NaOH. Tillsätt vatten för att få volymen till 450 mL. Tillsätt 5 g agaros till lösningen. Autoklav RÖREN buffert lösning och CAS-Fe lösningen vid 121 ° C i 30 min.
- Tillsätt försiktigt helheten av CAS-Fe lösningen till hela rör bufferten i biosäkerhet skåp efter var och en av dem är autoklaveras.
- Placera den blanda lösningen i ett vattenbad vid 50 ° C.
Obs: Förbereda färska alla reagenser i CAS-Fe-Agar medium före varje analys, som långsiktig lagring på 50 ° C leder till utfällning av CAS-Fe komplexa och kylande resultaten i stelnad medium. - Placera en steril reagens båt i steril sand i biosäkerhet skåp och värme till 50 ° C. Överföra de CAS-Fe-Agar till båten och sedan snabbt alikvotens 100 µL till varje brunn i en tydlig, platt botten, sterila 96 brunnar mikroplattan.
3. Pyoverdine/EDTA standardpreparatet
- Pyoverdine beredning
- Förbereda 800 μM pyoverdine standard (blandning av bärnstenssyra, 2-hydroxi glutaramide och succinaminde former av pyoverdine – se Tabell för material), i tidigare beredda modifierade M9 medium.
- Späd ut denna lösning till 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 och 6,25 μM lösningar.
- EDTA standardpreparatet
- Tillsätt 0.594 g av dinatrium etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA: C10H14N2Na2O8.2H2O), till 500 mL tidigare beredda modifierade M9 medium att förbereda 3200 μM EDTA standard.
- Späd ut denna lösning till 1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 och 6,25 μM lösningar.
- Standardkurvan generation
- Tillsätt 100 μL av varje koncentration av pyoverdine och EDTA till separata brunnar i en 96 brunnar mikroplattan innehållande 100 μL av CAS-Fe agarsubstrat. Gör dubbla tekniska replikationer av varje koncentration. Också lägga till tomma brunnar med endast M9 (EDTA eller pyoverdine).
- Använder en microplate reader, mäta absorbans (vid 420 nm och 665 nm) efter 1, 6 och 24 h inkubation vid 22 ° C och Använd absorbansen mätningar att generera standard kurvor.
Obs: För 420 nm mätningar, subtrahera absorbansen av råämnen från absorbansen hos pyoverdine eller EDTA innehållande brunnar. För 665 nm, subtrahera absorbans pyoverdine eller EDTA innehållande brunnar från absorbans blankvärden. Sedan regredieras log10(µM pyoverdine eller EDTA) mot absorbansen mätningarna. För att underlätta tolkningen av provresultaten, använda absorbansen som x-axeln och logga10(µM pyoverdine eller EDTA) som y-axeln.
4. insamling av omgivningsprov: jord och växt vävnader
- Tvätta provtagningsutrustning (spadar och sax) med 0,22 µm filtreras ddH2O följt av 70% etanol och torka med hushållspapper innan provtagning och mellan prover att bibehålla steril teknik och minska förorening.
- Punktskatt växt vävnader (korn och skott) från växter i fältet, och placera dem i en märkt plast förvaringsväska, lämnar nog skjuta stubb för att underlätta i rötterna på önskad prover av jord och rot.
- Gräva en liten roten bollen ca 15 cm djupt och 23 cm breda och placera den i en separat, märkt plastpåse för provberedning i laboratoriemiljö. Detta steg är samma som metoderna av McPherson et al.27.
- Placera alla prover (korn, skott, bulk jord och rot bollar i separata påsar) direkt på is och hålla vid 4 ° C tills prover behandlas för siderophore produktion analysen.
- Separera rot associerade jordprover i bulk, löst bundna odlingsbädden jord och tätt-bundna odlingsbädden jord.
- Ta rot bollar ur påsarna. Skaka försiktigt bort jord från rotklumpen. Skakas av jord, tillsammans med jord kvar i påsen består av ”bulk” smutsa.
- Använd en gummiklubba för att ytterligare ta bort jord från rotklumpen. Detta är löst bundna odlingsbädden smutsa.
- Generera tätt-bundna odlingsbädden jord genom tar rötter med tätt-bundna provet och sätta dem i ett centrifugrör. Tillsätt 30 mL ddH2O och vortex det för 2-3 minuter. Ta bort rötterna för att få tätt-bundna odlingsbädden jord flytgödsel utspädning.
5. beredning av siderophore anrikning kulturer och CAS-Fe siderophore produktion assay
Obs: Allt glas bör vara syra tvättad innan du påbörjar analyserna.
- Markberedning-prov (för varje av de tre jordtyper prov)
- Homogenisera varje jordprov inom prov påse, genom att blanda och vänder jorden så mycket som möjligt utan att öppna påsen.
Obs: Detta hjälper till att reducera naturliga jorden rumslig variabilitet och justerar med normala jord provtagningsförfaranden. Andra metoder kan utnyttjas för att homogenisera miljöprov, som är lämpligt och beroende på experimentell design. - Efter varje prov har varit grundligt blandat, alikvotens och avbryta 2,0 g av varje jord i 20 mL av modifierade M9 medium, späd sedan 10-3 till en total volym på 20 mL i en steril 50 mL centrifugrör med en steril skum plugg att möjliggöra luftning.
- För tätt-bundna odlingsbädden prover, tillsätt 2 mL av odlingsbädden jord suspensionen till 20 mL av modifierade M9 medium, sedan Späd 10-3 till en total volym på 20 mL i en steril 50 mL centrifugrör med en steril skum plugg att möjliggöra luftning.
- Homogenisera varje jordprov inom prov påse, genom att blanda och vänder jorden så mycket som möjligt utan att öppna påsen.
- Vävnad (rot, skjuta och korn) provberedning
- Yta sterilisera provet med 70% etanol. Lös upp 2,0 g färsk vävnad i 20 mL av modifierade M9 medium med en mixer på hög i 30 sekunder. Överför provet till en steril 50 mL centrifugrör, sedan Späd 10-3 till en total volym på 20 mL i en steril 50 mL centrifugrör med en steril skum plugg att möjliggöra luftning.
- Anrikning av Siderophore produktion genom Fe begränsning
- Inkubera 50 mL centrifugrör i rumstemperatur och skaka på 160 rpm.
6. CAS-Fe agar analyser för detektion av siderophore produktion i miljöprover
- Vid 24, 48 och 72 h efter inleder den berikande kulturen, ta bort 1 mL delproverna från anrikning rören med steril teknik och centrifugera vid 10 000 x g för 1 min i 2 mL centrifugrör till pelletize cellerna.
- Samla separerade supernatanten. Med steril teknik, tillsätt 100 μL av supernatanten till 100 μL lösning av CAS-Fe-Agar i två eller tre exemplar i mikroplattan. Även Tillsätt 100 µL sterilt M9 medium (som tomma). Sedan Inkubera plattan vid 28 ° C.
- Upphäva de återstående supernatanten och pellet för varje prov (inte läggas till mikrotiterplattan) i sin egen, steril 2 mL centrifugrör. Tillsätt 400 μL steril glycerol i varje prov-supernatanten röret och återsuspendera pelleten för att skapa glycerol bestånd. Frysa beståndet vid-80 ° C för senare analyser.
Obs: Detta steg kan ändras för att generera glycerol bestånd enligt Rekommenderad egna protokoll. - Mät absorbansen vid 6, 24, 48 och 72 h, vid 420 nm våglängd.
- Använda standarden kurvor genererade från pyoverdine eller EDTA för att tolka testmätningar absorbansen i form av pyoverdine medel.
Obs: Pyoverdine var fast besluten att vara en överlägsen standard jämfört med EDTA (vide infra), så EDTA inte användes att tolka resultaten i den aktuella studien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En pyoverdine blandning biosyntetiseras av Pseudomonas fluorescens användes som en standard för att tolka och kvantifiera absorbans (vid 420 nm) av prover i form av pyoverdine medel i µM. diagram 1 visar förhållandet mellan absorbans (420 nm) och börjar koncentrationen av pyoverdine (Log10 molariteten i µM). EDTA inte ger en tillräcklig standard eftersom prover utställda större absorbansen mätningar än var uppnåeligt med pyoverdine, och R2 var lägre (figur 2). Samtidigt inledande arbete med CAS-Fe-analys som en metod för siderophore upptäckt mäts absorbansen vid 630 nm, i en relaterad studie med en mycket liknande metod (CAS-Fe-Agar var blandad 1:1 med modifierade M9 att generera en 200 µL kolumn i mikroplattan), observerades det att topp absorbansen var på 665 nm, men som 420 nm var mer reproducerbar när det gäller förändringar i absorbans som induceras av prover (figur 3).
Siderophore produktion observerades i anrikning kulturerna i alla vävnadstyper efter 72 h Fe-underskott anrikning och siderophore verksamhet verkade stabiliseras efter 48 h för inkubation (kompletterande Figur1). Således har siderophore aktivitet 72 h berikning utvärderats på 48 h inkubation att bestämma påverkan av genotyp och prov typ på siderophore isolering (figur 4). Siderophore aktivitet i bulk jordprover var relativt låg och gjorde inte uppvisar skillnader mellan vete genotypen som bulk smutsa var provtas (figur 4A). Rikedomar av löst bundna jord isolerade från PI561725 genotypen uppvisade större siderophore produktion jämfört med löst bundna jord från Madsen och PI561727, men inte Lewjain (figur 4B). Siderophore produktion i rikedomar från tätt bundna marken var inte starkt påverkad av genotyp (figur 4 c).
Berikning kulturer av korn vävnad gav relativt låga siderophore produktion oavsett genotyp (figur 4 d). Rikedomar Lewjain skjuta vävnad hade betydligt lägre siderophore produktion än de andra genotyperna, och PI561725 skjuta vävnadskulturer resulterade i mer rörlig siderophore produktion (figur 4E). Siderophore aktiviteten var mer än 200% större i i roten vävnadskulturer anrikning av PI561725 jämfört med alla andra genotyper (figur 4F).
Figur 1. Absorbans vid 420 nm och 655 nm regredierat mot log10 koncentrationen av pyoverdine. (A) absorbans vid 420 nm regredierat mot log10 koncentrationen av pyoverdine i µM. En polynom kurva var lämpad att erhålla en förklarande ekvation för att tolka absorbansen i form av pyoverdine medel. (B) absorbans vid 665 nm regredierat mot stocken10 koncentrationen av pyoverdine i µM. R2 är kvadraten på korrelationskoefficienten till Pearsons och ekvationen förklarar monterade kurvan. Punkter är dubbletter av absorbansen mätningar vid 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 och 6,25 µM pyoverdine efter 6 h inkubation vid 28 ° C. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Absorbans vid 420 nm och 655 nm regredierat mot log10 koncentrationen av EDTA. (A) absorbans vid 420 nm regredierat mot log10 koncentrationen av EDTA i µM. En polynom kurva var lämpad att erhålla en förklarande ekvation för att tolka absorbansen i form av pyoverdine medel. (B) absorbans vid 665 nm regredierat mot stocken10 koncentrationen av EDTA i µM. R2 är kvadraten på korrelationskoefficienten till Pearsons och ekvationen förklarar monterade kurvan. Punkter är dubbletter av absorbansen mätningar på 3200, 1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 och 6,25 µM EDTA efter 6 h inkubation vid 28 ° C och felstaplar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Absorbansen File från 315−1000 nm mikroplattan brunnar innehållande 200 µL kolumner av 1:1 CAS-Fe-Agar och modifierade M9 eller M9 medium med siderophore producerar prover. Plattan var inkuberas vid 28 ° C i 72 timmar innan mäta absorbansen i en microplate reader. Absorbansen genomsökningar visar tre tomrummen som innehåller inget prov (svarta linjer) gav tätt klustrade kurvor med en peak på 665 nm. Absorbansen File Visa tre tomrummen som innehåller siderophore som producerar prover (grå linje) gav kurvor med mer variation, men med mer konsekvent absorbans vid 420 nm jämfört med 665 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Pyoverdine medel siderophore anrikning kulturer. Pyoverdine medel siderophore anrikning kulturer förknippas med (A) bulk (B) löst bunden, och (C) bundna tätt jord, och i vävnad homogenates av vete (D) korn (E) skjuter, och (F) rötter. Siderophore anrikning kulturer inkuberades för 72 h före överföring delprover till en mikroplattan och inkubation vid 28 ° C. Siderophore produktion bedömdes efter 48 h för inkubation med Chrome azurol S. genotyper/linjer är Lew = Lewjain, Mad = Madsen, 725 = PI561725 och 727 = PI561727. Asterisker representerar betydelse på alpha = 0,008 (efter Bonferroni korrigering). Barerna är standardavvikelsen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 1. Pyoverdine medel med tiden. Pyoverdine medel siderophore anrikning kulturer bedömas efter 24, 48 och 72 timmar efter inkubation med Chrome azurol S. Sderophore anrikning kulturer förknippas med (A) bulk (B) löst bundna, och (C) tätt bundna jord, och i vävnad homogenates av vete (D) skjuter korn (E) och (F) rötter. Siderophore anrikning kulturer inkuberades för 72 h före överföring delprover till en mikroplattan och inkubation vid 28 ° C. och subsampled att bedöma siderophore produktion vid varje tidpunkt. Genotyper/linjer är Lew = Lewjain, Mad = Madsen, 725 = PI561725 och 727 = PI561727. Siderophore produktion bedömdes efter, 24, 48 och 72 h inkubation. Barerna är standardavvikelsen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det primära resultatet av detta arbete är produktionen av en ny metod som kan användas för att snabbt berika för siderophore producerar mikrober medan kvantitativt mäta siderophore/produktionsverksamhet i miljömässiga provet. Metoden är snabb, enkel och kostnadseffektiv, och resultaten visar hur det kan användas för att upptäcka siderophore aktivitet från komplexa och romanen provtyper (e.g., jord och växt vävnad). Protokollet också resulterar i produktion av glycerol lager av anrikning kulturer, som enkelt kan tas genom tiden för att rymma studier av förskjutningar i mikrobiell gemenskapens struktur och funktion under Fe-brist genom DNA eller RNA baserade teknik . Intresserad av att undersöka kineticsen av siderophore aktivitet i ekologiska studier kunde sannolikt också dra nytta av denna metod. Resultaten visar också att pyoverdine medel (pyoverdines är viktigt sideroforer när det gäller miljö28 och medicin29) ger en bra metod för att kvantitativt bedöma siderophore produktion. Ett viktigt konstaterande är att absorbansen mätningar på 665 nm är otillräckliga för att fastställa siderophore aktivitet jämfört med de som observerats vid 420 nm (figur 1). Av särskild betydelse var konstaterandet att absorbansen vid 665 nm grupperad mellan ett brett spektrum av pyoverdine koncentrationer (Pyoverdine µM = 50-800 µM, log10(µM pyoverdine) = 0,18-0,76), vilket tyder på en upptäckt taket på denna våglängd (figur 1b). det bör noteras att medan pyoverdine var en överlägsen standard jämfört med EDTA, det är också kostsamt, så föreslås det att förberedande arbetet utförs med EDTA eller andra kostnadseffektiva kelater att säkerställa metodiken har behärskas före generera pyoverdine standarder.
I området i närheten finns det flera kritiska steg i hela protokollet som kräver uppmärksamhet. För det första är det viktigt att upprätthålla metallfri glas och andra varor där det är möjligt när arbetar med metaller, särskilt de som är nödvändiga i låga koncentrationer, som Fe. För det andra, eftersom kulturer berikades för siderophore produktion genom Fe begränsning, är det viktigt att upprätthålla aseptiska förhållanden under hela arbetsflödet för att minska påverkan av miljögifter. Slutligen, förberedelse av CAS-Fe-agar kräver noggrann uppmärksamhet på Detaljer och bör vara beredd som noga att beskrivs som möjligt. Exempelvis om CAS-Fe-agar lösningen hålls varm men används inte snabbt, kommer CAS-Fe fällningen. Dessutom är det viktigt att hålla CAS-Fe-ägarn varm under överföringen till mikroplattan. Detta uppnåddes med hjälp av uppvärmd, steril sand och snabbt överföra medium till mikroplattan i en biosäkerhet skåp.
En begränsning med metoden är att eftersom vissa växter producerar också sideroforer (phytosiderophores); dessa kan bidra till uppmätta siderophore aktivitet i anrikning kulturerna i växten vävnad homogenates. Det var också relativt hög variabilitet i resultaten från fältet replikat, vilket tyder på mer replikering kan vara till nytta i framtida studier. En annan begränsning av tekniken är att medan mikroplattmetoden används är hög genomströmning, provet samla och förberedelse är tidskrävande. Fortfarande, eftersom en enda mikroplattan kan användas för 96 prover (inklusive standarder), är tids- och ingångarna mycket lägre jämfört med befintlig teknik. Detta är främst eftersom andra befintliga metoder beroende utföra CAS-Fe analysen i petriskålar30, som är till sin natur mindre tids- och kostnadseffektivt att förbereda än en mikroplattan. Dessutom, eftersom solubilized CAS-Fe komplex är benägna att nederbörd12, är den föreslagna metoden använder CAS-Fe-agarsubstrat överlägsen vätskebaserade metoder, som har också anpassas till formatet 96 brunnar.
När det gäller rapporterade resultaten, med tanke på att den främsta skillnaden mellan PI561725 och PI561727 är förekomsten av ALMT1 vs.almt1, respektive tyder resultaten på förekomst av ALMT1 sannolikt resultat i valet av mikrobiella samhällen i både plantan och jorden som har en större potential för produktion av siderophore, som bedömt via anrikning kulturer. Framtida arbete bör vidare undersöka fenomenet med hjälp av ett större antal replikat, särskilt för att klargöra om förekomsten av ALMT1 väljer specifikt för förbättrad siderophore aktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Kalyani Muhunthan för bistånd i laboratorierutiner, Lee Opdahl för skörd av vete-genotyp, Washington State Concord Grape forskningsrådet och Washington State University Center for upprätthålla jordbruket och Naturresurser för ett BIOAg bidrag för att stödja detta arbete. Ytterligare finansiering tillhandahölls av den USDA/NIFA genom lucka projektet 1014527.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Apex | LF451320014 | |
| Aluminum Baking Pan | |||
| Aluminum Foil | |||
| Ammonium chloride, granular | Fiesher Scientific | 152315A | |
| Autoclave and Sterilizer | Thermo Scientific | ||
| Calcium chloride dihydrate | Fiesher Scientific | 171428 | |
| CAS (Chrome Azurol S) | Chem-Impex Int'l Inc) | 000331-27168 | |
| Dextrose Monohydrate (glucose), crystalline powder | Fiesher Scientific | 1521754 | |
| EDTA, disodium salt, dihydrate, Crystal | J.T.Baker | JI2476 | |
| Glycerol, Anhydrous | Baker Analyzed | C22634 | |
| HDTMA (Cetyltrimethylammomonium Bromide | Reagent World | FZ0941 | |
| Hydrochloride acid | ACROS Organic | B0756767 | |
| Infinite M200 PRO plate reader | TECAN | ||
| Iron (III) chloride hexahydrate, 99% | ACROS Organic | A0342179 | |
| Laboratory Fume Hood | Thermo Scientific | ||
| Laboratory Incubator | VWR Scientific | ||
| Magnesium Sulfate | Fiesher Scientific | 27855 | |
| Niric Acid, (69-70)% | J.T.Baker | 72287 | |
| PIPES buffer, 98.5% | ACROS Organic | A0338723 | |
| Potassium phosphate, dibaisc,powder | J.T.Baker | J48594 | |
| Pyoverdine | SIGMA-ALDRICH | 078M4094V | |
| Sand | |||
| SI-600R Shaker | Lab Companion | ||
| Sodium chloride, granular | Fiesher Scientific | 136539 | |
| Sodium hydroxide, pellets | J.T.Baker | G48K53 | |
| Sodium phosphate, dibasic heptahydrate, 99% | ACROS Organic | A0371705 |
References
- Butaite, E., Baumgartner, M., Wyder, S., Kummerli, R. Siderophore cheating and cheating resistance shape competition for iron in soil and freshwater Pseudomonas communities. Nature Communications. 8, (2017).
- Ghirardi, S., et al. Identification of Traits Shared by Rhizosphere-Competent Strains of Fluorescent Pseudomonads. Microbial Ecology. 64 (3), 725-737 (2012).
- Hider, R. C., Kong, X. L. Chemistry and biology of siderophores. Natural Product Reports. 27 (5), 637-657 (2010).
- Saha, M., et al. Microbial siderophores and their potential applications: a review. Environmental Science and Pollution Research. 23 (5), 3984-3999 (2016).
- Bhattacharyya, P. N., Jha, D. K. Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR): emergence in agriculture. World Journal of Microbiology, Biotechnology. 28 (4), 1327-1350 (2012).
- Lewis, R. W., Islam, A., Opdahl, L., Davenport, J. R., Sullivan, T. S. Phylogenetics, Siderophore Production, and Iron Scavenging Potential of Root Zone Soil Bacteria Isolated from 'Concord' Grape Vineyards. Microbial Ecology. , Accepted (2018).
- Li, S. S., et al. The opportunistic human fungal pathogen Candida albicans promotes the growth and proliferation of commensal Escherichia coli through an iron-responsive pathway. Microbiological Research. 207, 232-239 (2018).
- Lorenz, N., Shin, J. Y., Jung, K. Activity, Abundance, and Localization of Quorum Sensing Receptors in Vibrio harveyi. Frontiers in Microbiology. 8, (2017).
- O'Brien, S., Fothergill, J. L. The role of multispecies social interactions in shaping Pseudomonas aeruginosa pathogenicity in the cystic fibrosis lung. Fems Microbiology Letters. 364 (15), (2017).
- Ozkaya, O., Balbontin, R., Gordo, I., Xavier, K. B. Cheating on Cheaters Stabilizes Cooperation in Pseudomonas aeruginosa. Current Biology. 28 (13), (2018).
- Popat, R., et al. Environmental modification via a quorum sensing molecule influences the social landscape of siderophore production. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 284 (1852), (2017).
- Schwyn, B., Neilands, J. B. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).
- Sullivan, T. S., Ramkissoon, S., Garrison, V. H., Ramsubhag, A., Thies, J. E. Siderophore production of African dust microorganisms over Trinidad and Tobago. Aerobiologia. 28 (3), 391-401 (2012).
- Buyer, J. S., DeLorenzo, V., Neilands, J. B. Production of the siderophore aerobactin by a halophilic Pseudomonad. Applied and Environmental Microbiology. 57 (8), 2246-2250 (1991).
- Perez-Miranda, S., Cabirol, N., George-Tellez, R., Zamudio-Rivera, L., Fernandez, F. O-CAS, a fast and universal method for siderophore detection. Journal of Microbiological Methods. 70 (1), 127-131 (2007).
- Nakouti, I., Hobbs, G. A new approach to studying ion uptake by actinomycetes. Journal of Basic Microbiology. 53 (11), 913-916 (2013).
- Wang, L. J., et al. Diisonitrile Natural Product SF2768 Functions As a Chalkophore That Mediates Copper Acquisition in Streptomyces thioluteus. Acs Chemical Biology. 12 (12), 3067-3075 (2017).
- Retamal-Morales, G., et al. Detection of arsenic-binding siderophores in arsenic-tolerating Actinobacteria by a modified CAS assay. Ecotoxicology and Environmental Safety. 157, 176-181 (2018).
- Desai, A., Archana, G. Role of Siderophores in Crop Improvement. , (2011).
- Dertz, E. A., Raymond, K. N. Comprehensive coordination chemistry II. Que, L., Tolman, W. B. 8, Elsevier, Ltd. (2003).
- Arora, N. K., Verma, M. Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria. 3 Biotech. 7, 9 (2017).
- Bandyopadhyay, P., Bhuyan, S. K., Yadava, P. K., Varma, A., Tuteja, N. Emergence of plant and rhizospheric microbiota as stable interactomes. Protoplasma. 254 (2), 617-626 (2017).
- Lakshmanan, V., Castaneda, R., Rudrappa, T., Bais, H. P. Root transcriptome analysis of Arabidopsis thaliana exposed to beneficial Bacillus subtilis FB17 rhizobacteria revealed genes for bacterial recruitment and plant defense independent of malate efflux. Planta. 238 (4), 657-668 (2013).
- Sasaki, T., et al. A wheat gene encoding an aluminum-activated malate transporter. The Plant Journal. 37 (5), 645-653 (2004).
- Mahoney, A. K., Yin, C., Hulbert, S. H. Community Structure, Species Variation, and Potential Functions of Rhizosphere-Associated Bacteria of Different Winter Wheat (Triticum aestivum) Cultivars. Frontiers in Plant Science. 8 (132), (2017).
- Rayburn, A. L., Wetzel, J., Baligar, V. Mitotic analysis of sticky chromosomes in aluminum tolerant and susceptible wheat lines grown in soils of differing aluminum saturation. Euphytica. 127 (2), 193-199 (2002).
- McPherson, M. R., Wang, P., Marsh, E. L., Mitchell, R. B., Schachtman, D. P. Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments. Journal of Visualized Experiments. (137), 57932 (2018).
- Mirleau, P., et al. Fitness in soil and rhizosphere of Pseudomonas fluorescens C7R12 compared with a C7R12 mutant affected in pyoverdine synthesis and uptake. FEMS Microbiology Ecology. 34 (1), 35-44 (2000).
- Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. Pyoverdine siderophores: from biogenesis to biosignificance. Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).
- Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. Use of Blue Agar CAS Assay for Siderophore Detection. Journal of Microbiology, Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).
