Summary
Presenteren we een protocol voor snelle screening van milieu monsters voor siderofoor potentieel bijdragen aan micronutriënt biologische beschikbaarheid en omzet in terrestrische systemen.
Abstract
Siderophores (laag-moleculair gewicht metaal verbindingen chelaat) zijn belangrijk in verschillende ecologische fenomeen variërend van ijzer (Fe) biogeochemische fietsen in de bodem, pathogen competitie, plant groeibevorderaars en cross-Koninkrijk signalering. Bovendien zijn siderophores ook commerciële belangstelling voor bioleaching en bioweathering voor metalen mineralen en ertsen. Een robuuste, snelle en kosteneffectieve middelen van kwantitatief beoordeling siderofoor productie in complexe monsters is de sleutel tot het identificeren van belangrijke aspecten van de ecologische gevolgen van siderofoor activiteit, waaronder, roman siderofoor microben produceren. De methode die hier gepresenteerd is ontwikkeld om de siderofoor activiteiten beoordelen van in-tact microbiome Gemeenschappen, in milieu monsters, zoals grond of plantaardige weefsels. De monsters werden gehomogeniseerd en verdund in een gemodificeerde M9 medium (zonder Fe) en verrijking culturen werden geïncubeerd voor 3 dagen. Siderofoor productie in monsters op 24, 48 en 72 uur (h) met behulp van een roman 96-Wells-microplate CAS (Chrome azurol Boxmark) evalueerden-Fe agar assay, een aanpassing van de traditioneel vervelend en tijdrovend colorimetrische methode voor de beoordeling van siderofoor activiteit, uitgevoerd op afzonderlijke gecultiveerde microbiële isolaten. Wij onze methode aan 4 verschillende genotypen/lijnen van tarwe (Triticum aestivum L.), met inbegrip van Lewjain, Madsen, en PI561725 en PI561727 vaak geteeld in de binnenvaart Pacific Northwest toegepast. Siderofoor productie werd duidelijk beïnvloed door het genotype van tarwe, en met de specifieke soorten plantaardige weefsels waargenomen. We met succes onze methode gebruikt om snel scherm voor de invloed van plant genotype op siderofoor productie, een belangrijke functie in terrestrische en aquatische ecosystemen. Wij geproduceerd vele technische replicaten, opbrengst zeer betrouwbare statistische verschillen in de bodem en in plantaardige weefsels. Nog belangrijker is, blijkt de resultaten dat de voorgestelde methode kan worden gebruikt om snel siderofoor productie in complexe monsters te onderzoeken met een hoge mate van betrouwbaarheid, op een wijze waarmee gemeenschappen te behouden voor latere werk om taxa en functionele genen te identificeren.
Introduction
Siderophores zijn belangrijke biomoleculen betrokken voornamelijk in ijzer-chelatie voor biologische beschikbaarheid, maar met een breed scala van aanvullende doeleinden in terrestrische en aquatische ecosystemen variërend van microbiële quorum sensing, signalering naar microbiële plant-hosts, plant groeibevorderaars, samenwerking en concurrentie binnen de complexe microbiële gemeenschappen1,2. Siderophores kan worden in grote lijnen ingedeeld volgens hun actieve sites en structurele kenmerken, maken van de vier basistypen: carboxylaat, hydroxamate, catecholate, en gemengde typen3,4. Vele micro-organismen kunnen afscheiden van meer dan één type van siderofoor5 en in complexe Gemeenschappen, een overgrote meerderheid van de organismen biosynthesize de membraan receptoren zodat de opname van een nog breder scala aan siderophores1, 6. Recent werk geeft aan dat siderophores met name van belang op communautair niveau, en zelfs in het Koninkrijk van de onderlinge communicatie en biogeochemische overdrachten7,8,9,10 zijn ,11.
Chroom azurol Boxmark (CAS) is gebruikt voor meer dan 30 jaar als een chelaatvormer te binden ijzer (Fe) op een zodanige wijze dat toevoeging van liganden (bijvoorbeeld siderophores) leiden dissociatie van het CAS-Fe-complex tot kan, het creëren van een herkenbaar kleurverandering in het medium 12. Wanneer de CAS is gebonden met Fe, de kleurstof wordt weergegeven als een Koninklijk blauwe kleur, en als de CAS-Fe-complex distantieert, het medium verandert van kleur afhankelijk van de soort ligand gebruikt voor het opruimen van de Fe-13. Het medium van het oorspronkelijke, op vloeistof gebaseerde opgericht door Schwyn en Neilands in 1987, is gewijzigd in veel opzichten voor wijzigen van microbiële doelstellingen14, groei gewoonten en beperkingen15, evenals een verscheidenheid van metalen naast Fe, met inbegrip van aluminium, mangaan, kobalt, cadmium, nikkel, lithium, zink16, koperen17en zelfs arseen18.
Veel menselijke pathogenen, zo goed als plant groei bevorderen van micro-organismen (PGPM) zijn geïdentificeerd als siderofoor-producerende organismen3,19,20, en belangrijke rhizosfeer en endophytic PGPM vaak testen positief voor siderofoor-productie4. De traditionele Fe-gebaseerde vloeibare methode is aangepast aan de microtiterplaat testen van isolaten in teelt voor siderofoor productie21. Echter deze technieken niet om te erkennen het belang van de microbiële Gemeenschap als geheel (de microbiome), in samenwerking en mogelijke regulering van de productie van siderofoor in bodem en plant systemen22. Om die reden hebben we een high-throughput Gemeenschapsniveau beoordeling van de siderofoor productie van een bepaald milieucompartiment, gebaseerd op de traditionele CAS assay, maar met replicatie, gebruiksgemak meting, betrouwbaarheid en herhaalbaarheid in een microplate assay.
In deze studie is een kosteneffectieve, hoge-doorvoer CAS-Fe-assay voor het opsporen van siderofoor productie bedoeld om te beoordelen van de verrijking van de siderofoor productie van complexe monsters (dat wil zeggen, bodem en plant weefsel homogenates). Bulk, losjes-gebonden en strak gebonden rhizosfeer bodem (in termen van hoe de bodem was gebonden aan de wortel) samen met graan, schieten en wortel weefsels uit vier verschillende tarwe (Triticum aestivum L.) genotypen werden verkregen: Madsen, Lewjain, PI561725, en PI561727. Het was veronderstelde dat fundamentele verschillen in de genotypen van tarwe kunnen leiden tot verschillen in werving en selectie van siderofoor productie van gemeenschappen. Van bijzonder belang is het verschil tussen microbiële gemeenschappen die zijn gekoppeld aan de isogene lijn van PI561725, die is aluminium tolerant omdat het bezit ALMT1 (aluminium-geactiveerde Malate Transporter 1), in vergelijking met de aluminium gevoelige PI561727 isogene lijn, die beschikt over een niet-aluminium responsieve vorm van het gen, almt123,24,25,26. Het hoofddoel van de studie was een eenvoudige, snelle methode van het kwantitatief beoordeling van productie van het siderofoor in siderofoor verrijking culturen van complexe monster typen met behoud van de culturen voor toekomstige werkzaamheden te ontwikkelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Locatie van veld-Site: Washington State University, Plant Pathology boerderij (46 ° 46' 38,0" N 117 ° 04' 57,4 ' W). Zaden werden ingezaaid met behulp van een mechanische planter op 19 oktober 2017. Het genotype van elke tarwe werd geplant in headrows, ongeveer 1 meter uit elkaar overlappende van wortelsysteem te vermijden. Planten- en grond monsters werden verzameld op 9 augustus 2018, wanneer de planten klaar voor oogst waren. Monsters werden verzameld uit drie replicaat-organismen van vier tarwe genotypen: PI561727, Lewjain, PI561725, Madsen.
1. bereiding van gemodificeerde M9 medium
- Gebruik nb2PO4∙7H2O (12,8 g/200 mL), KH2PO4 (0,3 g/200 mL), NaCl (0,5 g/200 mL) en NH4Cl (1 g/20 mL) reagentia te bereiden de M9 zoutoplossing.
- 18 g MgSO4∙7H,2O in 100 mL dubbele gedeïoniseerd water (ddH2van O) gebruiken om te bereiden 0,75 M MgSO4∙7H2O.
- 1 M CaCl2∙2H,2O maken door toevoeging van 14,7 g CaCl2∙2H,2O met 100 mL ddH2O.
- Bereid de bufferoplossing door het oplossen van 6.048 g van buizen in 156 mL van ddH2O met roeren. Breng de pH op 6,8 met 5 M NaOH.
- 20% glucose (dextrose monohydraat) voor te bereiden door het oplossen van 20 g glucose in 100 mL ddH2O.
- Het bereiden van oplossingen en individueel autoclaaf alle maar de glucose. Filter steriliseren de glucose-oplossing voor toevoeging aan de M9 media na autoclaaf (0,22 µm).
- Bereid het gemodificeerde M9 medium door het mengen van 156 mL bufferoplossing PIJPEN, 40 mL M9 zouten oplossing, 20 μL van CaCl2·2H2O oplossing, 266 μL van MgSO4·7H2O en 4 mL 20% glucose oplossingen samen in het biosafety kabinet, met behulp van steriele techniek.
- Voor behoud van de gemodificeerde M9, verzegelen van de container, dek af met aluminiumfolie te beschermen tegen UV, en plaats bij 4 ° C.
2. voorbereiding van CAS-Fe-Agar medium
- Zuur wassen alle glaswerk in 100 mM HCl/100 mM HNO3 voor een minimum van 2 uur voorafgaand aan gebruik in de CAS-bepaling.
- Bereiden van een aluminium pan bakken gevuld met laboratorium rang zand en bedek het met aluminiumfolie. Autoclaaf bij 121 ° C gedurende 30 min en braaklegging.
- HDTMA (hexadecyltrimethylammonium bromide) voor te bereiden door toevoeging van 0.0365 g aan 20 mL ddH2O en plaats van de oplossing bij 37 ° C ter bevordering van solubilisatie.
- Bereiden van 10 mM HCl en genereren van 1 mM FeCl3·6H2O met behulp van 10 mM HCl als het oplosmiddel. Voeg 0.0302 g van Certificeringsinstanties tot 25 mL van ddH2O terwijl zachtjes roeren met een steriele magnetische roer bar. Voeg vervolgens 5 mL van 1 mM FeCl3·6H2O (in 10 mM HCl) om de 25 mL van de oplossing van de CAS terwijl het voortdurend zachtjes roeren (de oplossing verandert in donker roodachtig zwarte kleur).
- Voeg langzaam de 20 mL van de oplossing van de HDTMA terwijl het zachtjes roeren, in de oplossing van de Fe-CAS (dit resulteert in een donker blauwe oplossing).
- Bereid de bufferoplossing door ontbinding 15.12 g van buizen in 375 mL van ddH2O, met zachte roeren. Breng de pH op 6,8 met 5 M NaOH. Voeg om het volume tot 450 mL water toe. Voeg toe 5 g agarose aan de oplossing. Autoclaaf de leidingen buffer oplossing en de CAS-Fe oplossing bij 121 ° C gedurende 30 minuten.
- Voeg voorzichtig het geheel van de CAS-Fe oplossing om het geheel van de Buffer van de buizen in de bioveiligheid kabinet na elk van hen is een gesteriliseerde met autoclaaf.
- Plaats de gemengde oplossing in een waterbad van 50 ° C.
Opmerking: Vers bereiden alle reagentia in het medium van de CAS-Fe-Agar vóór elke assay, als op lange termijn opslag bij 50 ° C resulteert in een neerslag van de CAS-Fe complex en koeling resultaten in gestolde medium. - Plaats een steriele reagens boot in de steriel zand in het biosafety kabinet en warmte tot 50 ° C. De CAS-Fe-Agar overbrengen in de boot, dan snel aliquoot 100 µL aan elk putje in een duidelijke, flat-bottom, steriele 96-Wells-microplate.
3. Pyoverdine/EDTA standaard voorbereiding
- Pyoverdine voorbereiding
- Bereid 800 μM pyoverdine (mengsel van barnsteenzuur, 2-hydroxy-glutaramide en succinaminde vormen van pyoverdine – Zie Tabel of Materials), eerder bereid gemodificeerde M9 medium.
- Verdun deze oplossing in 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 en 6,25 μM oplossingen.
- EDTA standaard voorbereiding
- Voeg Dinatrium ethyleendiamminetetra zuur 0.594 g (EDTA: C10H14N2Na2O8.2H2O), 500 ml eerder bereid gemodificeerde M9 middellange tot 3200 μM EDTA standaard voor te bereiden.
- Verdun deze oplossing in 1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 en 6,25 μM oplossingen.
- Standaard curve generatie
- Voeg 100 μl van elke concentratie van pyoverdine en EDTA te scheiden wells van een 96-Wells-microplate met 100 μl van CAS-Fe Agar medium. Maken van dubbele technische replicaties voor elke concentratie. Ook het toevoegen van lege putjes met alleen M9 (geen EDTA of pyoverdine).
- Met behulp van een microplate reader, meet extinctie (op 420 nm en 665 nm) na 1, 6 en 24 uur incubatie bij 22 ° C en gebruik extinctie metingen voor het genereren van standaard curven.
Opmerking: Voor 420 nm metingen, aftrekken extinctie van vormstukken uit de extinctie van pyoverdine of EDTA bevatten wells. Voor 665 nm, aftrekken van de extinctie van pyoverdine of EDTA met putten van de extinctie van de blanco. Dan is log10(µM pyoverdine of EDTA) teruggelopen tegen de extinctie metingen. Voor het gemak van het interpreteren van de resultaten van de steekproef, extinctie gebruiken als de x-as en meld u10(µM pyoverdine of EDTA) als de y-as.
4. verzameling van milieu monsters: bodem en plant weefsels
- Wassen van bemonstering apparatuur (schoppen en schaar) met 0,22 µm gefilterd ddH2O gevolgd door 70% ethanol, en veeg met papieren handdoeken vóór de bemonstering en tussen monsters te handhaven van de steriele techniek en verminderen kruisbesmetting.
- Accijnzen van de plantaardige weefsels (korrels en scheuten) van planten in het veld, en plaats ze in een gelabelde kunststof opbergtas, verlaten genoeg schieten stoppels voor het gemak in het ontwortelen de gewenste monsters voor bodem- en wortel.
- Excavata een kleine wortel bal ongeveer 15 cm diep en 23 cm breed en plaats deze in een aparte, gelabelde plastic zak voor de bereiding van de monsters in de testomgeving. Deze stap is vergelijkbaar met de methoden van McPherson et al.27.
- Plaats alle monsters (granen, scheuten, bulk bodem en wortel ballen in aparte zakken) rechtstreeks op ijs en droog bij 4 ° C tot monsters worden verwerkt voor de siderofoor productie assay.
- Aparte wortel verbonden bodemmonsters in bulk, losjes gebonden rhizosfeer bodem en strak gebonden rhizosfeer bodem.
- Neem de wortel ballen uit de zakken. Zachtjes afschudden bodem van de bal van de wortel. Afgeschud bodem, samen met de bodem links in de tas bestaat uit de bodem "bulk".
- Gebruik een rubber hamer om verdere bodem van de bal van de wortel. Dit is de bodem losjes gebonden rhizosfeer.
- Strak-gebonden rhizosfeer bodem genereren door het nemen van wortels met het strak-gebonden monster en brengen hen in een centrifugebuis. Voeg 30 mL ddH2O en vortex voor 2-3 minuten. Wortels om de strak-gebonden rhizosfeer bodem drijfmest verdunning te verwijderen.
5. bereiding van siderofoor verrijking culturen en CAS-Fe siderofoor productie kwantitatieve analyse
Opmerking: Alle glaswerk moet zuur gewassen voorafgaand aan het begin van de tests.
- Bereiding van de monsters van de bodem (voor elk van de drie bodemtypes monster)
- Elk bodemmonster binnen de bemonsteringszak, Meng door mixen en draaien van de bodem zoveel mogelijk zonder het openen van de zak.
Opmerking: Dit vermindert het aantal natuurlijke bodem ruimtelijke variabiliteit en uitgelijnd met normale bodem bemonsteringsprocedures. Andere methoden kunnen worden gebruikt om het homogeniseren van milieu monsters, zo nodig, en afhankelijk van de proefopzet. - Nadat elk monster geweest grondig gemengde, aliquoot en schorten 2.0 g van de bodem in 20 mL gemodificeerde M9 voedingsbodem, vervolgens Verdun 10-3 tot een totaal volume van 20 mL in een centrifugebuis steriele 50 mL met een steriele schuim stekker toe beluchting.
- Voor strak gebonden rhizosfeer monsters, voeg toe 2 mL van de rhizosfeer bodem drijfmest tot 20 mL gemodificeerde M9 medium, dan Verdun 10-3 tot een totaal volume van 20 mL in een centrifugebuis steriele 50 mL met een steriele schuim stekker toe beluchting.
- Elk bodemmonster binnen de bemonsteringszak, Meng door mixen en draaien van de bodem zoveel mogelijk zonder het openen van de zak.
- Bereiding van de monsters (wortel, schieten en graan) van het weefsel
- Oppervlak steriliseren het monster met 70% ethanol. Maceraat 2.0 g van vers weefsel in 20 mL gemodificeerde M9 voedingsbodem met behulp van een mixer op hoge voor 30 seconden. Het monster overbrengen in een centrifugebuis steriele 50 mL en Verdun 10-3 tot een totaal volume van 20 mL in een centrifugebuis steriele 50 mL met een steriele schuim stekker toe beluchting.
- Verrijking van de siderofoor productie door middel van Fe beperking
- 50 mL centrifuge buizen bij kamertemperatuur incuberen en schudden bij 160 rpm.
6. CAS-Fe agar tests voor de opsporing van siderofoor productie in milieu monsters
- Op 24, 48 en 72 uur na de inleiding van de cultuur van de verrijking, door 1 mL deelmonsters te verwijderen van de buizen van de verrijking met steriele techniek en centrifuge op 10.000 x g gedurende 1 min. in 2 mL centrifuge buizen aan de pelletize van de cellen.
- Het verzamelen van het supernatans dat gescheiden. Met behulp van steriele techniek, 100 μL van de bovendrijvende substantie aan 100 μl oplossing van CAS-Fe-Agar in dubbele of drievoud in de microplate toevoegen. Ook Voeg 100 µL van steriele M9 medium (als leeg). Vervolgens Incubeer de plaat bij 28 ° C.
- De resterende supernatant en pellet voor elk monster (niet toegevoegd aan de microtiterplaat plaat) in zijn eigen, steriele 2 mL centrifugebuis opschorten. Voeg 400 μL van steriele glycerol in elke buis monster-supernatant en resuspendeer de pellet tot glycerol voorraden. Het bevriezen van de voorraad op-80 ° C voor latere analyses.
Opmerking: Deze stap kan worden aangepast voor het genereren van glycerol voorraden volgens een in-house voorkeursprotocol. - Meet de extinctie op 6, 24, 48 en 72 uur, bij 420 nm golflengte.
- Gebruik standaard curven gegenereerd op basis van pyoverdine of EDTA te kunnen interpreteren monster extinctie metingen op het gebied van pyoverdine-equivalenten.
Opmerking: Pyoverdine was vastbesloten te zijn een superieure standaard in vergelijking met EDTA (vide infra), dus EDTA was niet gewend aan het interpreteren van de resultaten in de huidige studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een pyoverdine mengsel levende door Pseudomonas fluorescens werd gebruikt als een standaard voor het interpreteren en kwantificeren van de extinctie (op 420 nm) van monsters in termen van pyoverdine equivalenten in µM. Figuur 1 toont de relatie tussen extinctie (420 nm) en het starten van de concentratie van pyoverdine (Log10 molarity in µM). EDTA verstrekten niet een voldoende mate omdat monsters tentoongesteld meer extinctie metingen dan waren haalbaar met pyoverdine, en de R-2 was lager (Figuur 2). Terwijl de eerste werkt met behulp van de CAS-Fe-test als een methode van siderofoor detectie gemeten absorptie bij 630 nm, in een gerelateerde studie met behulp van een zeer vergelijkbare methode (CAS-Fe-Agar werd gemengd 1:1 met gemodificeerde M9 voor het genereren van een 200 µL-kolom in de microplate), werd naar voren gebracht dat de piek-extinctie was op 665 nm, maar die 420 nm was meer reproduceerbare in termen van veranderingen in de extinctie geïnduceerd door monsters (Figuur 3).
Siderofoor productie werd waargenomen in culturen van de verrijking van alle weefseltypes (HLA) na 72 h van Fe-tekort verrijkings- en siderofoor activiteit leek te stabiliseren na 48u van incubatie (aanvullende figuur 1). Dus werd siderofoor activiteit van de verrijking van 72 h beoordeeld op 48 uur incubatie om te bepalen van de invloed van het genotype en monster type op siderofoor isolatie (Figuur 4). Siderofoor activiteit in bulk bodemmonsters relatief laag was en deed niet vertonen verschillen tussen het genotype van de tarwe waaruit de bodem van de bulk werd bemonsterd (figuur 4A). Verrijking van losjes gebonden bodem geïsoleerd van het genotype PI561725 tentoongesteld grotere productie van de siderofoor vergeleken met losjes gebonden bodem van Madsen en PI561727, maar niet Lewjain (figuur 4B). Siderofoor productie in de verrijking van strak gebonden bodem was niet zwaar beïnvloed door genotype (figuur 4C).
Verrijking culturen van graan weefsel leverde relatief lage siderofoor productie ongeacht genotype (Figuur 4 d). Verrijking van Lewjain schieten weefsel had aanzienlijk lagere siderofoor productie dan de andere genotypes, en PI561725 schieten weefselcultures resulteerde in meer variabele siderofoor productie (figuur 4E). Siderofoor activiteit was meer dan 200% groter in in wortel weefselcultures van de verrijking van PI561725 in vergelijking met alle andere genotypen (figuur 4F).
Figuur 1. Absorptie bij 420 nm en 655 nm achteruitgegaan tegen de log10-concentratie van pyoverdine. (A) absorptie bij 420 nm achteruitgegaan tegen de log10 concentratie van pyoverdine in µM. Een polynomiale curve was geschikt voor een verklarende vergelijking voor het interpreteren van de extinctie in termen van pyoverdine-equivalenten. (B) absorptie bij 665 nm achteruitgegaan tegen het logboek10 concentratie van pyoverdine in µM. R2 is het kwadraat van de correlatiecoëfficiënt van Pearson, en de vergelijking verklaart de ingerichte curve. Punten zijn dubbel extinctie metingen op 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 en 6,25 µM pyoverdine na 6 uur broedtijd bij 28 ° C. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Absorptie bij 420 nm en 655 nm achteruitgegaan tegen de log10-concentratie van EDTA. (A) absorptie bij 420 nm achteruitgegaan tegen de concentratie van de log-10 van EDTA in µM. Een polynomiale curve was geschikt voor een verklarende vergelijking voor het interpreteren van de extinctie in termen van pyoverdine-equivalenten. (B) absorptie bij 665 nm achteruitgegaan tegen het logboek10 concentratie van EDTA in µM. R2 is het kwadraat van de correlatiecoëfficiënt van Pearson, en de vergelijking verklaart de ingerichte curve. Punten zijn duplicaten van extinctie metingen bij 3200, 1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 en 6,25 µM EDTA na 6 uur broedtijd bij 28 ° C en foutbalken. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. Extinctieverhouding van 315−1000 nm van microplate putten met 200 µL kolommen van 1:1 CAS-Fe-Agar scant en bewerkt M9 of M9 medium met siderofoor produceren monsters. De plaat werd gedurende 72 uur vóór het meten van de extinctie in een microplate-lezer bij 28 ° C geïncubeerd. Absorptie scans tonen de drie blanco met geen enkel monster (zwarte lijnen) leverde strak geclusterde krommen met een piek op 665 nm. Absorptie scant Toon de drie blanco met siderofoor productie van monsters (grijze lijnen) leverde krommen met meer variabiliteit, maar met meer consistente absorptie bij 420 nm vergeleken met 665 nm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4. Pyoverdine-equivalenten van siderofoor verrijking culturen. Pyoverdine-equivalenten van siderofoor verrijking culturen gekoppeld (A) bulk (B) losjes gebonden, en (C) strak gebonden bodem, in weefsel homogenates van tarwe schiet (D) graan (E) en (F) wortels. Siderofoor verrijking culturen werden geïncubeerd gedurende 72 uur vóór de deelmonsters overbrengen naar een microplate en incuberen bij 28 ° C. Siderofoor productie evalueerden na 48u van incubatie met Chrome azurol S. genotypen/lijnen zijn Lew Lewjain, Mad = = Madsen, 725 = PI561725 en 727 = PI561727. Sterretjes vertegenwoordigen betekenis Alfa = 0,008 (na Bonferroni correctie). Bars zijn standaarddeviatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende figuur 1. Pyoverdine-equivalenten na verloop van tijd. Pyoverdine-equivalenten van siderofoor verrijking culturen beoordeeld na 24, 48 en 72 uur incubatie met Chrome azurol S. Sderophore verrijking culturen is gekoppeld (A) bulk (B) losjes gebonden, en (C) strak bodem gebonden, en in weefsel homogenates van tarwe (D) schiet graan (E) en (F) wortels. Siderofoor verrijking culturen werden geïncubeerd gedurende 72 uur vóór de deelmonsters overbrengen naar een microplate en incuberen bij 28 ° C. en subsampled om te beoordelen van de productie van de siderofoor bij elke timepoint. Genotypen/lijnen zijn Lew Lewjain, Mad = = Madsen, 725 = PI561725 en 727 = PI561727. Siderofoor productie na, 24, 48 en 72 uur incubatie werd geëvalueerd. Bars zijn standaarddeviatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het belangrijkste resultaat van dit werk is de productie van een nieuwe methodologie die kan worden gebruikt om snel verrijken siderofoor microben produceren tijdens het kwantitatief meten van siderofoor productie/activiteit in het milieu monster. De methodologie is snel, eenvoudig en kosteneffectief, en de resultaten laten zien hoe het kan worden gebruikt voor het detecteren van siderofoor activiteit van complexe en nieuwe monster typen (b.v.., bodem en plant weefsel). Het protocol ook resulteert in de productie van glycerol voorraden van de culturen van de verrijking, die kan gemakkelijk worden genomen door de tijd voor studies van verschuivingen in microbiële Gemeenschap structuur en functie tijdens Fe deficiëntie via DNA of RNA gebaseerd technieken . Wie geïnteresseerd is in de behandeling van de kinetiek van siderofoor activiteit in ecologische studies kon waarschijnlijk ook profiteren van deze methode. De resultaten laten ook zien dat pyoverdine equivalenten (pyoverdines zijn belangrijke siderophores op het gebied van het milieu28 en geneeskunde29) een goede methode bieden van het kwantitatief beoordeling siderofoor productie. Een belangrijke vaststelling is dat extinctie metingen op 665 nm volstaan voor het bepalen van de activiteit van de siderofoor vergeleken met die waargenomen bij 420 nm (Figuur 1). Van bijzonder belang was de bevinding dat absorptie bij 665 nm geclusterd in een brede waaier van pyoverdine concentraties (Pyoverdine µM = 50-800 µM, log10(µM pyoverdine) = 0.18-0.76), suggereren een detectie-plafond bij deze golflengte (figuur 1b). opgemerkt moet worden dat terwijl pyoverdine een superieure standaard in vergelijking met EDTA was, het is ook duur, dus het is gesuggereerd dat voorbereidende werkzaamheden is uitgevoerd met EDTA of andere kosteneffectieve chelaatvormers om ervoor te zorgen de methodologie heeft gemasterd vóór het genereren van pyoverdine normen.
Er zijn verschillende kritische stappen in het gehele protocol die aandacht vereisen. In de eerste plaats is het belangrijk om metaalvrije glaswerk en andere waren waar mogelijk wanneer werken met metalen, met name van die welke noodzakelijk zijn in lage concentraties, zoals Fe. Ten tweede, omdat culturen werden verrijkt voor de productie van de siderofoor door middel van Fe beperking, is het belangrijk om aseptische condities gedurende de werkstroom om de invloed van milieucontaminanten. Ten slotte, voorbereiding van de CAS-Fe-agar vereist zorgvuldige aandacht voor detail en moet als nauw omschreven als mogelijk. Bijvoorbeeld, als de oplossing van de CAS-Fe-agar wordt gehouden warm maar niet snel wordt gebruikt, neerslaat de CAS-Fe. Bovendien is het essentieel de CAS-Fe-Agar om warm te houden tijdens de overdracht aan de microplate. Dit werd bereikt door het gebruik van verwarmd, steriel zand en snel overbrengen van het medium naar de microplate in een kabinet bioveiligheid.
Een beperking van de methodologie is dat omdat sommige planten produceren ook siderophores (phytosiderophores); Dit kunnen bijdragen tot de gemeten siderofoor activiteit in verrijking culturen van plantaardige weefsels homogenates. Ook was er een relatief hoge variabiliteit in de resultaten van het veld wordt gerepliceerd, suggereren dat meer replicatie kan worden heilzaam bij toekomstige studies. Een andere beperking van de techniek is dat terwijl de microplate-methode is high-throughput, het monster te verzamelen en voorbereiding zijn tijdrovend. Nog steeds, omdat een enkele microplate kan worden gebruikt voor 96 monsters (met inbegrip van de normen), de ingangen tijd en kosten zijn veel lager in vergelijking met bestaande technieken. Dit is vooral omdat andere bestaande methoden afhankelijk zijn van het uitvoeren van de bepaling van de CAS-Fe in petrischalen30, die inherent minder tijd en kostenefficiënt te bereiden dan een microplate. Bovendien, omdat ontbindend CAS-Fe complexen gevoelig voor neerslag12 zijn, is de voorgestelde methode met behulp van CAS-Fe-Agar medium superieur aan vloeistof gebaseerde methoden, die hebben ook worden aangepast naar de 96-Wells-indeling.
In termen van de gerapporteerde bevindingen, gezien het feit dat het primaire verschil tussen de PI561725 en de PI561727 de aanwezigheid van ALMT1 versus.almt1, respectievelijk is, suggereren de resultaten de aanwezigheid van ALMT1 verwachten resultaten in de selectie van microbiële gemeenschappen in zowel de planten als de bodem hebben een groter potentieel voor de productie van de siderofoor, als de beoordeelde via de culturen van de verrijking. Toekomstige werkzaamheden moet verdere onderzoeken het verschijnsel met behulp van een groter aantal replicatieonderzoeken, met name om te verduidelijken wanneer de aanwezigheid van ALMT1 specifiek voor verbeterde siderofoor activiteit kiest.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen conflicten van belang om te vermelden.
Acknowledgments
De auteurs bedank Kalyani Muhunthan voor hulp bij het laboratorium procedures, Lee Opdahl voor het oogsten van tarwe-genotype, de Washington State Concord druif Research Council en de Washington State University Center voor duurzame landbouw en Natuurlijke middelen voor een BIOAg verlenen om dit werk te ondersteunen. Aanvullende financiering werd verstrekt door de USDA/NIFA via Hatch-project 1014527.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Apex | LF451320014 | |
| Aluminum Baking Pan | |||
| Aluminum Foil | |||
| Ammonium chloride, granular | Fiesher Scientific | 152315A | |
| Autoclave and Sterilizer | Thermo Scientific | ||
| Calcium chloride dihydrate | Fiesher Scientific | 171428 | |
| CAS (Chrome Azurol S) | Chem-Impex Int'l Inc) | 000331-27168 | |
| Dextrose Monohydrate (glucose), crystalline powder | Fiesher Scientific | 1521754 | |
| EDTA, disodium salt, dihydrate, Crystal | J.T.Baker | JI2476 | |
| Glycerol, Anhydrous | Baker Analyzed | C22634 | |
| HDTMA (Cetyltrimethylammomonium Bromide | Reagent World | FZ0941 | |
| Hydrochloride acid | ACROS Organic | B0756767 | |
| Infinite M200 PRO plate reader | TECAN | ||
| Iron (III) chloride hexahydrate, 99% | ACROS Organic | A0342179 | |
| Laboratory Fume Hood | Thermo Scientific | ||
| Laboratory Incubator | VWR Scientific | ||
| Magnesium Sulfate | Fiesher Scientific | 27855 | |
| Niric Acid, (69-70)% | J.T.Baker | 72287 | |
| PIPES buffer, 98.5% | ACROS Organic | A0338723 | |
| Potassium phosphate, dibaisc,powder | J.T.Baker | J48594 | |
| Pyoverdine | SIGMA-ALDRICH | 078M4094V | |
| Sand | |||
| SI-600R Shaker | Lab Companion | ||
| Sodium chloride, granular | Fiesher Scientific | 136539 | |
| Sodium hydroxide, pellets | J.T.Baker | G48K53 | |
| Sodium phosphate, dibasic heptahydrate, 99% | ACROS Organic | A0371705 |
References
- Butaite, E., Baumgartner, M., Wyder, S., Kummerli, R. Siderophore cheating and cheating resistance shape competition for iron in soil and freshwater Pseudomonas communities. Nature Communications. 8, (2017).
- Ghirardi, S., et al. Identification of Traits Shared by Rhizosphere-Competent Strains of Fluorescent Pseudomonads. Microbial Ecology. 64 (3), 725-737 (2012).
- Hider, R. C., Kong, X. L. Chemistry and biology of siderophores. Natural Product Reports. 27 (5), 637-657 (2010).
- Saha, M., et al. Microbial siderophores and their potential applications: a review. Environmental Science and Pollution Research. 23 (5), 3984-3999 (2016).
- Bhattacharyya, P. N., Jha, D. K. Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR): emergence in agriculture. World Journal of Microbiology, Biotechnology. 28 (4), 1327-1350 (2012).
- Lewis, R. W., Islam, A., Opdahl, L., Davenport, J. R., Sullivan, T. S. Phylogenetics, Siderophore Production, and Iron Scavenging Potential of Root Zone Soil Bacteria Isolated from 'Concord' Grape Vineyards. Microbial Ecology. , Accepted (2018).
- Li, S. S., et al. The opportunistic human fungal pathogen Candida albicans promotes the growth and proliferation of commensal Escherichia coli through an iron-responsive pathway. Microbiological Research. 207, 232-239 (2018).
- Lorenz, N., Shin, J. Y., Jung, K. Activity, Abundance, and Localization of Quorum Sensing Receptors in Vibrio harveyi. Frontiers in Microbiology. 8, (2017).
- O'Brien, S., Fothergill, J. L. The role of multispecies social interactions in shaping Pseudomonas aeruginosa pathogenicity in the cystic fibrosis lung. Fems Microbiology Letters. 364 (15), (2017).
- Ozkaya, O., Balbontin, R., Gordo, I., Xavier, K. B. Cheating on Cheaters Stabilizes Cooperation in Pseudomonas aeruginosa. Current Biology. 28 (13), (2018).
- Popat, R., et al. Environmental modification via a quorum sensing molecule influences the social landscape of siderophore production. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 284 (1852), (2017).
- Schwyn, B., Neilands, J. B. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).
- Sullivan, T. S., Ramkissoon, S., Garrison, V. H., Ramsubhag, A., Thies, J. E. Siderophore production of African dust microorganisms over Trinidad and Tobago. Aerobiologia. 28 (3), 391-401 (2012).
- Buyer, J. S., DeLorenzo, V., Neilands, J. B. Production of the siderophore aerobactin by a halophilic Pseudomonad. Applied and Environmental Microbiology. 57 (8), 2246-2250 (1991).
- Perez-Miranda, S., Cabirol, N., George-Tellez, R., Zamudio-Rivera, L., Fernandez, F. O-CAS, a fast and universal method for siderophore detection. Journal of Microbiological Methods. 70 (1), 127-131 (2007).
- Nakouti, I., Hobbs, G. A new approach to studying ion uptake by actinomycetes. Journal of Basic Microbiology. 53 (11), 913-916 (2013).
- Wang, L. J., et al. Diisonitrile Natural Product SF2768 Functions As a Chalkophore That Mediates Copper Acquisition in Streptomyces thioluteus. Acs Chemical Biology. 12 (12), 3067-3075 (2017).
- Retamal-Morales, G., et al. Detection of arsenic-binding siderophores in arsenic-tolerating Actinobacteria by a modified CAS assay. Ecotoxicology and Environmental Safety. 157, 176-181 (2018).
- Desai, A., Archana, G. Role of Siderophores in Crop Improvement. , (2011).
- Dertz, E. A., Raymond, K. N. Comprehensive coordination chemistry II. Que, L., Tolman, W. B. 8, Elsevier, Ltd. (2003).
- Arora, N. K., Verma, M. Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria. 3 Biotech. 7, 9 (2017).
- Bandyopadhyay, P., Bhuyan, S. K., Yadava, P. K., Varma, A., Tuteja, N. Emergence of plant and rhizospheric microbiota as stable interactomes. Protoplasma. 254 (2), 617-626 (2017).
- Lakshmanan, V., Castaneda, R., Rudrappa, T., Bais, H. P. Root transcriptome analysis of Arabidopsis thaliana exposed to beneficial Bacillus subtilis FB17 rhizobacteria revealed genes for bacterial recruitment and plant defense independent of malate efflux. Planta. 238 (4), 657-668 (2013).
- Sasaki, T., et al. A wheat gene encoding an aluminum-activated malate transporter. The Plant Journal. 37 (5), 645-653 (2004).
- Mahoney, A. K., Yin, C., Hulbert, S. H. Community Structure, Species Variation, and Potential Functions of Rhizosphere-Associated Bacteria of Different Winter Wheat (Triticum aestivum) Cultivars. Frontiers in Plant Science. 8 (132), (2017).
- Rayburn, A. L., Wetzel, J., Baligar, V. Mitotic analysis of sticky chromosomes in aluminum tolerant and susceptible wheat lines grown in soils of differing aluminum saturation. Euphytica. 127 (2), 193-199 (2002).
- McPherson, M. R., Wang, P., Marsh, E. L., Mitchell, R. B., Schachtman, D. P. Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments. Journal of Visualized Experiments. (137), 57932 (2018).
- Mirleau, P., et al. Fitness in soil and rhizosphere of Pseudomonas fluorescens C7R12 compared with a C7R12 mutant affected in pyoverdine synthesis and uptake. FEMS Microbiology Ecology. 34 (1), 35-44 (2000).
- Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. Pyoverdine siderophores: from biogenesis to biosignificance. Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).
- Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. Use of Blue Agar CAS Assay for Siderophore Detection. Journal of Microbiology, Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).
