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पर्यावरण के नमूनों से उच्च प्रवाह Siderophore स्क्रीनिंग: संयंत्र के ऊतकों, थोक मिट्टी, और Rhizosphere मिट्टी

Published: February 9, 2019 doi: 10.3791/59137
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 1
1Department of Crop and Soil Sciences, Washington State University, 2Department of Plant Pathology, Washington State University
* These authors contributed equally

Summary

हम siderophore संभावित सूक्ष्मपोषक जैव उपलब्धता और स्थलीय प्रणालियों में कारोबार के लिए योगदान के लिए पर्यावरणीय नमूनों की तेजी से जांच के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।

Abstract

Siderophores (कम आणविक वजन धातु chelating यौगिकों) लोहे से लेकर विभिंन पारिस्थितिक घटना में महत्वपूर्ण है (Fe) मिट्टी में biogeochemical सायक्लिंग, रोगज़नक़ प्रतियोगिता, संयंत्र विकास संवर्धन, और पार राज्य संकेतन । इसके अलावा, siderophores भी कर रहे है वाणिज्यिक ब्याज में और अधिक के साथ-साथ और अधिक धातु-असर खनिज और अयस्कों का अपक्षय । एक तेजी से, लागत प्रभावी, और मात्रात्मक जटिल नमूनों में siderophore उत्पादन का आकलन के मजबूत साधन siderophore गतिविधि के पारिस्थितिक असर, सहित, उपंयास siderophore उत्पादन रोगाणुओं के महत्वपूर्ण पहलुओं की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है । यहां प्रस्तुत विधि में चालबाज microbiome समुदायों की siderophore गतिविधि का आकलन करने के लिए विकसित किया गया था, पर्यावरणीय नमूनों में, जैसे मिट्टी या पौधों के ऊतकों । नमूनों homogenized थे और एक संशोधित M9 मध्यम (Fe के बिना) में पतला, और संवर्धन संस्कृतियों 3 दिनों के लिए मशीन थे । Siderophore उत्पादन में नमूनों में मूल्यांकन किया गया था 24, ४८, और ७२ घंटे (एच) एक उपंयास का उपयोग ९६-अच्छी तरह से microplate कैस (क्रोम azurol sulphonate)-Fe आगर परख, पारंपरिक थकाऊ और समय लेने वाली वर्णमिति विधि के एक अनुकूलन का आकलन Siderophore गतिविधि, व्यक्तिगत खेती माइक्रोबियल अलग पर प्रदर्शन किया । हम गेहूं की 4 अलग पादी/लाइनों (Triticum aestivum एल), Lewjain, Madsen, और PI561725 सहित के लिए हमारे विधि लागू है, और आमतौर पर अंतर्देशीय प्रशांत नॉर्थवेस्ट में हो PI561727 । Siderophore उत्पादन गेहूं की जीनोटाइप द्वारा स्पष्ट रूप से प्रभावित किया गया था, और संयंत्र के ऊतकों के विशिष्ट प्रकार में मनाया । हम सफलतापूर्वक siderophore उत्पादन, स्थलीय और जलीय पारिस्थितिकी प्रणालियों में एक महत्वपूर्ण समारोह पर संयंत्र जीनोटाइप के प्रभाव के लिए तेजी से स्क्रीन करने के लिए हमारे विधि का इस्तेमाल किया । हम कई तकनीकी दोहराने का उत्पादन किया, बहुत विश्वसनीय मिट्टी में सांख्यिकीय अंतर उपज और संयंत्र के ऊतकों के भीतर । महत्वपूर्ण बात, परिणाम दिखाने के प्रस्तावित विधि तेजी से विश्वसनीयता के एक उच्च स्तर के साथ जटिल नमूनों में siderophore उत्पादन की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, एक तरह से है कि समुदायों को बाद में काम के लिए संरक्षित करने के लिए taxa और कार्यात्मक जीन की पहचान की अनुमति देता है ।

Introduction

Siderophores जैव उपलब्धता के लिए मुख्य रूप से लौह-केलेशनथेरेपी में शामिल हैं, लेकिन अतिरिक्त प्रयोजनों की एक विस्तृत सरणी के साथ एक माइक्रोबियल कोरम संवेदन से लेकर स्थलीय और जलीय पारिस्थितिकी प्रणालियों, माइक्रोबियल संयंत्र-मेजबानों को संकेत, संयंत्र विकास संवर्धन, सहयोग और जटिल माइक्रोबियल समुदायों के भीतर प्रतियोगिता1,2। Siderophores मोटे तौर पर अपने सक्रिय साइटों और संरचनात्मक सुविधाओं के अनुसार वर्गीकृत किया जा सकता है, चार बुनियादी प्रकार बनाने: carboxylate, hydroxamate, catecholate, और मिश्रित प्रकार3,4। कई सूक्ष्मजीवों siderophore5 और जटिल समुदायों में से एक से अधिक प्रकार के उत्सर्जन, झिल्ली रिसेप्टर्स के एक विशाल बहुमत siderophores1की एक भी व्यापक विविधता के ऊपर उठाने की अनुमति देने के लिए सक्षम हैं, 6. हाल के काम इंगित करता है कि siderophores समुदाय के स्तर पर विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं, और यहां तक कि अंतर किंगडम संचार और biogeochemical स्थानांतरण में7,8,9,10 ,11.

क्रोम azurol sulphonate (कैस) के लिए एक chelating एजेंट के रूप में 30 से अधिक वर्षों के लिए इस्तेमाल किया गया है लोहे (fe) इस तरह से बांध के रूप में है कि लाइगैंडों के अलावा (यानी, siderophores) कैस-Fe परिसर के पृथक्करण में परिणाम कर सकते हैं, एक आसानी से पहचाने बनाने के माध्यम में रंग परिवर्तन 12. जब कैस fe के साथ ही बंधे है, डाई एक शाही नीले रंग के रूप में प्रकट होता है, और कैस-fe जटिल dissociates के रूप में, मध्यम परिवर्तन ligand के प्रकार के अनुसार रंग fe13सफ़ाई के लिए इस्तेमाल किया । प्रारंभिक, तरल आधारित १९८७ में Schwyn और Neilands द्वारा स्थापित माध्यम, कई मायनों में संशोधित किया गया है बदलने के लिए माइक्रोबियल14लक्ष्यों को समायोजित, विकास वाला और सीमाएं15, साथ ही साथ Fe के अलावा धातुओं की एक किस्म, सहित एल्यूमिनियम, मैंगनीज, कोबाल्ट, कैडमियम निकेल, लिथियम, जिंक16, कॉपर17, और यहां तक कि आर्सेनिक18।

कई मानव रोगजनकों, साथ ही संयंत्र विकास को बढ़ावा देने के सूक्ष्मजीवों (PGPM) siderophore उत्पादक जीवों के रूप में पहचान की गई है3,19,20, और महत्वपूर्ण rhizosphere और endophytic PGPM अक्सर परीक्षण siderophore-उत्पादन के लिए सकारात्मक4. पारंपरिक Fe आधारित तरल विधि siderophore उत्पादन21के लिए खेती में अलग के microtiter परीक्षण के लिए अनुकूलित किया गया है । हालांकि, इन तकनीकों को एक पूरे के रूप में माइक्रोबियल समुदाय के महत्व को पहचानने में विफल (microbiome), सहयोग और मिट्टी और संयंत्र22प्रणालियों में siderophore उत्पादन के संभावित विनियमन में । कि कारण के लिए, हम एक उच्च प्रवाह siderophore उत्पादन के समुदाय स्तर का आकलन एक दिया पर्यावरण से विकसित किया है, पारंपरिक कैस परख पर आधारित है, लेकिन प्रतिकृति के साथ, माप की आसानी, विश्वसनीयता, और एक microplate में दोहराव परख.

इस अध्ययन में, एक लागत प्रभावी, उच्च प्रवाह siderophore उत्पादन का पता लगाने के लिए कैस-Fe परख के लिए जटिल नमूनों से siderophore उत्पादन के संवर्धन का आकलन प्रस्तुत किया है (यानी, मिट्टी और संयंत्र ऊतक homogenates) । थोक, लचर बंधे, और कसकर बंधे rhizosphere मिट्टी (कैसे मिट्टी जड़ से बंधे थे के संदर्भ में) अनाज, गोली मार, और चार अलग गेहूं (Triticum aestivum एल) पादी: Lewjain, Madsen, PI561725, और जड़ से ऊतकों के साथ प्राप्त किया गया PI561727 । यह परिकल्पना की गई थी कि गेहूं पादी में बुनियादी मतभेदों की भर्ती में मतभेद और siderophore उत्पादन समुदायों के चयन में परिणाम सकता है । विशेष रूप से ब्याज की PI561725 isogenic लाइन है, जो एल्यूमीनियम सहिष्णु है क्योंकि यह ALMT1 (एल्यूमीनियम सक्रिय Malate ट्रांसपोर्टर 1), एल्यूमीनियम के साथ तुलना के साथ जुड़े माइक्रोबियल समुदायों के बीच अंतर है संवेदनशील PI561727 isogenic लाइन, जो जीन, almt123,24,25,26के एक गैर एल्यूमीनियम उत्तरदायी रूप के पास । अध्ययन के मुख्य उद्देश्य के लिए एक सरल, मात्रात्मक जटिल नमूना प्रकार के siderophore संवर्धन संस्कृतियों में siderophore उत्पादन का आकलन करते हुए भविष्य के काम के लिए संस्कृतियों के संरक्षण के एक सीधी, तेजी से विधि का विकास किया गया ।

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Protocol

नोट: फ़ील्ड साइट का स्थान: वाशिंगटन राज्य विश्वविद्यालय, संयंत्र पैथोलॉजी फार्म (46 ° 46 ' 38.0 "N 117 ° 04 ' 57.4" W). बीज 19 अक्टूबर, २०१७ पर एक यांत्रिक बागान का उपयोग कर बोया गया था । प्रत्येक गेहूं जीनोटाइप headrows में लगाया गया था, लगभग 1 मीटर के अलावा जड़ प्रणाली के अतिव्यापी से बचने के लिए । प्लांट और मिट्टी के नमूने 9 अगस्त, २०१८ को एकत्र किए गए, जब पौधे फसल के लिए तैयार हो गए । नमूने चार गेहूं पादी: PI561727, PI561725, Madsen, Lewjain के तीन दोहराने से एकत्रित किए गए ।

1. संशोधित M9 माध्यम की तैयारी

  1. का प्रयोग करें ना2पो4∙ 7H2ओ (१२.८ ग्राम/200 एमएल), KH2po4 (०.३ ग्राम/200 एमएल), NaCl (०.५ ग्राम/200 एमएल), और एनएच4सीएल (1 ग्राम/M9 नमक समाधान तैयार करने के लिए रिएजेंट ।
  2. MgSO4∙ 7H2o के १०० मिलीलीटर में डबल जल (ddH2o) तैयार करने के लिए ०.७५ मीटर MgSO4∙ 7H2हे का प्रयोग करें ।
  3. मेक 1 मी ऑफ CaCl2∙ 2H2ओ जोड़कर १४.७ जी के CaCl2∙ 2H2ओ के साथ १०० एमएल के ddH2हे.
  4. पाइपों के ६.०४८ g को भंग करके बफर सॉल्यूशन तैयार करें ddH2O के चमचे से १५६ मिलीलीटर में । 5 मीटर NaOH के साथ ६.८ करने के लिए पीएच समायोजित करें ।
  5. ddH2O के १०० मिलीलीटर में ग्लूकोज के 20 ग्राम को भंग करके 20% ग्लूकोज (डेक्सट्रोज मोनोहाइडे) तैयार करें ।
  6. समाधान तैयार है और व्यक्तिगत रूप से सभी लेकिन ग्लूकोज आटोक्लेव । autoclaving (०.२२ µm) के बाद M9 मीडिया के अलावा के लिए ग्लूकोज समाधान बाँझ फ़िल्टर.
  7. १५६ मिलीलीटर पाइपों बफर समाधान के मिश्रण से संशोधित M9 माध्यम तैयार करें, M9 लवण समाधान की ४० मिलीलीटर, 20 μL के CaCl2· 2H2हे समाधान, २६६ μL के MgSO4· 7H2हे, और 20% ग्लूकोज समाधान के 4 मिलीलीटर में एक साथ कैबिनेट, बाँझ तकनीक का उपयोग कर.
  8. संशोधित M9 के संरक्षण के लिए, कंटेनर सील, एल्यूमीनियम पंनी के साथ यूवी से बचाने के लिए, और जगह 4 डिग्री सेल्सियस पर कवर ।

2. कैस-Fe-आगर मीडियम की तैयारी

  1. एसिड धो १०० mm एचसीएल में सभी कांचियों/100 मिमी िनॉ3 कैस परख में उपयोग करने से पहले 2 ज की एक ंयूनतम के लिए ।
  2. एक एल्यूमीनियम पाक प्रयोगशाला ग्रेड रेत से भरा पैन तैयार है और यह एल्यूमीनियम पंनी के साथ कवर । 30 मिनट के लिए १२१ डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव और अलग सेट ।
  3. तैयार HDTMA (hexadecyltrimethylammonium ब्रोमाइड) को जोड़कर ०.०३६५ ग्राम को 20 मिलीलीटर ddH2हे और solubilization को बढ़ावा देने के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर समाधान जगह है ।
  4. 10 मिमी एचसीएल तैयार और 1 मिमी FeCl3· 6H2हे विलायक के रूप में 10 मिमी एचसीएल का उपयोग कर उत्पन्न करते हैं । ddH2के 25 मिलीलीटर के लिए कैस के ०.०३०२ जी जोड़ें हे, जबकि धीरे एक बाँझ चुंबकीय हलचल बार के साथ सरगर्मी । फिर 1 मिमी FeCl3· 6H2ओ (10 मिमी एचसीएल में) के 5 मिलीलीटर जोड़ें कैस समाधान के 25 मिलीलीटर करने के लिए धीरे से हलचल (समाधान अंधेरे लाल काले रंग में बदल जाता है) ।
  5. धीरे HDTMA समाधान के 20 मिलीलीटर जोड़ें, जबकि धीरे सरगर्मी में, Fe-कैस समाधान (इस पैदावार एक गहरे नीले समाधान) ।
  6. पाइप के १५.१२ g को भंग करके बफर सॉल्यूशन तैयार करें ddH2हे की, कोमल चमचे से ३७५ मिलीलीटर में । 5 मीटर NaOH के साथ ६.८ करने के लिए पीएच समायोजित करें । मात्रा को ४५० मिलीलीटर में लाने के लिए पानी डालें । समाधान के लिए agarose के 5 जी जोड़ें । पाइप्स बफ़र समाधान और CAS-Fe समाधान १२१ ° c 30 मिनट के लिए आटोक्लेव ।
  7. ध्यान से जोड़ने के लिए CAS-Fe समाधान की संपूर्णता में पाइप्स बफ़र की पूर्णरूप से प्रत्येक के बाद autoclaved है सुरक्षा कैबिनेट ।
  8. ५० डिग्री सेल्सियस पर एक पानी स्नान में मिश्रित समाधान प्लेस ।
    नोट: नए सिरे से प्रत्येक परख से पहले कैस-fe-आगर मध्यम में सभी एजेंट तैयार करते हैं, लंबी अवधि के भंडारण के रूप में कैस-fe जटिल के वर्षण में ५० ° c परिणाम, और जम मध्यम में ठंडा परिणाम ।
  9. ५० ° c करने के लिए एक बाँझ के लिए सुरक्षा कैबिनेट और गर्मी में बाँझ रेत में एक अनएजेंट नाव प्लेस । नाव के लिए कैस-Fe-आगर स्थानांतरण, तो जल्दी से aliquot १०० µ एल एक स्पष्ट, सपाट नीचे, बाँझ ९६-अच्छी तरह से microplate में एक अच्छी तरह से करने के लिए ।

3. Pyoverdine/EDTA मानक तैयारी

  1. Pyoverdine तयारी
    1. तैयार ८०० माइक्रोन pyoverdine मानक (succinic एसिड का मिश्रण, 2-hydroxy glutaramide, और succinaminde के pyoverdine रूपों – सामग्री की तालिकादेखें), पहले से तैयार संशोधित M9 माध्यम में.
    2. इस समाधान को ४००, २००, १००, ५०, 25, १२.५, और ६.२५ माइक्रोन समाधानों में पतला करें ।
  2. EDTA मानक तैयारी
    1. जोड़ें ०.५९४ g of disodium ethylenediaminetetraacetic अम्ल (EDTA: C10H14N2न2o8. 2H2o), के लिए पहले से तैयार संशोधित M9 मध्यम से ५०० मिलीलीटर को ३२०० माइक्रोन EDTA मानक तैयार करना ।
    2. इस समाधान को १६००, ८००, ४००, २००, १००, ५०, 25, १२.५, और ६.२५ माइक्रोन समाधानों में पतला करें ।
  3. मानक वक्र पीढ़ी
    1. pyoverdine और EDTA के प्रत्येक एकाग्रता के १०० μL जोड़ें एक ९६ के अलग कुओं के लिए अच्छी तरह से microplate युक्त १०० μL के कैस-Fe मध्यम । प्रत्येक एकाग्रता की डुप्लिकेट तकनीकी प्रतिकृतियां बनाओ । इसके अलावा, केवल M9 (कोई EDTA या pyoverdine) के साथ खाली कुओं जोड़ें ।
    2. एक microplate रीडर का उपयोग करना, मापने (४२० एनएम और ६६५ एनएम पर) अवशोषक 1, 6 के बाद, और 24 एच में 22 डिग्री सेल्सियस, और उपयोग के लिए अवशोषित माप मानक curves उत्पंन करने के लिए ।
      नोट: ४२० एनएम माप के लिए, pyoverdine या EDTA युक्त कुओं के अवशोषण से रिक्तियों के अवशोषण घटाना । ६६५ एनएम के लिए, pyoverdine या EDTA के अवशोषण घटाना रिक्त स्थान के अवशोषण से कुओं से युक्त । उसके बाद, लॉग10(µ m pyoverdine या EDTA) को सोखने की माप के खिलाफ regressed है । नमूना परिणामों की व्याख्या की आसानी के लिए, एक्स-अक्ष और लॉग10(µ m pyoverdine या EDTA) के रूप में अवशोषित का उपयोग करें y-अक्ष के रूप में ।

4. पर्यावरण के नमूनों का संग्रह: मिट्टी और संयंत्र के ऊतकों

  1. धो नमूना उपकरण (फावड़ियों और कैंची) के साथ ०.२२ µm फ़िल्टर्ड ddH2हे ७०% इथेनॉल के बाद, और नमूना और के बीच में नमूने से पहले कागज तौलिए से पोंछ और बाँझ तकनीक को बनाए रखने और पार संदूषण को कम करने के लिए ।
  2. उत्पाद संयंत्र के ऊतकों (अनाज और गोली मारता है) के क्षेत्र में पौधों से, और उंहें एक लेबल प्लास्टिक का भंडारण बैग में जगह, पर्याप्त वांछित मिट्टी और जड़ नमूनों को उखाड़ने में आसानी के लिए गोली मार खूंटी जा ।
  3. एक छोटे से रूट गेंद लगभग 15 सेमी गहरी और 23 सेमी चौड़ा और यह एक अलग में जगह, प्रयोगशाला वातावरण में नमूना तैयार करने के लिए प्लास्टिक की थैली लेबल राजमहल । यह कदम McPherson एट अल.27के तरीकों के समान है ।
  4. सभी नमूनों (अनाज, गोली मारता है, थोक मिट्टी, और अलग बैग में जड़ गेंदों) सीधे बर्फ पर रखें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रखने के लिए जब तक नमूनों siderophore उत्पादन परख के लिए कार्रवाई कर रहे हैं ।
  5. अलग रूट जुड़े मिट्टी के नमूनों में थोक, लचर बंधे rhizosphere मिट्टी, और कसकर बंधे rhizosphere मिट्टी ।
    1. बैग के बाहर जड़ गेंदों ले लो । धीरे जड़ गेंद से मिट्टी हिला । मिट्टी से हिल, बैग में छोड़ दिया मिट्टी के साथ "थोक" मिट्टी शामिल हैं ।
    2. आगे की जड़ गेंद से मिट्टी हटाने के लिए एक रबर हथौड़ा का प्रयोग करें । यह लचर बंधे rhizosphere मिट्टी है ।
    3. कस-बंधे नमूने के साथ जड़ें लेने और उंहें एक केंद्रापसारक ट्यूब में डाल द्वारा कसकर बंधे rhizosphere मिट्टी उत्पंन करते हैं । ddH2ओ के 30 मिलीलीटर और 2-3 मिनट के लिए यह भंवर जोड़ें । जड़ों को हटाने के लिए कसकर बंधे rhizosphere मिट्टी का घोल कमजोर पड़ने मिलता है.

5. siderophore संवर्धन संस्कृतियों और कैस-Fe siderophore उत्पादन परख की तैयारी

नोट: सभी कांच के नीचे की परख शुरू करने से पहले धोया एसिड होना चाहिए ।

  1. मिट्टी नमूना तैयारी (तीन मिट्टी नमूना प्रकार के प्रत्येक के लिए)
    1. नमूना बैग के भीतर प्रत्येक मिट्टी के नमूने Homogenize, मिश्रण और बैग खोलने के बिना संभव के रूप में के रूप में ज्यादा मोड़ से मिट्टी ।
      नोट: यह प्राकृतिक मिट्टी स्थानिक परिवर्तनशीलता को कम करने में मदद करता है और सामांय मिट्टी नमूना प्रक्रियाओं के साथ संरेखित । अंय तरीकों के लिए पर्यावरणीय नमूनों homogenize उपयोग किया जा सकता है, के रूप में उपयुक्त है, और प्रयोगात्मक डिजाइन पर निर्भर करता है ।
    2. प्रत्येक नमूने के बाद अच्छी तरह से मिलाया गया है, aliquot और संशोधित M9 माध्यम के 20 मिलीलीटर में प्रत्येक मिट्टी के २.० जी निलंबित, तो एक बाँझ ५० मिलीलीटर में 20 मिलीलीटर की कुल मात्रा के लिए 10-3 पतला एक बाँझ फोम प्लग के साथ वातन अनुमति देने के लिए.
    3. कसकर बंधे rhizosphere नमूनों के लिए, संशोधित M9 माध्यम के 20 मिलीलीटर के लिए rhizosphere मिट्टी के घोल के 2 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, तो 10 पतला एक बाँझ ५० मिलीलीटर एक बाँझ फोम प्लग के साथ में 20 मिलीलीटर की कुल मात्रा के लिए3 वातन अनुमति देने के लिए ।
  2. ऊतक नमूना (जड़, गोली मार और अनाज) की तैयारी
    1. भूतल ७०% इथेनॉल के साथ नमूना निष्फल । Macerate २.० संशोधित M9 मध्यम 30 सेकंड के लिए उच्च पर एक ब्लेंडर का उपयोग कर के 20 मिलीलीटर में ताजा ऊतक के जी । एक बाँझ ५० एमएल केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए नमूना हस्तांतरण, तो वातन की अनुमति देने के लिए एक बाँझ फोम प्लग के साथ एक बाँझ ५० एमएल केंद्रापसारक ट्यूब में 20 मिलीलीटर की कुल मात्रा के लिए 10-3 पतला ।
  3. Fe सीमा के माध्यम से Siderophore उत्पादन का संवर्धन
    1. मशीन ५० मिलीलीटर कमरे के तापमान पर ट्यूबों केंद्रापसारक और १६० rpm पर शेक ।

6. कैस-Fe पर्यावरण नमूनों में siderophore उत्पादन का पता लगाने के लिए परख

  1. 24, ४८, और ७२ में संवर्धन संस्कृति की शुरुआत के बाद एच, संवर्धन ट्यूबों से 1 मिलीलीटर उपनमूना हटाने बाँझ तकनीक का उपयोग और 2 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूबों में 1 मिनट के लिए १०,००० x जी पर केंद्रापसारक pelletize कोशिकाओं को ।
  2. अलग supernatant लीजिए. बाँझ तकनीक का प्रयोग, microplate में डुप्लिकेट या तपसिल में कैस-Fe-आगर के १०० μL समाधान के लिए supernatant के १०० μL जोड़ें । इसके अलावा बाँझ M9 मध्यम (रिक्तियों के रूप में) के १०० µ एल जोड़ें । फिर 28 डिग्री सेल्सियस पर थाली मशीन ।
  3. प्रत्येक नमूने के लिए शेष supernatant और गोली निलंबित (microtiter प्लेट में नहीं जोड़ा) अपने में, बाँझ 2 एमएल केंद्रापसारक ट्यूब । प्रत्येक नमूना-supernatant ट्यूब में बाँझ ग्लिसरॉल के ४०० μL जोड़ें और ग्लिसरॉल स्टॉक बनाने के लिए गोली resuspend । बाद में विश्लेषण के लिए-८० ° c पर शेयर फ्रीज ।
    नोट: यह कदम किसी भी पसंदीदा में घर प्रोटोकॉल के अनुसार ग्लिसरॉल शेयर उत्पंन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है ।
  4. 6, 24, ४८, और ७२ एच पर उपाय अवशोषक, ४२० एनएम तरंग दैर्ध्य पर ।
  5. pyoverdine समकक्ष के संदर्भ में नमूना अवशोषक माप की व्याख्या करने के लिए pyoverdine या EDTA से उत्पन्न मानक curves का उपयोग करें ।
    नोट: Pyoverdine एक बेहतर मानक EDTA (वी इंफ्रा) के साथ तुलना में निर्धारित किया गया था, तो EDTA वर्तमान अध्ययन में परिणाम की व्याख्या करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया गया था ।

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Representative Results

एक pyoverdine मिश्रण Pseudomonas fluorescens द्वारा संश्लेषित एक मानक के रूप में व्याख्या करने के लिए इस्तेमाल किया गया था और अवशोषण (४२० एनएम पर) नमूनों के रूप में pyoverdine समकक्ष के संदर्भ में µ मी. चित्रा 1 में अवशोषण (४२० के बीच संबंध दिखाता है एनएम) और pyoverdine की एकाग्रता शुरू (लॉग10 µ एम में molarity) । EDTA एक पर्याप्त मानक प्रदान नहीं किया है क्योंकि नमूनों अधिक से अधिक अवशोषक माप प्रदर्शन pyoverdine के साथ प्राप्य थे, और आर2 कम था (चित्रा 2) । जबकि प्रारंभिक काम siderophore का पता लगाने की एक विधि के रूप में कैस-fe परख का उपयोग कर ६३० एनएम पर मापा अवशोषित, एक संबंधित एक बहुत ही विधि का उपयोग कर अध्ययन में (कैस-fe-आगर 1:1 संशोधित M9 के साथ मिश्रित था microplate में एक २०० µ एल कॉलम उत्पंन), यह देखा गया था कि चोटी अवशोषक ६६५ एनएम पर था, लेकिन है कि ४२० एनएम नमूनों (चित्रा 3) द्वारा प्रेरित अवशोषक में परिवर्तन के मामले में अधिक reproducible था ।

Siderophore उत्पादन ७२ के बाद सभी ऊतक प्रकार के संवर्धन संस्कृतियों में मनाया गया Fe-घाटे संवर्धन और Siderophore गतिविधि के बाद ४८ (अनुपूरक चित्रा 1) के h के बाद स्थिर दिखाई । इस प्रकार, ७२ एच संवर्धन के siderophore गतिविधि ४८ एच मशीन पर मूल्यांकन के लिए जीनोटाइप और siderophore अलगाव (चित्रा 4) पर नमूना प्रकार के प्रभाव का निर्धारण किया गया । थोक मिट्टी के नमूनों में Siderophore गतिविधि अपेक्षाकृत कम थी और गेहूं जीनोटाइप के बीच अंतर प्रदर्शित नहीं किया था जिसमें से थोक मिट्टी का नमूना लिया गया था (चित्रा 4a) । शिथिलता से बंधे मिट्टी के संवर्धन PI561725 जीनोटाइप से पृथक Madsen और PI561727 से लचर बाध्य मिट्टी के साथ तुलना में अधिक से अधिक siderophore उत्पादन का प्रदर्शन किया, लेकिन नहीं Lewjain (चित्रा 4B) । कसकर बंधे मिट्टी से संवर्धन में Siderophore उत्पादन भारी जीनोटाइप (चित्रा 4c) से प्रभावित नहीं था ।

अनाज ऊतक के संवर्धन संस्कृतियों अपेक्षाकृत कम siderophore उत्पादन जीनोटाइप (चित्रा 4d) की परवाह किए बिना झुकेंगे । Lewjain गोली मार ऊतक के संवर्धन काफी अंय पादी से siderophore उत्पादन कम था, और PI561725 गोली मार ऊतक संस्कृतियों अधिक चर siderophore उत्पादन (चित्रा 4E) के परिणामस्वरूप । Siderophore गतिविधि PI561725 की जड़ ऊतक संवर्धन संस्कृतियों में अधिक से अधिक २००% अंय सभी पादी (चित्रा 4F) के साथ तुलना में था ।

Figure 1
चित्र 1. pyoverdine के log10 एकाग्रता के खिलाफ ४२० एनएम और ६५५ एनएम regressed पर अवशोषक । (क) µ एम में pyoverdine के लॉग10 एकाग्रता के खिलाफ ४२० एनएम regressed पर अवशोषक । एक बहुपद वक्र pyoverdine समकक्ष के संदर्भ में अवशोषित व्याख्या के लिए एक व्याख्यात्मक समीकरण प्राप्त करने के लिए फिट था । (ख) µ एम. आर2 में pyoverdine के लॉग10 एकाग्रता के खिलाफ ६६५ एनएम regressed पर अवशोषक पियरसन सहसंबंध गुणांक का वर्ग है, और समीकरण फिट वक्र बताते हैं । अंक ८००, ४००, २००, १००, ५०, 25, १२.५ पर अवशोषित माप के डुप्लिकेट हैं, और 28 डिग्री सेल्सियस पर 6 एच की मशीन के बाद ६.२५ µ एम pyoverdine । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. EDTA के log10 एकाग्रता के खिलाफ ४२० एनएम और ६५५ एनएम regressed पर अवशोषक । (क) µ एम में EDTA के लॉग10 एकाग्रता के खिलाफ ४२० एनएम regressed पर अवशोषक । एक बहुपद वक्र pyoverdine समकक्ष के संदर्भ में अवशोषित व्याख्या के लिए एक व्याख्यात्मक समीकरण प्राप्त करने के लिए फिट था । (ख) µ एम. आर2 में EDTA के लॉग10 एकाग्रता के खिलाफ ६६५ एनएम regressed पर अवशोषक पियरसन सहसंबंध गुणांक का वर्ग है, और समीकरण फिट वक्र बताते हैं । अंक ३२००, १६००, ८००, ४००, २००, १००, ५०, 25, १२.५, और ६.२५ µ एम EDTA पर 28 डिग्री सेल्सियस पर 6 एच की मशीन के बाद, और त्रुटि सलाखों के अवशोषित माप के डुप्लिकेट हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. 1:1 कैस-Fe-आगर के २०० µ एल कॉलम युक्त microplate वेल्स के 315 − 1000 एनएम से अवशोषण स्कैन और siderophore उत्पादन नमूनों के साथ M9 या M9 माध्यम संशोधित । प्लेट 28 डिग्री सेल्सियस पर ७२ घंटे के लिए एक microplate रीडर में अवशोषक मापने से पहले मशीन था । अवशोषक स्कैन तीन रिक्तियां कोई नमूना (काली लाइनों) से युक्त एक चोटी के साथ कसकर संकुल curves ६६५ एनएम में झुकेंगे दिखा । अवशोषित स्कैन तीन कारतूस siderophore उत्पादन नमूनों (ग्रे लाइनों) अधिक परिवर्तनशीलता के साथ घटता उपज युक्त दिखाने के लिए, लेकिन ६६५ एनएम के साथ तुलना में ४२० एनएम पर अधिक सुसंगत अवशोषक के साथ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4. siderophore संवर्धन संस्कृतियों के समकक्ष Pyoverdine । के साथ जुड़े siderophore संवर्धन संस्कृतियों के समकक्ष Pyoverdine (क) थोक (ख) ढीला बाध्य, और (ग) कसकर बंधे मिट्टी, और ऊतक homogenates में गेहूं की (घ) अनाज (ई) गोली मारता है, और (च) जड़ें । Siderophore संवर्धन संस्कृतियों ७२ ज के लिए एक microplate और 28 डिग्री सेल्सियस पर मशीनिंग के लिए उपनमूना स्थानांतरित करने से पहले मशीन थे । Siderophore उत्पादन के बाद ४८ क्रोम azurol एस पादी/लाइनों Lew = Lewjain, पागल = Madsen, ७२५ = PI561725, और ७२७ = PI561727 के साथ गर्मी के बाद मूल्यांकन किया गया । तारांकन (Bonferroni सुधार के बाद) अल्फा = ०.००८ पर महत्व का प्रतिनिधित्व करते हैं । सलाखों के मानक विचलन हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
अनुपूरक आंकड़ा 1 । समय के साथ समकक्ष Pyoverdine। Pyoverdine के समकक्ष siderophore संवर्धन संस्कृतियों के 24, ४८, और क्रोम azurol एस Sderophore संवर्धन के साथ जुड़े संस्कृतियों के ७२ एच के बाद का आकलन (क) थोक (ख) शिथिल बाध्य, और (ग) कसकर बंधे मिट्टी, और गेहूं के टिशू homogenates (डी) अनाज (ई) में गोली मारता है, और (एफ) जड़ें । Siderophore संवर्धन संस्कृतियों ७२ ज के लिए एक microplate और 28 डिग्री सेल्सियस पर मशीनिंग के लिए उपनमूना स्थानांतरित करने से पहले मशीन थे । और प्रत्येक timepoint पर siderophore उत्पादन का आकलन करने के लिए नमूना लिया । पादी/रेखाएं Lew = Lewjain, Mad = Madsen, ७२५ = PI561725, और ७२७ = PI561727 हैं । Siderophore उत्पादन के बाद मूल्यांकन किया गया, 24, ४८, और ७२ मशीन के एच । सलाखों के मानक विचलन हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

इस काम का प्राथमिक परिणाम एक नई पद्धति है कि तेजी से siderophore के लिए समृद्ध इस्तेमाल किया जा सकता है रोगाणुओं का उत्पादन करते हुए मात्रात्मक siderophore उत्पादन को मापने और पर्यावरण नमूने में गतिविधि है । कार्यप्रणाली जल्दी, सरल, और लागत प्रभावी है, और परिणाम दिखाने के लिए यह कैसे जटिल और उपंयास नमूना प्रकार (जैसे, मिट्टी और संयंत्र ऊतक) से siderophore गतिविधि का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । प्रोटोकॉल भी संवर्धन संस्कृतियों, जो आसानी से समय के माध्यम से लिया जा सकता है के ग्लिसरॉल शेयरों के उत्पादन में परिणाम के लिए माइक्रोबियल समुदाय संरचना में बदलाव के अध्ययन को समायोजित करने और डीएनए या आरएनए आधारित तकनीक के माध्यम से Fe की कमी के दौरान समारोह . पारिस्थितिक अध्ययन में siderophore गतिविधि के कैनेटीक्स की जांच करने में रुचि रखने वालों को भी इस विधि से लाभ की संभावना हो सकती है । परिणाम यह भी बताते हैं कि pyoverdine समकक्ष (pyoverdines पर्यावरण28 और मेडिसिन29के संदर्भ में महत्वपूर्ण siderophores हैं) मात्रात्मक आकलन siderophore उत्पादन का एक अच्छा तरीका प्रदान करते हैं. एक महत्वपूर्ण खोज है कि ६६५ एनएम पर अवशोषित माप siderophore गतिविधि निर्धारित करने के लिए अपर्याप्त है उन के साथ तुलना में ४२० एनएम पर मनाया (चित्रा 1) । विशेष महत्व की खोज है कि ६६५ एनएम pyoverdine सांद्रता (pyoverdine µ एम = 50-800 µ एम,10लॉग (µ एम pyoverdine) = 0.18-0.76) का एक व्यापक रेंज भर में संकुल में अवशोषित, इस तरंग दैर्ध्य पर एक जांच छत का सुझाव (आंकड़ा 1b) । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि जब pyoverdine एक बेहतर मानक EDTA के साथ तुलना में था, यह भी महंगा है, तो यह सुझाव दिया है कि प्रारंभिक काम EDTA या अन्य लागत प्रभावी chelators के साथ किया जाता है कि कार्यप्रणाली सुनिश्चित करने से पहले महारत हासिल कर ली है pyoverdine मानक जनरेट कर रहा है ।

वहां प्रोटोकॉल है कि करीब ध्यान देने की आवश्यकता भर में कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं । सबसे पहले, यह धातु मुक्त कांच के बनाए रखने और अंय सामान जहां भी संभव है जब धातुओं के साथ काम करने, विशेष रूप से कम सांद्रता में उन आवश्यक, Fe की तरह रखना महत्वपूर्ण है । दूसरे, क्योंकि संस्कृतियों Fe सीमा के माध्यम से siderophore उत्पादन के लिए समृद्ध थे, यह कार्यप्रवाह भर में अपूतित शर्तों को बनाए रखने के लिए पर्यावरणीय संदूषणों के प्रभाव को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है । अंत में, कैस-Fe की तैयारी-आगर विस्तार करने के लिए सावधान ध्यान देने की आवश्यकता है और के रूप में संभव के रूप में वर्णित बारीकी से तैयार किया जाना चाहिए । उदाहरण के लिए, यदि cas-fe-आगर समाधान गर्म रखा है, लेकिन जल्दी से इस्तेमाल नहीं किया है, कैस-fe वेग होगा । साथ ही, यह कैस-Fe-microplate को हस्तांतरण के दौरान गर्म-आगर रखने के लिए आवश्यक है । यह गर्म, बाँझ रेत का उपयोग करके प्राप्त किया गया था और जल्दी से एक microplate को एक सुरक्षा कैबिनेट में माध्यम स्थानांतरित ।

पद्धति की एक सीमा है कि क्योंकि कुछ पौधों को भी siderophores उत्पादन (phytosiderophores); ये संयंत्र ऊतक homogenates के संवर्धन संस्कृतियों में मापा siderophore गतिविधि में योगदान कर सकते हैं । इसके अलावा, वहां अपेक्षाकृत उच्च परिवर्तनशीलता था क्षेत्र प्रतिकृति से परिणाम में, और अधिक प्रतिकृति सुझाव भविष्य के अध्ययन में लाभप्रद हो सकता है । तकनीक की एक और सीमा है कि जब microplate विधि उच्च प्रवाह है, नमूना एकत्र करने और तैयारी समय लेने वाले हैं । फिर भी, क्योंकि एक एकल microplate ९६ नमूनों (मानकों सहित) के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, समय और लागत आदानों मौजूदा तकनीक के साथ तुलना में बहुत कम हैं. यह मुख्य रूप से है क्योंकि अंय मौजूदा तरीकों पेट्री व्यंजन30में कैस-Fe परख प्रदर्शन पर निर्भर है, जो स्वाभाविक कम समय और लागत के लिए एक microplate से तैयारी कुशल हैं । साथ ही, क्योंकि solubilized cas-fe परिसरों12वर्षण के लिए प्रवण हैं, प्रस्तावित विधि cas-fe-आगर माध्यम का उपयोग कर तरल-आधारित विधियों, जो भी ९६-well प्रारूप के लिए अनुकूलित किया जा करने के लिए बेहतर है ।

रिपोर्ट निष्कर्षों के संदर्भ में, यह देखते हुए कि PI561725 और PI561727 के बीच प्राथमिक अंतर ALMT1 बनामALMT1की उपस्थिति है, क्रमशः, परिणाम ALMT1 के चयन में संभावित परिणाम की उपस्थिति का सुझाव दोनों संयंत्र और मिट्टी में माइक्रोबियल समुदायों जो siderophore उत्पादन के लिए एक अधिक से अधिक क्षमता है, के रूप में संवर्धन संस्कृतियों के माध्यम से मूल्यांकन किया । भविष्य के काम आगे दोहराने की एक बड़ी संख्या का उपयोग कर घटना की जांच करना चाहिए, विशेष रूप से स्पष्ट अगर ALMT1 की उपस्थिति विशेष रूप से बढ़ाया siderophore गतिविधि के लिए चुनता है ।

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Disclosures

लेखकों के हित का खुलासा करने का कोई टकराव नहीं है.

Acknowledgments

लेखकों को प्रयोगशाला प्रक्रियाओं में सहायता के लिए कल्याणी Muhunthan, गेहूं जीनोटाइप संचयन के लिए ली Opdahl, वाशिंगटन राज्य Concord अंगूर अनुसंधान परिषद, और कृषि को बनाए रखने के लिए वाशिंगटन राज्य विश्वविद्यालय केंद्र का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं और एक BIOAg अनुदान के लिए प्राकृतिक संसाधनों के लिए इस काम का समर्थन । अतिरिक्त धन USDA द्वारा प्रदान की गई थी/

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Apex LF451320014
Aluminum Baking Pan
Aluminum Foil
Ammonium chloride, granular Fiesher Scientific 152315A
Autoclave and Sterilizer Thermo Scientific
Calcium chloride dihydrate Fiesher Scientific 171428
CAS (Chrome Azurol S) Chem-Impex Int'l Inc) 000331-27168
Dextrose Monohydrate (glucose), crystalline powder Fiesher Scientific 1521754
EDTA, disodium salt, dihydrate, Crystal J.T.Baker JI2476
Glycerol, Anhydrous Baker Analyzed C22634
HDTMA (Cetyltrimethylammomonium Bromide Reagent World FZ0941
Hydrochloride acid ACROS Organic B0756767
Infinite M200 PRO plate reader TECAN
Iron (III) chloride hexahydrate, 99% ACROS Organic A0342179
Laboratory Fume Hood Thermo Scientific
Laboratory Incubator VWR Scientific
Magnesium Sulfate Fiesher Scientific 27855
Niric Acid, (69-70)% J.T.Baker 72287
PIPES buffer, 98.5% ACROS Organic A0338723
Potassium phosphate, dibaisc,powder J.T.Baker J48594
Pyoverdine SIGMA-ALDRICH 078M4094V
Sand
SI-600R Shaker Lab Companion
Sodium chloride, granular Fiesher Scientific 136539
Sodium hydroxide, pellets J.T.Baker G48K53
Sodium phosphate, dibasic heptahydrate, 99% ACROS Organic A0371705

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References

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Lewis, R. W., Islam, A. A., Dilla-Ermita, C. J., Hulbert, S. H., Sullivan, T. S. High-throughput Siderophore Screening from Environmental Samples: Plant Tissues, Bulk Soils, and Rhizosphere Soils. J. Vis. Exp. (144), e59137, doi:10.3791/59137 (2019).

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