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Medicine

चिकनी मांसपेशी कोशिका वंश के उन्नत atherosclerotic घावों में सेलुलर संरचना का मात्रात्मक विश्लेषण-चूहों अनुरेखण

Published: February 20, 2019 doi: 10.3791/59139
Automatic Translation
1, 1, 2,3, 1,4
1Heart, Lung, Blood and Vascular Medicine Institute, University of Pittsburgh, 2Robert M. Berne Cardiovascular Research Center, University of Virginia, 3Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Virginia, 4Division of Cardiology, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

हम एक मानकीकृत प्रोटोकॉल का प्रस्ताव करने के लिए देर से मंच के सेलुलर संरचना की विशेषता मूरीन atherosclerotic घावों के व्यवस्थित तरीके सहित पशु विच्छेदन, ऊतक embedding, sectioning, धुंधला, और बाहु-शीर्ष धमनियों का विश्लेषण से atheroprone चिकनी मांसपेशी कोशिका वंश अनुरेखण चूहों.

Abstract

atherosclerosis दुनिया भर में मौत का प्रमुख कारण बना हुआ है और, अनगिनत पूर्व नैदानिक होनहार चिकित्सकीय लक्ष्यों का वर्णन अध्ययन के बावजूद, उपंयास हस्तक्षेप मायावी बनी हुई है । यह संभावना है, हिस्से में, आनुवंशिक जोड़तोड़ या atherosclerosis के विकास पर औषधीय उपचार के प्रभाव की जांच के बजाय स्थापित रोग से पूर्व नैदानिक रोकथाम मॉडल पर निर्भरता के लिए । इसके अलावा, इन अध्ययनों के परिणाम अक्सर क्योंकि सतही घाव का विश्लेषण और घाव कोशिका आबादी के लक्षण वर्णन की कमी के उपयोग के अनुरूप हैं । इन स्थानांतरीय बाधाओं को दूर करने में मदद करने के लिए, हम हस्तक्षेप मॉडल है कि इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला और संनाभि माइक्रोस्कोपी द्वारा एक एकल सेल स्तर पर सेलुलर संरचना में परिवर्तन की जांच को रोजगार पर एक वृद्धि की निर्भरता का प्रस्ताव । इस अंत करने के लिए, हम पशु विच्छेदन के लिए एक व्यवस्थित दृष्टिकोण, embedding, sectioning, धुंधला, और बाहु-शीर्ष धमनी के घावों के परिमाणन सहित एक मूरीन हस्तक्षेप मॉडल में एक ख्यात चिकित्सकीय एजेंट परीक्षण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन । इसके अलावा, देर से चरण atherosclerotic घावों के भीतर कोशिकाओं की लक्षणप्ररूपी विविधता के कारण, हम सेल विशेष का उपयोग करने के महत्व का वर्णन, inducible वंश अनुरेखण माउस सिस्टम और कैसे इस के निष्पक्ष लक्षण वर्णन के लिए डिप्लोमेसी किया जा सकता है atherosclerotic घाव सेल आबादी । साथ में, इन रणनीतियों संवहनी जीव की सहायता के लिए और अधिक सही मॉडल चिकित्सीय हस्तक्षेप और atherosclerotic रोग का विश्लेषण और उंमीद है कि नैदानिक परीक्षणों में सफलता की एक उच्च दर में अनुवाद करेंगे ।

Introduction

atherosclerosis रुग्णता और मृत्यु दर दुनिया भर में कोरोनरी धमनी रोग, परिधीय धमनी रोगों, और स्ट्रोक के बहुमत के प्रमुख कारण है । देर से मंच कोरोनरी atherosclerosis विश्व जनसंख्या मृत्यु दर1,2के लगभग 16% के लिए मायोकार्डियल अतिक्रमण लेखांकन सहित गंभीर जटिलताओं के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । सार्वजनिक स्वास्थ्य पर अपने विनाशकारी प्रभाव के कारण, पर्याप्त प्रयास atherosclerosis प्रगति ड्राइविंग तंत्र को समझने के लिए किया गया है, के रूप में अच्छी तरह के रूप में उपंयास चिकित्सकीय रणनीतियों का विकास । फिर भी, अनुमोदन की संभावना (loa) हृदय रोग के लिए नैदानिक परीक्षणों की दर सबसे कम जब अंय नैदानिक क्षेत्रों के साथ तुलना में है (केवल ८.७% चरण के लिए मैं)3। इस भाग में कई बाधाओं से समझाया जा सकता है कि atherosclerosis अपने लगभग सर्वव्यापी प्रकृति सहित कुशल औषधि विकास के लिए बन गया है, चिकित्सकीय-मूक प्रगति, और महत्वपूर्ण रोग heterogeneity । इसके अलावा, पूर्वनैदानिक पशु अध्ययन के सबऑप्टिमल डिजाइन भी नैदानिक अनुवाद में सफलता की कमी के लिए जिंमेदार हो सकता है । विशेष रूप से, हमें विश्वास है कि यह हस्तक्षेप अध्ययन जब भी संभव चिकित्सकीय रणनीतियों की प्रभावकारिता की जांच लागू करने के लिए आवश्यक है । इसके अलावा, भाग्य मानचित्रण और phenotyping द्वारा देर से मंच atherosclerotic घाव सेलुलर संरचना के उन्नत लक्षण वर्णन सहित घाव विश्लेषण के लिए मानकीकृत प्रक्रियाओं प्रदर्शन करने के लिए एक महत्वपूर्ण जरूरत है.

atherosclerosis के विशाल बहुमत atherosclerosis की रोकथाम के मॉडल पर ध्यान केंद्रित दवा उपचार या जीन हेरफेर से मिलकर (नॉकआउट या दस्तक में) स्वस्थ युवा चूहों में, रोग दीक्षा और प्रगति से पहले. इन अध्ययनों से जीन और संकेतन अणुओं की एक बड़ी संख्या का पर्दाफाश किया है कि atherosclerosis विकास में एक भूमिका निभाते हैं । हालांकि, इन लक्ष्यों में से अधिकांश मानव में कुशल चिकित्सा के लिए अनुवाद करने में विफल रहा । वास्तव में, यह प्रभाव बहिर्वेशन करने के लिए मुश्किल है एक थेरेपी उन्नत atherosclerotic घावों के साथ बुजुर्ग रोगियों के लिए स्वस्थ युवा चूहों पर है. इस प्रकार, पूर्व नैदानिक प्रायोगिक पाइपलाइन में हस्तक्षेप अध्ययनों के कार्यान्वयन की संभावना एक नई चिकित्सकीय की प्रासंगिकता और प्रभावकारिता का एक और अधिक सटीक चित्रण प्रदान करता है. विचार एक रोकथाम4,5,6 या हस्तक्षेप रणनीति7को रोजगार जब समर्थक भड़काऊ साइटोकाइन इंटरल्यूकिन-1β (आईएल-1β) बाधा के चर्यजनक अपसारी प्रभाव द्वारा समर्थित है । रोकथाम और हस्तक्षेप के बीच मतभेद अध्ययन सुझाव है कि विभिन्न सेलुलर प्रक्रियाओं atherosclerosis विकास के विभिन्न चरणों में होते हैं और तथ्य यह है कि रोकथाम के अध्ययन की संभावना नैदानिक परिदृश्य मॉडल के लिए अपर्याप्त हैं पर प्रकाश डाला गया पर्याप्त.

अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन ने हाल ही में एक वैज्ञानिक उचित प्रयोगात्मक डिजाइन, प्रक्रियात्मक मानकीकरण, विश्लेषण, और पशु atherosclerosis अध्ययन की रिपोर्टिंग के लिए सिफारिशों का ब्यौरा विवरण प्रकाशित8। यह लाभ और प्रमुख तकनीक क्षेत्र में इस्तेमाल की सीमाओं पर प्रकाश डाला गया । उदाहरण के लिए, महाधमनी के एन चेहरा सूडान चतुर्थ धुंधला अक्सर एक पहले पढ़ा-बाहर के रूप में किया जाता है । हालांकि एन फेस सूडान चतुर्थ लिपिड जमाव के दाग वैश्विक पट्टिका बोझ के आकलन के लिए एक उपयुक्त तरीका है, यह और अधिक उन्नत देर चरण घावों से प्रारंभिक चरण फैटी लकीर घावों भेद करने में असमर्थ है । जैसे, एन चेहरे धुंधला की व्याख्या अक्सर अस्पष्ट और सतही9है । ऊतक पार वर्गों का सावधानीपूर्वक विश्लेषण सुघड़ मापदंडों पोत, घाव, और लुमेन आकार और घाव स्थिरता के सूचकों के परिमाणन का उपयोग कर एक प्रयोग के प्रभाव की एक अधिक सटीक समझ प्रदान करता है ।

अंत में, मानव हिस्टोथोलॉजी अध्ययनों ने सुझाव दिया है कि सेलुलर संरचना घाव के आकार से ही टूटना का एक बेहतर कारक है, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं में खराब घावों के साथ (एसएमसी) और मैक्रोफेज में अमीर10टूटना करने के लिए अतिसंवेदनशील जा रहा है, 11. इन टिप्पणियों के मार्कर के लिए अभिरंजक के आधार पर सेल की पहचान के लिए इस्तेमाल किया (यानी, एसएमसी और LGALS3 या मैक्रोफेज के लिए CD68 के लिए ACTA2) थे । हालांकि, इन मार्करों की अभिव्यक्ति कड़ाई से एसएमसी, endothelial कोशिकाओं और माइलॉयड कोशिकाओं12सहित कई प्रजातियों के plasticity के कारण atherosclerotic घावों में एक भी कोशिका प्रकार के लिए प्रतिबंधित नहीं है । विशेष रूप से, atherosclerotic घाव के भीतर एसएमसी की स्पष्ट पहचान वस्तुतः असंभव था क्योंकि इन कोशिकाओं की संपत्ति के dedifferentiate और उनके वंश विशेष मार्कर जीन दमन करने के लिए पिछले एक दशक तक (एक प्रक्रिया के रूप में संदर्भित लक्षणप्ररूपी स्विचन) घायल या रोगग्रस्त जहाजों में13. एसएमसी पहचान में इस सीमा के विकास से दरकिनार कर दिया गया है वंश अनुरेखण7,14,15,16,17,18, 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. यह स्थाई रूप से लेबलिंग के होते है एसएमसी और उनकी संतान को उनके भाग्य और atherosclerosis प्रगति के दौरान लक्षणप्ररूपी विकास को ट्रैक करने के लिए एसएमसी-विशिष्ट प्रमोटरों द्वारा संचालित cre recombinase की अभिव्यक्ति का एक संयोजन का उपयोग करके (यानी, Myh117,15,17,18,19,20,21,22,23 , 24, Acta225,26 और, SM22α14,16) और रिपोर्टरों के सक्रियण (उदा., फ्लोरोसेंट प्रोटीन, β-galactosidase) [bentzon और majesky में समीक्षित २०१८27] । पहली अध्ययन में से एक में एसएमसी वंश पता लगाने के बाहर काम करना भ्रूणविज्ञान सेटिंग, speer एट अल.14 प्रदान की सबूत है कि एसएमसी उनके phenotype मिलाना और संवहन के दौरान chondrogenic कोशिकाओं में स्थानांतरित कर सकते है का उपयोग करके एक SM22α cre R26R lacz वंश अनुरेखण मॉडल । हालांकि इन अध्ययनों ने एसएमसी वंश अनुरेखण का बीड़ा उठाया है, वे आंशिक रूप से गोलमोल थे कि किसी भी गैर-एसएमसी व्यक्त SM22α रोग की स्थापना में रिपोर्टर द्वारा चिह्नित किया जाएगा । इस सीमा के विकास और tamoxifen के उपयोग से नजरअंदाज कर दिया गया है-inducible cre ERT/loxp सेल लेबलिंग के एक अस्थायी नियंत्रण की अनुमति. सेल लेबलिंग विशेष रूप से tamoxifen वितरण के दौरान होता है और सेल प्रकार-विशिष्ट प्रमोटर tamoxifen जोखिम के समय में cre ईआरटी अभिव्यक्ति ड्राइविंग व्यक्त करने के लिए प्रतिबंधित किया जाएगा, में cre सक्रिय करने के वैकल्पिक सेल प्रकार के ट्रेसिंग से परहेज रोग प्रगति की स्थापना. atherosclerosis में एसएमसी के वंश अनुरेखण के लिए, tamoxifen-inducible Myh11-cre/ERT2 फ्लोरोसेंट पत्रकारों के साथ जुड़े transgene (eyfp7,15,17,18 , 21, mtmg19,25, कंजेट्टी20,22,23 क्लोनी विस्तार अध्ययन के लिए) एक उल्लेखनीय दक्षता और एसएमसी लेबलिंग में विशिष्टता का प्रदर्शन किया है और हाल के अध्ययनों में atherosclerotic घावों में भाग्य नक्शा एसएमसी आबादी के लिए इस्तेमाल किया गया है । महत्वपूर्ण बात, इन अध्ययनों से पता चला है कि: 1) उन्नत atherosclerotic घावों के भीतर एसएमसी के ८०% किसी भी पारंपरिक एसएमसी मार्करों (ACTA2, MYH11) immunohistological विश्लेषण में इस्तेमाल व्यक्त नहीं करते हैं और इसलिए वंश अनुरेखण के बिना ने किया गया होता 17; 2) मैक्रोफेज मार्कर या मध्योतक स्टेम सेल मार्कर सहित वैकल्पिक सेल प्रकार के एसएमसी एक्सप्रेस मार्कर के सबसेट16,17,19; और 3) एसएमसी निवेश और ओलिगोक्लोनल विस्तार और एसएमसी क्लोन द्वारा atherosclerotic घाव आबाद phenotypically अलग आबादी20,23के लिए संक्रमण के लिए plasticity बनाए रखने के । संक्षेप में प्रस्तुत करने के लिए, यह अब स्पष्ट है कि चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं atherosclerotic घावों में एक उल्लेखनीय लक्षणप्ररूपी विविधता मौजूद है और उनके लक्षणप्ररूपी संक्रमण की प्रकृति पर निर्भर करता है घाव रोगजनन पर फायदेमंद या हानिकारक भूमिकाओं हो सकता है. इन खोजों के लिए एक उल्लेखनीय नए चिकित्सकीय एवेन्यू का प्रतिनिधित्व एसएमसी athero को लक्षित करने के लिए देर से चरण atherosclerosis में लक्षणप्ररूपी संक्रमण को बढ़ावा देने.

इस के साथ साथ, हम देर से मंच का विश्लेषण करने के लिए एक मानकीकृत प्रोटोकॉल का प्रस्ताव मूरीन atherosclerotic घावों के लिए व्यवस्थित तरीके सहित पशु विच्छेदन, embedding, sectioning, धुंधला, और बाहु-शीर्ष धमनी घावों के परिमाणन । के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए interleukin-1β निषेध पर एसएमसी भाग्य और phenotype, हम इस्तेमाल किया एसएमसी वंश अनुरेखण apoe-/ चूहों एक विरोधी IL1β एंटीबॉडी या isotype-मिलान igg नियंत्रण के साप्ताहिक इंजेक्शन प्राप्त करने से पहले 18 सप्ताह के लिए एक पश्चिमी आहार खिलाया ।

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Protocol

पशु प्रजनन, हैंडलिंग और प्रक्रियाओं वर्जीनिया विश्वविद्यालय और पिट्सबर्ग विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया ।

1. एसएमसी वंश अनुरेखण चूहों का उत्पादन

  1. नस्ल Myh11-cre/ERT2 नर28 (जैक्सन प्रयोगशाला; #019079) R26R-eyfp महिलाओं के साथ (जैक्सन प्रयोगशाला; #006148) Myh11-cre/ERT2+ R26R-eyfp+/+ नर प्राप्त करने के लिए ।
  2. नस्ल Myh11-cre/ERT2+ R26R-eyfp+/+ पुरुषों के साथ apoe-/- मादा चूहों (जैक्सन प्रयोगशाला; #002052) । संतति पार करो और जीनोटाइपिंग द्वारा चयन करें Myh11-cre/ERT2+ R26R-eyfp+/+ apoe-/ -पुरुष और R26R-eyfp+/+ apoe-/ -महिला चूहों अंतिम प्रजनकों के रूप में । क्लिप पूंछ और लिटलमेट्स पर genotyping प्रदर्शन । सभी पुरुष चूहों होना चाहिए Myh11-cre/ERT2+ R26R-eyfp+/+ apoe-/- और प्रयोगात्मक चूहों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है (चित्रा 1ए).
    नोट: genotyping प्रोटोकॉल जैक्सन प्रयोगशाला की वेबसाइट पर पाया जा सकता है । Myh11 cre/ERT2 transgene वाई गुणसूत्र पर स्थित है, महिलाओं के उपयोग precluding । अन्य वंश अनुरेखण प्रणालियों का इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन इस प्रणाली atherosclerosis में भाग्य नक्शा एसएमसी के लिए सबसे विश्वसनीय वंश अनुरेखण रणनीति तारीख करने के लिए है ।

2. चिकनी स्नायु सेल वंश-माउस आहार और उपचार अनुरेखण

  1. क्या पुरुष Myh11-cre/ERT2+ R26R-eyfp+/+ apoe-/ चूहों की एक श्रृंखला प्राप्त 1 मिलीग्राम tamoxifen इंजेक्शन छह से आठ सप्ताह की उम्र के लिए स्थायी रूप से लेबल करने के लिए Myh11+ yfp के साथ एसएमसी और उनके भाग्य को ट्रैक करने के लिए (चित्रा 1 क).
    1. ५५ डिग्री सेल्सियस पर मूंगफली का तेल गर्म करें ।
    2. tamoxifen के पूर्ण विघटन तक 10 मिलीग्राम/एमएल और ५५ डिग्री सेल्सियस पर सेते पर एक समाधान तैयार करने के लिए पूर्व-गर्म मूंगफली के तेल में टैमोक्सीफेन जोड़ें ।
    3. दो सप्ताह से अधिक दस इंजेक्शन की एक श्रृंखला के लिए 10 मिलीग्राम/एमएल tamoxifen समाधान के ०.१ मिलीलीटर के साथ एक intraperitoneal इंजेक्शन प्रदर्शन.
      नोट: tamoxifen एक biohazard है और देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए.
  2. tamoxifen के साथ अंतिम इंजेक्शन के बाद पांच से सात दिनों, उच्च वसा वाले आहार के साथ चाउ आहार की जगह (जैसे, पश्चिमी आहार; वसा से ४२% किलो कैलोरी; ०.२% कुल कोलेस्ट्रॉल) 18 सप्ताह की अवधि के लिए उन्नत atherosclerotic घावों के विकास के लिए अनुमति देने के लिए, जो लगातार एक साथ कई संवहनी बेड में विकसित करता है जिसमें एओर्टिक आर्क, एओर्टिक रूट, ब्रैचिओसिफैलिक धमनी और उदर एओर्टा शामिल हैं ।
  3. उच्च वसा वाले आहार के 18 सप्ताह में, वांछित अवधि (चित्रा 1बी) के लिए चिकित्सीय हस्तक्षेप शुरू करते हैं ।
    नोट: एक उदाहरण के रूप में, हम एक विरोधी के साथ साप्ताहिक intraperitoneal इंजेक्शन प्रदर्शन-IL1β एंटीबॉडी या एक isotype-मिलान के बीच igg नियंत्रण 18 और 26 उच्च वसा आहार के सप्ताह.
  4. प्लाज्मा कोलेस्ट्रॉल और ट्राइग्लिसराइड के लिए सटीक रीडिंग करने के लिए ऊतक कटाई से पहले 8 से 16 एच के लिए तेजी से चूहों को भोजन निकालें ।

3. ब्रेचिओसिफैलिक धमनी (बीसीए) की कटाई

  1. पशु इच्छामृत्यु पशु देखभाल और उपयोग समिति (acuc) आवश्यकताओं और विनियमों का पालन करना चाहिए । के लिए सह2 asphyxiation द्वारा प्रयोगात्मक चूहों euthanize 5 मिनट और पैर की अंगुली चुटकी द्वारा मौत की पुष्टि ।
  2. माउस वजन और रक्त इकट्ठा ।
    1. माउस को तौलना
    2. ७०% इथेनॉल के साथ माउस के अधर पक्ष स्प्रे
    3. छाती गुहा के बाईं ओर से वेंट्रिकले में 1 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ा एक 25g सुई डालने से कार्डियक पंचर निष्पादित करें । ०.१ से 1 मिलीलीटर रक्त एकत्र किया जा सकता है ।
    4. सिरिंज निस्तब्धता द्वारा एक edta वैक्यूम ट्यूब के लिए रक्त हस्तांतरण और 10-15 मिनट के लिए एक घुमाव या रोटेटर पर ट्यूब जगह है ।
    5. एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब और 10 मिनट २५० एक्स जी पर 4 डिग्री सेल्सियस के लिए सेंट्रेसेज के लिए रक्त स्थानांतरण । एक पिपेट और पर्याप्त सुझावों के साथ शीर्ष प्लाज्मा चरण को ध्यान से निकालें, और एक नई ट्यूब पर स्थानांतरित करें । कोलेस्ट्रॉल और ट्राइग्लिसराइड्स को मापने से पहले-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें ।
      नोट: पूरे रक्त रक्त कोशिका गिनती और साइटोकिन्स या प्रतिरक्षा सेल रूपरेखा सहित अंय रक्त घटकों सहित अतिरिक्त अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  3. कैंची का उपयोग करते हुए मध्य पेट पर त्वचा में सन्निककता 2 सेमी का एक चीरा बनाओ और उदर गुहा को बेनकाब करने के लिए त्वचा खींचो । क्षतिग्रस्त ऊतकों के बिना उरोस्थि तक पेरिटोनियम को काटें । छाती के माध्यम से मध्य-कक्षीय लाइन पर दो कटौती करें, दिल और फेफड़ों को नुकसान पहुंचाने के लिए सावधान नहीं किया जा रहा है ।
  4. चिमटी के साथ उरोस्थि लिफ्ट और आंशिक रूप से दिल बेनकाब करने के लिए डायाफ्राम काट. अगर दिल आसानी से सुलभ नहीं है, दूर काटने का निशानवाला पर्याप्त सही atrium तक पहुंचने के लिए ।
  5. एक गुरुत्वाकर्षण छिड़काव प्रणाली (चित्रा 2ए) के साथ माउस perfuse । गुरुत्वाकर्षण छिड़काव प्रणाली स्थापित करें इस तरह कि छिड़काव द्रव का दबाव औसत मरीन रक्तचाप (चित्रा 2बी) के बराबर है । इस प्रणाली के छिड़काव में निरंतरता के लिए अनुमति देता है और दोनों पोत आकारिकी बनाए रखता है और लाल रक्त कोशिकाओं flushes ।
    नोट: संदर्भ के रूप में, C57Bl6 चूहों के बीच एक शारीरिक रक्तचाप है १२० mmhg (औसत सिस्टोलिक रक्तचाप) और ७० mmhg (औसत डायस्टोलिक रक्तचाप)29,30. औसत सिस्टोलिक और डायस्टोलिक रक्तचाप माउस आनुवंशिक पृष्ठभूमि के साथ भिन्न हो सकते हैं ।
    1. गुरुत्वाकर्षण छिड़काव प्रणाली के लिए एक 23 या 25g तितली सुई से कनेक्ट और ट्यूब से हवा को निष्कासित करने के लिए सुई के माध्यम से फॉस्फेट-buffered खारा (pbs) चलाते हैं । बाएं वेंट्रिल में सुई डालें और जगह में सुई को सुरक्षित करें । आईरिस कैंची का प्रयोग, सही atrium या आरोही aorta में एक छोटा सा चीरा (< 2 मिमी) बनाते हैं ।
    2. 5 मिलीलीटर पीबीएस के साथ perfuse, तो 4% paraformaldehyde (pbs) समाधान के 10 मिलीलीटर, तो pbs के 5 मिलीलीटर । परिवेश के तापमान पर पीबीएस और 4% पीएफए समाधान का उपयोग करें ।
    3. ब्याज के ऊतकों लीजिए (जैसे, जिगर, फेफड़े, प्लीहा) और उन्हें 4% पीएफए समाधान में रखें ।
  6. बीसीए का पर्दाफाश
    1. त्वचा और लार ग्रंथियों को हटाकर गर्दन के क्षेत्र को साफ करें ।
    2. कैंची का उपयोग कर उरोस्थि के माध्यम से उरोस्थि के मध्यरेखा के नीचे एक कट प्रदर्शन. ध्यान रखें कि कैंची उरोस्थि के पीछे के करीब रहने के लिए उरोस्थि के नीचे स्थित vasculature को नुकसान पहुँचाए से बचने के लिए. पूरी तरह से छाती गुहा खोलने के लिए संदंश के साथ ribcage के दोनों किनारों खींचो. ग्रीवा आंशिक रूप से दृश्यमान होनी चाहिए ।
    3. मांसपेशियों और संयोजी ऊतक खींच कर और ठीक चिमटी के साथ वसा को हटाने जब तक सही ग्रीवा, बाहु-शीर्ष धमनी subclएवियन विभाजन और महाधमनी चाप साफ कर रहे है और आसपास के संयोजी ऊतक और वसा के पृथक से साफ (चित्रा 2ग).
  7. बीसीए निकालें
    1. संदंश का उपयोग करना, अपने विभाजन के नीचे सही ग्रीवा हड़पने और संदंश ऊपर एक प्रारंभिक कटौती (चित्रा 2घ) ।
    2. अभी भी ग्रीवा धारण, subclएवियन धमनी के माध्यम से एक दूसरी कटौती करते हैं । अंतिम दो कटौती के माध्यम से कर रहे हैं महाधमनी चाप, बाहु-शीर्ष धमनी के दोनों ओर (चित्रा 2D).
    3. ब्याज की अन्य संवहनी ऊतकों को इकट्ठा (जैसे, उदर aorta, हृदय की सुपीरियर हिस्सा जिसमें aorta जड़ युक्त).
    4. कमरे के तापमान पर रात भर 4% पीएफए समाधान में बीसीए और अन्य ऊतकों को रखें ।
      नोट: निर्धारण समय पूरे अध्ययन में सुसंगत रखा जाना चाहिए.

4. ऊतक प्रसंस्करण और सेक्शनिंग

  1. 4% पीएफए से ऊतक निकालें और एक लेबल ऊतक कैसेट में जगह (चित्रा 3ए) । ऊतक अपने अभिविन्यास बनाए रखने और प्रसंस्करण कदम (चित्रा 3बी) के माध्यम से कैसेट में रहता है यह सुनिश्चित करने के लिए कैसेट में फोम पैड का प्रयोग करें । कैसेट बंद करो और ऊतक प्रसंस्करण (24 72h) तक ७०% इथेनॉल में विसर्जित कर दिया ।
    1. प्रक्रिया बीसीए और अन्य ऊतक हिस्टोलॉजिकल और इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला के लिए एकत्र निम्नानुसार (वैक्यूम प्रवेश के साथ एक प्रोसेसर का उपयोग कर दिनचर्या रातोंरात प्रक्रिया का उदाहरण): 10% तटस्थ परिवेश के तापमान (2x), ७५% पर 30 मिनट के लिए buffered formalin 30 डिग्री सेल्सियस (1x) पर ६० मिनट के लिए इथेनॉल, 30 डिग्री सेल्सियस पर ६० मिनट के लिए ९०% इथेनॉल (1x), ९५ ६० मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस (1x), १००% इथेनॉल पर ६० मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस (3x), पर ६० मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस (3x), और में ८० मिनट के लिए पैराफिन वैक्स ६२ डिग्री सेल्सियस (3x) ।
  2. बीसीए अनुलंब, ब्लॉक चेहरे (चित्रा 3सी) के लिए महाधमनी चाप निकटतम के साथ एंबेड ।
  3. एक रोटरी माइक्रोटोम (10 μm मोटाई) पर पैराफिन ब्लॉक के माध्यम से कट एंबेडेड ऊतक तक पहुंचने तक ।
  4. एक बार ऊतक दिखाई देने के बाद, स्थिति निर्धारित करने के लिए एक खुर्दबीन के नीचे एक अनुभाग की जांच करें । यदि महाधमनी चाप अभी भी दिखाई दे रहा है, एक समय में १० १० μm वर्गों को हटा दें, प्रत्येक अंतराल पर एक अनुभाग की जांच ।
  5. जब महाधमनी चाप के माध्यम से खोदी गई है और बाहु-शीर्ष धमनी दिखाई दे रहा है, खंड के अभिविन्यास समायोजित करने के लिए माइक्रोटोम ब्लेड के लिए पूरी तरह से सीधा ऊतक की स्थिति.
  6. 10 μm की एक धारा मोटाई में बीसीए कट । उस बिंदु पर, सभी वर्गों स्लाइड प्रति तीन वर्गों के साथ प्रश्नपत्र एकत्र कर रहे हैं । subclएवियन विभाजन तक पहुंचने तक लीजिए (चित्रा 3डी).
    नोट: यह बाद जेड स्टैक संनाभि छवि अधिग्रहण और एकल सेल गिनती के लिए 10 μm की एक खंड मोटाई में बीसीए कटौती करने के लिए महत्वपूर्ण है. इस मोटाई एक ही नाभिक और कोशिकाद्रव्यी या झिल्ली धुंधला के बीच एसोसिएशन के कठोर और गैर coसंस्थापकों मूल्यांकन हालांकि पार अनुभाग की गहराई की अनुमति होगी ।

5. इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला

नोट: atherosclerotic घावों का एक पूरा लक्षण वर्णन रूपात्मक मापदंडों और पट्टिका स्थिरता या अस्थिरता और सेलुलर संरचना है कि वर्तमान प्रोटोकॉल का ध्यान केंद्रित नहीं होगा के सूचकांक का आकलन भी शामिल है । घाव morphology, कोलेजन सामग्री, और intraplaque नकसीर movat द्वारा विश्लेषण किया जा सकता7,17, picrosirius लाल 7,31, Ter119 धुंधला 7,18, क्रमशः. यहां, हम घावों की सेलुलर संरचना का विश्लेषण करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करेंगे ।

  1. एक रासायनिक हुड के तहत कमरे के तापमान पर निम्नलिखित समाधानों में स्लाइड सेते: 5 मिनट के लिए xylene (2x), 5 मिनट के लिए १००% इथेनॉल (2x), 5 मिनट के लिए ९५% इथेनॉल (2x), 5 मिनट के लिए ७०% इथेनॉल (2x), और 5 मिनट के लिए विआयनीकृत H2O (2ओ)
  2. निर्माता के निर्देश के अनुसार प्रतिजन पुनर्प्राप्ति समाधान में स्लाइड्स सेते हैं ।
    1. साइट्रिक एसिड आधारित प्रतिजन unmasking समाधान के साथ ( सामग्री की तालिकादेखें), समाधान की 3 मिलीलीटर ३२० मिलीलीटर में डीः2ओ के पतला, एक धुंधला जलाशय में स्लाइड रखें और तैयार प्रतिजन पुनर्प्राप्ति समाधान के साथ शीर्ष पर भरें ।
    2. भी हीटिंग सुनिश्चित करने के लिए रिक्त स्लाइड के साथ स्लाइड रैक में किसी भी खाली स्लॉट्स भरें । antigen पुनर्प्राप्ति समाधान वाष्पीकरण के बिना फोड़ा करने के लिए अनुमति देने के लिए एक ढक्कन के साथ कंटेनर को कवर ।
    3. लगभग 675-700 वाट में 20 मिनट के लिए एक माइक्रोवेव में स्लाइड गर्मी । नियमित रूप से स्लाइड की जांच करें और की जगह2डीआई के साथ वाष्पित तरल इस तरह है कि वर्गों को हर समय unmasking समाधान में जलमग्न रहते हैं ।
    4. कमरे के तापमान पर 1 ज के लिए स्लाइड को समाधान में ठंडा करने की अनुमति दें ।
  3. पीबीएस के 1 एल में मछली त्वचा जिलेटिन (fsg) के 6 जी भंग । pbs/fsg वाशिंग बफर के रूप में प्रयोग किया जाता है । pbs/fsg में 10% सामान्य सीरम का ब्लॉकिंग सॉल्यूशन तैयार करें ।
    नोट: मछली त्वचा जिलेटिन अवरुद्ध बफर की तैयारी में प्रयोग किया जाता है । fsg सीरम प्रोटीन है कि पार कर सकते है स्तनधारी एंटीबॉडी के साथ प्रतिक्रिया, पृष्ठभूमि शोर को कम नहीं करता है । हालांकि, अन्य ब्लॉकिंग विकल्प को बायोटिन डिटेक्शन सिस्टम के साथ पसंद किया जाना चाहिए क्योंकि एफएसजी में अंतर्जात बायोटिन होता है । उपयोग किया जाने वाला सामान्य सीरम का प्रकार द्वितीयक एंटीबॉडी पर आधारित होता है । जब गधा माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है, सामान्य घोड़े सीरम अवरुद्ध और एंटीबॉडी dilutions के लिए चुना जाना चाहिए.
  4. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए पीबीएस में स्लाइड सेते । एक हाइड्रोफोबिक कलम के साथ सर्किल ऊतक वर्गों । कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए अवरुद्ध बफर pbs/fsg/सामान्य सीरम के साथ वर्गों को कवर । इस चरण के दौरान पीबीएस/fsg/सामान्य सीरम में प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें जबकि ऊतकों को अवरुद्ध कर रहे हैं ।
  5. एक नमी चैंबर में 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर pbs/fsg/सामान्य सीरम में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ सेते । एक स्लाइड प्रति अनुभाग प्राथमिक एंटीबॉडी विशेष के लिए नियंत्रण करने के लिए प्राइमरी एंटीबॉडीज के रूप में एक ही एकाग्रता पर igg नियंत्रण एंटीबॉडी के मिश्रण के साथ incubated किया जाना चाहिए ।
  6. स्लाइड धोने के रूप में इस प्रकार के कमरे के तापमान पर: pbs/fsg 5 मिनट (3x) के लिए, तो 5 मिनट (1x) के लिए pbs ।
  7. फ्लोरोफोर के साथ सेते-संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी ( सामग्री तालिकादेखें) और diamidino-2-फेनीलिंडोल (dapi) न्यूक्लियस के लिए पीबीएस/fsg/सामान्य सीरम में पतला करने के लिए कमरे के तापमान पर 1 ज । स्लाइड को प्रकाश से सुरक्षित करें ।
  8. चरण ५.६ में बताए अनुसार स्लाइड्स को धोएं ।
  9. माउंट स्लाइड प्रतिदीप्ति के लिए उपयुक्त बढ़ते मीडिया का उपयोग ( सामग्री की तालिकादेखें) ।

6. संनाभि सूक्ष्मदर्शी

नोट: एक संनाभि माइक्रोस्कोप और जेड-स्टैक अधिग्रहण का उपयोग एकल-सेल गिनती के लिए महत्वपूर्ण है ।

  1. पूरे अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले प्राप्ति पैरामीटर सेट करें: छवि रिज़ॉल्यूशन (1024x1024 या 2048x2048 पिक्सेल); ऑप्टिकल पथ और चैनलों की संख्या, जो चयनित माध्यमिक एंटीबॉडी के संयोजन का एक समारोह कर रहे हैं; स्कैनिंग गति (अनुशंसित स्कैनिंग गति: 7-8); और विभेदक हस्तक्षेप कन्ट्रास्ट (DIC) चैनल ।
  2. प्राथमिक एंटीबॉडी और igg नियंत्रण के साथ दाग वर्गों का उपयोग करना, डिटेक्टर संवेदनशीलता, लेजर शक्ति, और प्रत्येक व्यक्ति चैनल के लिए ऑफसेट सेट. igg नियंत्रण पृष्ठभूमि संकेत को कम करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।
  3. z-स्टैक प्राप्ति के लिए ऊपरी और निचले स्थान सेट करें. पूर्व निर्धारित मोटाई और ढेर की संख्या प्राप्त करने के लिए । इन मापदंडों को पूरे अध्ययन में सुसंगत रहना चाहिए ।
    नोट: हम 1 μm मोटाई के 8 से 10 स्टैक इमेजिंग की सलाह देते हैं । अध्ययन में imaged ढेर की संख्या में संगत रहो ।
  4. छवि ऊतक प्राथमिक एंटीबॉडी और डीआईसी सहित सभी चैनलों के लिए igg नियंत्रण के साथ दाग वर्गों ।
  5. एकल कक्ष गणना के दौरान छवि कैलिब्रेशन के लिए स्केल पट्टी के साथ ंयूनतम एक छवि को लेबल करना ।

7. सिंगल सेल काउंटिंग

  1. इंस्टॉल करें और खोलें imagej. यदि आवश्यक हो तो, डाउनलोड Plugins के अनुभाग में डाउनलोड > इनपुट/आउटपुट छवि को खोलने के लिए imagej वेबसाइट के प्रारूप के आधार पर उत्पन्न छवियों के संनाभि सूक्ष्मदर्शी द्वारा उत्पन्न.
  2. इमेज फाइल को imagej में खोलें ।
  3. ६.६में उत्पन्न छवि का उपयोग कर एक संदर्भ स्केल पट्टी के साथ छवि जांचना ।
  4. ब्याज के क्षेत्र में जो एकल सेल गिनती डीआईसी चैनल (चित्रा 4) का उपयोग कर प्रदर्शन किया जाएगा चित्रित ।
    नोट: एक क्षेत्र एक समय में चित्रित किया जा सकता है । प्रयोगात्मक प्रश्नों के आधार पर, एकल सेल गिनती पूरे घाव क्षेत्र में किया जा सकता है (देखें 7.3.1) और/या घाव के एक उपस्थान में । उदाहरण के लिए, रेशेदार कैप क्षेत्र की जांच ( 7.3.2देखें) विशेष रूप से प्रासंगिक है क्योंकि इसकी सेलुलर संरचना टूटना के लिए घाव प्रवृत्ति का एक महत्वपूर्ण सूचकांक है ।
    1. लुमेन बॉर्डर (चित्रा 4ए; सफेद तीर) और आंतरिक इलास्टिक लेमिना (चित्रा 4ए; पीला तीर) का अनुसरण करके लीशन क्षेत्र को चित्रित करना डीआईसी छवि पर दिखाई देता है ।
    2. रेशेदार टोपी क्षेत्र के विश्लेषण के लिए, लुमेन से 30 μm के दूर सीमा का निर्धारण और सीमा का पता लगाने ( चित्रा 4बी-डी) ।
      नोट: रेशेदार कैप क्षेत्र प्रतिष्ठित क्षेत्र के रूप में परिभाषित किया गया है ACTA2 + कोशिकाओं और कोलेजन लुमेन (चित्रा 4बी) में समृद्ध । ACTA2 + सेल में संवर्धन और कोलेजन घाव स्थिरता में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । पिछले अध्ययनों से निर्धारित किया है कि ACTA2 + सेल रिच रेशेदार टोपी क्षेत्र औसत से 30 μm की मोटाई एसएमसी में लुमेन-वंश अनुरेखण apoe-/ चूहों 18 से 26 सप्ताह (चित्रा 4सी) के लिए एक उच्च वसा वाले आहार खिलाया । इस प्रकार, आनुवंशिक हेरफेर या तंतुमय टोपी क्षेत्र सेलुलर संरचना पर औषधीय उपचार के प्रभाव के सावधानीपूर्वक लक्षण वर्णन प्रासंगिक है ।
  5. चैनल उपकरण पैनल खोलें (छवि > रंग > चैनल उपकरण) और छद्म रंग अलग धुंधला चैनल (चित्रा 5A; बॉक्स 1) ।
  6. रंग चैनल (छवि > रंग > मर्जरंग) (चित्र 5A; बॉक्स 2) मिलाएं । सभी चैनल एक ही छवि (चित्रा 5बी) पर दिखाई जानी चाहिए । चैनल टूल पैनल (चित्र 5A; बॉक्स 1) का उपयोग करके व्यक्तिगत रंग चैनल चालू और बंद करें.
  7. मतगणना उपकरण सेट करें ।
    1. उपकरण पट्टी में गिनती आइकन पर दायां क्लिक करें (चित्रा 5सी; बॉक्स 1) और बहु सूत्री उपकरणका चयन करें ।
    2. प्वाइंट टूल पैनल खोलने के लिए एक ही आइकन पर डबल क्लिक करें (चित्रा 5सी; बॉक्स 2) ।
    3. कक्षों की गणना करने के लिए उपयोग किए गए आइटंस के प्रकार और आकार का चयन करें ।
    4. सभी दिखाएंचेक करें ।
  8. चैनल टूल पैनल में केवल dapi चैनल चालू करें और काउंटर चैनल 0 (चित्र 5C; बॉक्स 3) चुनें. व्यक्तिगत नाभिका पर क्लिक करें जिसे टैग किया जाएगा (जैसे, चित्रा 5सी-डीमें पीले डॉट्स) । z-स्टैक स्क्रॉल करने के लिए ब्याज के क्षेत्र में सभी नाभिका दाग गिनती । घटनाओं की संख्या प्वाइंट टूल पैनल में काउंटर चैनल के नीचे इंगित किया गया है (चित्रा 5सी; बॉक्स 4) ।
  9. एक और धुंधला चैनल (जैसे, eyfp धुंधला) को चालू करें । काउंटर चैनल 1 का चयन करें । उन कक्षों पर क्लिक करें जिनमें dapi और धुंधला के बीच में एक कोलोलाइज़ेशन है. कोशिकाद्रव्यी धुंधला के लिए, के लिए कक्षों का चयन करें धुंधला के साथ नाभिक की पूरी गहराई (कई जेड ढेर की जांच) पर नाभिक चारों ओर से घेरे ।
  10. धुंधला संयोजन को संशोधित करने और नए काउंटर चैनलों के चयन के लिए ब्याज की सेल आबादी गिनती द्वारा दोहराएं । प्रत्येक डॉट रंग किसी भिंन कक्ष जनसंख्या (चित्र 5D) का प्रतिनिधित्व करता है । परिणाम dapi की कुल संख्या या क्षेत्र क्षेत्र के लिए कक्षों की संख्या के लिए कक्षों की संख्या के रूप में व्यक्त किया जा सकता है ।

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Representative Results

Myh11-cre/ERT2 R26R-eyfp apoe-/ चूहों एक उच्च वसा आहार खिलाया जा रहा से पहले उम्र के छह और आठ सप्ताह के बीच tamoxifen के साथ इंजेक्शन किया गया. उच्च वसा आहार खिलाने के 18 सप्ताह में, आठ चूहों के दो समूहों या तो एक माउस मोनोक्लोनल एंटी-आईएल-1β एंटीबॉडी या एक isotype-मिलान igg नियंत्रण पर 10 मिलीग्राम/किग्रा के लिए 8 सप्ताह के साथ साप्ताहिक इलाज किया गया (चित्रा 1)7. चूहों बलिदान और एक 4% pfa-pfa समाधान के साथ perfused थे । ब्रैचिओसिफैलिक धमनियों को विच्छेद, संसाधित, और ऊपर वर्णित के रूप में खोदी गई (चित्रा 2 और चित्रा 3) ।

वंश अनुरेखण रिपोर्टर (yfp) और लक्षणप्ररूपी मार्करों (ACTA2, LGALS3, RUNX2) को लक्षित एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला के बाद, बीसीए क्रॉस सेक्शन की 8-10 μm की मोटाई एक संनाभि माइक्रोस्कोप का उपयोग कर imaged था. प्रत्येक व्यक्ति धुंधला की छवियां, dapi (परमाणु धुंधला), और डीआईसी का अधिग्रहण किया गया । एकल कोशिका गिनती (घाव, रेशेदार टोपी) के लिए ब्याज के क्षेत्रों के अष्टक डीआईसी छवियों (चित्रा 4) का उपयोग किया गया था । एकल सेल अलग एसएमसी की बहुतायत निर्धारित करने के लिए गिनती प्राप्त आबादी imagej (चित्रा 5) का उपयोग किया गया था ।

हम दो प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला और एकल उन्नत atherosclerotic घावों में सेलुलर संरचना पर आईएल-1β निषेध के प्रभाव का आकलन गिनती प्रस्तुत करते हैं । सबसे पहले, धुंधला एसएमसी वंश अनुरेखण रिपोर्टर yfp के लिए किया गया था, एसएमसी मार्कर ACTA2, और मैक्रोफेज मार्कर LGALS3 के दो अलग स्थानों पर पार वर्गों में बीसीए (४८० μm और महाधमनी चाप से ७८० μm) (चित्रा 6) । इन पार अनुभाग के रेशेदार कैप क्षेत्र में एकल कोशिका गिनती विश्लेषण प्रदर्शन किया गया, और उल्लेखनीय मतभेद एंटी-आईएल-1β एंटीबॉडी और चूहों के साथ इलाज के साथ इलाज चूहों के बीच तंतुमय टोपी क्षेत्र के सेलुलर संरचना में पाए गए isotype-मिलान igg नियंत्रण (चित्रा 6ए) । आईएल-1β का निषेध yfp + एसएमसी में कमी और LGALS3 + कोशिकाओं में वृद्धि (चित्रा 6बी) के साथ जुड़ा हुआ था । एसएमसी आबादी के phenotypes के बारे में, yfp + ACTA2 + एसएमसी की संख्या में कमी देखी गई, जबकि एसएमसी व्युत्पन्न मैक्रोफेज (yfp + LGALS3 +) की सापेक्ष संख्या काफी दोनों बीसीए स्थानों (चित्रा 6सी) में वृद्धि हुई थी ।

अंत में, हम chondrogenic कोशिकाओं में एसएमसी लक्षणप्ररूपी संक्रमण पर आईएल-1β निषेध के प्रभाव की जांच की । इस लक्षणप्ररूपी संक्रमण संवहनी calcification के एक महत्वपूर्ण चालक है, देर से मंच atherosclerosis की प्रमुख विशेषता14,३२,३३. बीसीए पार वर्गों एसएमसी वंश अनुरेखण रिपोर्टर yfp, osteochondrogenic मार्कर RUNX2, और मैक्रोफेज मार्कर LGALS3 (चित्रा 7ए) के लिए दाग थे । बहुतायत और RUNX2 + chondrogenic कोशिकाओं की उत्पत्ति हमारे दो प्रायोगिक समूहों में घाव क्षेत्र के भीतर विशेषता थी । हमने पाया है कि आईएल-1β के निषेध ने घाव के भीतर RUNX2 + कोशिकाओं की कुल संख्या को प्रभावित नहीं किया, न ही एसएमसी-व्युत्पन्न (yfp + RUNX2 +) और मैक्रोफेज-व्युत्पन्न (yfp-LGALS3 + RUNX2 +) chondrogenic कोशिकाओं (चित्रा 7बी) के अनुपात ।

Figure 1
चित्रा 1 : चिकनी मांसपेशी कोशिका वंश अनुरेखण चूहों में हस्तक्षेप अध्ययन. (क) Myh11का योजनाबद्ध निरूपण-cre/ERT2 R26R-eyfp apoe-/ टैमोक्सीफेन-इंदुसिबल एसएमसी विशिष्ट वंश अनुरेखण माउस मॉडल । tamoxifen के साथ उपचार R26R-yfp लोकस के पुनर्योजन और एक बंद कोडोन के छांटना और एसएमसी द्वारा yfp की स्थायी अभिव्यक्ति लाती. (ख) हस्तक्षेप अध्ययन के योजनाबद्ध जिसमें Myh11-cre/ERT2 R26R-eyfp apoe-/ चूहों 18 सप्ताह के लिए एक पश्चिमी आहार खिलाया आईएल-1β एंटीबॉडी या एक isotype-मिलान igg नियंत्रण एंटीबॉडी के साथ साप्ताहिक इंजेक्शन थे 10 मिलीग्राम की एकाग्रता में/ 8 सप्ताह के लिए किलो । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : brachiocephalic धमनी विच्छेदन । (क) एक गुरुत्वाकर्षण संचालित छिड़काव प्रणाली के योजनाबद्ध । प्रणाली एक सटीक चूहों में औसत सिस्टोलिक रक्तचाप के करीब दबाव में छिड़काव की अनुमति ऊंचाई पर स्थापित किया गया है । दबाव थोड़ा मात्रा ऊंचाई के साथ बदलता है के रूप में तरल ऊंचाई एच1 और एच2के बीच छिड़काव के दौरान प्रयोग किया जाता है । (ख) स्थैतिक तरल पदार्थ और ऊंचाई के दृढ़ संकल्प के दबाव की गणना के लिए समीकरण C57Bl6 माउस औसत सिस्टोलिक रक्तचाप के बराबर छिड़काव के दबाव तक पहुंचने के लिए । (ग) समीपस् थ महाधमनी और C57Bl6 माउस में शाखाओं में बंटी धमनियों की तस्वीरें एक चाउ आहार खिलाया (बाएं चित्र) और apoe-/- माउस 26 सप्ताह (सही तस्वीर) के लिए एक उच्च वसा आहार खिलाया । तारांकन atherosclerotic घावों की उपस्थिति को इंगित करता है । (घ) समीपस्थल एओर्टा और शाखाओं में बंटी धमनियों का योजनाबद्ध. लाल तीर सही ग्रीवा और बाहु-शीर्ष धमनी अलगाव के अलगाव के लिए कटौती का प्रतिनिधित्व करते है और संख्या में कटौती के आदेश से संकेत मिलता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : ऊतक प्रसंस्करण, embedding, और सेक्शनिंग । (क) बीसीए ऊतक के साथ एक embedding कैसेट की तस्वीर । बीसीए में फोम पैड पर तैनात है । (ख) फोम पैड पर तैनात बीसीए की जूम-इन । इस BCA के साथ उंमुख है महाधमनी मेहराब के लेबल भाग के पास कैसेट और ग्रीवा सीधे सीधा । स्केल बार: 1 सेमी. (ग) ब्रैचिओसिफैलिक धमनी की एम्बेडिंग के बाद पैराफिन ब्लॉक का योजनाबद्ध । (घ) 10 μm-मोटी धारावाहिक वर्गों के साथ धारावाहिक स्लाइड के योजनाबद्ध से दूरी के संकेत के साथ महाधमनी चाप । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4 : atherosclerotic घाव और रेशेदार टोपी क्षेत्र के अष्टक । (क) ब्रैचिओसिफैलिक धमनी में डीआईसी छवि atherosclerotic घाव के प्रतिनिधि माइक्रोग्राफ से पार वर्गों Myh11-cre/ERT2 R26R-eyfp apoe-/ luminal और आंतरिक लोचदार लामिना सीमाओं सफेद और पीले तीर द्वारा स्थानीयकृत रहे हैं, क्रमशः (बाएँ पैनल). घाव क्षेत्र एक डैश्ड लाइन (दाएं पैनल) स्केल बार द्वारा चित्रित किया गया है: १०० μm (B) डीआईसी और ACTA2 धुंधला के प्रतिनिधि माइक्रोग्राफ । डबल सिर तीर लुमेन रेशेदार टोपी क्षेत्र को परिभाषित करने के क्षेत्र के भीतर ACTA2 धुंधला की मोटाई दिखा । (ग) Myh11-cre/ERT2 R26R-eyfp apoe-/- 18, 21 और 26 सप्ताह के लिए एक उच्च वसा आहार खिलाया में subluminal ACTA2+ मोटाई का quantification । चूहों के इस तनाव का उपयोग करते हुए, रेशेदार टोपी अग्रिम atherosclerotic घावों में 25-30 μm की एक औसत मोटाई है । परिणाम के रूप में व्यक्त कर रहे है मतलब ± SEM. (घ) एकल कोशिका गिनती के लिए एक निश्चित 30 μm मोटी रेशेदार टोपी क्षेत्र के अष्टक । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 : एकल सेल imagej का उपयोग गिनती । संनाभि माइक्रोस्कोपी द्वारा अधिग्रहीत छवियों पर imagej साथ गिनती एकल सेल के प्रमुख चरणों illustrating स्क्रीन कब्जा । (A) प्रत्येक व्यक्ति धुंधला चैनल और व्यक्तिगत z-स्टैक स्क्रॉल करके दिखाई देते हैं c: और z: पट्टी छवि के निचले भाग पर । धुंधला चैनलों चैनल पैनल (1) धुंधला चैनल (yfp, LGALS3, ACTA2, परमाणु धुंधला और डीआइसी के लिए dapi) का उपयोग कर रहे हैं मर्ज चैनल पैनल (2) का उपयोग कर विलय कर रहे हैं । (B) yfp, LGALS3, ACTA2, dapi, और DIC के लिए चैनल मर्ज करने के परिणाम. (ग) नाभिक गिनती आइकन (1) और बिंदु उपकरण पैनल (2) का उपयोग कर dapi धुंधला के आधार पर गणना । एक अलग काउंटर चैनल प्रत्येक कोशिका जनसंख्या (3) के लिए प्रयोग किया जाता है । गिना घटनाओं की संख्या काउंटर चैनल (4) के नीचे संकेत दिया है । सफेद आयत: क्षेत्र के अधिकार पर बढ़े । (घ) रेशेदार टोपी क्षेत्र (डैपी (पीला डॉट्स), yfp+ कोशिकाओं (magenta डॉट्स), yfp-LGALS3+ कोशिकाओं (सियान डॉट्स) सहित कई सेल आबादी के लिए (धराशायी लाइन) के भीतर एकल सेल गिनती के प्रतिनिधि छवि, yfp+LGALS3+ कोशिकाओं (नारंगी डॉट्स), yfp+ACTA2+ कोशिकाओं (हरे डॉट्स), और yfp-ACTA2+ कोशिकाओं (डार्क ब्लू डॉट्स). सफेद आयत: क्षेत्र के अधिकार पर बढ़े । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6 : दो अलग एसएमसी वंश के बीसीए स्थानों पर रेशेदार कैप क्षेत्र के सेलुलर संरचना पर आईएल-1β निषेध के प्रभाव का लक्षण वर्णन apoe-/ (A) ४८० μm और ७८० μm पर बीसीए पार वर्गों आईएल-1β एंटीबॉडी या आईडीजी नियंत्रण के साथ इलाज चूहों से महाधमनी चाप से yfp, LGALS3 के लिए दाग थे, और dapi (परमाणु धुंधला) और खंड डीआईसी द्वारा imaged था । इम्यूनोफ्लोरोसेंट चैनल (नीचे सही पैनलों) विलय कर दिया गया । डैश्ड रेखाएं रेशेदार कैप क्षेत्रों को चित्रित करती हैं । स्केल पट्टियां: १०० μm. (ख) एकल कोशिका गिनती पता चलता है कि आईएल-1β का निषेध yfp+ कोशिकाओं में एक महत्वपूर्ण कमी और रेशेदार टोपी क्षेत्र के भीतर LGALS3+ कोशिकाओं में वृद्धि के साथ जुड़ा हुआ है । C) yfp+ सेल जनसंख्या के भीतर, yfp + ACTA2 +में कमी और yfp+LGALS3+ आबादी में वृद्धि देखी जाती है. परिणाम के रूप में व्यक्त कर रहे है मतलब ± SEM । सांख्यिकीय विश्लेषण: अयुग्मित एकाधिक t-test. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7 : उन्नत atherosclerotic घावों के साथ RUNX2 + chondrogenic कोशिकाओं की संख्या पर आईएल-1β निषेध का प्रभाव. ए) बीसीए पार वर्गों yfp, LGALS3, RUNX2 और dapi (परमाणु धुंधला) के लिए दाग रहे हैं, और सभी चैनलों विलय (नीचे पैनलों) थे । डैश्ड रेखाएं घाव क्षेत्र को चित्रित करती हैं । स्केल पट्टियां: १०० μm. B) एकल सेल गिनती से पता चलता है कि आईएल-1β के निषेध से न तो घाव के भीतर RUNX2+ कोशिकाओं की कुल संख्या प्रभावित होती है और न ही एसएमसी मूल से RUNX2+ कोशिकाओं का अनुपात (yfp+RUNX2+; yfp+LGALS3+RUNX2+) और मेलॉयड मूल (yfp-LGALS3+RUNX2+) । परिणाम SEM मतलब के रूप में व्यक्त कर रहे हैं । सांख्यिकीय विश्लेषण: अयुग्मित एकाधिक t-test. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

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Discussion

अनुसंधान और atherosclerosis के अध्ययन में तकनीकी प्रगति के दशकों के बावजूद, क्षेत्र नैदानिक चिकित्सा३४,३५वैज्ञानिक निष्कर्षों का अनुवाद करने का एक निराशाजनक इतिहास है । इस घटना को भाग में पशु मॉडल, प्रयोगात्मक डिजाइन, और घाव विश्लेषण में विसंगतियों से समझाया जा सकता है । इस के साथ साथ, हम एक प्रयोगात्मक पाइपलाइन का वर्णन है कि हम उन्नत atherosclerotic घावों में सेलुलर संरचना का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया वंश अनुरेखण चूहों7. इस विधि सेल भाग्य मानचित्रण और phenotyping, जो उन्नत atherosclerotic घावों में खेलने पर संभावित तंत्र द्वारा नियंत्रित प्रमुख मापदंडों रहे हैं की एक सावधानीपूर्वक जांच के लिए अनुमति देता है ।

एसएमसी-वंश अनुरेखण माउस मॉडल सही इस वंश के भाग्य और लक्षणप्ररूपी नियमन और atherosclerosis रोगजनन के लिए उनके योगदान को ट्रैक करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है । tamoxifen-प्रेरित cre-loxp प्रणाली परिपक्व संवहनी एसएमसी के लेबल atherosclerosis की दीक्षा से पहले MYH11 व्यक्त सक्षम बनाता है । सम्मोहक इस प्रणाली का उपयोग सबूत प्रदर्शन किया है कि atherosclerotic सजीले टुकड़े अत्यधिक प्लास्टिक कर रहे हैं और संवहनी एसएमसी लक्षणप्ररूपी स्विचन से गुजरना कर सकते हैं, उनके सिकुड़ा phenotype और एसएमसी-विशिष्ट मार्करों खोने, proliferating, पलायन, और यहां तक कि मैक्रोफेज की तरह कोशिकाओं में transdifferentiating17,18. वर्तमान प्रोटोकॉल में, हम बताएंगे कि कैसे वंश-पता लगाने और ब्याज के मार्करों के लिए इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला सटीक रूप से अन्य एसएमसी आबादी के बीच एसएमसी और उनके रिश्तेदार आवृत्ति द्वारा किए गए लक्षणप्ररूपी संक्रमण का निर्धारण करने के लिए एकीकृत किया जा सकता है ।

इस पद्धति के अंय assays अक्सर क्षेत्र में प्रदर्शन के साथ उच्च पूरक है । पहला, सूडान चतुर्थ द्वारा लिपिड धुंधला के साथ संयुक्त एन फेस महाधमनी की तैयारी के द्वारा atherosclerotic घाव के बोझ का आकलन व्यापक रूप से अपनी सुविधा और गति के कारण किया जाता है । हालांकि, इस तरह के घाव आकार, लुमेन आकार, और पोत remodeling के रूप में कुंजी रूपात्मक मानकों का एक अपर्याप्त उपाय है । सूडान चतुर्थ द्वारा एन चेहरे महाधमनी तैयारी के धुंधला करने के लिए लिपिड बयान की कल्पना करने के लिए महाधमनी के भीतर रिश्तेदार घाव क्षेत्र यों तो इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह घावों के असंगत धुंधला प्रदान कर सकते हैं, के रूप में केवल तटस्थ लिपिड घटक कल्पना है, जबकि अन्य घटकों द्वारा कब्जा क्षेत्रों, इस तरह के extracellular मैट्रिक्स के रूप में, आमतौर पर8उपेक्षित कर रहे हैं. इसके अलावा, एन चेहरे धुंधला घाव आकारिकी के बारे में सूचित करने में असमर्थ है और फैटी धारियाँ और उन्नत घावों के बीच भेद नहीं कर सकता । पोत आकारिकी एक महत्वपूर्ण atherosclerosis स्टेज और टूटना जोखिम का मूल्यांकन, घाव आकार, लुमेन व्यास, पोत remodeling7,३६,३७सहित के लिए इस्तेमाल किया पैरामीटर है । ये विश्लेषण उचित मात्रा के लिए पोत आकारिकी के संरक्षण की आवश्यकता है । महत्वपूर्ण बात, रूपात्मक मापदंडों की जांच के लिए प्रोटोकॉल बहुत विस्तृत यहां प्रोटोकॉल के साथ ओवरलैप । विशेष रूप से, वे लागू दबाव में अधिक से अधिक स्थिरता प्रदान करने के लिए pbs और फिक्टिव छिड़काव के लिए एक गुरुत्वाकर्षण चालित संवहनी छिड़काव प्रणाली के उपयोग पर भरोसा करते हैं । गुरुत्वाकर्षण चालित घुसपैठ प्रणाली प्रत्येक स्वतंत्र माउस के बीच एक निरंतर प्रवाह गति और दबाव की गारंटी देती है और स्वतंत्र प्रयोगों या शोधकर्ताओं के बीच मैनुअल बल-चालित छिड़काव की विसंगति को रोकती है । गुरुत्वाकर्षण छिड़काव प्रणाली का गठन किया जाना चाहिए, जो औसत मुरीन रक्तचाप (70-120 mmhg) के पास एक दबाव पर छिड़काव को प्रेरित करने के लिए । दूसरा, हम embedding और बाहु-शीर्ष धमनी के लिए परिच्छेदन के एक मानकीकृत और व्यवस्थित विधि प्रदान की है । सेक्शनिंग की शुरुआत साइट को परिभाषित करने और बाहु-शीर्ष धमनी भर में कई स्थानों पर घाव क्षेत्र बढ़ाता द्वारा, हम सीमित नमूना के साथ आता है कि यादृच्छिक भिन्नता सीमित कर सकते हैं.

प्रवाह cytometry एक और अत्यधिक इम्यूनोफ्लोरोसेंट एक कोशिका गिनती कि व्यापक रूप से atherosclerotic घावों३८के भीतर सेल आबादी बढ़ाता में इस्तेमाल किया गया है के साथ युग्मित धुंधला के साथ पूरक तकनीक है । यह माउस महाधमनी और फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के साथ जारी की कोशिकाओं के लेबल के पाचन के होते हैं । प्रवाह साइटोमेट्री aorta में मौजूद सेलुलर आबादी का एक मात्रात्मक विश्लेषण प्रदान करता है । हालांकि, सभी प्रौद्योगिकियों की तरह, प्रवाह cytometry सीमाएं हैं । एक साथ मार्करों की एक बड़ी सरणी फिटिंग के अलग लाभ के बावजूद, स्थानिक संकल्प का एक पूरा नुकसान है, और यह स्पष्ट नहीं हो जाता है कि क्या एक कोशिका आबादी रेशेदार टोपी या नेक्रोटिक कोर में समृद्ध है । इसके अतिरिक्त, वहां कमजोर पड़ने के प्रभाव का खतरा है के बाद से प्रवाह cytometry कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या की आवश्यकता है और अक्सर केवल atherosclerotic क्षेत्रों पर ध्यान केंद्रित नहीं करता है । इस कारण के लिए, इम्यूनोफ्लोरेसेंस और प्रवाह cytometry एक पूरक तरीके से इस्तेमाल किया जा सकता है दोनों उच्च आयामी रूपरेखा और घाव स्थानीयकरण के लिए अनुमति देते हैं ।

अंत में, प्रोटोकॉल paraformaldehyde-फिक्स्ड और पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक वर्गों का उपयोग कर बीसीए उन्नत घाव में एसएमसी आबादी के परिमाणन पर ध्यान केंद्रित किया है । हालांकि, इस प्रोटोकॉल के लिए महाधमनी जड़ या उदर महाधमनी, दो संवहनी क्षेत्रों atherosclerosis विकास के अधीन सहित अन्य संवहनी बिस्तरों की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । व्यवस्थित प्रसंस्करण और महाधमनी जड़ के परिच्छेदन पहले अच्छी तरह से8,३९वर्णित किया गया है । के रूप में atherosclerosis विभिंन स्थानों पर विकसित करता है और है कि आनुवंशिक हेरफेर या चिकित्सीय हस्तक्षेप गैर homogenously इन21साइटों को प्रभावित कर सकते हैं, यह संभव के रूप में कई संवहनी बिस्तरों के रूप में जांच करने के लिए सटीक निष्कर्ष आकर्षित महत्वपूर्ण है । इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला और एकल सेल गिनती भी जमे हुए वर्गों का उपयोग किया जा सकता है । यह पैराफिन वर्गों के साथ एंटीबॉडी की असंगति के कारण आवश्यक हो सकता है । हालांकि पशु छिड़काव और ऊतक embedding इस प्रोटोकॉल से अलग होगा, जांचकर्ताओं प्रयोगात्मक यहां वर्णित प्रक्रियाओं के बाकी का पालन कर सकते हैं ।

अंत में, यहां वर्णित तकनीकों में घाव कोशिका आबादी और phenotypes का विश्लेषण करने के लिए एक व्यवस्थित दृष्टिकोण रूपरेखा देर से मंच murine atherosclerosis । इस प्रोटोकॉल के रूप में सेवा कर सकते है एक टेंपलेट के रूप में जल्दी और देर से मंच atherosclerosis, साथ ही रोकथाम और हस्तक्षेप के अध्ययन सहित प्रयोगात्मक डिजाइन के सभी प्रकार में immunofluorescent धुंधला द्वारा घाव आबादी की जांच ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम जीवविज्ञान इमेजिंग के लिए केंद्र धंयवाद (nih 1s10od019973-01 द्वारा समर्थित) पिट्सबर्ग विश्वविद्यालय में उनकी सहायता के लिए । इस काम के द्वारा समर्थित किया गया है द्वारा समर्थित है वैज्ञानिक विकास अनुदान 15sdg25860021 अमेरिकी हार्ट एसोसिएशन से डीजी r.a.b. nih अनुदान F30 HL136188 द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% Paraformaldehyde aqueous solution Electron Microscopy Sciences RT 15710 Tissue perfusion and fixation
23G butterfly needle Fisher BD367342
25G needle Fisher 14-821-13D 
A1 Confocal microscope Nikon Confocal microscope
ACTA2-FITC antibody (mouse) Sigma Aldrich F3777 Primary Antibody
Alexa-647 anti goat Invitrogen A-21447 Secondary antibody
Antigen Unmasking solution, Citric acid based Vector Labs H-3300 Antigen retrieval solution
Chow Diet Harlan Teklad TD.7012
Coverslip Fisher 12-544-14 Any 50 x 24 mm cover glass
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen D1306 Nucleus fluorescent counterstaining
Donkey Alexa-488 anti-rabbit Invitrogen A-21206 Secondary antibody
Donkey Alexa-555 anti-rat Abcam ab150154 Secondary antibody
DPBS 10X without Calcium and Magnesium Gibco 14200166 PBS for solution dilutions and washes. Dilute to 1x in deionized water
Embedding cassette Fisher 15-182-701D
ETDA vacuum tube Fisher 02-685-2B
Ethanol 200 proof Decon 2701
Foam pad Fisher 22-222-012
Gelatin from cold water fish skin Sigma Aldrich G7765
GFP antibody (goat) abcam ab6673 Primary antibody
goat IgG control Vector Labs I-5000 IgG control
High Fat Diet Harlan Teklad TD.88137
ImageJ NIH Computer program https://imagej.nih.gov/ij/ 
LGALS3 antibody (rat) Cedarlane CL8942AP Primary antibody
LSM700 confocal microscope Zeiss Confocal microscope
Microscope Slides, Superfrost Plus Fisher 12-550-15
Microtome blades Fisher 30-538-35
Mouse IgG control Vector Labs I-2000 IgG control
NIS element imaging software Nikon Imaging software for z-stack image acquisition
Normal Horse serum Sigma Aldrich H1270
Pap Pen Fisher 50-550-221
Peanut oil Sigma P2144
Prolong gold Antifade mountant Invitrogen P36930 Mounting medium 
Rabbit IgG control Vector Labs I-1000 IgG control
Rat IgG control Vector Labs I-4000 IgG control
RUNX2 antibody (rabbit) Abcam ab192256 Primary Antibody
Syringe BD 309628 1 ml syringe
Tamoxifen Sigma T5648
Xylene Fisher X55K-4
Zen imaging software Zeiss Imaging software for z-stack image acquisition

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References

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चिकनी मांसपेशी कोशिका वंश के उन्नत atherosclerotic घावों में सेलुलर संरचना का मात्रात्मक विश्लेषण-चूहों अनुरेखण
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Mahan, S., Liu, M., Baylis, R. A., Gomez, D. Quantitative Analysis of Cellular Composition in Advanced Atherosclerotic Lesions of Smooth Muscle Cell Lineage-Tracing Mice. J. Vis. Exp. (144), e59139, doi:10.3791/59139 (2019).

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