Summary
Apresentamos um protocolo para a seleção rápida de amostras ambientais para Sideróforo potencial, contribuindo para a biodisponibilidade de micronutrientes e volume de negócios em sistemas terrestres.
Abstract
Sideróforos (metal de peso molecular baixo quelantes compostos) são importantes em vários fenômeno ecológico variando de ferro (Fe) biogeoquímicos Ciclismo nos solos, a concorrência do patógeno, promoção de crescimento de planta e Cruz-Reino de sinalização. Além disso, sideróforos são também de interesse comercial em bioleaching e bioweathering de metais, minerais e minérios. Um meio rápido, custo-eficaz e robusto de avaliar quantitativamente a produção Sideróforo em amostras complexas é a chave para identificar aspectos importantes das ramificações ecológicas de atividade Sideróforo, incluindo, romance Sideróforo produzindo micróbios. O método aqui apresentado foi desenvolvido para avaliar a atividade Sideróforo no tato microbiome comunidades, em amostras ambientais, tais como tecidos de solo ou planta. As amostras foram homogeneizadas e diluídas em meio M9 modificado (sem fé), e culturas de enriquecimento foram incubadas por 3 dias. Produção de Sideróforo foi avaliada em amostras em 24, 48 e 72 horas (h) usando uma romance microplacas de 96 poços CAS (cromo azurol sulfonato)-ensaio de ágar de Fe, uma adaptação do método colorimétrico tradicionalmente tedioso e demorado de avaliação Sideróforo atividade, realizada em individuais isolados microbianos cultivados. Aplicamos o nosso método de 4 diferentes genótipos/linhas de trigo (Triticum aestivum L.), incluindo Lewjain, Madsen e PI561725 e PI561727 comumente cultivada no interior do noroeste do Pacífico. Produção Sideróforo claramente foi impactada pelo genótipo de trigo e em tipos específicos de tecidos vegetais observados. Temos utilizado com sucesso nosso método para a tela rapidamente para a influência do genótipo da planta na produção de Sideróforo, uma função fundamental nos ecossistemas terrestres e aquáticos. Nós produzimos muitas repetições de técnicas, gerando diferenças estatísticas muito confiáveis em solos e em tecidos vegetais. Importante, os resultados mostram que o método proposto pode ser usado para examinar rapidamente a produção Sideróforo em amostras complexas com um alto grau de confiabilidade, de uma forma que permite que as comunidades a ser preservado para posterior trabalho de identificar genes funcionais e táxons.
Introduction
Sideróforos são biomoléculas importantes envolvidos principalmente na quelação de ferro para a biodisponibilidade, mas com uma grande variedade de efeitos adicionais nos ecossistemas terrestres e aquáticos, variando de quórum microbiana sensoriamento, sinalizando a planta microbianas-hosts, promoção de crescimento de planta, cooperação e competição dentro de comunidades microbianas complexas1,2. Sideróforos podem ser classificados de acordo com seus sites ativos e características estruturais, criando quatro tipos básicos: carboxilato, hydroxamate, catecholate e misturado tipos3,4. Muitos microorganismos são capazes de excretar mais de um tipo de Sideróforo5 e nas comunidades do complexas, uma grande maioria dos organismos biossintetize os receptores de membrana para permitir a absorção de uma variedade ainda maior de sideróforos1, 6. Trabalho recente indica que sideróforos são particularmente importantes a nível comunitário e mesmo no Reino inter comunicação e transferências biogeoquímicos7,8,9,10 ,11.
Cromo azurol sulfonato (CAS) tem sido utilizado por mais de 30 anos como um agente quelante para ligar o ferro (Fe) de tal forma que a adição de ligantes (i.e., sideróforos) pode resultar em dissociação do complexo Fe-CAS, criando uma mudança de cor facilmente identificáveis no meio 12. quando o CAS está vinculado com o Fe, o corante aparece como uma cor azul royal, e como o complexo de CAS-Fe dissocia-se, o médio muda de cor de acordo com o tipo de ligante usado para eliminar a Fe13. O inicial, baseada em líquido médio estabelecido por Romualdo Silva e Neilands em 1987, foi modificado de várias maneiras para acomodar a alteração microbiana alvos14, hábitos de crescimento e limitações15, bem como uma variedade de metais além do Fe, incluindo alumínio, manganês, cobalto, níquel cádmio, lítio, zinco16, cobre17e nem arsênico18.
Muitos patógenos humanos, também como planta microorganismos promotores de crescimento (PGPM) foram identificados como organismos produtores de Sideróforo3,19,20e importante rizosfera e endofíticos PGPM frequentemente testar positivo para Sideróforo-produção4. O tradicional método de líquido baseado em Fe foi adaptado para microtitulação testes de isolados no cultivo para produção de Sideróforo21. No entanto, essas técnicas não reconhecem a importância da comunidade microbiana como um todo (o microbiome), em cooperação e Regulamento potencial de produção de Sideróforo no solo e planta sistemas22. Por esse motivo, nós desenvolvemos uma avaliação de nível comunitário alto rendimento de produção Sideróforo de um determinado ambiente, com base no ensaio CAS tradicional, mas com replicação, facilidade de medição, confiabilidade e repetibilidade em uma microplaca do ensaio.
Neste estudo, um ensaio CAS-Fe custo-benefício, alta produtividade para a detecção de produção Sideróforo é apresentado para avaliar o enriquecimento da produção Sideróforo de amostras complexas (ou seja, solo e planta homogenates de tecido). Solo da rizosfera granel, frouxamente ligados e firmemente ligados (em termos de como o solo era vinculado à raiz) foram obtidos juntamente com o grão, atirar e tecidos de raiz de quatro genótipos distintos trigo (Triticum aestivum L.): Lewjain, Madsen, PI561725, e PI561727. Foi hipotetisado que diferenças fundamentais em genótipos de trigo podem resultar em diferenças no recrutamento e selecção de Sideróforo produzindo comunidades. De particular interesse é a diferença entre as comunidades microbianas associadas com a linha isogénicas de PI561725, que é de alumínio tolerante porque possui ALMT1 (alumínio-ativado 1 transportador malato), comparada com o alumínio sensível PI561727 isogénicas linha, que possui uma forma de alumínio não responsiva do gene, almt123,24,25,26. O principal objetivo do estudo foi desenvolver um método simples, rápido de avaliar quantitativamente a produção Sideróforo em culturas de enriquecimento Sideróforo de tipos de amostras complexas, preservando as culturas para trabalhos futuros.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Nota: Localização do campo local: Universidade do estado de Washington, a fazenda de patologia de plantas (46 ° 46' 38,0" N 117 ° 04' 57,4" W). As sementes foram semeadas usando um plantador de mecânico em 19 de outubro de 2017. Cada genótipo de trigo foi plantado em headrows, aproximadamente 1 medidor distante para evitar a sobreposição do sistema radicular. Amostras de solo e planta foram coletadas em 9 de agosto de 2018, quando as plantas estavam prontas para a colheita. Amostras foram coletadas de três repetições de quatro genótipos de trigo: PI561727, PI561725, Madsen, Lewjain.
1. preparação do meio modificado de M9
- Uso at2PO4∙7H2O (12,8 g/200 mL), KH2PO4 (0,3 g/200 mL), NaCl (0,5 g/200 mL) e NH4Cl (1G/20ml) reagentes para preparar a solução de sal de M9.
- Use 18 g de MgSO4∙7H2O em 100 mL de água desionizada dupla (ddH2O) para preparar 0,75 M MgSO4∙7H2O.
- Fazer 1 M de CaCl2∙2H2O adicionando 14,7 g de CaCl2∙2H2O com 100 mL de DDQ2O.
- Prepare a solução-tampão, dissolvendo 6,048 g de tubulações em 156 mL de DDQ2O agitando. Ajuste o pH para 6,8 com 5 M de NaOH.
- Prepare-se 20% de glicose (dextrose monohidrato) dissolvendo-se 20g de glicose em 100 mL de DDQ2O.
- Prepare soluções e individualmente autoclave todos mas a glicose. Filtro de esterilizar a solução de glicose para adição à mídia M9 após autoclavagem (0,22 µm).
- Preparar o meio modificado de M9 misturando 156 mL de solução-tampão de tubulações, 40 mL de solução de sais M9, 20 μL de solução de2O CaCl2·2H e 266 μL de MgSO4·7H2O 4 mL de soluções de glicose 20% juntos na biossegurança armário, usando uma técnica estéril.
- Para preservação do M9 modificada, sele o recipiente, cobrir com papel alumínio para proteger de UV e colocar a 4 ° C.
2. preparação de CAS-Fe-ágar-ágar
- Ácido lavar todos os copos em 100mm HCl/100 mM HNO3 por um período mínimo de 2 h antes da utilização no ensaio CAS.
- Prepare uma assadeira de alumínio preenchida com areia de grau de laboratório e cubra com papel alumínio. Autoclave a 121 ° C por 30 min e reserve.
- Prepare HDTMA (brometo de hexadeciltrimetilamónio), acrescentando 0,0365 g de 20ml ddH2O e colocar a solução a 37 ° C, para promover a solubilização.
- Preparar 10 mM HCl e gerar 1 mM FeCl3·6H2O uso do HCl de 10 milímetros como solvente. Adicione 0,0302 g de CAS para 25 mL de DDQ2O agitando suavemente com uma barra de agitação magnética estéril. Em seguida, adicione 5 mL de 1 mM FeCl3·6H2O (em HCl de 10 milímetros) para os 25 mL de solução de CAS, continuando a agitar suavemente (a solução transforma cor preto avermelhado escuro).
- Adicione lentamente a 20 mL de solução HDTMA, agitando suavemente, para a solução de Fe-CAS (isso resulta em uma solução azul escura).
- Prepare a solução-tampão, dissolvendo 15,12 g de tubulações em 375 mL de DDQ2O, com agitação suave. Ajuste o pH para 6,8 com 5 M de NaOH. Adicione água para o volume para 450 mL. Adicione 5 g de agarose para a solução. Autoclave os tubos buffer de solução e a solução CAS-Fe a 121 ° C por 30 min.
- Cuidadosamente, adicione a totalidade da solução CAS-Fe para a totalidade da reserva no armário a biossegurança tubos após cada um deles é esterilizado.
- Coloque a solução mista em um banho de água a 50 ° C.
Nota: Recentemente prepara todos os reagentes no meio de ágar-CAS-Fe antes de cada ensaio, como o armazenamento a longo prazo em 50 ° C resulta na precipitação dos resultados complexos e resfriamento CAS-Fe em meio solidificado. - Coloque um barco de reagente estéril na areia estéril no armário a biossegurança e calor de 50 ° C. Transferi o CAS-Fe-Agar para o barco e, em seguida, rapidamente alíquota 100 µ l de cada poço em uma microplaca de 96 poços claro, fundo plano, estéril.
3. preparação-padrão Pyoverdine/EDTA
- Preparação do Pyoverdine
- Preparar 800 μM pyoverdine padrão (mistura de ácido succínico, 2-hidroxi-glutaramide e succinaminde formas de pyoverdine – consulte Tabela de materiais), em meio de M9 modificado previamente preparado.
- Dilua esta solução para 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 e 6,25 soluções μM.
- Preparação padrão de EDTA
- Adicionar 0,594 g de ácido etilenodiaminotetracético de dissódico (EDTA: C10H14N2Na2O8.2h2O), a 500 mL de meio de M9 modificado previamente preparado para preparar 3200 μM EDTA padrão.
- Diluir esta solução para 1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 e 6,25 soluções μM.
- Geração da curva padrão
- Adicione 100 μL de cada concentração de pyoverdine e EDTA para separar poços de uma microplaca de 96 poços contendo 100 μL de CAS-Fe do ágar. Fazer duplicadas replicações técnicas de cada concentração. Também, adicionar poços em branco com apenas M9 (sem EDTA ou pyoverdine).
- Usando um leitor de microplacas, medir a absorvância (a 420 nm e 665 nm) após incubação de 1, 6 e 24 h a 22 ° C e medidas de absorvância uso para gerar curvas padrão.
Nota: Para medições de 420 nm, subtrai a absorvância de espaços em branco da absorvância do pyoverdine ou poços contendo EDTA. Para 665 nm, subtrair a absorvância do pyoverdine ou EDTA contendo poços de absorvância de espaços em branco. Em seguida, log10(pyoverdine µM ou EDTA) é regredido contra as medidas de absorvância. Para facilitar a interpretação dos resultados de exemplo, use a absorvância como o eixo x e log10(pyoverdine µM ou EDTA) como o eixo y.
4. coleta de amostras ambientais: tecidos de solo e planta
- Lavar o equipamento de amostragem (pás e tesouras) com 0,22 µm filtrada ddH2O seguido por 70% de etanol e limpe com papel toalha antes da amostragem e entre as amostras para manter uma técnica estéril e reduzir a contaminação.
- Impostos especiais de consumo os tecidos vegetais (grãos e brotos) de plantas no campo e colocá-los em um saco de armazenamento de plástico etiquetados, deixando bastante restolho de atirar para a facilidade no desenraizamento das amostras de solo e raiz desejadas.
- Escavar uma raiz pequena bola aproximadamente 15 cm de profundidade e 23 cm de largura e coloque-o em um saco de plástico separado, etiquetado para preparação da amostra no ambiente de laboratório. Este passo é semelhante aos métodos de McPherson et al27.
- Coloque todas as amostras (grãos, brotos, em massa de solo e bolas de raiz em sacos separados) diretamente no gelo e manter a 4 ° C até que as amostras são processadas para o ensaio de produção Sideróforo.
- Separar amostras de solo de raiz associado em granel, solo frouxamente ligados rizosfera e solo rizosfera firmemente ligados.
- Tire os sacos, as bolas de raiz. Agite delicadamente fora solo da esfera de raiz. Sacudido solo, juntamente com o solo, esquerda na bolsa compreende o solo "em massa".
- Use um martelo de borracha para remover ainda mais solo da esfera de raiz. Este é o solo da rizosfera frouxamente ligados.
- Gere o solo rizosfera firmemente ligados tomando raízes com a amostra firmemente ligados e colocá-los num tubo de centrífuga. Adicionar 30 mL de DDQ2O e vórtice por 2-3 minutos. Remova as raízes para obter a diluição de chorume de solo rizosfera firmemente ligados.
5. preparação de culturas de enriquecimento Sideróforo e ensaio de produção Sideróforo CAS-Fe
Nota: Todos os produtos vidreiros devem ser ácido lavado antes de começar os ensaios.
- Preparação da amostra de solo (para cada um dos tipos de amostra de solo de três)
- Homogeneizar a cada amostra de solo dentro do saco de amostra, misturando e passando o solo o máximo possível sem abrir o saco.
Nota: Isto ajuda a reduzir a variabilidade espacial de solos naturais e alinha-se com os procedimentos de amostragem do solo normal. Outros métodos podem ser utilizados para homogeneizar amostras ambientais, conforme o caso e dependendo do projeto experimental. - Depois de cada amostra foi completamente misturados, alíquota e suspender a 2,0 g de cada solo em 20 mL de meio de M9 modificado, então dilua 10-3 para um volume total de 20 mL em um tubo de centrífuga de 50ml estéril com um plug de espuma estéril para permitir a aeração.
- Para amostras de rizosfera firmemente ligados, adicionar 2 mL de chorume de solo da rizosfera a 20 mL de meio de M9 modificado e, em seguida, diluir 10-3 para um volume total de 20 mL em um tubo de centrífuga de 50ml estéril com um plug de espuma estéril para permitir a aeração.
- Homogeneizar a cada amostra de solo dentro do saco de amostra, misturando e passando o solo o máximo possível sem abrir o saco.
- Preparação da amostra (raiz, atirar e grãos) de tecido
- Superfície de esterilizar a amostra com etanol a 70%. Macerar a 2,0 g de tecido fresco em 20 mL de meio de M9 modificado usando um liquidificador em alta por 30 segundos. Transferir a amostra para um tubo de centrífuga de 50ml estéril e, em seguida, diluir 10-3 para um volume total de 20 mL em um tubo de centrífuga de 50ml estéril com um plug de espuma estéril para permitir a aeração.
- Enriquecimento da produção Sideróforo através da limitação de Fe
- Incubar os tubos de centrífuga de 50 mL à temperatura ambiente e agite a 160 rpm.
6. ensaios de ágar CAS-Fe para a deteção de produção Sideróforo em amostras ambientais
- Em 24, 48 e 72 h após o início da cultura de enriquecimento, remova subamostras de 1 mL de tubos de enriquecimento usando uma técnica estéril e centrifugação a 10.000 x g por 1 min em tubos de centrífuga de 2 mL para peletizar as células.
- Recolha o sobrenadante separado. Utilizando uma técnica estéril, adicione 100 μL do sobrenadante a solução 100 μL de CAS-Fe-ágar-ágar em duplicado ou triplicado na microplaca. Também Adicione 100 µ l de estéril M9 médio (como espaços em branco). Em seguida, incubar a placa a 28 ° C.
- Suspenda o restante do sobrenadante e sedimento para cada amostra (não adicionado à placa de microtitulação) no tubo de centrífuga própria, estéril de 2 mL. Adicionar 400 μL de glicerol estéril em cada tubo de amostra-sobrenadante e ressuspender o precipitado para criar ações de glicerol. Congele o estoque a-80 ° C para posteriores análises.
Nota: Este passo pode ser modificado para gerar ações de glicerol, de acordo com qualquer protocolo preferido em casa. - Medir a absorvância a 6, 24, 48 e 72 h, no comprimento de onda de 420 nm.
- Use curvas padrão geradas a partir de pyoverdine ou EDTA para interpretar medidas de absorvância amostra em termos de pyoverdine equivalentes.
Nota: Pyoverdine estava determinado a ser um padrão superior em comparação com EDTA (vide infra), então o EDTA não foi usado para interpretar os resultados no estudo atual.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Um pyoverdine mistura biossintetizados por Pseudomonas fluorescens foi usado como um padrão para interpretar e quantificar a absorvância (a 420 nm) de amostras em termos de equivalentes de pyoverdine em µM. a Figura 1 mostra a relação entre absorbância (420 nm) e começando a concentração do pyoverdine (molaridade do Log10 em µM). EDTA não forneceram um padrão adequado porque amostras expostas as medidas de absorbância maiores do eram atingíveis com pyoverdine e a R2 foi menor (Figura 2). Enquanto inicial trabalhar usando o ensaio de CAS-Fe como um método de Sideróforo deteção medida absorvância a 630 nm, em um estudo relacionado usando um método muito semelhante (CAS-Fe-ágar foi misturado 1:1 com M9 modificada para gerar uma coluna de 200 µ l em microplate), observou-se que a absorvância do pico foi em 665 nm, mas que 420 nm foi mais reprodutível em termos da evolução absorvância induzida por amostras (Figura 3).
Produção Sideróforo foi observada em culturas de enriquecimento de todos os tipos de tecido após 72 h de enriquecimento Fe-défice e atividade Sideróforo apareceu estabilizar após 48 h de incubação (complementar a Figura 1). Assim, a atividade de Sideróforo do enriquecimento de 72 h foi avaliada em incubação de 48 h para determinar a influência do genótipo e amostra tipo no isolamento Sideróforo (Figura 4). Atividade Sideróforo em amostras de solo em massa foi relativamente baixa e que não mostra as diferenças entre o genótipo de trigo do qual o solo em massa foi amostrada (Figura 4A). Avanços do solo frouxamente ligado isolado do genótipo PI561725 exibiram maior produção Sideróforo, em comparação com solo frouxamente acoplado de Madsen e PI561727, mas não Lewjain (Figura 4B). Produção de Sideróforo em avanços do solo limita firmemente não foi fortemente influenciada pelo genótipo (Figura 4).
Culturas de enriquecimento do tecido grão renderam Sideróforo relativamente baixa produção independentemente do genótipo (Figura 4). Avanços da Lewjain de fotos de tecido tinham produção de Sideróforo significativamente mais baixa do que os outros genótipos, e culturas de tecidos de atirar PI561725 resultou na produção de Sideróforo mais variáveis (Figura 4E). Sideróforo atividade foi mais de 200% maior em culturas de enriquecimento de tecido de raiz do PI561725 comparado com todos os outros genótipos (Figura 4F).
Figura 1. Absorbância a 420 nm e 655 nm regredido contra a concentração de log10 do pyoverdine. (A) absorbância a 420 nm regredido contra a concentração de10 registro do pyoverdine em µM. Uma curva polinomial estava apto para obter uma equação explicativa para interpretar a absorvância em termos de pyoverdine equivalentes. (B) absorvância a 665 nm regredido contra o Log10 concentração do pyoverdine em µM. R2 é o quadrado do coeficiente de correlação de Pearson, e a equação explica a curva equipada. Pontos são duplicados das medições de absorvância no 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 e 6,25 pyoverdine µM após incubação de 6 h a 28 ° C. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Absorbância a 420 nm e 655 nm regredido contra a concentração de log10 de EDTA. (A) absorbância a 420 nm regredido contra a concentração de10 registro de EDTA em µM. Uma curva polinomial estava apto para obter uma equação explicativa para interpretar a absorvância em termos de pyoverdine equivalentes. (B) absorvância a 665 nm regredido contra o Log10 concentração de EDTA em µM. R2 é o quadrado do coeficiente de correlação de Pearson, e a equação explica a curva equipada. Pontos são duplicados das medições de absorvância em 3200, 1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 e 6,25 µM EDTA, após incubação de 6 h a 28 ° C e barras de erro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Absorvância varreduras de nm 315−1000 de poços de microplacas contendo 200 µ l colunas de 1:1 CAS-Fe-Agar e modificado M9 ou M9 médio com Sideróforo produzir amostras. A placa foi incubada a 28 ° C durante 72 horas antes de medir a absorvância em um leitor de microplacas. Varreduras de absorbância mostraram os três espaços em branco que contém nenhuma amostra (linhas pretas) renderam curvas firmemente em cluster com um pico em 665 nm. Absorvância verifica mostrar os três espaços em branco contendo Sideróforo produzir amostras (linhas cinzentas) rendidas curvas com mais variabilidade, mas com mais consistente absorbância a 420 nm comparado com 665 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Pyoverdine equivalentes de culturas de enriquecimento Sideróforo. Pyoverdine equivalentes de culturas de enriquecimento Sideróforo associados em massa (A) (B) frouxamente ligada e (C) rigidamente vinculada a solo, em tecido homogenates de trigo, grão (D) (E) dispara e raízes (F). Culturas de enriquecimento Sideróforo foram incubadas durante 72 h antes de transferir subamostras para uma microplaca e incubando a 28 ° C. Produção de Sideróforo foi avaliada após 48 h de incubação com cromo azurol S. genótipos/linhas são Lew = Lewjain, Mad = Madsen, 725 = PI561725 e 727 = PI561727. Asteriscos representam significado no alpha = 0,008 (após correção de Bonferroni). Bares são o desvio-padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Complementar Figura 1. Pyoverdine equivalentes ao longo do tempo. Pyoverdine equivalentes de culturas de enriquecimento Sideróforo avaliadas após 24, 48 e 72 h de incubação com culturas de enriquecimento do cromo azurol S. Sderophore associados em massa (A) (B) frouxamente ligada, e (C) rigidamente vinculada a solo, e em tecido homogenates de trigo (D) atira em grão (E), e (F) raízes. Culturas de enriquecimento Sideróforo foram incubadas durante 72 h antes de transferir subamostras para uma microplaca e incubando a 28 ° C. e subsampled para avaliar a produção de Sideróforo em cada commit. Genótipos/linhas são Lew = Lewjain, Mad = Madsen, 725 = PI561725 e 727 = PI561727. Produção de Sideróforo foi avaliada após, 24, 48 e 72 h de incubação. Bares são o desvio-padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O resultado principal deste trabalho é a produção de uma nova metodologia que pode ser usada para enriquecer rapidamente para Sideróforo produzindo micróbios ao medir quantitativamente Sideróforo/actividade de produção da amostra ambiental. A metodologia é rápida, simples e econômica, e os resultados mostram como ele pode ser usado para detectar atividade Sideróforo de tipos de amostras complexas e romance (ex.., solo e planta de tecido). O protocolo também resulta na produção de estoques de glicerol das culturas de enriquecimento, que pode facilmente ser tomado através do tempo para acomodar os estudos de mudanças na estrutura da comunidade microbiana e função durante a deficiência de Fe através de DNA ou RNA com base em técnicas . Os interessados em estudar a cinética da atividade Sideróforo em estudos ecológicos também provavelmente poderiam beneficiar deste método. Os resultados mostram também que pyoverdine equivalentes (pyoverdines são sideróforos importantes em termos de ambiente medicina de28 e29) fornecem um bom método de avaliar quantitativamente a produção Sideróforo. Uma constatação importante é a absorbância medidas em 665 nm são insuficientes para determinar a atividade Sideróforo comparada com aqueles observados em 420 nm (Figura 1). De particular importância foi a constatação que absorvância a 665 nm agrupado em uma ampla gama de concentrações de pyoverdine (Pyoverdine µM = 50-800 µM, log10(pyoverdine µM) = 0.18-0,76), sugerindo um teto de deteção neste comprimento de onda (Figura 1B). Note-se que enquanto pyoverdine era um padrão superior em comparação com EDTA, também é caro, então sugere que o trabalho preliminar é realizado com EDTA ou outros quelantes cost-effective para garantir a metodologia tem sido dominado antes gerando pyoverdine padrões.
Existem várias etapas críticas em todo o protocolo que exigem muita atenção. Em primeiro lugar, é importante manter a vidraria metal-free e outros mercadorias, sempre que possível quando trabalhar com metais, especialmente os necessários em baixas concentrações, como Fe. Em segundo lugar, porque as culturas foram enriquecidas para produção de Sideróforo através de limitação de Fe, é importante manter condições assépticas durante todo o fluxo de trabalho para reduzir a influência dos contaminantes ambientais. Por último, a preparação do CAS-Fe-agar requer cuidadosa atenção aos detalhes e deve ser preparada como pròxima o descreveu como possível. Por exemplo, se a solução CAS-Fe-agar é mantida quente, mas não é usada rapidamente, o CAS-Fe irá precipitar. Além disso, é essencial para manter o CAS-Fe-ágar quente durante a transferência para a microplaca. Esta foi conseguida usando aquecido, areia estéril e transferir rapidamente o meio para a microplaca em uma armário de biossegurança.
Uma limitação da metodologia que é porque algumas plantas também produzem sideróforos (phytosiderophores); Estas podem contribuir para a atividade Sideróforo medido em culturas de enriquecimento dos homogenates do tecido de planta. Além disso, houve relativamente alta variabilidade nos resultados de campo réplicas, sugerindo que mais replicação pode ser benéfica em estudos futuros. Outra limitação da técnica é que, enquanto o método de microplacas é elevado-throughput, a coleta de amostra e preparação são demorados. Ainda, porque uma única microplaca pode ser usada para 96 amostras (incluindo normas), as entradas de tempo e custos são muito baixa em comparação com as técnicas existentes. Isto é principalmente porque outros métodos existentes baseiam-se sobre como realizar o ensaio CAS-Fe em placas de Petri,30, que são inerentemente menos tempo e custo eficiente de preparar que uma microplaca. Além disso, porque solubilizados CAS-Fe complexos são propensos a precipitação12, o método proposto, usando de CAS-Fe-ágar-ágar é superior ao líquido-baseado métodos, que também tem de ser adaptado para o formato de 96 poços.
Em termos de resultados relatados, dado que a principal diferença entre o PI561725 e PI561727 é a presença de ALMT1 vs.almt1, respectivamente, os resultados sugerem a presença de ALMT1 os resultados prováveis na seleção de comunidades microbianas em tanto a planta e o solo que têm um maior potencial para produção de Sideróforo, como avaliado através de culturas de enriquecimento. Trabalho futuro deve investigar o fenômeno usando um número maior de repetições, particularmente para esclarecer se a presença de ALMT1 seleciona especificamente para atividade Sideróforo reforçada.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores têm sem conflitos de interesse a divulgar.
Acknowledgments
Os autores desejam agradecer a Kalyani Muhunthan para assistência em procedimentos laboratoriais, Lee Opdahl para a colheita do trigo genótipo, Conselho de pesquisa de Washington estado Uva Concord e centro de Universidade do estado de Washington para sustentar a agricultura e Recursos naturais para um BIOAg conceder para apoiar este trabalho. Adicionais de financiamento foi fornecido pelo USDA/NIFA através de projeto da Hatch 1014527.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Apex | LF451320014 | |
| Aluminum Baking Pan | |||
| Aluminum Foil | |||
| Ammonium chloride, granular | Fiesher Scientific | 152315A | |
| Autoclave and Sterilizer | Thermo Scientific | ||
| Calcium chloride dihydrate | Fiesher Scientific | 171428 | |
| CAS (Chrome Azurol S) | Chem-Impex Int'l Inc) | 000331-27168 | |
| Dextrose Monohydrate (glucose), crystalline powder | Fiesher Scientific | 1521754 | |
| EDTA, disodium salt, dihydrate, Crystal | J.T.Baker | JI2476 | |
| Glycerol, Anhydrous | Baker Analyzed | C22634 | |
| HDTMA (Cetyltrimethylammomonium Bromide | Reagent World | FZ0941 | |
| Hydrochloride acid | ACROS Organic | B0756767 | |
| Infinite M200 PRO plate reader | TECAN | ||
| Iron (III) chloride hexahydrate, 99% | ACROS Organic | A0342179 | |
| Laboratory Fume Hood | Thermo Scientific | ||
| Laboratory Incubator | VWR Scientific | ||
| Magnesium Sulfate | Fiesher Scientific | 27855 | |
| Niric Acid, (69-70)% | J.T.Baker | 72287 | |
| PIPES buffer, 98.5% | ACROS Organic | A0338723 | |
| Potassium phosphate, dibaisc,powder | J.T.Baker | J48594 | |
| Pyoverdine | SIGMA-ALDRICH | 078M4094V | |
| Sand | |||
| SI-600R Shaker | Lab Companion | ||
| Sodium chloride, granular | Fiesher Scientific | 136539 | |
| Sodium hydroxide, pellets | J.T.Baker | G48K53 | |
| Sodium phosphate, dibasic heptahydrate, 99% | ACROS Organic | A0371705 |
References
- Butaite, E., Baumgartner, M., Wyder, S., Kummerli, R. Siderophore cheating and cheating resistance shape competition for iron in soil and freshwater Pseudomonas communities. Nature Communications. 8, (2017).
- Ghirardi, S., et al. Identification of Traits Shared by Rhizosphere-Competent Strains of Fluorescent Pseudomonads. Microbial Ecology. 64 (3), 725-737 (2012).
- Hider, R. C., Kong, X. L. Chemistry and biology of siderophores. Natural Product Reports. 27 (5), 637-657 (2010).
- Saha, M., et al. Microbial siderophores and their potential applications: a review. Environmental Science and Pollution Research. 23 (5), 3984-3999 (2016).
- Bhattacharyya, P. N., Jha, D. K. Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR): emergence in agriculture. World Journal of Microbiology, Biotechnology. 28 (4), 1327-1350 (2012).
- Lewis, R. W., Islam, A., Opdahl, L., Davenport, J. R., Sullivan, T. S. Phylogenetics, Siderophore Production, and Iron Scavenging Potential of Root Zone Soil Bacteria Isolated from 'Concord' Grape Vineyards. Microbial Ecology. , Accepted (2018).
- Li, S. S., et al. The opportunistic human fungal pathogen Candida albicans promotes the growth and proliferation of commensal Escherichia coli through an iron-responsive pathway. Microbiological Research. 207, 232-239 (2018).
- Lorenz, N., Shin, J. Y., Jung, K. Activity, Abundance, and Localization of Quorum Sensing Receptors in Vibrio harveyi. Frontiers in Microbiology. 8, (2017).
- O'Brien, S., Fothergill, J. L. The role of multispecies social interactions in shaping Pseudomonas aeruginosa pathogenicity in the cystic fibrosis lung. Fems Microbiology Letters. 364 (15), (2017).
- Ozkaya, O., Balbontin, R., Gordo, I., Xavier, K. B. Cheating on Cheaters Stabilizes Cooperation in Pseudomonas aeruginosa. Current Biology. 28 (13), (2018).
- Popat, R., et al. Environmental modification via a quorum sensing molecule influences the social landscape of siderophore production. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 284 (1852), (2017).
- Schwyn, B., Neilands, J. B. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).
- Sullivan, T. S., Ramkissoon, S., Garrison, V. H., Ramsubhag, A., Thies, J. E. Siderophore production of African dust microorganisms over Trinidad and Tobago. Aerobiologia. 28 (3), 391-401 (2012).
- Buyer, J. S., DeLorenzo, V., Neilands, J. B. Production of the siderophore aerobactin by a halophilic Pseudomonad. Applied and Environmental Microbiology. 57 (8), 2246-2250 (1991).
- Perez-Miranda, S., Cabirol, N., George-Tellez, R., Zamudio-Rivera, L., Fernandez, F. O-CAS, a fast and universal method for siderophore detection. Journal of Microbiological Methods. 70 (1), 127-131 (2007).
- Nakouti, I., Hobbs, G. A new approach to studying ion uptake by actinomycetes. Journal of Basic Microbiology. 53 (11), 913-916 (2013).
- Wang, L. J., et al. Diisonitrile Natural Product SF2768 Functions As a Chalkophore That Mediates Copper Acquisition in Streptomyces thioluteus. Acs Chemical Biology. 12 (12), 3067-3075 (2017).
- Retamal-Morales, G., et al. Detection of arsenic-binding siderophores in arsenic-tolerating Actinobacteria by a modified CAS assay. Ecotoxicology and Environmental Safety. 157, 176-181 (2018).
- Desai, A., Archana, G. Role of Siderophores in Crop Improvement. , (2011).
- Dertz, E. A., Raymond, K. N. Comprehensive coordination chemistry II. Que, L., Tolman, W. B. 8, Elsevier, Ltd. (2003).
- Arora, N. K., Verma, M. Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria. 3 Biotech. 7, 9 (2017).
- Bandyopadhyay, P., Bhuyan, S. K., Yadava, P. K., Varma, A., Tuteja, N. Emergence of plant and rhizospheric microbiota as stable interactomes. Protoplasma. 254 (2), 617-626 (2017).
- Lakshmanan, V., Castaneda, R., Rudrappa, T., Bais, H. P. Root transcriptome analysis of Arabidopsis thaliana exposed to beneficial Bacillus subtilis FB17 rhizobacteria revealed genes for bacterial recruitment and plant defense independent of malate efflux. Planta. 238 (4), 657-668 (2013).
- Sasaki, T., et al. A wheat gene encoding an aluminum-activated malate transporter. The Plant Journal. 37 (5), 645-653 (2004).
- Mahoney, A. K., Yin, C., Hulbert, S. H. Community Structure, Species Variation, and Potential Functions of Rhizosphere-Associated Bacteria of Different Winter Wheat (Triticum aestivum) Cultivars. Frontiers in Plant Science. 8 (132), (2017).
- Rayburn, A. L., Wetzel, J., Baligar, V. Mitotic analysis of sticky chromosomes in aluminum tolerant and susceptible wheat lines grown in soils of differing aluminum saturation. Euphytica. 127 (2), 193-199 (2002).
- McPherson, M. R., Wang, P., Marsh, E. L., Mitchell, R. B., Schachtman, D. P. Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments. Journal of Visualized Experiments. (137), 57932 (2018).
- Mirleau, P., et al. Fitness in soil and rhizosphere of Pseudomonas fluorescens C7R12 compared with a C7R12 mutant affected in pyoverdine synthesis and uptake. FEMS Microbiology Ecology. 34 (1), 35-44 (2000).
- Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. Pyoverdine siderophores: from biogenesis to biosignificance. Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).
- Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. Use of Blue Agar CAS Assay for Siderophore Detection. Journal of Microbiology, Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).
