Summary
Мы представляем собой протокол для быстрого отбора экологических проб для потенциальных siderophore, способствуя биодоступность микроэлементов и оборот в наземных систем.
Abstract
Siderophores (низкий молекулярный вес металла хелатными соединениями) имеют важное значение в различные экологические явления, начиная от железа (Fe) биогеохимических циклов в почвах, возбудитель конкуренции, стимулирования роста растений, и кросс Королевство сигнализации. Кроме того siderophores также имеют коммерческий интерес в биологическое выщелачивание и bioweathering минералов и руд металлов подшипника. Быстрое, экономически эффективные и надежные средства количественной оценки производства siderophore в сложных образцов является ключом к выявлению важных аспектов экологических последствий siderophore деятельности, в том числе, Роман siderophore, производства микробов. Представленные здесь метод был разработан для оценки деятельности siderophore в такт микрофлора сообществ, в пробах окружающей среды, таких как почвы или растения тканей. Образцы были гомогенизированные разводят в изменение средних M9 (без Fe), и обогащения культур были инкубировали в течение 3 дней. Siderophore производство оценивалась в пробах на 24, 48 и 72 часов (h) использование Роман 96-луночных микропланшетов CAS (хром azurol сульфонатных)-Fe агар пробирного, адаптация традиционно утомительным и трудоемким колориметрический метод оценки siderophore деятельность, на индивидуальных возделываемых микробной изолятов. Мы обратились в наш метод для 4 различных генотипов/линий пшеницы (Triticum aestivum L.), включая Lewjain, Мадсен и PI561725 и PI561727, обычно выращивается внутреннему Тихоокеанском северо-западе. Siderophore производство четко затронуты генотипов пшеницы и в конкретных видах тканей растений наблюдается. Мы успешно использовали наш метод для быстро экран для влияния генотип растений на siderophore производстве, одной из ключевых функций в наземных и водных экосистем. Мы произвели много технических реплицирует, уступая очень надежные статистические различия в почвах и в тканях растений. Важно отметить, что результаты показывают, что предложенный метод может использоваться для быстро изучить производство siderophore в сложных образцов с высокой степенью надежности, в манере, которая позволяет общинам необходимо сохранить для дальнейшей работы для определения таксонов и функциональных генов.
Introduction
Siderophores являются важными биомолекул участвует главным образом в железо Хелаты для биодоступность, но с широкий спектр дополнительных целей в наземных и водных экосистем, начиная от микроорганизмов кворума зондирования, сигнализации для микробной растений хозяев, стимулирования роста растений, сотрудничества и конкуренции в рамках сложных микробных сообществ1,2. Siderophores можно подразделить по их активных сайтов и структурных особенностей, создание четырех основных типов: карбоксилат, hydroxamate, catecholate и смешанные типы3,4. Многие микроорганизмы способны выделяют более чем один тип siderophore5 и в сложных общинах, подавляющее большинство организмов biosynthesize мембранных рецепторов разрешить поглощение даже широкий спектр siderophores1, 6. Недавние работы показывает, что siderophores имеют особенно важное значение на уровне общин и даже в коммуникации между Королевством и биогеохимических переводы7,8,9,10 ,11.
Хром azurol сульфонатных (CAS) был использован для более чем 30 лет в качестве агента хелатирующих для связывания железа (Fe) таким образом, что добавление лигандов (т.е. siderophores) может привести к диссоциации CAS-Fe комплекса, создавая изменения легко идентифицировать цвета в среднесрочной 12. когда CAS связан с Fe, краситель появляется как Королевский синий цвет, и как комплекс CAS-Fe разъединяет, средний меняет цвет в зависимости от типа лигандов для Мусоробот Fe-13. Первоначальный, на основе жидкости среднего, установленные Schwyn и Нейлэндс в 1987 году, был изменен в много способов, чтобы вместить изменения микробной цели14, роста привычки и ограничения15, а также различных металлов, кроме Fe, включая алюминия, марганца, кобальта, кадмий никель, литий, цинка16, медные17и даже мышьяк18.
Многие патогенов человека, а также как посадить роста развитие микроорганизмов (PGPM) были определены как siderophore производителей организмов3,19,20и важные ризосфере и эндофитные PGPM часто тест siderophore производство4положительный. Традиционный метод жидкость на основе Fe был адаптирован к микротитровальных тестирования изолятов культивирования для производства siderophore21. Однако эти методы не признать важность микробных в целом (микрофлора), в сотрудничестве и потенциал регулирования производства siderophore в почве и растений систем22. По этой причине мы разработали общинного уровня оценки высок объём производства siderophore из определенной среды, основанные на традиционной assay CAS, но с репликации, простота измерения, надежность и воспроизводимость в микропланшетов анализа.
В этом исследовании экономически эффективных, высокопроизводительных assay CAS-Fe для обнаружения siderophore производства представлен для оценки обогащения siderophore производства из сложных образцов (то есть, гомогенатах ткани почвы и растений). Массовая, слабо связанные и плотно прыгните ризосфере почвы (с точки зрения как почвы был привязан к корню) были получены вместе с зерном, стрелять и тканей корня из четырех генотипов собственный пшеницы (Triticum aestivum L.): Lewjain, Мадсен, PI561725, и PI561727. Было предположить, что фундаментальные различия в генотипов пшеницы может привести к различиям в подбор siderophore, производства общин. Особый интерес это различие между микробных сообществ, связанной с линией isogenic PI561725, который является алюминий терпимая(ый), потому что он обладает ALMT1 (алюминий активированный малат транспортер 1), по сравнению с алюминия чувствительных PI561727 isogenic линия, которая обладает гибкой формы-алюминиевые гена, almt123,24,25,26. Главной задачей этого исследования было разработать простой, быстрый метод количественной оценки производства siderophore в siderophore обогащения культур сложных образцов типов при сохранении культур для будущей работы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Расположение поля сайта: Университет штата Вашингтон, завод патологии фермы (46 ° 46' 38,0" N 117 ° 04' 57,4» W). Семена были посеяны, используя Механические сеялки на 19 октября 2017. Каждый генотипов пшеницы было посажено в headrows, примерно в 1 метра друг от друга во избежание дублирования корневой системы. На 9 августа 2018, когда растения были готовы к уборке были собраны образцы растений и почв. Образцы были собраны из трех реплицирует четырех генотипов пшеницы: PI561727, PI561725, Мадсен, Lewjain.
1. Подготовка изменение средних M9
- Использование Na2PO4∙7H2O (12,8 г/200 мл), KH2PO4 (0,3 г/200 мл), NaCl (0,5 г/200 мл) и NH4реагенты Cl (1 г/20 мл) подготовить раствор соли M9.
- Используйте 18 g MgSO4∙7H2O в 100 мл двойной деонизированной воды (ddH2O) для подготовки 0,75 М MgSO4∙7H2O.
- Сделать 1 M O CaCl2∙2H2, добавив 14.7 g CaCl2∙2H2O с 100 мл ddH2O.
- Приготовляют раствор буфера путем растворения 6.048 g труб в 156 мл ddH2O с перемешиванием. Отрегулируйте pH 6.8 с 5 M NaOH.
- Подготовка 20% глюкоза (декстроза моногидрат) растворяют в 100 мл ddH2O. 20 г глюкозы
- Подготовка решения и индивидуально автоклава все но глюкозы. Фильтр стерилизовать раствора глюкозы для того, чтобы средства массовой информации M9 после автоклавирования (0.22 мкм).
- Подготовить измененный среднего M9, смешивая 156 мл трубы буферного раствора, 40 мл раствора соли M9, 20 мкл раствора CaCl2·2H2O, 266 мкл O MgSO4·7H2и 4 мл 20% глюкозы решений вместе в области биобезопасности кабинет, используя стерильную методику.
- Для сохранения измененного M9 печать контейнер, накрыть алюминиевой фольгой для защиты от УФ и поставить на 4 ° C.
2. Подготовка среды CAS-Fe-агар
- Кислота Вымойте все стекла в 100 мм HCl/100 мм HNO3 для минимум 2 часа до использования в CAS assay.
- Подготовить алюминиевый противень с песком класс лаборатории и накрыть алюминиевой фольгой. Автоклаве при температуре 121 ° C за 30 мин и отложите.
- Подготовка HDTMA (hexadecyltrimethylammonium бромид), добавив 0.0365 g 20 мл ddH2O и поместите решение при 37 ° C содействовать солюбилизация.
- Подготовка 10 мм HCl и генерировать 1 мм FeCl3·6H2O, используя 10 мм HCl в качестве растворителя. Добавьте 0.0302 g CAS 25 мл ddH2O помешивая осторожно с баром стерильные магнитные перемешать. Затем добавьте 5 мл 1 мм FeCl3·6H2O (в 10 мм HCl) к 25 мл раствора CAS продолжая осторожно перемешать (решение превращается в темного красновато черный цвет).
- Медленно добавьте 20 мл HDTMA раствора помешивая осторожно, в раствор Fe-CAS (это дает темно синий раствор).
- Подготовьте буферный раствор, растворяя 15.12 g труб в 375 мл ddH2O, с мягким перемешиванием. Отрегулируйте pH 6.8 с 5 M NaOH. Добавьте воду, довести объем до 450 мл. Добавьте в решение 5 g агарозы. Автоклав трубы буферного раствора и раствора CAS-Fe при 121 ° C за 30 мин.
- Тщательно добавьте полностью CAS-Fe решения полностью буфера труб в кабинет биобезопасности после того, как каждый из них газобетона.
- Место смешанного решения в водяной бане при температуре 50 ° C.
Примечание: Свежие Подготовьте все реагенты в CAS-Fe-агар среде перед калибровочных, как длительного хранения на 50 ° C приводит к осадков CAS-Fe комплекс и охлаждения результатов в затвердевшей среде. - Место лодку стерильные реагента в стерильных песка в кабинет биобезопасности и тепла до 50 ° C. Передача на CAS-Fe-агар лодки, а затем быстро аликвота 100 мкл для каждой скважины в четкие, с плоским дном, стерильные 96-луночных микропланшетов.
3. Pyoverdine/ЭДТА стандартные подготовка
- Pyoverdine подготовка
- Подготовка 800 мкм pyoverdine стандарт (смесь янтарной кислоты, 2-гидрокси glutaramide и succinaminde форм pyoverdine – см. Таблицу материалы), в ранее подготовленных изменение средних M9.
- Разбавьте это решение в 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 и 6,25 мкм решения.
- Подготовка стандартных ЭДТА
- Добавить 0.594 г динатрия Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА: C10H14N2Na2O8.2H2O), по 500 мл ранее подготовленные изменение средних M9 подготовить 3200 мкм ЭДТА стандарт.
- Разбавьте это решение в 1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 и 6,25 мкм решения.
- Поколение калибровочной кривой
- Добавьте 100 мкл каждого концентрации pyoverdine и ЭДТА отделить скважин 96-луночных микропланшетов, содержащей 100 мкл CAS-Fe агар среды. Чтобы дублировать технические репликаций каждого концентрации. Кроме того, добавить пустой скважин с только M9 (ЭДТА или pyoverdine).
- С помощью Считыватель микропланшетов измерять поглощение (на 420 Нм и 665 нм) после 1, 6 и 24 ч инкубации при 22 ° C и использование измерений оптической плотности для создания стандартных кривых.
Примечание: Для 420 Нм измерений, вычтите оптической плотности заготовок от поглощения pyoverdine или содержащие ЭДТА скважин. Для 665 нм, вычесть поглощения pyoverdine или ЭДТА, содержащие скважин от поглощения заготовок. Затем против измерений оптической плотности регресс журнала10(pyoverdine мкм или ЭДТА). Для облегчения интерпретации результатов выборки использовать поглощения в качестве оси x и войти10(pyoverdine мкм или ЭДТА) как по оси y.
4. сбор проб окружающей среды: тканями растений и почвы
- Мойте оборудование для отбора проб (лопаты и ножницы) с 0,22 мкм фильтруют ddH2O следуют 70% этиловом спирте и протрите бумажные полотенца до отбора проб и между образцы для поддержания стерильных и уменьшить перекрестное загрязнение.
- Акцизный растительных тканей (зерно и побеги) от растений в поле и поместите их в пластиковые надписью хранения сумку, оставляя достаточно стрелять стерни для облегчения выкорчевывание желаемого образцов почвы и корня.
- Выкопать маленький корневой мяч примерно 15 см глубиной и шириной 23 см и разместите его в отдельный, обозначенные пластиковый пакет для пробоподготовки в лабораторной среде. Этот шаг аналогичен методам McPherson et al.27.
- Поместите все образцы (зерна, побеги, массовых почвы и корня шарики в отдельные мешки) прямо на льду и хранить при 4 ° C до тех пор, пока образцы обрабатываются для assay производства siderophore.
- Отдельные образцы почвы корень связанных в массовых, слабо связанные ризосферной почвы и плотно прыгните ризосферной почву.
- Возьмите корень шарики из сумки. Аккуратно стряхните почвы от корневого кома. Стряхнуть почвы, наряду с почвы слева в мешке включает «массовых» почвы.
- Использование резинового молотка для дальнейшего удаления почвы от корневого кома. Это слабо связанные ризосфере почвы.
- Генерировать плотно прыгните ризосфере почвы, принимая корни с образцом плотно привязкой и положить их в пластиковых пробирок. Добавить 30 мл ddH2O и вихревой его на 2-3 минут. Удаление корней получить разбавление навозной жижи почвы плотно прыгните ризосфере.
5. Подготовка siderophore обогащения культур и CAS-Fe siderophore производства пробирного
Примечание: Все посуда должна быть кислоты промывают до начала анализов.
- Подготовка образцов почвы (для каждого из трех образцов почвах)
- Однородный каждого образца грунта в пределах проб, смешивания и повернув почвы, насколько это возможно без открытия мешка.
Примечание: Это помогает уменьшить пространственная изменчивость почвы и выравнивает с нормальной почвы процедуры отбора проб. Другие методы могут быть использованы для гомогенизации проб окружающей среды, а также в зависимости от экспериментальный дизайн. - После того, как каждый образец был тщательно смешанные, аликвота и приостановить 2.0 g каждой почвы в 20 мл изменение среды M9, затем развести 10-3 с общим объемом 20 мл в пластиковых пробирок стерильные 50 мл с вилкой стерильных пены позволяют аэрации.
- Плотно прыгните ризосфере образцов добавьте 2 мл раствора почвы ризосферной 20 мл изменение среды M9, затем развести 10-3 с общим объемом 20 мл в пластиковых пробирок стерильные 50 мл с вилкой стерильных пены позволяют аэрации.
- Однородный каждого образца грунта в пределах проб, смешивания и повернув почвы, насколько это возможно без открытия мешка.
- Подготовка образца (корень, стрелять и зерно) тканей
- Поверхность стерилизовать образца с 70% этиловом спирте. Размачиваем 2.0 g свежие ткани в 20 мл модифицированных M9 среды с помощью блендер на высоко в течение 30 секунд. Перенесите образец стерильные 50 мл пластиковых пробирок, затем развести 10-3 с общим объемом 20 мл в пластиковых пробирок стерильные 50 мл с вилкой стерильных пены позволяют аэрации.
- Обогащение Siderophore производства через ограничение Fe
- Инкубировать 50 мл пробирок при комнатной температуре и погрозит 160 об/мин.
6. CAS-Fe агар анализов для выявления siderophore производства в пробах окружающей среды
- На 24, 48 и 72 ч после начала обогащения культуры удалите 1 мл проб из трубы обогащения, использование стерильных и центрифуги на 10000 x g 1 мин в 2 мл пробирок для гранулирование клетки.
- Сбор разделенных супернатант. С помощью стерильных, добавьте 100 мкл супернатант 100 мкл раствора CAS-Fe-агара в дубликат или экземплярах микроплиты. Также добавьте 100 мкл стерильные среды M9 (пустые). Затем она подогревает пластину на 28 ° C.
- Приостановите оставшиеся супернатант и гранулы для каждого образца, (не добавляется к микротитровальных плита) в его собственный, стерильные 2 мл пластиковых пробирок. Добавить 400 мкл стерильных глицерина в каждую пробирку образца супернатант и Ресуспензируйте гранулы для создания запасов глицерина. Заморозить запасы на-80 ° C для последующего анализа.
Примечание: Этот шаг может быть изменен для создания глицерин запасов согласно любой предпочтительный внутренний протокол. - Измерьте absorbance на 6, 24, 48 и 72 ч, при длине волны 420 Нм.
- Используйте стандартные кривые, созданные из pyoverdine или ЭДТА для интерпретации результатов измерений оптической плотности образца pyoverdine эквиваленте.
Примечание: Pyoverdine было определено Улучшенный стандарт по сравнению с ЭДТА (смотри ниже), так что ЭДТА не использовался для интерпретации результатов в рамках нынешнего исследования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Смесь biosynthesized pyoverdine, Pseudomonas fluorescens был использован в качестве стандарта для интерпретации и количественного определения оптической плотности (на 420 Нм) образцов эквивалентах pyoverdine в мкм. на рисунке 1 показана взаимосвязь между поглощения (420 Нм) и концентрация pyoverdine (Log10 Молярность в мкм). ЭДТА не предоставляют адекватных стандартов, поскольку образцы, выставлены более измерений оптической плотности, чем были достижимыми с pyoverdine и R2 был ниже (Рисунок 2). Во время первоначальной работы с использованием CAS-Fe пробирного как метод siderophore обнаружения измерения оптической плотности на 630 Нм, в соответствующие исследования с использованием метода очень похожи (CAS-Fe-агар смешивали 1:1 с модифицированных M9, чтобы сформировать столбец 200 мкл микроплиты), было отмечено, что пик поглощения был в 665 нм, но что 420 Нм был более воспроизводимые с точки зрения изменений в оптической плотности, вызванных образцы (рис. 3).
Siderophore производства наблюдалось в обогащения культур всех типов тканей после 72 ч Fe дефицит обогащения и siderophore деятельности, по-видимому, стабилизации после 48 ч инкубации (дополнительный рис. 1). Таким образом siderophore деятельность 72 h обогащения оценивалась в 48ч инкубации определить влияние генотипа и образец типа на siderophore изоляции (рис. 4). Siderophore деятельность в массовых проб почвы была относительно низкой, и сделал не экспонат различия между генотипом пшеницы, из которого основная почва была пробы (Рисунок 4A). Сосредоточения слабо связанного почвы, изолированный от генотипа PI561725 выставлены более siderophore производства по сравнению с слабо связанного почвы от Мадсен и PI561727, но не Lewjain (рис. 4В). Siderophore производство в обогащения от тесно связанных почвы не был сильно влияние генотипа (рис. 4 c).
Обогащения культур зерно ткани принесли сравнительно низкой siderophore производства независимо от генотипа (рис. 4 d). Обогащения Lewjain стрелять ткани были значительно ниже siderophore производства, чем других генотипов, и PI561725 стрелять тканевых культур привело к более переменной siderophore производство (Рисунок 4E). Siderophore деятельность была более чем на 200% больше в в корень ткани обогащения культур PI561725, по сравнению с всеми другими генотипами (Рисунок 4F).
Рисунок 1. Поглощения в 420 Нм и 655 нм регресс против log10 концентрация pyoverdine. (A) Absorbance на 420 Нм регресс против концентрации10 журнала pyoverdine в мкм. Аппроксимации полиномиальной кривой был пригоден для получения пояснительные уравнение для интерпретации поглощения эквивалентах pyoverdine. (B) Absorbance на 665 нм регресс против журнала10 концентрация pyoverdine в мкм. R2 квадрат коэффициента корреляции Пирсона, и уравнение объясняет гладкой кривой. Очки являются дубликатами измерений оптической плотности на 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 и 6,25 мкм pyoverdine после 6 ч инкубации при 28 ° C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Поглощения в 420 Нм и 655 нм регресс против log10 концентрации ЭДТА. (A) Absorbance на 420 Нм регресс против журнала10 концентрации ЭДТА в мкм. Аппроксимации полиномиальной кривой был пригоден для получения пояснительные уравнение для интерпретации поглощения эквивалентах pyoverdine. (B) Absorbance на 665 нм регресс против журнала10 концентрации ЭДТА в мкм. R2 квадрат коэффициента корреляции Пирсона, и уравнение объясняет гладкой кривой. Очки являются дубликатами измерений оптической плотности на 3200, 1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 и 6,25 мкм ЭДТА после 6 ч инкубации при 28 ° C и погрешностей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Поглощения сканирует от Нм 315−1000 Гонав скважин, содержащие 200 мкл столбцы 1:1 CAS-Fe-агар и изменение M9 или средний M9 с siderophore производства образцов. Плита была инкубировали при 28 ° C за 72 часа перед началом измерения оптической плотности в Считыватель микропланшетов. Оптической плотности сканирования показывают три пробелы, содержащий не образца (черные линии) принесли плотно кластерных кривых с пика в 665 нм. Поглощение сканирует показать три бланки, содержащие siderophore, производство образцов (серые линии) принесли кривых с более изменчивости, но с более последовательного поглощения в 420 Нм по сравнению с 665 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Pyoverdine эквивалентов обогащения культур siderophore. Эквиваленты Pyoverdine siderophore обогащения культур, связанные с (A) оптом (B) слабо связаны и (C) тесно связаны почвы и в гомогенатах тканей пшеницы стреляет зерна (D) (E) и (F) корни. Siderophore обогащения культур были инкубировали за 72 ч до передачи подсэмплы Гонав и инкубации на 28 ° C. Siderophore производство оценивали после 48 ч инкубации с Chrome azurol S. генотипов/линии Lew = Lewjain, Mad = Мадсен, 725 = PI561725 и 727 = PI561727. Звездочки представляют значение на альфа = 0,008 (после коррекции Бонферрони). Бары – стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Дополнительная цифра 1. Эквиваленты Pyoverdine со временем. Эквиваленты Pyoverdine siderophore обогащения культур начисленных после 24, 48 и 72 ч инкубации с Chrome azurol S. Sderophore обогащения культур, связанные с (A) оптом (B) слабо связаны, и (C) тесно связаны почвы, и в гомогенатах тканей пшеницы (D) стреляет зерна (E) и (F) корни. Siderophore обогащения культур были инкубировали за 72 ч до передачи подсэмплы Гонав и инкубации на 28 ° C. и половинной оценить siderophore производства на каждом timepoint. Генотипов/линии являются Lew = Lewjain, Mad = Мадсен, 725 = PI561725 и 727 = PI561727. Siderophore производство оценивали после, 24, 48 и 72 ч инкубации. Бары – стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Основным результатом этой работы является производство новой методологии, которая может использоваться для быстрого обогащения для siderophore производства микробов при количественном измерении siderophore производством в образце окружающей среды. Методология является быстрым, простым и экономически эффективным, и результаты показывают, каким образом она может использоваться для определения siderophore активности от сложных и новых образцов типов (например., почв и растительных тканей). Протокол также приводит в производстве глицерина запасов обогащения культур, которые легко могут быть приняты через время для размещения во время дефицита Fe через ДНК или РНК исследований сдвигов в структуре микробных сообществ и функции на основе методов . Тех, кто заинтересован в изучении кинетика siderophore активности в экологических исследованиях, также, вероятно, может извлечь пользу из этого метода. Результаты также показывают, что pyoverdine эквивалентов (pyoverdines являются важными siderophores с точки зрения окружающей среды28 и медицины29) обеспечивают хороший метод количественной оценки siderophore производства. Важный вывод заключается в что поглощения измерений на 665 нм, являются недостаточными для определения siderophore активности по сравнению с теми, которые наблюдались в 420 Нм (рис. 1). Особое значение был вывод, что поглощение в 665 нм сгруппированы в широком диапазоне концентраций pyoverdine (Pyoverdine мкм = 50-800 мкм, журнал10(pyoverdine мкм) = 0,18-0.76), предложив потолок обнаружения на этой длине волны (Рисунок 1В). следует отметить, что в то время как pyoverdine был улучшенный стандарт по сравнению с ЭДТА, это также дорогостоящим, поэтому предполагается, что предварительная работа выполняется с ЭДТА, или других экономически хелаторов обеспечить методология была освоена до Создание pyoverdine стандартов.
Есть несколько критических шагов во всем протокола, которые требуют пристального внимания. Во-первых важно поддерживать безметалловой посуда и другие изделия везде, где это возможно при работе с металлами, особенно тех, которые необходимы в низких концентрациях, как Fe. Во-вторых потому что культур были обогащенные для производства siderophore через ограничение Fe, важно поддержание асептических условий на протяжении всего рабочего процесса для уменьшения воздействия загрязнителей окружающей среды. И наконец подготовка CAS-Fe агар требует пристального внимания к деталям и должны быть готовы как тесно описано как можно скорее. Например если решение CAS-Fe агар является теплым, но не используется быстро, CAS-Fe будет выпадать в осадок. Кроме того важно, чтобы согреться CAS-Fe-агар во время передачи в микроплиты. Это было достигнуто с помощью нагревается, стерильные песка и быстро передачи средних микроплиты в биобезопасности кабинета.
Одно ограничение методологии это потому, что некоторые заводы также производят siderophores (phytosiderophores); Это может способствовать деятельности измеренные siderophore в обогащение культуры тканей растений гомогенатах. Кроме того в относительно высокой изменчивости результатов от поля реплицирует, предполагая, что больше репликации может быть полезным в будущих исследованиях. Еще одно ограничение этого метода является то, что в то время как метод Гонав является высокой пропускной способности, образец сбор и подготовка времени. Тем не менее потому что один Гонав может использоваться для 96 образцов (включая нормы), затраты времени и ресурсов гораздо ниже, по сравнению с существующими методами. Это главным образом потому, что другие существующие методы полагаются на выполнение пробирного CAS-Fe в Петри30, которые являются по своей сути, меньше времени и экономически эффективным для подготовки чем микроплиты. Кроме того потому что растворимых комплексов CAS-Fe подвержены осадков12, предложенный метод, с помощью CAS-Fe-агар среднего является улучшенный жидкости на основе методов, которые также должны быть адаптированы к 96-луночных формат.
С точки зрения сообщил выводы учитывая, что основное различие между PI561725 и PI561727 является наличие ALMT1 против.almt1, соответственно, результаты указывают на наличие возможных результатов ALMT1 в выборе микробные общины в растений и почвы, которые имеют больший потенциал для производства siderophore, как начисленных через обогащения культур. Будущая работа должна далее изучить это явление, используя большее количество реплицирует, особенно для уточнения, если присутствие ALMT1 специально выбирает для расширенной siderophore деятельности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют никаких конфликтов интересов раскрыть.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Kalyani Мухунтхар за помощь в лабораторных процедур, ли Opdahl для уборки пшеницы генотип, винограда Конкорд исследования Вашингтон государственный совет и центр университета штата Вашингтон для поддержания сельского хозяйства и Природные ресурсы для BIOAg Грант для поддержки этой работы. Дополнительное финансирование было предоставлено USDA/НИФА через люк проекта 1014527.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Apex | LF451320014 | |
| Aluminum Baking Pan | |||
| Aluminum Foil | |||
| Ammonium chloride, granular | Fiesher Scientific | 152315A | |
| Autoclave and Sterilizer | Thermo Scientific | ||
| Calcium chloride dihydrate | Fiesher Scientific | 171428 | |
| CAS (Chrome Azurol S) | Chem-Impex Int'l Inc) | 000331-27168 | |
| Dextrose Monohydrate (glucose), crystalline powder | Fiesher Scientific | 1521754 | |
| EDTA, disodium salt, dihydrate, Crystal | J.T.Baker | JI2476 | |
| Glycerol, Anhydrous | Baker Analyzed | C22634 | |
| HDTMA (Cetyltrimethylammomonium Bromide | Reagent World | FZ0941 | |
| Hydrochloride acid | ACROS Organic | B0756767 | |
| Infinite M200 PRO plate reader | TECAN | ||
| Iron (III) chloride hexahydrate, 99% | ACROS Organic | A0342179 | |
| Laboratory Fume Hood | Thermo Scientific | ||
| Laboratory Incubator | VWR Scientific | ||
| Magnesium Sulfate | Fiesher Scientific | 27855 | |
| Niric Acid, (69-70)% | J.T.Baker | 72287 | |
| PIPES buffer, 98.5% | ACROS Organic | A0338723 | |
| Potassium phosphate, dibaisc,powder | J.T.Baker | J48594 | |
| Pyoverdine | SIGMA-ALDRICH | 078M4094V | |
| Sand | |||
| SI-600R Shaker | Lab Companion | ||
| Sodium chloride, granular | Fiesher Scientific | 136539 | |
| Sodium hydroxide, pellets | J.T.Baker | G48K53 | |
| Sodium phosphate, dibasic heptahydrate, 99% | ACROS Organic | A0371705 |
References
- Butaite, E., Baumgartner, M., Wyder, S., Kummerli, R. Siderophore cheating and cheating resistance shape competition for iron in soil and freshwater Pseudomonas communities. Nature Communications. 8, (2017).
- Ghirardi, S., et al. Identification of Traits Shared by Rhizosphere-Competent Strains of Fluorescent Pseudomonads. Microbial Ecology. 64 (3), 725-737 (2012).
- Hider, R. C., Kong, X. L. Chemistry and biology of siderophores. Natural Product Reports. 27 (5), 637-657 (2010).
- Saha, M., et al. Microbial siderophores and their potential applications: a review. Environmental Science and Pollution Research. 23 (5), 3984-3999 (2016).
- Bhattacharyya, P. N., Jha, D. K. Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR): emergence in agriculture. World Journal of Microbiology, Biotechnology. 28 (4), 1327-1350 (2012).
- Lewis, R. W., Islam, A., Opdahl, L., Davenport, J. R., Sullivan, T. S. Phylogenetics, Siderophore Production, and Iron Scavenging Potential of Root Zone Soil Bacteria Isolated from 'Concord' Grape Vineyards. Microbial Ecology. , Accepted (2018).
- Li, S. S., et al. The opportunistic human fungal pathogen Candida albicans promotes the growth and proliferation of commensal Escherichia coli through an iron-responsive pathway. Microbiological Research. 207, 232-239 (2018).
- Lorenz, N., Shin, J. Y., Jung, K. Activity, Abundance, and Localization of Quorum Sensing Receptors in Vibrio harveyi. Frontiers in Microbiology. 8, (2017).
- O'Brien, S., Fothergill, J. L. The role of multispecies social interactions in shaping Pseudomonas aeruginosa pathogenicity in the cystic fibrosis lung. Fems Microbiology Letters. 364 (15), (2017).
- Ozkaya, O., Balbontin, R., Gordo, I., Xavier, K. B. Cheating on Cheaters Stabilizes Cooperation in Pseudomonas aeruginosa. Current Biology. 28 (13), (2018).
- Popat, R., et al. Environmental modification via a quorum sensing molecule influences the social landscape of siderophore production. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 284 (1852), (2017).
- Schwyn, B., Neilands, J. B. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).
- Sullivan, T. S., Ramkissoon, S., Garrison, V. H., Ramsubhag, A., Thies, J. E. Siderophore production of African dust microorganisms over Trinidad and Tobago. Aerobiologia. 28 (3), 391-401 (2012).
- Buyer, J. S., DeLorenzo, V., Neilands, J. B. Production of the siderophore aerobactin by a halophilic Pseudomonad. Applied and Environmental Microbiology. 57 (8), 2246-2250 (1991).
- Perez-Miranda, S., Cabirol, N., George-Tellez, R., Zamudio-Rivera, L., Fernandez, F. O-CAS, a fast and universal method for siderophore detection. Journal of Microbiological Methods. 70 (1), 127-131 (2007).
- Nakouti, I., Hobbs, G. A new approach to studying ion uptake by actinomycetes. Journal of Basic Microbiology. 53 (11), 913-916 (2013).
- Wang, L. J., et al. Diisonitrile Natural Product SF2768 Functions As a Chalkophore That Mediates Copper Acquisition in Streptomyces thioluteus. Acs Chemical Biology. 12 (12), 3067-3075 (2017).
- Retamal-Morales, G., et al. Detection of arsenic-binding siderophores in arsenic-tolerating Actinobacteria by a modified CAS assay. Ecotoxicology and Environmental Safety. 157, 176-181 (2018).
- Desai, A., Archana, G. Role of Siderophores in Crop Improvement. , (2011).
- Dertz, E. A., Raymond, K. N. Comprehensive coordination chemistry II. Que, L., Tolman, W. B. 8, Elsevier, Ltd. (2003).
- Arora, N. K., Verma, M. Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria. 3 Biotech. 7, 9 (2017).
- Bandyopadhyay, P., Bhuyan, S. K., Yadava, P. K., Varma, A., Tuteja, N. Emergence of plant and rhizospheric microbiota as stable interactomes. Protoplasma. 254 (2), 617-626 (2017).
- Lakshmanan, V., Castaneda, R., Rudrappa, T., Bais, H. P. Root transcriptome analysis of Arabidopsis thaliana exposed to beneficial Bacillus subtilis FB17 rhizobacteria revealed genes for bacterial recruitment and plant defense independent of malate efflux. Planta. 238 (4), 657-668 (2013).
- Sasaki, T., et al. A wheat gene encoding an aluminum-activated malate transporter. The Plant Journal. 37 (5), 645-653 (2004).
- Mahoney, A. K., Yin, C., Hulbert, S. H. Community Structure, Species Variation, and Potential Functions of Rhizosphere-Associated Bacteria of Different Winter Wheat (Triticum aestivum) Cultivars. Frontiers in Plant Science. 8 (132), (2017).
- Rayburn, A. L., Wetzel, J., Baligar, V. Mitotic analysis of sticky chromosomes in aluminum tolerant and susceptible wheat lines grown in soils of differing aluminum saturation. Euphytica. 127 (2), 193-199 (2002).
- McPherson, M. R., Wang, P., Marsh, E. L., Mitchell, R. B., Schachtman, D. P. Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments. Journal of Visualized Experiments. (137), 57932 (2018).
- Mirleau, P., et al. Fitness in soil and rhizosphere of Pseudomonas fluorescens C7R12 compared with a C7R12 mutant affected in pyoverdine synthesis and uptake. FEMS Microbiology Ecology. 34 (1), 35-44 (2000).
- Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. Pyoverdine siderophores: from biogenesis to biosignificance. Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).
- Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. Use of Blue Agar CAS Assay for Siderophore Detection. Journal of Microbiology, Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).
