Summary
Vi presenterer en protokoll for rask screening av miljøprøver for siderophore potensielle bidra til micronutrient bioavailability og omsetning i terrestriske systemer.
Abstract
Siderophores (lav-molekylær vekt metall chelaterande forbindelser) er viktige i ulike økologiske fenomenet fra iron (Fe) biogeochemical sykling i jord, patogen konkurranse, plante vekst forfremmelse og kryss-rike signalering. Videre er siderophores også av kommersiell interesse i bioleaching og bioweathering av metall-bærende mineraler og malm. En rask, kostnadseffektiv og robust betyr kvantitativt vurdere siderophore produksjon i komplekse eksempler er nøkkelen til å identifisere viktige aspekter av de økologiske konsekvensene av siderophore aktivitet, inkludert, Roman siderophore produsere mikrober. Metoden som presenteres her er utviklet for å vurdere siderophore aktivitet av inne-takt microbiome samfunn, i miljøprøver, som jord eller plante vev. Prøvene ble homogenisert og fortynnet i en endret M9 medium (uten Fe) og berikelse kulturer ble inkubert for 3 dager. Siderophore produksjon ble vurdert i eksempler på 24, 48 og 72 timer (h) med en roman 96-brønnen microplate CAS (Chrome azurol sulphonate)-Fe agar analysen, en tilpasning av tradisjonelt kjedelig og tidkrevende kolorimetrisk metoden vurdere siderophore aktivitet, på enkelte dyrket mikrobiell isolater. Vi brukt vår metode til 4 forskjellige genotyper/linjer hvete (Triticum aestivum L.), inkludert Lewjain, Madsen, og PI561725 og PI561727 vanligvis dyrkes i innlands Pacific Northwest. Siderophore produksjon var tydelig påvirket av genotype hvete, og i bestemte typer anlegg vev observert. Vi brukt vår metode å raskt skjermen for påvirkning av anlegget genotype på siderophore produksjon, en viktig funksjon i terrestriske og akvatiske økosystemer. Vi produserte mange tekniske gjentak, gir svært pålitelig statistiske forskjeller i jord og plante vev. Viktigst, viser resultatene den foreslåtte metoden kan brukes til å raskt undersøke siderophore produksjon i komplekse prøver med en høy grad av pålitelighet, på en måte som tillater samfunn skal bevares for senere arbeid for å identifisere taxa og funksjonelle gener.
Introduction
Siderophores er viktig biomolecules involvert i jern-chelation for biotilgjengelighet, men med en lang rekke flere formål i terrestriske og akvatiske økosystemer fra mikrobiell quorum sensing, signalisering til microbial plante-verter, plante vekst forfremmelse, samarbeid og konkurranse innen komplekse mikrobielle samfunn1,2. Siderophores kan grovt klassifiseres i henhold til deres aktive nettsteder og strukturfunksjonene, opprette fire hovedtyper: carboxylate, hydroxamate, catecholate, og blandet typer3,4. Mange mikroorganismer kan skiller ut mer enn én type siderophore5 og komplekse samfunn, et stort flertall av organismer biosynthesize membran reseptorer slik at opptaket av enda større valgmulighet siderophores1, 6. Nyere arbeid indikerer at siderophores er spesielt viktig i samfunnsnivå, og selv i mellom Storbritannia kommunikasjon og biogeochemical transport7,8,9,10 ,11.
Chrome azurol sulphonate (CAS) har blitt brukt i over 30 år som chelaterande agent binde iron (Fe) slik at tillegg av ligander (dvs. siderophores) kan resultere i av CAS-Fe komplekset, å skape en lett identifiserbare fargeendring i medium 12. Når the CAS er bundet med Fe fargestoff vises som en royal blå farge og som CAS-Fe komplekset dissociates, mediet endrer farge i henhold til ligand brukes åtseleter Fe13. Den første, vannbasert mediet etablert av Schwyn og Neilands i 1987, er endret på mange måter å imøtekomme endre mikrobiell mål14, vekst vaner og begrensninger15, samt en rekke metaller foruten Fe, inkludert aluminium, mangan, kobolt, nikkel kadmium, litium, sink16, kobber17og selv arsen18.
Mange menneskelige patogener, så vel som anlegg veksten fremme mikroorganismer (PGPM) har blitt identifisert som siderophore-produserende organismer3,19,20, og viktige rhizosphere og endophytic PGPM ofte test positiv for siderophore-produksjon4. Den tradisjonelle Fe-baserte flytende metoden er tilpasset å være ferdig innen testing av isolerer i dyrking for siderophore produksjon21. Imidlertid mislykkes disse teknikkene å anerkjenne betydningen av mikrobielle samfunnet som helhet (microbiome), i samarbeid og potensielle regulering av siderophore produksjon i jord og plante systemer22. Derfor har vi utviklet en høy gjennomstrømming fellesskapet nivå vurdering av siderophore produksjon fra et gitt miljø, basert på tradisjonell CAS analysen, men med replikering, måling, pålitelighet og repeatability i en microplate analysen.
I denne studien er en kostnadseffektiv, høy gjennomstrømming CAS-Fe analysen for å oppdage siderophore produksjon presentert for å vurdere anriking av siderophore produksjon fra komplekse eksempler (dvs. jord og plante vev homogenates). Bulk, løst-bundet og tett-bundet rhizosphere jord (i form av hvordan jord var bundet til roten) ble innhentet korn, skyte og rot vev fra fire forskjellige hvete (Triticum aestivum L.) genotyper: Lewjain, Madsen, PI561725, og PI561727. Var hypotesen at grunnleggende forskjeller i hvete genotyper kan resultere i forskjeller i rekruttering og utvelgelse av siderophore produsere samfunn. Av spesiell interesse er forskjellen mellom mikrobielle samfunn forbundet med PI561725 isogenic linjen er aluminium tolerant fordi det har ALMT1 (aluminium-aktivert Malate Transporter 1), sammenlignet med aluminium sensitive PI561727 isogenic linje, som besitter en ikke-aluminium mottakelig form av genet, almt123,24,25,26. Det viktigste målet for studien var å utvikle en enkel, rask metode kvantitativt vurdere siderophore produksjon i siderophore berikelse kulturer av komplekse utvalg samtidig bevare kulturene for fremtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: Plasseringen av feltet område: Washington State University, plante patologi Farm (46 ° 46'38.0 "N 117 ° 04'57.4" W). Frøene ble sådd med en mekanisk planter på 19 oktober 2017. Hver hvete genotype ble plantet i headrows, ca 1 meter fra hverandre for å unngå overlappende med rotsystem. Plante- og jord prøvene ble samlet på 9 August 2018, da planter var klar for innhøsting. Prøvene ble samlet inn fra tre gjenskapninger av fire hvete genotyper: PI561727, PI561725, Madsen, Lewjain.
1. forberedelse av endrede M9 medium
- Bruk Na2PO4∙7H2O (12,8 g/200 mL), KH2PO4 (0,3 g/200 mL), NaCl (0,5 g/200 mL) og NH4Cl (1 g/20 mL) reagenser å forberede M9 salt løsning.
- Bruke 18 g av MgSO4∙7H2O i 100 mL dobbel deionisert vann (ddH2O) for å forberede 0,75 M MgSO4∙7H2O.
- Gjøre 1 M av CaCl2∙2H2O ved å legge 14,7 g av CaCl2∙2H2O med 100 mL av ddH2O.
- Klargjør buffer løsning ved oppløsning 6.048 g av rør inn 156 mL ddH2O med omrøring. Justere pH til 6,8 med 5 M NaOH.
- Klargjør 20% glukose (druesukker monohydrat) ved oppløsning 20 g av glukose i 100 mL ddH2O.
- Utarbeide løsninger og individuelt autoklav alle men glukose. Filteret sterilisere glukose løsningen for tillegg til M9 media etter autoklavering (0.22 µm).
- Forberede den endrede M9 mediet ved å blande 156 mL rør Buffer løsning, 40 mL av M9 salter løsning, 20 μL CaCl2·2H2O løsning, 266 μL MgSO4·7H2O og 4 mL av 20% glukose løsninger sammen i fravær av smittefarlige stoffer skap, bruker steril teknikk.
- For bevaring av endrede M9, sel beholderen, dekk med aluminiumsfolie for å beskytte mot UV, og plasser på 4 ° C.
2. forberedelse av CAS-Fe-Agar medium
- Syre vask alle glass i 100 mM HCl/100 mM HNO3 i minst 2 timer før utnyttelse i CAS analysen.
- Forberede en aluminium brødformen fylt med laboratoriet klasse sand og dekke det med aluminiumsfolie. Autoclave ved 121 ° C i 30 min og sett til side.
- Forberede HDTMA (hexadecyltrimethylammonium bromide) ved å legge 0.0365 g til 20 mL ddH2O og sted i løsning på 37 ° C å fremme solubilization.
- Forberede 10 mM HCl og generere 1 mM FeCl3·6H2O med 10 mM HCl som løsemiddelet. Legge til 0.0302 g CAS 25 mL av ddH2O mens forsiktig under omrøring med en bakteriefri magnetic røre bar. Deretter Legg 5 mL 1 mM FeCl3·6H2O (i 10 mM HCl) til de 25 mL av CAS løsning mens du fortsetter å forsiktig røre (løsning blir til mørk rødbrun svart farge).
- Sakte legge til 20 mL HDTMA løsning mens forsiktig røring, Fe-CAS-løsning (dette gir en mørk blå løsning).
- Klargjør buffer løsning ved oppløsning 15.12 g av rør til 375 mL ddH2O, med milde omrøring. Justere pH til 6,8 med 5 M NaOH. Legge til vann for å bringe volumet til 450 mL. Legge 5 g av agarose til løsningen. Autoclave RØRENE buffer løsning og CAS-Fe løsningen ved 121 ° C i 30 min.
- Forsiktig legge helheten av CAS-Fe løsningen på helheten av rør bufferen i biosikkerhet regjering etter hver av dem er autoklaveres.
- Plass blandet løsningen i et vannbad på 50 ° C.
Merk: Forberede fersk alle reagenser i CAS-Fe-Agar medium før hver analysen, som langvarig lagring på 50 ° C resultater på nedbør CAS-Fe komplekse og kjøling resultatene i befestet medium. - Plass en steril reagens båt i sterilt sand i biosikkerhet skap og varme til 50 ° C. Overføre CAS-Fe-Agar båten, så raskt aliquot 100 µL hver brønn i en klar, flat bunn, sterile 96-brønnen microplate.
3. Pyoverdine/EDTA standard forberedelse
- Pyoverdine forberedelse
- Forberede 800 μM pyoverdine standard (blanding av succinic acid, 2-hydroxy glutaramide og succinaminde former for pyoverdine-se Tabellen for materiale), tidligere utarbeidet endret M9 medium.
- Fortynne denne løsningen til 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 og 6,25 μM løsninger.
- EDTA standard forberedelse
- Legge 0.594 g av disodium ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA: C10H14N2Na2O8.2H2O), til 500 mL av tidligere forberedt endret M9 medium å forberede 3200 μM EDTA standard.
- Fortynne denne løsningen i 1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 og 6,25 μM løsninger.
- Standardkurve generasjon
- Tilsett 100 μL av hver konsentrasjonen av pyoverdine og EDTA skille wells fra en 96-brønnen microplate som inneholder 100 μL CAS-Fe Agar medium. Gjør like teknisk replications av hver konsentrasjon. Også legge til tomme brønner med bare M9 (ingen EDTA eller pyoverdine).
- Bruker en microplate leser, måle absorbansen (på 420 nm og 665 nm) etter 1, 6 og 24-timers inkubasjon 22 ° C og bruk absorbansen mål å generere standard kurver.
Merk: For 420 nm målinger, trekk absorbansen av tomromene fra absorbansen pyoverdine eller EDTA inneholder brønner. For 665 nm, trekke absorbansen pyoverdine eller EDTA inneholder brønner fra absorbansen av tomme. Deretter er Logg10(µM pyoverdine eller EDTA) tilbakeslag mot absorbansen målinger. For enkel tolke prøven resultater, bruke absorbansen som x-aksen og logge10(µM pyoverdine eller EDTA) som y-aksen.
4. innhenting av miljøprøver: jord og plante vev
- Vask utstyr for prøvetaking (spader og saks) med 0.22 µm filtrert ddH2O etterfulgt av 70% etanol, og tørk med tørkepapir før prøvetaking og mellom prøver å opprettholde steril teknikk og redusere kryssforurensning.
- Avgiftsdirektoratet anlegget vev (korn og skyter) fra planter i feltet, og legg dem i en merket plast oppbevaringspose, forlater nok skyte skjeggstubbene for enkel i forvisning de ønskede jord og roten prøvene.
- Grave en liten rot ballen ca 15 cm dyp og 23 cm bred og plassere den i en egen, merket plastpose for eksempel forberedelse i laboratoriemiljø. Dette trinnet er lik metodene McPherson et al.27.
- Plassere alle prøver (korn, skudd, bulk jord og rot baller i separate poser) på is og holde på 4 ° C før prøver behandles for siderophore produksjon analysen.
- Dele rot forbundet jordprøver i bulk, løst-bundet rhizosphere jord og tett-bundet rhizosphere jord.
- Ta rot ballene av poser. Forsiktig risting av jord fra roten ballen. Ristet av jord, sammen med jord venstre i posen består av "bulk" jord.
- Bruk en gummihammer ytterligere fjerne jord fra roten ballen. Dette er løst-bundet rhizosphere jord.
- Generere tett bundet rhizosphere jord ved å ta røtter med tett-bundet prøven og setter dem i en sentrifuge rør. Legge til 30 mL av ddH2O og vortex det for 2-3 minutter. Fjerne røtter for å få tett bundet rhizosphere jord slurry fortynning.
5. forberedelse av siderophore berikelse kulturer og CAS-Fe siderophore produksjon analysen
Merk: Alle glass skal acid vasket før begynnelsen av analyser.
- Eksempel jordforbedring (for hver av de tre jord utvalg)
- Homogenize hver jordprøve i prøven posen, miksing og snu jorden som mulig uten å åpne vesken.
Merk: Dette reduserer naturlige jord romlige variasjon og passer med normal jord utvalgstrekking. Andre metoder kan brukes til å homogenize miljøprøver, etter behov, og avhengig av eksperimentell design. - Etter hvert utvalg har blitt grundig blandet, aliquot og suspendere 2.0 g hver jord i 20 mL av endrede M9 medium, deretter fortynne 10-3 til et totalvolum på 20 mL i et sterilt 50 mL sentrifuge rør med en bakteriefri skum plugg å tillate lufting.
- For tett-bundet rhizosphere prøver, Legg 2 mL rhizosphere jord slurry til 20 mL av endrede M9 medium, så fortynne 10-3 til et totalvolum på 20 mL i et sterilt 50 mL sentrifuge rør med en bakteriefri skum plugg å tillate lufting.
- Homogenize hver jordprøve i prøven posen, miksing og snu jorden som mulig uten å åpne vesken.
- Vev utvalg (rot, skyte og korn) forberedelse
- Overflaten sterilisere prøven med 70% etanol. Macerate 2.0 g av ferskt vev i 20 mL endret M9 mediet bruker en blender på høy i 30 sekunder. Overføre prøven til et sterilt 50 mL sentrifuge rør og fortynne 10-3 til et totalvolum på 20 mL i et sterilt 50 mL sentrifuge rør med en bakteriefri skum plugg å tillate lufting.
- Anriking av Siderophore produksjon gjennom Fe begrensning
- Inkuber 50 mL sentrifuge rør ved romtemperatur og riste på 160 rpm.
6. CAS-Fe agar analyser for oppdagelsen av siderophore produksjon miljøprøver
- 24 fjerner 48 og 72 h etter å igangsette berikelse kultur, 1 mL underutvalg fra berikelse rørene bruker steril teknikk og sentrifuger 10.000 x g for 1 min i 2 mL sentrifuge rør for å pelletize cellene.
- Samle atskilt nedbryting. Bruker steril teknikk, tilsett 100 μL nedbryting av 100 μL løsning av CAS-Fe-Agar i to og tre eksemplarer i microplate. Også legge til 100 µL av sterile M9 medium (som tomme). Deretter ruge platen på 28 ° C.
- Suspendere de resterende nedbryting og pellets for hver prøve (ikke lagt til være ferdig innen plate) inn i sin egen, sterile 2 mL sentrifuge rør. Legg til 400 μL sterilt glyserol i hver prøve-nedbryting rør og resuspend pellets for å opprette glyserol aksjer. Fryse aksjen-80 ° c for senere analyser.
Merk: Dette trinnet kan endres for å generere glyserol aksjer etter noen foretrukne in-house protokoll. - Måle absorbans ved 6, 24, 48 og 72 h, på 420 nm bølgelengde.
- Bruk standard kurver generert fra pyoverdine eller EDTA for å tolke eksempel absorbansen målinger i pyoverdine tilsvarer.
Merk: Pyoverdine var bestemt på å være en overlegen standard sammenlignet med EDTA (vide infrarød), så EDTA ikke ble brukt til å tolke resultatene i denne studien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En pyoverdine blanding biosynthesized av Pseudomonas fluorescens ble brukt som standard til å tolke og kvantifisere absorbansen (på 420 nm) prøver i pyoverdine ekvivalenter i µM. figur 1 viser forholdet mellom absorbansen (420 NM) og konsentrasjonen av pyoverdine (Logg10 molarity i µM). EDTA gi ikke en tilstrekkelig standard fordi prøver utstilt større absorbansen målinger enn var oppnåelige med pyoverdine og R2 var lavere (figur 2). Mens innledende arbeid med CAS-Fe analysen som siderophore gjenkjenning målt absorbans ved 630 nm, i en beslektet studie bruker en tilsvarende metode (CAS-Fe-Agar ble blandet 1:1 med endrede M9 generere en 200 µL kolonne i microplate), ble det observert som topp absorbansen var 665 nm, men at 420 nm var mer reproduserbar i forhold til endringer i absorbansen indusert av prøver (Figur 3).
Siderophore produksjon ble observert i berikelse kulturer av alle vev etter 72 h Fe-underskudd berikelse og siderophore aktivitet syntes å stabilisere etter 48 timer med inkubering (supplerende figur 1). Dermed ble siderophore aktivitet av 72 h anriking vurdert på 48t inkubasjon å bestemme påvirkning av genotype og eksempel på siderophore isolasjon (Figur 4). Siderophore aktivitet i bulk jordprøver var relativt lav gjorde ikke utstillingen forskjellene mellom hvete genotype som bulk jord var samplet (figur 4A). Enrichments løst bundet jord isolert fra PI561725 genotype utstilt større siderophore produksjon sammenlignet med løst bundet jord fra Madsen og PI561727, men ikke Lewjain (figur 4B). Siderophore produksjon i enrichments fra tett bundet jord var ikke sterkt påvirket av genotype (figur 4C).
Berikelse kulturer av korn vev gitt relativt lav siderophore produksjonen uavhengig anleggspreg (Figur 4 d). Enrichments av Lewjain skyte vev hadde betydelig lavere siderophore produksjon enn de andre genotyper og PI561725 skyte vev kulturer resulterte i mer variabel siderophore produksjon (figur 4E). Siderophore aktivitet var mer enn 200% større i roten vev berikelse kulturer av PI561725 sammenlignet med alle andre genotyper (figur 4F).
Figur 1. Absorbans ved 420 nm og 655 nm regressed mot log10 konsentrasjonen av pyoverdine. (A) absorbans ved 420 nm regressed mot Logg10 konsentrasjonen av pyoverdine i µM. En polynom Kurvetilpasning var å få en forklarende formel for å tolke absorbansen i pyoverdine ekvivalenter. (B) absorbans ved 665 nm regressed mot loggen10 konsentrasjonen av pyoverdine i µM. R2 er kvadratet av Pearson korrelasjonskoeffisient, og ligningen forklarer montert kurven. Poeng er duplikater av absorbansen målinger på 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 og 6,25 µM pyoverdine etter 6 h inkubasjon på 28 ° C. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Absorbans ved 420 nm og 655 nm regressed mot log10 konsentrasjonen av EDTA. (A) absorbans ved 420 nm regressed mot Logg10 konsentrasjonen av EDTA i µM. En polynom Kurvetilpasning var å få en forklarende formel for å tolke absorbansen i pyoverdine ekvivalenter. (B) absorbans ved 665 nm regressed mot loggen10 konsentrasjon av EDTA i µM. R2 er kvadratet av Pearson korrelasjonskoeffisient, og ligningen forklarer montert kurven. Poeng er duplikater av absorbansen målinger på 3200, 1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 og 6,25 µM EDTA etter 6 h inkubasjon på 28 ° C og feilfelt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Absorbansen skanner fra 315−1000 nm microplate brønner som inneholder 200 µL kolonner til 1:1 CAS-Fe-Agar og endret M9 eller M9 medium med siderophore produsere prøver. Platen ble inkubert på 28 ° C i 72 timer før måling absorbansen i en microplate-leser. Absorbansen skanninger viser tre rubrikkene som inneholder ingen prøve (svarte linjer) gitt tett gruppert kurver med en topp på 665 nm. Absorbansen skanner Vis tre rubrikkene som inneholder siderophore produsere prøver (grå linjer) gitt kurver med mer variasjon, men med mer konsekvent absorbans ved 420 nm sammenlignet med 665 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Pyoverdine tilsvarer siderophore berikelse kulturer. Pyoverdine tilsvarer siderophore berikelse kulturer forbundet med (A) bulk (B) løst bundet, og (C) bundet jord, i vev homogenates hvete skyter (D) korn (E) og (F) røtter. Siderophore berikelse kulturer ble inkubert 72 h før overføre underutvalg til en microplate og rugende på 28 ° C. Siderophore produksjon ble vurdert etter 48 timer med inkubering med Chrome azurol S. genotyper/linjer er Lew = Lewjain, Mad = Madsen, 725 = PI561725 og 727 = PI561727. Stjerner representerer betydning på alpha = 0.008 (etter Bonferroni korreksjon). Barer er standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 1. Pyoverdine ekvivalenter over tid. Pyoverdine tilsvarer siderophore berikelse kulturer vurdert etter 24, 48 og 72 h med inkubering med Chrome azurol S. Sderophore berikelse kulturer forbundet med (A) bulk (B) løst bundet, og (C) bundet jord, og i vev homogenates hvete (D) korn (E) skyter, og (F) røtter. Siderophore berikelse kulturer ble inkubert 72 h før overføre underutvalg til en microplate og rugende på 28 ° C. og subsamplet å vurdere siderophore produksjon på hver timepoint. Genotyper/linjer er Lew = Lewjain, Mad = Madsen, 725 = PI561725 og 727 = PI561727. Siderophore produksjon ble vurdert etter, 24, 48 og 72 h inkubasjon. Barer er standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Primære resultatet av dette arbeidet er produksjon av en ny metode som kan brukes til å raskt berike for siderophore produsere mikrober mens kvantitativt måle siderophore produksjon/aktivitet i miljømessige utvalget. Metodene er rask, enkel og kostnadseffektiv, og resultatene viser hvordan den kan brukes til å oppdage siderophore aktivitet fra komplekse og romanen typer (f.eks., jord og plante vev). Protokollen resulterer også i produksjonen av glyserol aksjer av berikelse kulturer, som kan lett bli tatt gjennom tid til studier av endringer i mikrobielle samfunn struktur og funksjon under Fe mangel gjennom DNA eller RNA basert teknikker . De som er interessert i å undersøke the kinetics av siderophore aktivitet i tillegg til økologiske studier kan sannsynligvis også ha nytte av denne metoden. Resultatene viser også at pyoverdine ekvivalenter (pyoverdines er viktige siderophores i miljøet28 og medisin29) gir en god metode kvantitativt vurdere siderophore produksjon. En viktig funn er at absorbansen målinger på 665 nm er utilstrekkelige for å bestemme siderophore aktivitet sammenlignet med de observert 420 nm (figur 1). Av særlig betydning var å finne at absorbans ved 665 nm gruppert over et bredt spekter av pyoverdine konsentrasjoner (Pyoverdine µM = 50-800 µM, Logg10(µM pyoverdine) = 0,18-0.76), antyder en gjenkjenning taket på dette bølgelengde (figur 1B). det bør bemerkes at mens pyoverdine var en overlegen standard sammenlignet med EDTA, det er også kostbart, så er det foreslått at forarbeidet utføres med EDTA eller andre kostnadseffektiv chelater å sikre metoder har blitt mastret før genererer pyoverdine standarder.
Det er flere viktige trinn gjennom protokollen som krever nøye. Først er det viktig å opprettholde metall-free glass og andre varer mulig når arbeider med metaller, særlig de som er nødvendig i lave konsentrasjoner Fe. Dernest fordi kulturer ble beriket for siderophore produksjon gjennom Fe begrensning, er det viktig å opprettholde aseptiske forhold gjennom hele arbeidsflyten å redusere innflytelsen til miljøgifter. Til slutt, utarbeidelse av CAS-Fe-agar krever spesiell oppmerksomhet for detaljer og bør være forberedt som tett til beskrevet som mulig. For eksempel hvis CAS-Fe-agar løsningen holdes varmt, men ikke brukes raskt, vil CAS-Fe utløse. I tillegg er det viktig å holde CAS-Fe-Agar varme under overføring til microplate. Dette ble oppnådd ved hjelp av oppvarmet, sterile sand og raskt overføre mediet til microplate i en biosafety kabinett.
En begrensning av metodikken er det fordi noen planter produserer siderophores (phytosiderophores); Dette kan bidra til målte siderophore aktivitet i berikelse kulturer av anlegget vev homogenates. Også var det relativt høye variasjon i resultatene fra feltet gjentak, tyder flere replikering kan være gunstig i fremtidige studier. En annen begrensning av teknikken er at mens metoden microplate er høy gjennomstrømming, prøven innsamling og forberedelse er tidkrevende. Likevel, fordi en enkelt microplate kan brukes for 96 prøver (inkludert standarder), tid og kostnader innganger er mye lavere sammenlignet med eksisterende teknikker. Dette er hovedsakelig fordi andre eksisterende metoder avhengige utføre CAS-Fe analysen i Petri retter30, som er iboende mindre tid og kostnadseffektivt å forberede enn en microplate. I tillegg, fordi solubilized CAS-Fe komplekser er utsatt for nedbør12, er den foreslåtte metoden bruker CAS-Fe-Agar medium overlegen vannbasert metoder, som har også tilpasses til 96-brønns format.
I forhold til rapporterte funnene, gitt at den primære forskjellen mellom PI561725 og PI561727 er tilstedeværelsen av ALMT1 vs.almt1, henholdsvis tyder resultatene tilstedeværelsen av ALMT1 sannsynlig resultater i valg av mikrobielle samfunn i både anlegget og jord som har et større potensial for siderophore produksjon, som vurdert via berikelse kulturer. Fremtidig bør videre undersøke fenomenet med et større tall av replikat, særlig for å avklare om tilstedeværelsen av ALMT1 spesielt velger for forbedret siderophore aktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konflikter av interesse å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Kalyani Muhunthan for assistanse i laboratorium prosedyrer, Lee Opdahl for hvete genotype høsting, Washington State Concord drue forskningsråd og Washington State University Center for opprettholde landbruk og Naturressurser for en BIOAg gi for å støtte dette arbeidet. Ekstra midler ble gitt av USDA/NIFA gjennom Luke prosjekt 1014527.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Apex | LF451320014 | |
| Aluminum Baking Pan | |||
| Aluminum Foil | |||
| Ammonium chloride, granular | Fiesher Scientific | 152315A | |
| Autoclave and Sterilizer | Thermo Scientific | ||
| Calcium chloride dihydrate | Fiesher Scientific | 171428 | |
| CAS (Chrome Azurol S) | Chem-Impex Int'l Inc) | 000331-27168 | |
| Dextrose Monohydrate (glucose), crystalline powder | Fiesher Scientific | 1521754 | |
| EDTA, disodium salt, dihydrate, Crystal | J.T.Baker | JI2476 | |
| Glycerol, Anhydrous | Baker Analyzed | C22634 | |
| HDTMA (Cetyltrimethylammomonium Bromide | Reagent World | FZ0941 | |
| Hydrochloride acid | ACROS Organic | B0756767 | |
| Infinite M200 PRO plate reader | TECAN | ||
| Iron (III) chloride hexahydrate, 99% | ACROS Organic | A0342179 | |
| Laboratory Fume Hood | Thermo Scientific | ||
| Laboratory Incubator | VWR Scientific | ||
| Magnesium Sulfate | Fiesher Scientific | 27855 | |
| Niric Acid, (69-70)% | J.T.Baker | 72287 | |
| PIPES buffer, 98.5% | ACROS Organic | A0338723 | |
| Potassium phosphate, dibaisc,powder | J.T.Baker | J48594 | |
| Pyoverdine | SIGMA-ALDRICH | 078M4094V | |
| Sand | |||
| SI-600R Shaker | Lab Companion | ||
| Sodium chloride, granular | Fiesher Scientific | 136539 | |
| Sodium hydroxide, pellets | J.T.Baker | G48K53 | |
| Sodium phosphate, dibasic heptahydrate, 99% | ACROS Organic | A0371705 |
References
- Butaite, E., Baumgartner, M., Wyder, S., Kummerli, R. Siderophore cheating and cheating resistance shape competition for iron in soil and freshwater Pseudomonas communities. Nature Communications. 8, (2017).
- Ghirardi, S., et al. Identification of Traits Shared by Rhizosphere-Competent Strains of Fluorescent Pseudomonads. Microbial Ecology. 64 (3), 725-737 (2012).
- Hider, R. C., Kong, X. L. Chemistry and biology of siderophores. Natural Product Reports. 27 (5), 637-657 (2010).
- Saha, M., et al. Microbial siderophores and their potential applications: a review. Environmental Science and Pollution Research. 23 (5), 3984-3999 (2016).
- Bhattacharyya, P. N., Jha, D. K. Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR): emergence in agriculture. World Journal of Microbiology, Biotechnology. 28 (4), 1327-1350 (2012).
- Lewis, R. W., Islam, A., Opdahl, L., Davenport, J. R., Sullivan, T. S. Phylogenetics, Siderophore Production, and Iron Scavenging Potential of Root Zone Soil Bacteria Isolated from 'Concord' Grape Vineyards. Microbial Ecology. , Accepted (2018).
- Li, S. S., et al. The opportunistic human fungal pathogen Candida albicans promotes the growth and proliferation of commensal Escherichia coli through an iron-responsive pathway. Microbiological Research. 207, 232-239 (2018).
- Lorenz, N., Shin, J. Y., Jung, K. Activity, Abundance, and Localization of Quorum Sensing Receptors in Vibrio harveyi. Frontiers in Microbiology. 8, (2017).
- O'Brien, S., Fothergill, J. L. The role of multispecies social interactions in shaping Pseudomonas aeruginosa pathogenicity in the cystic fibrosis lung. Fems Microbiology Letters. 364 (15), (2017).
- Ozkaya, O., Balbontin, R., Gordo, I., Xavier, K. B. Cheating on Cheaters Stabilizes Cooperation in Pseudomonas aeruginosa. Current Biology. 28 (13), (2018).
- Popat, R., et al. Environmental modification via a quorum sensing molecule influences the social landscape of siderophore production. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 284 (1852), (2017).
- Schwyn, B., Neilands, J. B. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).
- Sullivan, T. S., Ramkissoon, S., Garrison, V. H., Ramsubhag, A., Thies, J. E. Siderophore production of African dust microorganisms over Trinidad and Tobago. Aerobiologia. 28 (3), 391-401 (2012).
- Buyer, J. S., DeLorenzo, V., Neilands, J. B. Production of the siderophore aerobactin by a halophilic Pseudomonad. Applied and Environmental Microbiology. 57 (8), 2246-2250 (1991).
- Perez-Miranda, S., Cabirol, N., George-Tellez, R., Zamudio-Rivera, L., Fernandez, F. O-CAS, a fast and universal method for siderophore detection. Journal of Microbiological Methods. 70 (1), 127-131 (2007).
- Nakouti, I., Hobbs, G. A new approach to studying ion uptake by actinomycetes. Journal of Basic Microbiology. 53 (11), 913-916 (2013).
- Wang, L. J., et al. Diisonitrile Natural Product SF2768 Functions As a Chalkophore That Mediates Copper Acquisition in Streptomyces thioluteus. Acs Chemical Biology. 12 (12), 3067-3075 (2017).
- Retamal-Morales, G., et al. Detection of arsenic-binding siderophores in arsenic-tolerating Actinobacteria by a modified CAS assay. Ecotoxicology and Environmental Safety. 157, 176-181 (2018).
- Desai, A., Archana, G. Role of Siderophores in Crop Improvement. , (2011).
- Dertz, E. A., Raymond, K. N. Comprehensive coordination chemistry II. Que, L., Tolman, W. B. 8, Elsevier, Ltd. (2003).
- Arora, N. K., Verma, M. Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria. 3 Biotech. 7, 9 (2017).
- Bandyopadhyay, P., Bhuyan, S. K., Yadava, P. K., Varma, A., Tuteja, N. Emergence of plant and rhizospheric microbiota as stable interactomes. Protoplasma. 254 (2), 617-626 (2017).
- Lakshmanan, V., Castaneda, R., Rudrappa, T., Bais, H. P. Root transcriptome analysis of Arabidopsis thaliana exposed to beneficial Bacillus subtilis FB17 rhizobacteria revealed genes for bacterial recruitment and plant defense independent of malate efflux. Planta. 238 (4), 657-668 (2013).
- Sasaki, T., et al. A wheat gene encoding an aluminum-activated malate transporter. The Plant Journal. 37 (5), 645-653 (2004).
- Mahoney, A. K., Yin, C., Hulbert, S. H. Community Structure, Species Variation, and Potential Functions of Rhizosphere-Associated Bacteria of Different Winter Wheat (Triticum aestivum) Cultivars. Frontiers in Plant Science. 8 (132), (2017).
- Rayburn, A. L., Wetzel, J., Baligar, V. Mitotic analysis of sticky chromosomes in aluminum tolerant and susceptible wheat lines grown in soils of differing aluminum saturation. Euphytica. 127 (2), 193-199 (2002).
- McPherson, M. R., Wang, P., Marsh, E. L., Mitchell, R. B., Schachtman, D. P. Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments. Journal of Visualized Experiments. (137), 57932 (2018).
- Mirleau, P., et al. Fitness in soil and rhizosphere of Pseudomonas fluorescens C7R12 compared with a C7R12 mutant affected in pyoverdine synthesis and uptake. FEMS Microbiology Ecology. 34 (1), 35-44 (2000).
- Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. Pyoverdine siderophores: from biogenesis to biosignificance. Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).
- Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. Use of Blue Agar CAS Assay for Siderophore Detection. Journal of Microbiology, Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).
