Summary
Presentamos un protocolo para la detección rápida de muestras ambientales para pseudobactina potencial contribuyendo a micronutrientes biodisponibilidad y volumen de ventas en sistemas terrestres.
Abstract
Sideróforos (quelantes de compuestos del metal de bajo peso molecular) son importantes en el fenómeno ecológico diversos que van desde ciclo biogeoquímicos hierro (Fe) en los suelos, a la competencia de patógeno, promoción del crecimiento vegetal y Cruz-Reino de señalización. Además, sideróforos son también de interés comercial en biolixiviación y bioweathering de metal-minerales y los minerales. Un medio rápido, eficaz y robusto de evaluar cuantitativamente la producción de pseudobactina en muestras complejas es clave para la identificación de aspectos importantes de las consecuencias ecológicas de pseudobactina actividad, incluyendo, novela pseudobactina producir microbios. El método presentado aquí fue desarrollado para evaluar actividad de pseudobactina de comunidades del microbioma en el tacto, en muestras ambientales, tales como los tejidos de la planta o el suelo. Las muestras fueron homogeneizadas y diluidas en un medio modificado de M9 (sin Fe), y cultivos de enriquecimiento se incubaron por 3 días. Producción de pseudobactina se evaluó en las muestras a las 24, 48 y 72 horas (h) utilizar una microplaca de 96 pozos novela CAS (cromo azurol sulfonato)-ensayo de agar de Fe, una adaptación del método colorimétrico de evaluar pseudobactina tradicionalmente tedioso y lento actividad, el individuo cultiva cepas microbianas. Aplicamos nuestro método a 4 genotipos líneas de trigo (Triticum aestivum L.), incluyendo Lewjain, PI561725, Madsen y PI561727 comúnmente cultivadas en el Pacífico noroeste interior. Producción de pseudobactina fue afectado claramente por el genotipo de trigo y en los tipos específicos de tejidos vegetales observados. Hemos utilizado con éxito nuestro método para detectar rápidamente la influencia del genotipo de la planta en producción de pseudobactina, una función clave en los ecosistemas terrestres y acuáticos. Produjimos muchas repeticiones técnicas, produciendo diferencias estadísticas muy confiables en suelos y en los tejidos vegetales. Lo importante, los resultados muestran que el método propuesto puede utilizarse para examinar rápidamente la producción de pseudobactina en muestras complejas con un alto grado de fiabilidad, de manera que permite a las comunidades a preservarse para que trabajo posterior identificar taxones y genes funcionales.
Introduction
Sideróforos son importantes biomoléculas implicadas principalmente en la quelación del hierro de biodisponibilidad, pero con una amplia gama de propósitos adicionales en ecosistemas terrestres y acuáticos, desde la microbiana quórum sensing, señalización a microbianas-anfitriones de la planta, promoción del crecimiento vegetal, la cooperación y competición dentro de las comunidades microbianas complejas1,2. Sideróforos pueden ampliamente clasificarse según sus sitios activos y características estructurales, creando cuatro tipos básicos: carboxilato, hydroxamate, catecholate y mezclado tipo3,4. Muchos microorganismos son capaces de excretar más de un tipo de pseudobactina5 y en comunidades complejas, una gran mayoría de organismos sintetizar los receptores de membrana para permitir la absorción de una variedad aún más amplia de sideróforos1, 6. Trabajo reciente indica que los sideróforos son particularmente importantes en el nivel de la comunidad e incluso en el Reino entre comunicaciones y transferencias biogeoquímicas7,8,9,10 ,11.
Cromo azurol sulfonato (CAS) se ha utilizado por más de 30 años como un agente quelante para enlazar el hierro (Fe) de tal manera que la adición de ligandos (es decir, sideróforos) puede resultar en la disociación del complejo CAS-Fe, creando un cambio de color fácilmente identificable en el medio 12. cuando el CAS está ligada con la Fe, el tinte aparece como un color azul real, y como se disocia el complejo de CAS-Fe, el medio cambia de color según el tipo de ligando utilizado para compactar la Fe13. El medio inicial, base líquida establecido por Schwyn y Neilands en 1987, se ha modificado de muchas maneras para cambiar microbiana objetivos14, hábitos de crecimiento y limitaciones15, así como una variedad de metales además de Fe, incluyendo aluminio, manganeso, cobalto, níquel cadmio, litio, zinc16, cobre17e incluso arsénico18.
Muchos patógenos humanos, así como microorganismos de promoción de crecimiento (PGPM) han sido identificados como organismos productores de pseudobactina3,19,20y rizosfera importante y endófitos PGPM a menudo prueba positivo para la producción de pseudobactina4. El método líquido basado en la Fe tradicional se ha adaptado para microtitulación pruebas de aislamientos en cultivo para producción de pseudobactina21. Sin embargo, estas técnicas no reconocer la importancia de la comunidad microbiana en su totalidad (microbioma), en cooperación y regulación potencial de pseudobactina producción en suelos y sistemas de planta22. Por esa razón, hemos desarrollado una evaluación de nivel de la comunidad de alto rendimiento de pseudobactina producción de un entorno dado, basado en el análisis tradicional de CAS, pero con replicación, facilidad de medición, fiabilidad y repetibilidad en una microplaca ensayo.
En este estudio, se presenta un análisis de CAS-Fe rentable, de alto rendimiento para la detección de pseudobactina producción para evaluar el enriquecimiento de la producción de pseudobactina de muestras complejas (es decir, suelo y planta de homogenados de tejido). Suelo de la rizosfera a granel, limite y firmemente enlazado (en términos de cómo la tierra estuvo limitada a la raíz) se obtuvieron junto con grano, disparar y los tejidos de la raíz de cuatro genotipos distintos de trigo (Triticum aestivum L.): Lewjain, Madsen, PI561725, y PI561727. Fue presumido que diferencias fundamentales en los genotipos de trigo podrían resultar en diferencias en el reclutamiento y selección de pseudobactina comunidades productoras. De particular interés es la diferencia entre las comunidades microbianas asociadas con la línea isogénicas de PI561725, que es de aluminio tolerante porque posee ALMT1 (aluminio activación malato Transporter 1), en comparación con el aluminio sensible PI561727 isogénicas línea, que posee una forma sensible sin aluminio del gene, almt123,24,25,26. El objetivo principal del estudio fue desarrollar un método sencillo y rápido de evaluar cuantitativamente pseudobactina producción en cultivos de enriquecimiento pseudobactina de tipos de muestras complejas mientras que preserva las culturas para el trabajo futuro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Nota: Ubicación del sitio de campo: Universidad Estatal de Washington, planta patología granja (46 ° 46' 38,0" N 117 ° 57,4 ' 04" W). Las semillas se sembraron con una sembradora mecánica en 19 de octubre de 2017. Cada genotipo de trigo se sembró en headrows, aproximadamente 1 metro de distancia para evitar la superposición del sistema radicular. Se recolectaron muestras de suelo y planta en 09 de agosto de 2018, cuando las plantas estaban listas para la cosecha. Las muestras fueron recogidas de tres repeticiones de cuatro genotipos de trigo: PI561727, PI561725, Madsen, Lewjain.
1. preparación de medio M9 modificado
- Uso Na2PO4∙7H2O (12,8 g/200 mL), KH2PO4 (0,3 g/200 mL) y NaCl (0,5 g/200 mL) y NH4Cl (1 g/20 mL) reactivos para preparar la solución de sal de M9.
- Utilizar 18 g de MgSO4∙7H2O en 100 mL de agua doble desionizada (ddH2O) para preparar 0,75 M MgSO4∙7H2O.
- Hacer de 1 M de CaCl2∙2H2O añadiendo 14,7 g de CaCl2∙2H2O con 100 mL de ddH2O.
- Preparar la solución amortiguadora disolviendo 6,048 g de pipas en 156 mL de ddH2O con agitación. Ajustar el pH a 6.8 con NaOH M 5.
- Preparar 20% glucosa (dextrosa monohidrato) disolviendo 20 g de glucosa en 100 mL de ddH2O.
- Preparar soluciones y autoclave todos individualmente sino la glucosa. Filtro de esterilizar la solución de glucosa para la adición a los medios de comunicación de M9 después de autoclave (0,22 μm).
- Preparar el medio M9 modificado mezclando 156 mL de solución tampón PIPES, 40 mL de solución de sales M9, 20 μL de solución de CaCl2·2H2O y 266 μL de MgSO4·7H2O 4 mL de soluciones de glucosa 20% en la seguridad de la biotecnología gabinete, usa técnica estéril.
- Para la preservación de la M9 modificado, sellar el recipiente, cubrir con papel de aluminio para proteger de rayos UV y colocar a 4 ° C.
2. preparación del medio Agar-Fe-CAS
- Ácido lavar toda la cristalería en HCl/100 100 mM m m HNO3 durante al menos 2 h antes de la utilización en el ensayo de CAS.
- Preparar una bandeja para hornear de aluminio llenado de arena de grado laboratorio y cubrirla con papel de aluminio. Autoclave a 121 ° C durante 30 minutos y apartar.
- Prepare HDTMA (bromuro de hexadeciltrimetilamonio) añadiendo 0,0365 g 20 mL ddH2O y coloque la solución a 37 ° C para promover la solubilización.
- Preparar 10 mM HCl y generar 1 mM FECLAS3·6H2O con 10 mM HCl como el solvente. Añadir 0,0302 g de CAS a 25 mL de ddH2O agitando suavemente con una barra de agitación magnética estéril. Luego añadir 5 mL de FECLAS3·6H2O (en 10 mM HCl) 1 m m a 25 mL de solución de CAS sin dejar de revolver suavemente (la solución se convierte en color negro rojizo oscuro).
- Lentamente agregar los 20 mL de solución de HDTMA agitando suavemente, en la solución de Fe-CAS (esto produce una solución azul oscurezca).
- Preparar la solución amortiguadora disolviendo 15,12 g de pipas en 375 mL de ddH2O, con agitación suave. Ajustar el pH a 6.8 con NaOH M 5. Añadir agua para llevar el volumen a 450 mL. Añadir 5 g de agarosa a la solución. Autoclave los tubos buffer solución y la solución de CAS-Fe a 121 ° C durante 30 minutos.
- Agregue cuidadosamente la totalidad de la solución de CAS-Fe para la totalidad del Buffer PIPES en el gabinete de seguridad biológica después de cada uno de ellos es esterilizado.
- Coloque la solución mezclada en un baño de agua a 50 ° C.
Nota: Recién preparar todos los reactivos en el medio de CAS-Fe-Agar antes de cada ensayo, como almacenamiento a largo plazo en resultados de 50 ° C en la precipitación de los resultados complejos y enfriamiento de CAS-Fe en medio solidificado. - Coloque un bote estéril reactivo en la arena estéril en el gabinete de seguridad de la biotecnología y calentar a 50 ° C. Transferencia del CAS-Fe-Agar para el barco, y luego rápidamente alícuotas de 100 μl a cada pocillo de una microplaca de 96 pozos de clara, fondo plano, estéril.
3. preparación estándar Pyoverdine/EDTA
- Preparación del pyoverdine
- Preparación estándar de pyoverdine de 800 μM (mezcla de ácido succínico, glutaramide 2-hidroxi y succinaminde formas del pyoverdine-véase Tabla de materiales), en medio de M9 modificado previamente preparado.
- Diluir esta solución en 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 y 6,25 μM soluciones.
- Preparación estándar de EDTA
- Añadir 0,594 g del ácido etilendiaminotetracético disódico (EDTA: C10H14N2Na2O8.2 h2O), a 500 mL de medio de M9 modificado previamente preparado para preparar estándar de EDTA 3200 μM.
- Diluir esta solución en 1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 y 6,25 soluciones μM.
- Generación de la curva estándar
- Añada 100 μL de cada concentración del pyoverdine y EDTA para separar los pocillos de una microplaca de 96 pocillos con 100 μL de medio de Agar CAS-Fe. Hacer duplicados técnicos repeticiones de cada concentración. También, añadir pozos en blanco con solamente M9 (no EDTA o pyoverdine).
- Usando un lector de microplacas, medir la absorbancia (a 420 nm y 665 nm) después de 1, 6 y 24 h de incubación a 22 ° C y las medidas de absorbancia de uso para generar curvas estándar.
Nota: Para mediciones de 420 nm, restar la absorbancia del blanco de la absorbancia del pyoverdine o pozos que contienen EDTA. Para 665 nm, restar la absorbancia del pyoverdine o EDTA con pozos de absorción de espacios en blanco. Entonces, log10(μm pyoverdine o EDTA) se regresa contra las medidas de absorbancia. Para facilitar la interpretación de los resultados de la muestra, usar la absorbancia como el eje x y log10(μm pyoverdine o EDTA) como el eje y.
4. colección de muestras ambientales: tejidos de suelo y planta
- Lavar equipos de muestreo (palas y tijeras) con 0.22 μm filtrado ddH2O seguido de etanol al 70% y limpiar con toallas de papel antes de muestreo y entre muestras para mantener una técnica estéril y reducir la contaminación cruzada.
- Suprimir los tejidos de la planta (granos y brotes) de las plantas en el campo y colocarlos en una bolsa de plástico etiquetadas, dejando suficiente rastrojo de sesión para facilitar el desarraigo de las muestras de suelo y la raíz deseadas.
- Excavar a una profundidad de raíz pequeña bola aproximadamente 15 cm y 23 cm de ancho y colóquelo en una bolsa de plástico aparte, rotulada para preparación de muestras en el entorno de laboratorio. Este paso es similar a los métodos de McPherson et al27.
- Colocar todas las muestras (granos, brotes, a granel tierra y cepellones en bolsas separadas) directamente en el hielo y conservar a 4 ° C hasta que se procesan las muestras para el ensayo de producción de pseudobactina.
- Separar las muestras de suelo de raíz asociado a granel, suelo de rizosfera de-limite y suelo de la rizosfera limitan firmemente.
- Sacar los cepellones de las bolsas. Sacuda suavemente el suelo de la bola de la raíz. Sacudido el suelo, junto con el suelo izquierda en la bolsa comprende el suelo "a granel".
- Utilice un mazo de goma para más quitar la suciedad de la pelota de la raíz. Este es el suelo de rizosfera de-limite.
- Generar suelo de la rizosfera limitan fuertemente las raíces con la muestra firmemente enlazado y colocarlos en un tubo de centrífuga. Añadir 30 mL de ddH2O y de vortex durante 2-3 minutos. Quite las raíces para obtener la dilución de la mezcla de suelo rizosfera limitan firmemente.
5. preparación de pseudobactina cultivos de enriquecimiento y análisis de producción de pseudobactina CAS-Fe
Nota: Toda la cristalería debe lavado antes de comenzar con los ensayos de ácido.
- Preparación de muestras de suelo (para cada uno de los tipos de muestra de suelo de tres)
- Homogeneizar cada muestra de suelo dentro de la bolsa de la muestra, mezclando y convirtiendo el suelo tanto como sea posible sin necesidad de abrir la bolsa.
Nota: Esto ayuda a reducir la variabilidad espacial de suelos naturales y se alinea con procedimientos de muestreo de suelo normal. Otros métodos pueden utilizarse para homogeneizar muestras ambientales, según el caso y dependiendo del diseño experimental. - Después de cada muestra ha sido muy bien mezclada, alícuota y suspender 2,0 g de cada suelo en 20 mL de medio M9 modificado, luego diluir 10-3 para un volumen total de 20 mL en un tubo de centrífuga estéril de 50 mL con un tapón de espuma estéril para permitir la aireación.
- Para las muestras de la rizosfera limitan firmemente, añadir 2 mL de la mezcla de suelo de rizosfera a 20 mL de medio M9 modificado, luego diluir 10-3 para un volumen total de 20 mL en un tubo de centrífuga estéril de 50 mL con un tapón de espuma estéril para permitir la aireación.
- Homogeneizar cada muestra de suelo dentro de la bolsa de la muestra, mezclando y convirtiendo el suelo tanto como sea posible sin necesidad de abrir la bolsa.
- Preparación de muestras (raíz, brote y grano) de tejido
- Superficie de esterilizar la muestra con etanol al 70%. Macerar 2,0 g de tejido fresco en 20 mL de medio M9 modificado usando una licuadora en alta durante 30 segundos. Transferir la muestra a un tubo de centrífuga estéril 50 mL, luego diluir 10-3 para un volumen total de 20 mL en un tubo de centrífuga estéril de 50 mL con un tapón de espuma estéril para permitir la aireación.
- Enriquecimiento de pseudobactina producción a través de la limitación de la Fe
- Incubar los tubos de centrífuga de 50 mL a temperatura ambiente y agite a 160 rpm.
6. ensayos de agar CAS-Fe para la detección de la producción de pseudobactina en muestras ambientales
- A las 24, 48 y 72 h después de iniciar la cultura del enriquecimiento, sacar submuestras de 1 mL de los tubos de enriquecimiento utilizando una técnica estéril y centrifugar a 10.000 x g durante 1 min en tubos de centrífuga de 2 mL para granular en las células.
- Recoger el sobrenadante separado. Utilizando una técnica estéril, añada 100 μL del sobrenadante a 100 μL solución de CAS-Fe-Agar duplicado o triplicado en la microplaca. También añadir 100 μl de medio M9 estéril (como espacios en blanco). Luego incubar la placa a 28 º C.
- Suspender el resto del sobrenadante y pellet para cada muestra (no ha añadido a la placa de microtitulación) en su el propios, tubo de centrífuga estériles de 2 mL. Añadir 400 μL de glicerol estéril en cada tubo de muestra sobrenadante y resuspender el precipitado para crear acciones de glicerol. Congele la acción a-80 ° C para posteriores análisis.
Nota: Este paso puede ser modificado para generar acciones de glicerol según cualquier protocolo interno recomendado:. - Medir la absorbancia a las 6, 24, 48 y 72 h, a longitud de onda de 420 nm.
- Use curvas estándar generadas del pyoverdine o EDTA para interpretar las mediciones de absorbancia de la muestra en términos de equivalentes del pyoverdine.
Nota: Pyoverdine fue determinada para ser un estándar superior en comparación con el EDTA (vide infra), por lo que el EDTA no se utilizó para interpretar los resultados en el estudio actual.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Un pyoverdine mezcla biosynthesized por Pseudomonas fluorescens fue utilizado como un estándar para interpretar y cuantificar la absorbancia (a 420 nm) de las muestras en términos de equivalentes de pyoverdine en μm. la figura 1 muestra la relación entre la absorbancia (420 nm) y a partir de la concentración del pyoverdine (molaridad de Log10 en μm). EDTA no presentó un nivel adecuado porque muestras expuestas medidas de absorbancia mayor que eran alcanzables con pyoverdine y la R2 fue menor (figura 2). Al inicial trabajo usando el análisis de CAS-Fe como un método de pseudobactina detección medida absorbancia a 630 nm, en un estudio relacionado con un método muy similar (CAS-Fe-Agar se mezcló 1:1 con M9 modificado para generar una columna de 200 μL en la microplaca), se observó que la absorbancia máxima fue a 665 nm, pero que 420 nm fue más reproducible en términos de cambios en la absorbancia por muestras (figura 3).
Producción de pseudobactina observó en cultivos de enriquecimiento de todos los tipos de tejido después de 72 h de enriquecimiento Fe-déficit y pseudobactina actividad parece estabilizarse después de 48 h de incubación (figura 1 complementaria). Así, evaluaron la pseudobactina actividad de enriquecimiento de 72 h a 48 h de incubación para determinar la influencia del genotipo y muestra el tipo de pseudobactina aislamiento (figura 4). Actividad de pseudobactina en muestras de suelo a granel fue relativamente baja y que no muestra diferencias entre el genotipo de trigo que el suelo a granel era muestreados (Figura 4A). Enriquecimientos de suelo suelto consolidado aislado del genotipo PI561725 exhiben una mayor producción de pseudobactina en comparación con el suelo ligeramente consolidado de Madsen y PI561727, pero no Lewjain (Figura 4B). Producción de pseudobactina en enriquecimientos de suelo firmemente consolidado no fue influenciada por el genotipo (figura 4).
Cultivos de enriquecimiento de tejido de grano rindieron pseudobactina relativamente baja producción independientemente del genotipo (figura 4). Enriquecimientos de tejidos Lewjain tenían producción de pseudobactina significativamente menor que los otros genotipos, y PI561725 sesión de tejido culturas dio lugar a la producción de pseudobactina más variable (figura 4E). Actividad de pseudobactina era más de 200% mayor en los cultivos de enriquecimiento de tejido de raíz de PI561725 en comparación con los otros genotipos (figura 4F).
Figura 1. Absorbancia a 420 nm y 655 nm regresó frente a la concentración de log10 del pyoverdine. (A) absorbancia a 420 nm regresó frente a la concentración de10 registro del pyoverdine en μm. Se ajustó una curva polinómica para obtener una ecuación explicativa para interpretar absorbancia en términos equivalentes del pyoverdine. (B) absorbancia a 665 nm regresó contra el registro de10 concentración del pyoverdine en μm. R2 es el cuadrado del coeficiente de correlación de Pearson, y la ecuación de la curva integral, explica. Los puntos son duplicados de mediciones de absorbancia a 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 y 6,25 μm pyoverdine después de 6 h de incubación a 28 ° C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Absorbancia a 420 nm y 655 nm regresó frente a la concentración de log10 de EDTA. (A) absorbancia a 420 nm regresó contra el log10 la concentración de EDTA en μm. Se ajustó una curva polinómica para obtener una ecuación explicativa para interpretar absorbancia en términos equivalentes del pyoverdine. (B) absorbancia a 665 nm regresó contra el registro de10 concentración de EDTA en μm. R2 es el cuadrado del coeficiente de correlación de Pearson, y la ecuación de la curva integral, explica. Los puntos son duplicados de mediciones de absorbancia a 3200, 1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 y 6,25 μm EDTA después de 6 h de incubación a 28 ° C y barras de error. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Absorbancia explora de nm 315−1000 de pozos de la microplaca que contiene 200 μL columnas de 1:1 de CAS Fe de Agar y modificado M9 o medio M9 con pseudobactina producir muestras. La placa se incubó a 28 ° C durante 72 horas antes de medir la absorbancia en un lector de microplacas. Análisis de absorbancia muestran los tres espacios en blanco no muestra (líneas negras) rindieron bien agrupado las curvas con un pico en el 665 nm. Absorbancia analiza mostrar los tres espacios en blanco que contiene pseudobactina producir muestras (líneas grises) rindió las curvas con mayor variabilidad, pero con más consistente absorbancia a 420 nm en comparación con 665 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Pyoverdine equivalentes de culturas de enriquecimiento pseudobactina. Pyoverdine equivalentes de culturas de enriquecimiento pseudobactina asociada a granel (A) (B) ligada y (C) firmemente limitados de suelo, en homogenados de tejido de trigo grano (D) (E) dispara y raíces (F). Cultivos de enriquecimiento pseudobactina se incubaron durante 72 h antes de la transferencia de submuestras a una microplaca e incubando a 28 ° C. Producción de pseudobactina se evaluó después de 48 h de incubación con cromo azurol S. genotipos/líneas Lew = Lewjain, Mad = Madsen, 725 = PI561725 y 727 = PI561727. Asteriscos representan importancia en alfa = 0.008 (después de la corrección de Bonferroni). Barras son de desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Suplementario Figura 1. Pyoverdine equivalentes en el tiempo. Pyoverdine equivalentes de pseudobactina enriquecimiento culturas evaluadas después de 24, 48 y 72 h de incubación con cultivos de enriquecimiento cromo azurol Sderophore S. asociaron a granel (A) (B) ligada, y (C) firmemente limitados de suelo, y en homogenados de tejido de trigo (D) brotes de grano (E) y (F) raíces. Cultivos de enriquecimiento pseudobactina se incubaron durante 72 h antes de la transferencia de submuestras a una microplaca e incubando a 28 ° C. y subsampled para evaluar producción de pseudobactina en cada punto. Líneas de genotipos son Lew = Lewjain, Mad = Madsen, 725 = PI561725 y 727 = PI561727. Se evaluó la producción de pseudobactina después, 24, 48 y 72 h de incubación. Barras son de desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El principal resultado de este trabajo es la producción de una nueva metodología que puede utilizarse para enriquecer rápidamente para producir microbios y cuantitativo de medición pseudobactina producción y actividad en la muestra ambiental de pseudobactina. La metodología es rápida, sencilla y rentable, y los resultados muestran cómo puede ser utilizado para detectar actividad de pseudobactina de tipos de muestras complejas y novedosas (por ejemplo., tejido de suelo y planta). El protocolo también da como resultado la producción de las existencias de glicerol de los cultivos de enriquecimiento, que puede fácilmente tomarse tiempo para estudios de cambios en la función y estructura de la comunidad microbiana durante la deficiencia de Fe a través de ADN o ARN técnicas basadas en . También es probable que los interesados en el examen de la cinética de la actividad de pseudobactina en estudios ecológicos podrían beneficiarse de este método. Los resultados también muestran que pyoverdine equivalentes (pyoverdines son sideróforos importante en términos de medio ambiente medicina y28 29) proporcionan un buen método de evaluar cuantitativamente la producción de pseudobactina. Un hallazgo importante es que muestra las mediciones de 665 nm son insuficientes para determinar actividad de pseudobactina en comparación con los observados en 420 nm (figura 1). De particular importancia fue el hallazgo que absorbancia a 665 nm agrupadas en una amplia gama de concentraciones del pyoverdine (Pyoverdine μm = 50-800 μm, log10(μm pyoverdine) = 0.18-0,76), lo que sugiere un límite de detección en esta longitud de onda (figura 1B). Cabe señalar que mientras que pyoverdine era un estándar superior en comparación con el EDTA, es también costoso, por lo que se sugiere que el trabajo preliminar se realiza con EDTA u otros quelantes rentables para garantizar la metodología ha sido dominado antes de generando estándares pyoverdine.
Hay varios pasos críticos en todo el protocolo que requieren mucha atención. En primer lugar, es importante mantener vidrio libre de metal y otras mercancías, siempre que sea posible cuando trabajo con metales, particularmente las necesarias en bajas concentraciones, como la Fe. En segundo lugar, porque las culturas fueron enriquecidas para la producción de pseudobactina a través de la limitación de la Fe, es importante mantener las condiciones asépticas en el flujo de trabajo para reducir la influencia de los contaminantes ambientales. Por último, preparación del CAS-Fe-agar requiere atención cuidadosa al detalle y debe estar preparado como cerca a descrito como sea posible. Por ejemplo, si la solución CAS-Fe-agar se mantiene caliente pero no se usa rápido, la CAS-Fe precipitará. Además, es esencial para mantener el CAS-Fe-Agar caliente durante la transferencia a la microplaca. Esto se logró utilizando calefacción, arena estéril y transferir rápidamente el medio a la microplaca en un gabinete de bioseguridad.
Una limitación de la metodología es porque algunas plantas también producen sideróforos (phytosiderophores); Estos pueden contribuir a la actividad pseudobactina medida en cultivos de enriquecimiento de homogenados de tejido de planta. Además, era relativamente alta variabilidad en los resultados de repeticiones de campo, sugiriendo que replicación más podría ser beneficiosa en estudios futuros. Otra limitación de la técnica es que mientras el método de microplaca es alto rendimiento, la muestra recogida y preparación son desperdiciadores de tiempo. Todavía, porque puede utilizar una sola microplaca para 96 muestras (incluyendo estándares), las entradas de tiempo y costo son baje mucho en comparación con las técnicas existentes. Esto es principalmente porque otros métodos existentes se basan en realizar el análisis de CAS-Fe en placas de Petri de30, que son inherentemente menos tiempo y costo eficiente para preparar de una microplaca. Además, debido a complejos solubles de Fe CAS son propensos a precipitación12, el método propuesto por medio de CAS-Fe-Agar es métodos superiores para base líquida, que también se han adaptado al formato de 96 pozos.
En cuanto a los resultados divulgados, dado que la principal diferencia entre el PI561725 y el PI561727 es la presencia de ALMT1 vs.almt1, respectivamente, los resultados sugieren la presencia de resultados probablemente ALMT1 en la selección de comunidades microbianas en la planta y el suelo que tienen un mayor potencial para la producción de pseudobactina, evaluados a través de culturas de enriquecimiento. Labor futura debe investigar el fenómeno utilizando un mayor número de repeticiones, sobre todo para aclarar si la presencia de ALMT1 selecciona específicamente pseudobactina mayor actividad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen conflictos de interés divulgar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Kalyani Muhunthan por asistencia en procedimientos de laboratorio, Lee Opdahl para la cosecha de genotipo de trigo, el Consejo de investigación de Washington estado uva Concord y la Washington State University Center para mantener la agricultura y Concesión de recursos naturales para un BIOAg para apoyar este trabajo. Financiación adicional fue proporcionada por la USDA/NIFA a través del proyecto 1014527 de la portilla.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Apex | LF451320014 | |
| Aluminum Baking Pan | |||
| Aluminum Foil | |||
| Ammonium chloride, granular | Fiesher Scientific | 152315A | |
| Autoclave and Sterilizer | Thermo Scientific | ||
| Calcium chloride dihydrate | Fiesher Scientific | 171428 | |
| CAS (Chrome Azurol S) | Chem-Impex Int'l Inc) | 000331-27168 | |
| Dextrose Monohydrate (glucose), crystalline powder | Fiesher Scientific | 1521754 | |
| EDTA, disodium salt, dihydrate, Crystal | J.T.Baker | JI2476 | |
| Glycerol, Anhydrous | Baker Analyzed | C22634 | |
| HDTMA (Cetyltrimethylammomonium Bromide | Reagent World | FZ0941 | |
| Hydrochloride acid | ACROS Organic | B0756767 | |
| Infinite M200 PRO plate reader | TECAN | ||
| Iron (III) chloride hexahydrate, 99% | ACROS Organic | A0342179 | |
| Laboratory Fume Hood | Thermo Scientific | ||
| Laboratory Incubator | VWR Scientific | ||
| Magnesium Sulfate | Fiesher Scientific | 27855 | |
| Niric Acid, (69-70)% | J.T.Baker | 72287 | |
| PIPES buffer, 98.5% | ACROS Organic | A0338723 | |
| Potassium phosphate, dibaisc,powder | J.T.Baker | J48594 | |
| Pyoverdine | SIGMA-ALDRICH | 078M4094V | |
| Sand | |||
| SI-600R Shaker | Lab Companion | ||
| Sodium chloride, granular | Fiesher Scientific | 136539 | |
| Sodium hydroxide, pellets | J.T.Baker | G48K53 | |
| Sodium phosphate, dibasic heptahydrate, 99% | ACROS Organic | A0371705 |
References
- Butaite, E., Baumgartner, M., Wyder, S., Kummerli, R. Siderophore cheating and cheating resistance shape competition for iron in soil and freshwater Pseudomonas communities. Nature Communications. 8, (2017).
- Ghirardi, S., et al. Identification of Traits Shared by Rhizosphere-Competent Strains of Fluorescent Pseudomonads. Microbial Ecology. 64 (3), 725-737 (2012).
- Hider, R. C., Kong, X. L. Chemistry and biology of siderophores. Natural Product Reports. 27 (5), 637-657 (2010).
- Saha, M., et al. Microbial siderophores and their potential applications: a review. Environmental Science and Pollution Research. 23 (5), 3984-3999 (2016).
- Bhattacharyya, P. N., Jha, D. K. Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR): emergence in agriculture. World Journal of Microbiology, Biotechnology. 28 (4), 1327-1350 (2012).
- Lewis, R. W., Islam, A., Opdahl, L., Davenport, J. R., Sullivan, T. S. Phylogenetics, Siderophore Production, and Iron Scavenging Potential of Root Zone Soil Bacteria Isolated from 'Concord' Grape Vineyards. Microbial Ecology. , Accepted (2018).
- Li, S. S., et al. The opportunistic human fungal pathogen Candida albicans promotes the growth and proliferation of commensal Escherichia coli through an iron-responsive pathway. Microbiological Research. 207, 232-239 (2018).
- Lorenz, N., Shin, J. Y., Jung, K. Activity, Abundance, and Localization of Quorum Sensing Receptors in Vibrio harveyi. Frontiers in Microbiology. 8, (2017).
- O'Brien, S., Fothergill, J. L. The role of multispecies social interactions in shaping Pseudomonas aeruginosa pathogenicity in the cystic fibrosis lung. Fems Microbiology Letters. 364 (15), (2017).
- Ozkaya, O., Balbontin, R., Gordo, I., Xavier, K. B. Cheating on Cheaters Stabilizes Cooperation in Pseudomonas aeruginosa. Current Biology. 28 (13), (2018).
- Popat, R., et al. Environmental modification via a quorum sensing molecule influences the social landscape of siderophore production. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 284 (1852), (2017).
- Schwyn, B., Neilands, J. B. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).
- Sullivan, T. S., Ramkissoon, S., Garrison, V. H., Ramsubhag, A., Thies, J. E. Siderophore production of African dust microorganisms over Trinidad and Tobago. Aerobiologia. 28 (3), 391-401 (2012).
- Buyer, J. S., DeLorenzo, V., Neilands, J. B. Production of the siderophore aerobactin by a halophilic Pseudomonad. Applied and Environmental Microbiology. 57 (8), 2246-2250 (1991).
- Perez-Miranda, S., Cabirol, N., George-Tellez, R., Zamudio-Rivera, L., Fernandez, F. O-CAS, a fast and universal method for siderophore detection. Journal of Microbiological Methods. 70 (1), 127-131 (2007).
- Nakouti, I., Hobbs, G. A new approach to studying ion uptake by actinomycetes. Journal of Basic Microbiology. 53 (11), 913-916 (2013).
- Wang, L. J., et al. Diisonitrile Natural Product SF2768 Functions As a Chalkophore That Mediates Copper Acquisition in Streptomyces thioluteus. Acs Chemical Biology. 12 (12), 3067-3075 (2017).
- Retamal-Morales, G., et al. Detection of arsenic-binding siderophores in arsenic-tolerating Actinobacteria by a modified CAS assay. Ecotoxicology and Environmental Safety. 157, 176-181 (2018).
- Desai, A., Archana, G. Role of Siderophores in Crop Improvement. , (2011).
- Dertz, E. A., Raymond, K. N. Comprehensive coordination chemistry II. Que, L., Tolman, W. B. 8, Elsevier, Ltd. (2003).
- Arora, N. K., Verma, M. Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria. 3 Biotech. 7, 9 (2017).
- Bandyopadhyay, P., Bhuyan, S. K., Yadava, P. K., Varma, A., Tuteja, N. Emergence of plant and rhizospheric microbiota as stable interactomes. Protoplasma. 254 (2), 617-626 (2017).
- Lakshmanan, V., Castaneda, R., Rudrappa, T., Bais, H. P. Root transcriptome analysis of Arabidopsis thaliana exposed to beneficial Bacillus subtilis FB17 rhizobacteria revealed genes for bacterial recruitment and plant defense independent of malate efflux. Planta. 238 (4), 657-668 (2013).
- Sasaki, T., et al. A wheat gene encoding an aluminum-activated malate transporter. The Plant Journal. 37 (5), 645-653 (2004).
- Mahoney, A. K., Yin, C., Hulbert, S. H. Community Structure, Species Variation, and Potential Functions of Rhizosphere-Associated Bacteria of Different Winter Wheat (Triticum aestivum) Cultivars. Frontiers in Plant Science. 8 (132), (2017).
- Rayburn, A. L., Wetzel, J., Baligar, V. Mitotic analysis of sticky chromosomes in aluminum tolerant and susceptible wheat lines grown in soils of differing aluminum saturation. Euphytica. 127 (2), 193-199 (2002).
- McPherson, M. R., Wang, P., Marsh, E. L., Mitchell, R. B., Schachtman, D. P. Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments. Journal of Visualized Experiments. (137), 57932 (2018).
- Mirleau, P., et al. Fitness in soil and rhizosphere of Pseudomonas fluorescens C7R12 compared with a C7R12 mutant affected in pyoverdine synthesis and uptake. FEMS Microbiology Ecology. 34 (1), 35-44 (2000).
- Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. Pyoverdine siderophores: from biogenesis to biosignificance. Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).
- Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. Use of Blue Agar CAS Assay for Siderophore Detection. Journal of Microbiology, Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).
