Summary
نقدم بروتوكول للفحص السريع للعينات البيئية لإمكانات سيديروفوري المساهمة في التوافر البيولوجي المغذيات الدقيقة ودوران في النظم الأرضية.
Abstract
Siderophores (الوزن الجزيئي المنخفض خالب مركبات معدنية) ذات أهمية في ظاهرة إيكولوجية مختلفة تتراوح من الحديد (Fe) البيوجيوكيميائيه الدراجات في التربة، والممرض المنافسة وتشجيع نمو النبات، وإشارة الصليب-المملكة. وعلاوة على ذلك، سيديروفوريس أيضا ذات الأهمية التجارية في التصفية الحية وبيووياثيرينج للمعادن وخامات المعادن. وسيلة سريعة وفعالة من حيث التكلفة، وقوية لتقييم كمية الإنتاج سيديروفوري في العينات المعقدة هي المفتاح للتعرف على جوانب هامة من تداعيات بيئية النشاط سيديروفوري، بما في ذلك، رواية سيديروفوري المنتجة للميكروبات. تم تطوير الطريقة المعروضة هنا لتقييم نشاط سيديروفوري المجتمعات المحلية ميكروبيومي ببراعة، في عينات بيئية، مثل الأنسجة النباتية أو التربة. تجانس العينات وتضعف في متوسط M9 معدلة (بدون الحديد)، وإثراء الثقافات كان المحتضنة لمدة 3 أيام. تم تقييم الإنتاج سيديروفوري في عينات في 24 و 48 و 72 ساعة (ح) استخدام ميكروسكوبية 96-جيدا رواية CAS (خماسي أزورول كروم)-Fe أجار المقايسة، وتكييف أسلوب قياس الألوان تقليديا شاقة وتستغرق وقتاً طويلاً لتقييم سيديروفوري نشاط، يقوم على الفردية المعزولة الميكروبية المزروعة. قمنا بتطبيق أسلوب لدينا إلى 4 الأنماط الجينية/خطوط مختلفة من القمح (قمح aestivum L.)، بما في ذلك لوجين مادسن، و PI561725 و PI561727 عادة تزرع في شمال غرب المحيط الهادئ الداخلية. إنتاج سيديروفوري تأثرت وضوح النمط الوراثي للقمح، وفي أنواع معينة من الأنسجة النباتية ولاحظ. أننا استخدمت بنجاح أسلوبنا لسرعة الشاشة لتأثير الوراثي النباتي في إنتاج سيديروفوري، ومهمة رئيسية في النظم الإيكولوجية الأرضية والمائية. انتجنا replicates تقنية كثيرة، مما أسفر عن اختلافات إحصائية موثوقة جداً في التربة وداخل الأنسجة النباتية. وتبين النتائج الأهم من ذلك، يمكن استخدام الطريقة المقترحة لسرعة فحص الإنتاج سيديروفوري في عينات معقدة بدرجة عالية من الموثوقية، بطريقة تسمح بالمجتمعات المحلية على الحفاظ على للعمل فيما بعد لتحديد الأنواع والجينات الوظيفية.
Introduction
سيديروفوريس هي الجزيئات الحيوية الهامة المعنية أساسا في استخلاب الحديد للتوافر البيولوجي، ولكن مع مجموعة واسعة من الأغراض الإضافية في النظم الإيكولوجية الأرضية والمائية، بدءاً من النصاب الميكروبية الاستشعار، وإشارات إلى الميكروبية النباتية-المضيفين، تعزيز نمو النباتات، والتعاون والمنافسة داخل المجتمعات الميكروبية المعقدة1،2. سيديروفوريس يمكن عموما تصنيف وفقا للمواقع النشطة والسمات الهيكلية، خلق أربعة أنواع أساسية: كاربوكسيلات، هيدروكساماتي، كاتيتشولاتي، ومختلطة الأنواع3،4. العديد من الكائنات الحية الدقيقة قادرون على التغوط أكثر من نوع واحد من سيديروفوري5 وفي المجتمعات المعقدة، وغالبية العظمى من الكائنات biosynthesize مستقبلات غشاء للسماح باستيعاب مجموعة أوسع من، سيديروفوريس1 6. العمل مؤخرا يشير إلى أن سيديروفوريس أهمية خاصة على صعيد المجتمع المحلي، وحتى في الاتصالات بين المملكة ونقل البيوجيوكيميائيه7،،من89،10 ،11.
وقد استخدمت لأكثر من 30 سنة كعامل شيلاتينغ خماسي أزورول كروم (CAS) لربط الحديد (Fe) في مثل هذه طريقة أن إضافة يغاندس (أي، سيديروفوريس) يمكن أن ينتج عن تفكك المجمع CAS-Fe، وخلق تغيير لون يمكن تحديدها بسهولة في الأجلين المتوسط 12-CAS عندما يرتبط مع الحديد، والصبغ يظهر بلون أزرق ملكي، وكما تنأى بالمجمع CAS-Fe، المتوسط يتغير لونها وفقا لنوع يجند المستخدمة لمسح الحديد13. تم تعديل المتوسطة الأولية المستندة إلى سائل، أنشأ شوين نيلاندس في عام 1987، في العديد من الطرق لاستيعاب تغيير الأهداف الميكروبية14، ونمو العادات والقيود15، فضلا عن مجموعة متنوعة من المعادن بالإضافة إلى الحديد، بما في ذلك الألومنيوم، والمنغنيز، الكوبالت والنيكل كادميوم، الليثيوم، والزنك16، النحاس17و الزرنيخ حتى18.
العديد من مسببات الأمراض البشرية وكذلك كالنباتات الكائنات المجهرية تعزيز النمو (بجبم) قد حددت كالكائنات الحية المنتجة سيديروفوري3،،من1920، وهامة رهيزوسفيري وبجبم اندوفيتيك في كثير من الأحيان اختبار إيجابية بالنسبة لإنتاج سيديروفوري4. الأسلوب السائلة التقليدية المستندة إلى Fe تم تكييف لاختبار microtiter يعزل في زراعة ل إنتاج سيديروفوري21. ومع ذلك، تفشل هذه التقنيات الاعتراف بأهمية المجتمع الميكروبية ككل (ميكروبيومي)، وفي التعاون والتنظيم المحتملة لإنتاج سيديروفوري في التربة والنبات نظم22. ولهذا السبب، قمنا بتطوير بتقييم مستوى المجتمع الفائق لإنتاج سيديروفوري من بيئة معينة، تقوم على المقايسة الأكاديمية التقليدية، ولكن مع النسخ المتماثل، وسهولة قياس، والموثوقية، والتكرار في ميكروسكوبية المقايسة.
في هذه الدراسة، ترد مقايسة CAS-الحديد الفائق، وفعالة من حيث التكلفة للكشف عن إنتاج سيديروفوري لتقييم تخصيب اليورانيوم لإنتاج سيديروفوري من العينات المعقدة (على أي التربة والنبات هوموجيناتيس الأنسجة). وتم الحصول على تربة rhizosphere السائبة وفضفاضة زمنياً، وربط محكم (من حيث كيفية ملزمة التربة إلى الجذر) جنبا إلى جنب مع الحبوب وتبادل لإطلاق النار، وأنسجة الجذر من الأنماط الجينية القمح متميزة (قمح aestivum L.) أربعة: ليوجاين، مادسن، PI561725، و PI561727. كان الافتراض بأن الاختلافات الجوهرية في الأنماط الجينية القمح يمكن أن يسفر عن الاختلافات في التعيين والاختيار من سيديروفوري المنتجة للمجتمعات المحلية. أهمية خاصة هو الفرق بين المجتمعات الميكروبية المرتبطة بالخط اسوي PI561725، والتي هي الألومنيوم متسامح نظراً لأنها تمتلك ALMT1 (مالات الألومنيوم المنشط 1 الناقل)، مقارنة مع الألومنيوم حساسية PI561727 اسوي الخط، الذي يملك نموذج استجابة غير الألومنيوم من الجينات، almt1،من2324،،من2526. وكان الهدف الرئيسي لهذه الدراسة لتطوير طريقة بسيطة وسريعة لتقييم كمية الإنتاج سيديروفوري في سيديروفوري إثراء الثقافات أنواع العينة معقدة مع الحفاظ على الثقافات للعمل في المستقبل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: موقع الميدان: جامعة ولاية واشنطن، ومزرعة علم الأمراض النباتية (46 ° 46 '38.0"ن 117 ° 04 '57.4" W). زرعت بذور استخدام أصيص ميكانيكية في 19 أكتوبر 2017. أنه تم زرع كل الوراثي القمح في حيدروس، حوالي 1 متر عن بعضها البعض لتجنب التداخل في جذر النظام. تم جمع عينات النبات والتربة في 9 أغسطس 2018، عندما كانت محطات جاهزة للحصاد. تم جمع عينات من replicates ثلاثة من الأربعة القمح الوراثية: PI561727، PI561725، مادسن، لوجين.
1-إعداد تعديل M9 المتوسطة
- استخدام غ2ص4∙7H2س (12.8 غ/200 مل)، خ2ص4 (0.3 غ/200 مل)، وكلوريد الصوديوم (0.5 غ/200 مل)، و NH4الكواشف Cl (ز 1/20 مل) لإعداد الحل الملح M9.
- استخدم 18 جرام من ∙7H مجسو42س في 100 مل مياه مزدوجة (ddH2س) لإعداد 0.75 م MgSO4∙7H2أ.
- جعل م 1 كاكل2∙2H2س بإضافة ز 14.7 كاكل2∙2H2س مع 100 مل من ddH2o.
- إعداد المخزن المؤقت الحل بتذويب 6.048 ز أنابيب إلى 156 مل ddH2س مع التحريك. قم بضبط درجة الحموضة إلى 6.8 مع 5 م هيدروكسيد الصوديوم.
- إعداد 20% جلوكوز (سكر العنب مونوهيدرات) بإذابة 20 غراما السكر في 100 مل من ddH2o.
- إعداد الحلول والاوتوكلاف كل على حدة لكن الجلوكوز. فلتر تعقيم حل الجلوكوز بالإضافة إلى وسائط الإعلام M9 بعد التعقيم (0.22 ميكرومتر).
- إعداد متوسطة M9 معدلة بخلط 156 مل الحل الأنابيب العازلة، 40 مل من محلول أملاح M9، 20 ميكروليتر كاكل2·2H2س الحل وميكروليتر 266 مجسو4·7H2س 4 مل 20% جلوكوز الحلول معا في السلامة الأحيائية مجلس الوزراء، باستخدام تقنية معقمة.
- للحفاظ على M9 المعدلة، ختم الحاوية، وتغطي برقائق الألومنيوم حماية من الأشعة فوق البنفسجية، ووضع في 4 درجات مئوية.
2-إعداد متوسطة CAS-Fe-أجار
- حمض يغسل جميع الأواني الزجاجية في HCl/100 مم 100 مم HNO3 للحد ني ح 2 قبل استخدامها في التحليل CAS.
- تحضير ألومنيوم الخبز عموم مليئة بالرمال الصف المختبر وتغطية ذلك مع رقائق الألومنيوم. اﻷوتوكﻻف في 121 درجة مئوية و 30 دقيقة وتوضع جانبا.
- إعداد هدتما (بروميد هيكساديسيلتريميثيلامونيوم) بإضافة 20 مل ddH2س ز 0.0365 ووضع الحل في 37 درجة مئوية لتعزيز سولوبيليزاتيون.
- إعداد 10 ملم HCl وتوليد 1 مم فيكل3·6H2س باستخدام 10 ملم HCl المذيب. إضافة 0.0302 ز من الأكاديمية الصينية للعلوم إلى 25 مل من ddH2س أثناء التحريك بلطف مع شريط إثارة مغناطيسية عقيمة. قم بإضافة 5 مل من 1 مم فيكل3·6H2س (في 10 ملم HCl) إلى 25 مل من محلول CAS مع الاستمرار في إثارة بلطف (حل يتحول إلى اللون الأسود المحمر الداكن).
- إضافة 20 مل من محلول هدتما ببطء أثناء التحريك بلطف، إلى الحل Fe-CAS (هذا تؤدي إلى حل أزرق داكن).
- إعداد المخزن المؤقت الحل بتذويب ز 15.12 من الأنابيب إلى 375 مل من ddH2س، مع التحريك لطيف. قم بضبط درجة الحموضة إلى 6.8 مع 5 م هيدروكسيد الصوديوم. إضافة المياه إحضار وحدة التخزين إلى 450 مل. إضافة 5 غ من [اغروس] إلى الحل. اﻷوتوكﻻف الأنابيب المخزن المؤقت الحل والحل CAS-الحديد في 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- بعناية إضافة الحل CAS-Fe بأكملها بأكملها مخزن الأنابيب في السلامة الأحيائية مجلس الوزراء بعد كل واحد منهم يعقم.
- ضع الحل المختلط في حمام مائي عند 50 درجة مئوية.
ملاحظة: إعداد طازجة جميع الكواشف في المتوسط CAS-Fe-أجار قبل كل المقايسة، كالتخزين الطويل الأجل في نتائج 50 درجة مئوية في هطول الأمطار النتائج المعقدة، والتبريد CAS-الحديد في المتوسط طدت. - ضع قارب كاشف عقيمة في الرمال العقيمة في السلامة الأحيائية مجلس الوزراء والحرارة إلى 50 درجة مئوية. نقل CAS-Fe-أجار القارب، ثم الكوة بسرعة ميليلتر 100 لكل بئر في ميكروسكوبية 96-جيدا واضحة، مسطحة القاع، وعقيمة.
3-بيوفيرديني/يدتا إعداد قياسية
- إعداد بيوفيرديني
- إعداد معيار بيوفيرديني ميكرو 800 (مزيج من حمض سوكسينيك، جلوتاراميدي 2-هيدروكسي، وأشكال سوكسيناميندي بيوفيرديني – انظر الجدول للمواد)، في متوسطة M9 المحورة المعدة مسبقاً.
- تمييع هذا الحل إلى 400، 200، 100، 50، 25، 12.5، وحلول ميكرومترات 6.25.
- إعداد معيار يدتا
- إضافة 0.594 ز حمض ثنائي الإيثيلين (يدتا: ج10ح14ن2غ2س8.2H2س)، إلى 500 مل متوسطة M9 المعدلة معدّة مسبقاً لإعداد معيار يدتا ميكرومترات 3200.
- تمييع هذا الحل إلى 1600، 800، 400، 200، 100، 50، 25 و 12.5 و 6.25 ميكرومترات الحلول.
- إنشاء المنحنى المعياري
- إضافة 100 ميكروليتر من تركيز كل من بيوفيرديني ويدتا لفصل الآبار الميكروسكوبية 96-البئر تحتوي على 100 ميكروليتر من المتوسطة "أجار" CAS-الحديد. قم بتكرار التقنية المكررة لكل تركيز. أيضا، إضافة آبار فارغة مع M9 فقط (لا يدتا أو بيوفيرديني).
- استخدام قارئ ميكروسكوبية، قياس امتصاص (في 420 نانومتر و 665 nm) بعد حضانة 1 و 6 و 24 ساعة في 22 درجة مئوية، واستخدام القياسات امتصاص لتوليد المنحنيات القياسية.
ملاحظة: 420 نانومتر القياسات، طرح امتصاص فراغات من امتصاص بيوفيرديني أو الآبار التي تحتوي على يدتا. ل 665 شمال البحر الأبيض المتوسط، طرح امتصاص بيوفيرديني أو يدتا التي تحتوي على آبار من امتصاص فراغات. ثم، هو تراجع سجل10(بيوفيرديني ميكرومتر أو يدتا) ضد امتصاص القياسات. تسهيلا لتفسير نتائج العينة، استخدام امتصاص كالمحور السيني وتسجيل10(بيوفيرديني ميكرومتر أو يدتا) كمحور y.
4-جمع العينات البيئية: أنسجة التربة والنبات
- غسل معدات أخذ العينات (معاول ومقص) مع 0.22 ميكرومتر تصفية ddH2س تليها الإيثانول 70%، ويمسح مع مناشف ورقية قبل أخذ العينات، وبين عينات للحفاظ على أسلوب تعقيم والحد من التلوث عبر.
- المكوس الأنسجة النباتية (الحبوب ويطلق النار) من النباتات في الحقل، ووضعها في كيس تخزين بلاستيك مسمى، تاركاً قش تبادل لإطلاق النار ما يكفي لسهولة اقتلاع عينات التربة والجذر المطلوب.
- حفر الجذرية الصغيرة الكرة حوالي 15 سم عمق و 23 سم ووضعها في كيس بلاستيكي منفصل، المسمى لإعداد نموذج في بيئة معمل. هذه الخطوة مشابهة لأساليب ماكفرسون et al.27.
- ضع جميع العينات (الحبوب ويطلق النار والتربة السائبة وكرات الجذر في أكياس منفصلة) مباشرة على الجليد والحفاظ على 4 درجة مئوية حتى تتم معالجة العينات لفحص الإنتاج سيديروفوري.
- فصل عينات التربة الجذرية المرتبطة إلى الأكبر وتربة rhizosphere فضفاضة زمنياً وتربة rhizosphere زمني محكم.
- إخراج الكرات الجذر من الحقائب. بلطف التخلص من التربة من الكرة الجذر. تخلصت من التربة، جنبا إلى جنب مع التربة واليسار في الحقيبة تضم التربة "الأكبر".
- استخدام مطرقة مطاطية لمواصلة إزالة التربة من الكرة الجذر. هذا هو التربة rhizosphere فضفاضة زمنياً.
- إنشاء تربة rhizosphere ربط محكم بأخذ جذور مع نموذج محدد محكم ووضعها في أنبوب الطرد مركزي. إضافة 30 مل ddH2س ودوامه لمدة 2-3 دقائق. إزالة الجذور للحصول على تمييع الملاط تربة rhizosphere زمني محكم.
5-إعداد سيديروفوري إثراء الثقافات والأكاديمية الصينية للعلوم-Fe سيديروفوري إنتاج الإنزيم
ملاحظة: يجب أن تكون جميع الأواني الزجاجية حمض غسلها قبل البدء فحوصات.
- إعداد عينة التربة (بالنسبة لكل نوع من أنواع التربة ثلاثة نماذج)
- مجانسة كل عينة التربة داخل كيس عينة، بخلط وتحول التربة إلى أقصى حد ممكن دون فتح الحقيبة.
ملاحظة: هذا يساعد على الحد من تقلب التربة الطبيعية المكانية وينسجم مع إجراءات أخذ العينات من التربة العادية. يمكن استخدام أساليب أخرى مجانسة العينات البيئية، حسبما يكون مناسباً، ووفقا للتصميم التجريبي. - بعد كل عينة مختلطة تماما، الكوة وتعليق ز 2.0 كل التربة في 20 مل من تعديل M9 المتوسطة، ثم يضعف 10-3 لإجمالي حجم 20 مل في أنبوب الطرد مركزي عقيمة 50 مل مع المكونات رغوة معقمة للسماح بالتهوية.
- لعينات rhizosphere ربط محكم، وإضافة 2 مل الملاط تربة rhizosphere إلى 20 مل من تعديل M9 المتوسطة، ثم يضعف 10-3 لإجمالي حجم 20 مل في أنبوب الطرد مركزي عقيمة 50 مل مع المكونات رغوة معقمة للسماح بالتهوية.
- مجانسة كل عينة التربة داخل كيس عينة، بخلط وتحول التربة إلى أقصى حد ممكن دون فتح الحقيبة.
- إعداد نموذج (الجذر وتبادل لإطلاق النار والحبوب) الأنسجة
- تعقيم سطح العينة مع الإيثانول 70%. مسرات ز 2.0 أنسجة جديدة في 20 مل من تعديل M9 المتوسطة باستخدام خلاط في عالية لمدة 30 ثانية. نقل العينة إلى أنبوب الطرد مركزي عقيمة 50 مل، ثم يضعف 10-3 لإجمالي حجم 20 مل في أنبوب الطرد مركزي عقيمة 50 مل مع المكونات رغوة معقمة للسماح بالتهوية.
- تخصيب اليورانيوم لإنتاج سيديروفوري من خلال الحد من الحديد
- احتضان أنابيب الطرد المركزي 50 مل عند درجة حرارة الغرفة ويهز 160 لفة في الدقيقة.
6-CAS-Fe أجار فحوصات للكشف عن إنتاج سيديروفوري في العينات البيئية
- في 24 و 48 و 72 ح بعد الشروع في إثراء الثقافة، إزالة عنها 1 مل من أنابيب الإثراء استخدام تقنية تعقيم وأجهزة الطرد المركزي في 10,000 س ز لمدة 1 دقيقة في أنابيب الطرد المركزي 2 مل إلى بيليتيزي الخلايا.
- جمع المادة طافية المنفصلين عن ذويهم. باستخدام تقنية تعقيم، إضافة 100 ميكروليتر من المادة طافية 100 ميكروليتر حل CAS-Fe-أجار في تكرار أو ثلاث نسخ في الميكروسكوبية. أيضا إضافة 100 ميليلتر من العقيمة M9 المتوسطة (كفراغات). ثم احتضان لوحة عند 28 درجة مئوية.
- تعليق المادة طافية وبيليه لكل عينة (لا تضاف إلى لوحة ميكروتيتير) المتبقية في أنبوب الطرد المركزي الخاصة، معقم 2 مل. إضافة 400 ميكروليتر من والغليسيرول العقيمة في كل أنبوبة العينة-المادة طافية وريسوسبيند بيليه إنشاء مخزونات والغليسيرول. تجميد الأسهم في-80 درجة مئوية لتحليلات لاحقة.
ملاحظة: يمكن تعديل هذه الخطوة إنشاء مخزونات والغليسيرول وفقا لأي بروتوكول داخلية المفضل. - قياس امتصاص في 6 و 24، 48 و 72 ح، في الطول الموجي نانومتر 420.
- استخدام المنحنيات القياسية التي تم إنشاؤها من بيوفيرديني أو يدتا لتفسير القياسات امتصاص العينة مكافئات بيوفيرديني.
ملاحظة: بيوفيرديني مصممة لتكون معياراً أعلى بالمقارنة مع يدتا (راجع أدناه)، حيث لم يستخدم أدتا تفسير نتائج الدراسة الحالية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بيوسينثيسيزيد بيوفيرديني خليط من المتألقة Pseudomonas استخدمت كمعيار لتفسير وتحديد مقدار امتصاص (في 420 nm) نماذج مكافئات بيوفيرديني في ميكرومتر. الشكل 1 يبين العلاقة بين امتصاص (420 شمال البحر الأبيض المتوسط) والبدء في تركيز بيوفيرديني (سجل10 مولاريتي في ميكرومتر). ولم تقدم يدتا معياراً كافياً لأن العينات المعروضة القياسات امتصاص أكبر مما يمكن تحقيقه مع بيوفيرديني، و البحث والتطوير2 كان أقل (الشكل 2). بينما الأولى العمل باستخدام مقايسة CAS-الحديد كوسيلة لامتصاص الكشف عن قياس سيديروفوري في 630 نيوتن متر، في دراسة ما يتصل استخدام طريقة مشابهة جداً (CAS-Fe-أجار كانت مختلطة 1:1 مع M9 المعدلة لإنشاء عمود 200 ميليلتر في الميكروسكوبية)، لوحظ أن كان امتصاص الذروة في 665 شمال البحر الأبيض المتوسط، ولكن أن 420 نانومتر تم استنساخه بأكثر من حيث التغييرات في امتصاص الناجم عن عينات (الشكل 3).
ولوحظ الإنتاج سيديروفوري في إثراء الثقافات من جميع أنواع الأنسجة بعد ح 72 تخصيب Fe-العجز ونشاط سيديروفوري على ما يبدو تحقيق الاستقرار بعد 48 ساعة حضانة (تكميلية الشكل 1). وهكذا، تم تقييم النشاط سيديروفوري لإثراء ح 72 في حضانة 48 ساعة لتحديد تأثير نوع النمط الوراثي وعينه على عزل سيديروفوري (الشكل 4). النشاط سيديروفوري في عينات التربة السائبة منخفضة نسبيا، وعينات لا معرض الاختلافات بين النمط الوراثي القمح الذي كانت التربة السائبة (الشكل 4 أ). أظهرت الفاسدون تربة فضفاضة ملزمة معزولة عن النمط الوراثي PI561725 إنتاج سيديروفوري أكبر بالمقارنة مع التربة فضفاضة منضم من مادسن و PI561727، ولكن لا لوجين (الشكل 4 باء). الإنتاج سيديروفوري في الإثراء من التربة أحكام ملزمة لا بشدة تأثر الوراثي (الشكل 4).
إثراء الثقافات الأنسجة الحبوب أسفرت عن إنتاج سيديروفوري منخفضة نسبيا بغض النظر عن النمط الوراثي (الشكل 4). الفاسدون أنسجة تبادل لإطلاق النار ليوجاين إنتاج سيديروفوري أقل بكثير من الأنماط الجينية الأخرى، وزرع الأنسجة PI561725 تبادل لإطلاق النار أسفر عن أكثر من متغير سيديروفوري الإنتاج (4E الشكل). وكان النشاط سيديروفوري أكثر من 200% زيادة في الجذر نسيج تخصيب الثقافات من PI561725 مقارنة مع جميع الأنماط الجينية الأخرى (الشكل 4F).
رقم 1. امتصاص في 420 نانومتر و 655 نانومتر تراجعت ضد تركيز log10 بيوفيرديني- (أ) امتصاص في 420 نانومتر تراجعت ضد تركيز10 سجل بيوفيرديني في ميكرومتر. كان ملائمة منحنى متعدد الحدود للحصول على معادلة تفسيرية لتفسير امتصاص مكافئات بيوفيرديني. (ب) امتصاص في 665 نانومتر تراجعت ضد السجل هو تركيز10 بيوفيرديني في ميكرومتر. آر2 مربع معامل ارتباط Pearson، ويشرح المعادلة منحنى المجهزة. النقاط نسخ مطابقة للقياسات امتصاص في 800، 400، 200، 100، 50، 25 و 12.5 و 6.25 مكم بيوفيرديني بعد 6 ح الحاضنات في 28 درجة مئوية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2. امتصاص في 420 نانومتر و 655 نانومتر تراجعت ضد تركيز log10 يدتا. امتصاص (A) على 420 نانومتر تراجعت ضد سجل10 تركيز يدتا في ميكرومتر. كان ملائمة منحنى متعدد الحدود للحصول على معادلة تفسيرية لتفسير امتصاص مكافئات بيوفيرديني. (ب) امتصاص في 665 نانومتر تراجعت ضد السجل هو تركيز10 يدتا في ميكرومتر. آر2 مربع معامل ارتباط Pearson، ويشرح المعادلة منحنى المجهزة. والنقاط نسخ مطابقة للقياسات امتصاص في 3200، 1600، 800، 400، 200، 100، 50، 25 و 12.5 و 6.25 ميكرومتر يدتا بعد الاحتضان ح 6 في 28 درجة مئوية، وأشرطة الخطأ. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3. امتصاص الأشعة من 315−1000 شمال البحر الأبيض المتوسط من الآبار ميكروسكوبية تحتوي على 200 ميليلتر الأعمدة من 1:1 CAS-Fe-أجار وتعديل M9 أو عينات متوسطة M9 مع سيديروفوري المنتجة. وكان المحتضنة اللوحة عند 28 درجة مئوية لمدة 72 ساعة قبل قياس امتصاص في قارئ ميكروسكوبية. امتصاص الأشعة إظهار الفراغات الثلاثة التي تحتوي على لا عينة (خطوط سوداء) أسفرت عن منحنيات محكم متفاوت بذروتها في 665 شمال البحر الأبيض المتوسط. امتصاص الأشعة إظهار الفراغات الثلاثة التي تحتوي على سيديروفوري إنتاج عينات (الخطوط الرمادية) أسفرت عن المنحنيات مع مزيد من التقلبات، ولكن مع امتصاص أكثر اتساقا في 420 نانومتر مقارنة مع 665 شمال البحر الأبيض المتوسط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4. مكافئات بيوفيرديني سيديروفوري إثراء الثقافات. مكافئات بيوفيرديني سيديروفوري إثراء الثقافات المرتبطة بالجملة (أ) (ب) فضفاضة ملزمة، وأحكام ملزمة (ج) التربة، وفي الأنسجة هوموجيناتيس من القمح يطلق النار على الحبوب (د) (ه)، وجذور (F). سيديروفوري إثراء الثقافات كان المحتضنة ح 72 قبل نقل عنها إلى ميكروسكوبية وتفرخ في 28 درجة مئوية. تم تقييم الإنتاج سيديروفوري بعد 48 ساعة حضانة مع كروم أزورول "س." الأنماط الجينية/خطوط ليو = لوجين، جنون = مادسن، 725 = PI561725، و 727 = PI561727. العلامات النجمية تمثل أهمية في ألفا = 0، 008 (بعد التصحيح بونفيروني). أشرطة قابلة للانحراف المعياري. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
التكميلية الرقم 1. مكافئات بيوفيرديني على مر الزمن. مكافئات بيوفيرديني سيديروفوري إثراء الثقافات المقررة بعد 24 و 48 و 72 ساعة من الحضانة مع كروم أزورول سديروفوري س. إثراء الثقافات المرتبطة بالجملة (أ) (ب) فضفاضة ملزمة، و (ج) أحكام ملزمة التربة، و في الأنسجة هوموجيناتيس من القمح (د) يطلق النار على الحبوب (E)، وجذور (F). سيديروفوري إثراء الثقافات كان المحتضنة ح 72 قبل نقل عنها إلى ميكروسكوبية وتفرخ في 28 درجة مئوية. و subsampled لتقييم إنتاج سيديروفوري في كل تيميبوينت. الأنماط الوراثية/خطوط هي ليو = لوجين، جنون = مادسن، 725 = PI561725، و 727 = PI561727. وجرى تقييم الإنتاج سيديروفوري، وبعد 24 و 48 و 72 ساعة من الحضانة. أشرطة قابلة للانحراف المعياري. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
النتيجة الأولى لهذا العمل هو إنتاج المنهجية الجديدة التي يمكن استخدامها لإثراء سريعاً سيديروفوري المنتجة للميكروبات أثناء قياس كمي سيديروفوري/النشاط الإنتاجي في العينات البيئية. المنهجية التي سريعة وبسيطة وفعالة من حيث التكلفة، والنتائج التي تظهر كيف يمكن استخدامه للكشف عن النشاط سيديروفوري من أنواع العينات المعقدة ورواية (على سبيل المثال.، نسيج التربة والنبات). البروتوكول أيضا النتائج في إنتاج مخزونات والغليسيرول الثقافات تخصيب اليورانيوم، الذي يمكن بسهولة أن تتخذ من خلال الوقت لاستيعاب الدراسات المتعلقة بالتغيرات في هيكل المجتمع الميكروبي ووظيفة أثناء عوز الحديد عن طريق الحمض النووي الريبي أو على أساس تقنيات . المهتمين بدراسة حركية النشاط سيديروفوري في الدراسات الإيكولوجية يمكن أن يرجح أيضا أن تستفيد من هذا الأسلوب. وأظهرت النتائج أيضا أن مكافئات بيوفيرديني (وبيوفيردينيس سيديروفوريس هامة من حيث البيئة28 والطب29) يوفر طريقة جيدة لتقييم كمية الإنتاج سيديروفوري. استنتاج هام هو أن امتصاص القياسات في 665 غير كافية لتحديد النشاط سيديروفوري بالمقارنة مع تلك التي لوحظت في 420 نانومتر نانومتر (الشكل 1). أهمية خاصة وكان الاستنتاج أن امتصاص في 665 نانومتر متفاوت المسافات عبر طائفة واسعة من تركيزات بيوفيرديني (بيوفيرديني مكم = 50-800 ميكرون، سجل10(بيوفيرديني ميكرومتر) = 0.18-0.76)، مما يوحي بسقف كشف في هذا الطول الموجي (الشكل 1B)-تجدر الإشارة إلى أن بينما بيوفيرديني معيار متفوقة مقارنة مع يدتا، كما أنها باهظة التكلفة، حيث يقترح أن يتم تنفيذ الأعمال الأولية مع يدتا أو غيرها chelators فعالة من حيث التكلفة لضمان المنهجية قد أتقن قبل توليد معايير بيوفيرديني.
وهناك العديد من الخطوات الحاسمة في جميع أنحاء البروتوكول التي تتطلب اهتماما خاصا. أولاً، من المهم للحفاظ على الأواني خالية من المعادن والتركيبات الأخرى كلما أمكن ذلك عند العمل مع المعادن، خاصة تلك اللازمة في تركيزات منخفضة، مثل الحديد. وثانيا، لأنه تم إثراء الثقافات لإنتاج سيديروفوري من خلال الحد من الحديد، من المهم الحفاظ على ظروف معقمة طوال سير العمل الحد من تأثير الملوثات البيئية. وأخيراً، إعداد CAS-Fe-أجار يتطلب عناية فائقة بالتفاصيل، وأن تكون مستعدة عن كثب لوصف ممكن. على سبيل المثال، إذا كان الحل CAS-Fe-أجار هو إبقاء الحارة، لكن لا يتم استخدامها بسرعة، سوف يعجل بالأكاديمية الصينية للعلوم-الحديد. بالإضافة إلى ذلك، فإنه ضروري للحفاظ CAS-Fe-أجار الحارة أثناء نقل إلى الميكروسكوبية. وكان ذلك عن طريق استخدام ساخنة والرمال العقيمة ونقل بسرعة المتوسطة إلى الميكروسكوبية في السلامة الأحيائية مجلس الوزراء.
واحد الحد من المنهجية أن لبعض النباتات أيضا إنتاج سيديروفوريس (فيتوسيديروفوريس)؛ وهذه يمكن أن يسهم النشاط سيديروفوري المقاسة في إثراء الثقافات من مصنع نسيج هوموجيناتيس. أيضا، كان هناك تباين مرتفعة نسبيا في النتائج من replicates الميدانية، مما يوحي بمزيد من النسخ المتماثل يمكن أن تكون مفيدة في الدراسات المستقبلية. قيد آخر من هذا الأسلوب أنه في حين الطريقة الميكروسكوبية الفائق، عينة جمع وإعداد مضيعة للوقت. لأنه يمكن استخدامها صفيحة واحدة لعينات 96 (بما في ذلك المعايير)، لا تزال، هي كثير أقل بالمقارنة مع التقنيات الموجودة مدخلات الوقت والتكلفة. هذا أساسا لأن الأساليب القائمة الأخرى تعتمد على إجراء المقايسة CAS-الحديد في30من أطباق بيتري، التي هي أصلاً أقل وقت وتكلفة فعالة لإعداد من ميكروسكوبية. بالإضافة إلى ذلك، لأن solubilized CAS-Fe المجمعات عرضه لهطول الأمطار12، هو الأسلوب المقترح استخدام CAS-Fe-أجار المتوسطة أساليب متفوقة على أساس السائل، الذي قد يكون أيضا تكييف شكل 96-جيدا.
من حيث النتائج المبلغ عنها، نظراً إلى أن الفرق الرئيسي بين PI561725 و PI561727 وهو وجود ALMT1 مقابل.almt1، على التوالي، وتشير النتائج إلى وجود ALMT1 النتائج المحتملة في اختيار المجتمعات الميكروبية في النبات والتربة التي تنطوي على إمكانيات أكبر لإنتاج سيديروفوري، المقررة عن طريق إثراء الثقافات. العمل في المستقبل ينبغي أن يبحث كذلك ظاهرة استخدام عدد أكبر من replicates، لا سيما لتوضيح ما إذا كان تحديد وجود ALMT1 على وجه التحديد للنشاط سيديروفوري المحسن.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب قد لا يوجد تضارب في الكشف عن.
Acknowledgments
الكتاب نود أن نشكر شابان مجروح للمساعدة في الإجراءات المختبرية، عبدل لي لحصاد القمح الوراثي، ومجلس البحوث في عنب كونكورد الدولة واشنطن، ومركز جامعة واشنطن الدولة "الحفاظ على الزراعة" و الموارد الطبيعية لأغراض بيواج منحة لدعم هذا العمل. تم توفير التمويل الإضافي بوزارة الزراعة/NIFA من خلال مشروع هاتش 1014527.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Apex | LF451320014 | |
| Aluminum Baking Pan | |||
| Aluminum Foil | |||
| Ammonium chloride, granular | Fiesher Scientific | 152315A | |
| Autoclave and Sterilizer | Thermo Scientific | ||
| Calcium chloride dihydrate | Fiesher Scientific | 171428 | |
| CAS (Chrome Azurol S) | Chem-Impex Int'l Inc) | 000331-27168 | |
| Dextrose Monohydrate (glucose), crystalline powder | Fiesher Scientific | 1521754 | |
| EDTA, disodium salt, dihydrate, Crystal | J.T.Baker | JI2476 | |
| Glycerol, Anhydrous | Baker Analyzed | C22634 | |
| HDTMA (Cetyltrimethylammomonium Bromide | Reagent World | FZ0941 | |
| Hydrochloride acid | ACROS Organic | B0756767 | |
| Infinite M200 PRO plate reader | TECAN | ||
| Iron (III) chloride hexahydrate, 99% | ACROS Organic | A0342179 | |
| Laboratory Fume Hood | Thermo Scientific | ||
| Laboratory Incubator | VWR Scientific | ||
| Magnesium Sulfate | Fiesher Scientific | 27855 | |
| Niric Acid, (69-70)% | J.T.Baker | 72287 | |
| PIPES buffer, 98.5% | ACROS Organic | A0338723 | |
| Potassium phosphate, dibaisc,powder | J.T.Baker | J48594 | |
| Pyoverdine | SIGMA-ALDRICH | 078M4094V | |
| Sand | |||
| SI-600R Shaker | Lab Companion | ||
| Sodium chloride, granular | Fiesher Scientific | 136539 | |
| Sodium hydroxide, pellets | J.T.Baker | G48K53 | |
| Sodium phosphate, dibasic heptahydrate, 99% | ACROS Organic | A0371705 |
References
- Butaite, E., Baumgartner, M., Wyder, S., Kummerli, R. Siderophore cheating and cheating resistance shape competition for iron in soil and freshwater Pseudomonas communities. Nature Communications. 8, (2017).
- Ghirardi, S., et al. Identification of Traits Shared by Rhizosphere-Competent Strains of Fluorescent Pseudomonads. Microbial Ecology. 64 (3), 725-737 (2012).
- Hider, R. C., Kong, X. L. Chemistry and biology of siderophores. Natural Product Reports. 27 (5), 637-657 (2010).
- Saha, M., et al. Microbial siderophores and their potential applications: a review. Environmental Science and Pollution Research. 23 (5), 3984-3999 (2016).
- Bhattacharyya, P. N., Jha, D. K. Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR): emergence in agriculture. World Journal of Microbiology, Biotechnology. 28 (4), 1327-1350 (2012).
- Lewis, R. W., Islam, A., Opdahl, L., Davenport, J. R., Sullivan, T. S. Phylogenetics, Siderophore Production, and Iron Scavenging Potential of Root Zone Soil Bacteria Isolated from 'Concord' Grape Vineyards. Microbial Ecology. , Accepted (2018).
- Li, S. S., et al. The opportunistic human fungal pathogen Candida albicans promotes the growth and proliferation of commensal Escherichia coli through an iron-responsive pathway. Microbiological Research. 207, 232-239 (2018).
- Lorenz, N., Shin, J. Y., Jung, K. Activity, Abundance, and Localization of Quorum Sensing Receptors in Vibrio harveyi. Frontiers in Microbiology. 8, (2017).
- O'Brien, S., Fothergill, J. L. The role of multispecies social interactions in shaping Pseudomonas aeruginosa pathogenicity in the cystic fibrosis lung. Fems Microbiology Letters. 364 (15), (2017).
- Ozkaya, O., Balbontin, R., Gordo, I., Xavier, K. B. Cheating on Cheaters Stabilizes Cooperation in Pseudomonas aeruginosa. Current Biology. 28 (13), (2018).
- Popat, R., et al. Environmental modification via a quorum sensing molecule influences the social landscape of siderophore production. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 284 (1852), (2017).
- Schwyn, B., Neilands, J. B. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).
- Sullivan, T. S., Ramkissoon, S., Garrison, V. H., Ramsubhag, A., Thies, J. E. Siderophore production of African dust microorganisms over Trinidad and Tobago. Aerobiologia. 28 (3), 391-401 (2012).
- Buyer, J. S., DeLorenzo, V., Neilands, J. B. Production of the siderophore aerobactin by a halophilic Pseudomonad. Applied and Environmental Microbiology. 57 (8), 2246-2250 (1991).
- Perez-Miranda, S., Cabirol, N., George-Tellez, R., Zamudio-Rivera, L., Fernandez, F. O-CAS, a fast and universal method for siderophore detection. Journal of Microbiological Methods. 70 (1), 127-131 (2007).
- Nakouti, I., Hobbs, G. A new approach to studying ion uptake by actinomycetes. Journal of Basic Microbiology. 53 (11), 913-916 (2013).
- Wang, L. J., et al. Diisonitrile Natural Product SF2768 Functions As a Chalkophore That Mediates Copper Acquisition in Streptomyces thioluteus. Acs Chemical Biology. 12 (12), 3067-3075 (2017).
- Retamal-Morales, G., et al. Detection of arsenic-binding siderophores in arsenic-tolerating Actinobacteria by a modified CAS assay. Ecotoxicology and Environmental Safety. 157, 176-181 (2018).
- Desai, A., Archana, G. Role of Siderophores in Crop Improvement. , (2011).
- Dertz, E. A., Raymond, K. N. Comprehensive coordination chemistry II. Que, L., Tolman, W. B. 8, Elsevier, Ltd. (2003).
- Arora, N. K., Verma, M. Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria. 3 Biotech. 7, 9 (2017).
- Bandyopadhyay, P., Bhuyan, S. K., Yadava, P. K., Varma, A., Tuteja, N. Emergence of plant and rhizospheric microbiota as stable interactomes. Protoplasma. 254 (2), 617-626 (2017).
- Lakshmanan, V., Castaneda, R., Rudrappa, T., Bais, H. P. Root transcriptome analysis of Arabidopsis thaliana exposed to beneficial Bacillus subtilis FB17 rhizobacteria revealed genes for bacterial recruitment and plant defense independent of malate efflux. Planta. 238 (4), 657-668 (2013).
- Sasaki, T., et al. A wheat gene encoding an aluminum-activated malate transporter. The Plant Journal. 37 (5), 645-653 (2004).
- Mahoney, A. K., Yin, C., Hulbert, S. H. Community Structure, Species Variation, and Potential Functions of Rhizosphere-Associated Bacteria of Different Winter Wheat (Triticum aestivum) Cultivars. Frontiers in Plant Science. 8 (132), (2017).
- Rayburn, A. L., Wetzel, J., Baligar, V. Mitotic analysis of sticky chromosomes in aluminum tolerant and susceptible wheat lines grown in soils of differing aluminum saturation. Euphytica. 127 (2), 193-199 (2002).
- McPherson, M. R., Wang, P., Marsh, E. L., Mitchell, R. B., Schachtman, D. P. Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments. Journal of Visualized Experiments. (137), 57932 (2018).
- Mirleau, P., et al. Fitness in soil and rhizosphere of Pseudomonas fluorescens C7R12 compared with a C7R12 mutant affected in pyoverdine synthesis and uptake. FEMS Microbiology Ecology. 34 (1), 35-44 (2000).
- Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. Pyoverdine siderophores: from biogenesis to biosignificance. Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).
- Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. Use of Blue Agar CAS Assay for Siderophore Detection. Journal of Microbiology, Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).
