Summary
動物解剖、組織を埋め込む、断面、染色、腕頭動脈の分析の体系的な方法を含む後期マウスの動脈硬化病変の細胞構成を特徴づけるための標準化されたプロトコルを提案します。atheroprone 平滑筋細胞系譜トレース マウス。
Abstract
動脈硬化は世界における死亡の主要な原因と、有望な治療上のターゲットを記述する無数の前臨床研究にもかかわらず新規介入はとらえどころのない残っています。これは可能性が高いため、一部では、確立された病気ではなく、遺伝子操作や動脈硬化の進展に対する薬理学的治療法の効果を調べる臨床予防モデルに依存します。また、これらの研究の結果は、表在病変解析の使用と病変の細胞集団の特性の不足のため交絡しばしば。これらの並進のハードルを克服するためには、蛍光抗体染色および共焦点顕微鏡による単一細胞レベルでの細胞組成の変化の調査を用いる介入モデル依存の増加を提案します。このため、動物解剖、埋め込み、および断面、染色、腕頭動脈病変の定量化のための体系的なアプローチを含むマウス介入モデルで推定される治療上のエージェントをテストするためのプロトコルについて述べる。さらに、末期動脈硬化病変内のセルの表現型多様性によるセル固有の誘導の系譜トレース マウス システムとどのようにこれは公平な評価に利用できますを使用しての重要性を述べるアテローム性動脈硬化病変の細胞集団。一緒に、これらの戦略はより正確に治療上の介在をモデル化および動脈硬化性疾患を分析する血管生物学者を助けるかもしれない、臨床試験の成功のより高い速度に変換されますうまくいけば。
Introduction
動脈硬化は、罹患率と死亡率の世界的冠動脈疾患、末梢動脈疾患、脳卒中の大半の基になる主要な原因です。後期冠動脈アテローム性動脈硬化は、心筋梗塞会計世界人口の死亡率1,2のほぼ 16% を含む重篤な合併症につながります。衝撃その壊滅的な公衆衛生上、新規治療戦略の開発を行うとともに、動脈硬化の進行を駆動メカニズムを解読する実質的な努力をしました。まだ、心血管疾患の臨床試験の承認の可能性 (LOA) 率は最低水準 (8.7% 相) のみ他の臨床フィールドと比較すると3です。これは説明することができます一部で多くの障壁によってその動脈硬化のポーズをほぼユビキタス性質、臨床的に無声進行の重要な病気の不均一性など効率的な医薬品開発へ。さらに、前臨床動物実験の準最適設計に臨床的翻訳の成功の欠如説明もできます。具体的には、治療戦略の有効性を調査するため可能な限り介入研究を実施する必要があると考えています。また、運命のマッピングおよび表現型解析によって末期動脈硬化病変の細胞構成の高度な特徴を含む病変解析の標準化された手順を実行するための重要な必要性があります。
アテローム性動脈硬化研究の大半は薬物治療や遺伝子操作 (ノックアウトまたはノックアウトの) 病気の開始そして進行の前に、健康な若いマウスの動脈硬化予防のモデルに焦点を当てます。これらの研究は、多数の遺伝子と動脈硬化の進展に関与するシグナル分子を発見されています。ただし、これらのターゲットのほとんどは人間の効率的な治療に翻訳できませんでした。確かに、治療法が高度な動脈硬化病変を有する高齢者患者に健康な若いマウスに及ぼす影響を推定することは困難です。など、可能性が臨床実験的パイプラインにおける介入研究の実装では、関連性と有効性の新しい治療のより正確な描写を提供します。アイデアは、プロ炎症性サイトカイン インターロイキン 1 β (il-1) を阻害する予防4,5,6または介入戦略7を採用の著しく発散効果によってサポートされます。予防と介入研究の違いは、異なる細胞プロセスが動脈硬化の進展のさまざまなフェーズで発生し、予防の研究の可能性があるという事実を強調を示唆している臨床のシナリオをモデル化するが不足しています。適切に。
アメリカ心臓協会は最近、適切な実験計画、手順の標準化、分析、および動物の動脈硬化研究8のレポートの推奨事項を詳述した科学的な声明を発表しました。これは、利点と制限フィールドで使用される支配的な技術をハイライトします。たとえば、最初の読み出しとしてアン顔スーダン IV は、大動脈の染色はしばしば実行されます。脂質沈着のアン顔スーダン IV 染色はグローバル プラーク負担の評価に適した方法より高度な遅段階の病変を早期脂肪筋病変を区別することはないです。など、アンの顔を汚すの解釈はしばしばあいまいな、うわべだけの9です。慎重に分析組織の形態学的パラメーター容器、病変、および内腔のサイズと病変の安定性の指標の定量化を使用して断面積実験の効果のより正確な理解を提供します。
最後に、人間の病理組織学的研究は、細胞構成が平滑筋細胞 (SMC) 病変の貧乏人および10、破裂しやすくされているマクロファージが豊富と病巣の大きさ自体よりも破断のよりよい予測因子であることを示唆しています。 11。これらの観察は、古典的な細胞の識別に使用されるマーカーの染色に基づいていた (すなわち、SMC と LGALS3 または大食細胞の CD68 の ACTA2)。ただし、これらのマーカーの発現は SMC、血管内皮細胞、骨髄細胞の12を含む複数の系統の可塑性による動脈硬化病変における 1 つのセル型に厳密に制限されません。特に、動脈硬化病変内で SMC の明白な識別は事実上不可能過去 10 年まで「脱分化」と (プロセスと呼ばれる系統特異的マーカー遺伝子を抑制するこれら細胞特性のため表現型スイッチング) 負傷したまたは患部の血管13。SMC の識別にこの制限はリネージュ トレース7,14,15,16,17,18,の開発によって回避されています19,20,21,22,23,24. それ永久にラベリング Cre リコンビナーゼ SMC 特異的発現プロモーターによる発現の組み合わせを使用してアテローム性動脈硬化の進行中に彼らの運命と表現型進化を追跡するには、SMC と彼らの子孫成っている (すなわち、 Myh117,15,17,18,19,20,21,22,23,24、26 Acta225、と、 SM22α14,16) と記者 (例えば、蛍光タンパク質、β-ガラクトシダーゼ) [Bentzon と Majesky で確認の活性化201827]。胚外 SMC リネージュ トレースを用いた最初の研究の 1 つは、シュペーアら14は、SMC 調節することが彼らの表現型と分化形質転換軟骨細胞に血管石灰化の間を使用して証拠を提供SM22α Cre R26R LacZ 系統のトレース モデル。これらの研究は、トレースする SMC 血統を開拓した、病気の設定で任意の与えられた非 SMC 表現する SM22α はレポーターによって分類されること、部分的に明白でした。この制限は開発と使用のタモキシフェン誘導 Cre ERT/LoxP 細胞ラベリングの時空間制御を許可によってバイパスされています。タモキシフェンの配信中にのみ発生する細胞ラベリングと代替セル型で Cre のアクティブ化の追跡を回避する運転 Cre ERT 式タモキシフェン露出の時にセル型固有プロモーターを表現するセルに限定されます、病気の進行の設定。動脈硬化、蛍光レポーター (eYFP7,15,17,18に関連付けられているタモキシフェン誘導Myh11- Cre/ERT2 transgene の SMC のトレースする血統の,21, mTmG19,25, 紙吹雪20,22,23クローン性増殖研究) 顕著な効率と SMC のラベリングの特異性を示しているし、は最近の研究で動脈硬化病変における運命地図 SMC 個体群に使用されています。重要なは、これらの研究は、それを明らかにした: 1) SMC の 80% 内高度動脈硬化病変は発現していない、従来 SMC マーカー (ACTA2、MYH11) 免疫組織学的解析のため、したがって系譜トレースせず誤認されているだろう17;2) SMC のサブセット エクスプレス マクロファージ マーカーまたは間葉系幹細胞マーカー16,17,19を含む代替セル型のマーカー・ 3) SMC 投資し、オリゴグローナル拡張、動脈硬化病変と SMC クローン保持可塑性表現型別の集団20,23に移行します。要約すれば、それは今オフに平滑筋細胞が動脈硬化病変における顕著な表現型の多様性を提示し、その表現型変化の性質に応じて病変発生機序に関する有益なまたは有害な役割を持つことができます。これらの発見は、SMC 末期動脈硬化の粥腫推進表現型転移をターゲットに顕著な新しい治療上の道を表しています。
ここで、動物解剖、埋め込み、断面、染色、腕頭動脈病変の定量化のための体系的なメソッドを含む後期マウスの動脈硬化病変を分析するための標準化されたプロトコルを提案する.SMC 運命と表現型に及ぼすインターロイキン 1 β 阻害を決定するには、SMC リネージュ アポ-/-マウス抗 IL1β 抗体の IgG アイソタイプ対照毎週注射を受ける前に 18 週間西部飼料をトレースを使用しました。
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Protocol
動物飼育、処理およびプロシージャは、バージニア大学とピッツバーグ大学施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。
1. SMC リネージュ トレース マウスの世代
- Myh11- Cre/ERT2 男性28を繁殖 (ジャクソンの実験室; #019079) R26R EYFP 女性と (ジャクソンの実験室; #006148) Myh11- Cre/ERT2+ R26R EYFP を取得する+/+男性。
- Myh11- Cre/ERT2+ R26R EYFP を繁殖+/+アポ-/-メスのマウスと男性 (ジャクソンの実験室; #002052)。子孫をクロスし、遺伝子型Myh11- Cre/ERT2+ R26R EYFP を選択+/+アポ-/-男性と R26R EYFP+/+最終的なブリーダーとしてアポ-/-雌マウス。ツインテールをクリップし、同腹子に遺伝子型を実行します。男性のすべてのマウスは、 Myh11- Cre/ERT2+ R26R EYFP をする必要があります+/+アポ-/-実験的マウス (図 1A) として使用することができます。
注: Genotyping のプロトコルは、ジャクソンの実験室のウェブサイトで見つけることが。Myh11 Cre/ERT2 遺伝子は Y 染色体、女性の使用を排除にあります。他の系統のトレース システムを使用できますが、しかしこのシステムはアテローム性動脈硬化の運命マップ SMC に最も信頼性の高い系統トレース戦略まで。
2. 平滑筋細胞系譜トレース マウス食事と治療
- 男性Myh11- Cre/ERT2+ R26R EYFP をある+/+アポ-/-マウスは、6 Myh11 を永久にラベルを生後 8 週から 1 mg タモキシフェン注射の一連を表示+ SMC YFP と彼らの運命 (図 1を追跡するにはA)。
- 55 ° C で熱ピーナッツ油
- 10 mg/mL の溶液を調製し、タモキシフェンの完全解散まで, 55 ° C で事前に加熱されたピーナッツ油にタモキシフェンを追加します。
- 2 週間以上 10 注射一連のタモキシフェン 10 mg 溶液 0.1 mL を腹腔内注射を実行します。
注: タモキシフェンは、バイオハザード注意して処理する必要があります。
- タモキシフェンと最後の注射後 5 から 7 日を可能にする高度な動脈硬化病変の開発 18 週の持続期間のため (例えば、西部の食事療法; 脂肪からカロリーを 42% 0.2% 総コレステロール) の高脂肪食で食事ダイエットを交換します。大動脈、大動脈、右腕頭動脈・腹部大動脈を含む複数の血管ベッドで一貫して開発しています。
- 高脂肪食の 18 週時 (図 1B) の希望の期間の治療的介入を開始します。
注: 例として、抗 IL1β 抗体または 18 ~ 26 週間高脂肪食のアイソタイプ一致 IgG コントロールと毎週の腹腔内注射を行った。 - 8 に 16 時間組織血中コレステロールおよびトリグリセリドの正確な測定値を実行するために収穫前の高速マウスに食品を削除します。
3. 腕頭動脈 (BCA) の収穫
- 動物の安楽死は、動物のケアおよび使用委員会 (ACUC) の要件および規制に従う必要があります。5 分 approximatively CO2窒息による実験的マウスを安楽死させるつま先ピンチで死を確認してください。
- マウスの重量を量るし、血を収集します。
- マウスの重量を量る
- マウスの腹側を 70% にスプレー エタノール
- 胸腔内の左側から心室に 1 mL の注射器に接続して 25 G 針を挿入することによって心臓穿刺を行います。0.1 を 1 ミリリットルの血液を集めることができます。
- EDTA の真空管に注射器をフラッシュすることによって血液を転送し、ロッカーまたは 10 〜 15 分のための回転子の管を配置します。
- 1.5 mL チューブ、4 ° C で 10 分間 250 x gの遠心血液を転送します。慎重にピペットと十分なヒント トップ プラズマ相を撤回し、新しい管に転送。コレステロールとトリグリセリドを測定する前に-20 ° C で保存します。
注: 全血は血液細胞数およびサイトカイン、免疫細胞のプロファイリングなど他の血液成分を含む追加的な研究に使用できます。
- 使用して中間腹部の皮膚で approximatively 2 cm の切開はさみし、腹腔内を公開するために皮膚を引っ張る。組織を損傷することがなく胸骨まで腹膜をカットします。心臓や肺を傷つけないように注意しながら、胸部を半ば腋窩線で 2 つのカットを作る。
- ピンセットで胸骨を持ち上げるし、中心部を部分的に公開するダイアフラムをカットします。中心部に簡単にアクセスできない場合は、右心房に到達する十分な胸部を切り取る。
- 重力灌流システム (図 2A) を使って、マウスを灌流します。灌流液の圧力が (図 2B) マウス平均血圧に相当重力散水システムをインストールします。このシステムにより、血流の一貫性を保つのため両方おり容器形態とフラッシュ赤の血液細胞があります。
注記: 参照として C57Bl6 マウスは、120 の mmHg (平均収縮期血圧) と 70 mmHg (平均拡張期血圧)29,30間生理的血圧を持っています。平均の収縮期および拡張期血圧マウス遺伝的背景によって異なります。- 25 G 重力灌流システムに針を蝶し、チューブから空気を吐き出すために針をリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) を実行または、23 を接続します。左心室に針を挿入、場所に針を固定します。アイリスはさみを使用して、右心房や上行大動脈に小切開 (< 2 mm) を作る。
- その後、5 mL の PBS を PBS、5 ml、10 mL、4% パラホルムアルデヒド (PFA) ソリューションの灌流します。周囲温度で PBS および 4 %pfa のソリューションを使用します。
- (肝臓、肺、脾臓など) の興味の組織を収集し、4 %pfa ソリューションの配置。
- BCA を公開します。
- 皮膚や唾液腺を除去することによって首の部分をきれいに。
- 胸骨柄のはさみを使用してを介して胸骨の正中線を 1 つのカットを実行します。はさみが密接に胸骨の下にある血管の損傷を避けるために胸骨の背部に近くとどまることに注意してください。胸腔を開放に鉗子で胸部の両側を引き出します。頸動脈が部分的に表示されます。
- 筋肉や結合組織を引っ張ってくると右の頚動脈、鎖骨下の分岐と大動脈弓が掃除され、周囲の結合組織や脂肪 (図の分離した腕頭動脈まで高級ピンセットで脂肪を削除するクリーンアップします。2C)。
- BCA を削除します。
- 鉗子を使用すると、その分岐の下右頸動脈をつかんで鉗子 (図 2D) 上の最初のカットを作る。
- 頸動脈を押したまま、鎖骨下動脈を通って 2 番目のカットを作る。最終的な 2 つの切口は大動脈弓, 腕頭動脈 (図 2D) のいずれかの側にあります。
- (例えば、腹部大動脈、大動脈のルートを含む心の優れた部分) の興味の他の維管束組織を収集します。
- BCA や他の組織を室温で一晩 4 %pfa ソリューションに配置します。
注意: 固定時間は研究で一貫して保管すべき。
4. ティッシュの処理と断面
- 4 %pfa とラベルの付いた組織カセット (図 3A) の場所から組織を削除します。向きや処理手順 (図 3B) カセットのまま組織を確保するためカセットに使用フォーム パッドを保持します。カセットを閉じるし、処理 (72 h 24) ティッシュまで 70% エタノールに浸します。
- BCA はプロセスおよび他の組織は組織学的および免疫蛍光染色 (プロセッサを用いた真空浸透一晩手順の例) では次のように収集: 10% 中性緩衝ホルマリン周囲温度 (2 x) で 30 分の 75%エタノール 30 ° c (1 x)、90% のエタノール 30 ° c (1 x)、95% のエタノール 30 ° c (1 x)、100% のエタノール 30 ° c (3 x) 30 ° C (3 x) で 60 分のキシレン、パラフィン ワックス 62 ° C (3 x) で 80 分の 60 分の 60 分の 60 分の 60 分。
- ブロック面 (図 3C) に最も近い大動脈弓に垂直方向に BCA を埋め込みます。
- 埋め込まれた組織に到達するまで回転式ミクロトーム (10 μ m 厚) のパラフィン ブロックをカットします。
- 組織が表示と、位置を調べるための顕微鏡の下でセクションを調べます。大動脈弓がまだ表示されている場合は、各間隔で] セクションを調べて、時 10 10 μ m のセクションまで削除します。
- 大動脈弓がによって切断された腕頭動脈が表示されるときは、ティッシュのミクロトーム刃に完全に垂直の位置にブロックの向きを調整します。
- 10 μ m の切片厚で BCA をカットします。その時点ですべてのセクションはスライドごとの 3 つのセクションに連続的に収集されます。(図 3D) の鎖骨下の分岐に到達するまでを収集します。
注意: 後続の z スタック共焦点画像の獲得および単一セルのカウントの 10 μ m 厚で BCA をカットすることが重要です。この厚さは、協会単一核と細胞質の膜断面の深さで染色も厳格かつ非 cofounding の評価になります。
5. 免疫蛍光染色
注: 形態学的パラメーターの評価およびない議定書の焦点となる細胞の構成や不安定プラークの安定性の指標にアテローム性動脈硬化病変の完全な評価が含まれます。病変形態、コラーゲン含有量およびコリン出血は、それぞれの Movat7,17, PicroSirius 赤7,31, Ter119 染色7、18、によって分析できます。ここでは、病変の細胞の組成を分析するためのプロトコルについて述べる。
- 化学のフードの下で室温以下のソリューションでスライドを孵化させなさい: 5 分 (2 x)、100% のエタノール 5 分 (2 x) の 5 分 (2 x) の 95% エタノール、70% のエタノールの 5 分 (2 x) と脱 H2O のキシレン (式行先方向2O) 5 分 (2 x)。
- 製造元の指示に従って抗原検索ソリューション内のスライドを孵化させなさい。
- クエン酸ベースの抗原のマスキング ソリューション (材料の表を参照)、準備された抗原検索ソリューションでトップに染色の貯水池と塗りつぶしにスライド式行先方向2o. 場所の 320 mL の溶液 3 mL を希釈します。
- さらに加熱できるように白紙のスライドとスライド ラックの空のスロットを埋めます。蒸発せず沸騰させる抗原検索ソリューションを許可するふた付きの容器をカバーします。
- 熱は約 675 700 ワットで 20 分間電子レンジでスライド。チェック定期的にスライドと式行先方向2O セクションなどのまま蒸発した置換液に浸漬マスキング ソリューションすべての回で。
- 室温で 1 時間のためのソリューションでクールダウンしてスライドを許可します。
- 魚皮ゼラチン (FSG) PBS の 1 L の 6 g を溶解します。PBS/FSG は、洗浄液として使用されます。PBS/FSG で 10% 血清のブロッキング液を準備します。
注: 魚の皮のゼラチンは、ブロック バッファーの準備で使用されます。FSG には哺乳類の抗体と交差反応することができます血清蛋白がないため、バック グラウンド ノイズを最小限に抑えます。ただし、ブロックの他のオプションは FSG には内因性のビオチンが含まれているビオチン検出システムで優先されるべき。通常血清使用の種類は、二次抗体の使用に基づいています。ロバ二次抗体を使用すると、通常の馬の血清を選択してブロックと抗体希釈用ください。 - 室温で 5 分間 PBS でスライドを孵化させなさい。疎水性ペンで円ティッシュ セクション。PBS/FSG/正常血清室温で 1 時間ブロッキング バッファーのセクションをカバーしてください。組織をブロックしている間このステップの間に PBS、FSG、正常血清で一次抗体溶液を準備します。
- 一晩で 4 ° C 湿度チャンバー PBS/FSG/正常血清で希釈した一次抗体とインキュベートします。スライドごとの 1 つのセクションは、一次抗体の特異性の制御する一次抗体と同じ濃度でコントロール抗体の組み合わせで孵化する必要があります。
- 室温で次のようにスライドを洗う: 5 分 (3 倍)、5 分間 (1 x)、PBS PBS/FSG。
- 核 counterstaining 室温で 1 時間 PBS/FSG/正常血清で希釈した蛍光標識二次抗体 (材料の表を参照) と diamidino-2-phenylindole (DAPI) 孵化させなさい。光からスライドを保護します。
- 5.6 の手順で説明するようにスライドを洗います。
- 蛍光に適したメディアをマウントを使用してスライドをマウント (材料の表を参照してください)。
6. 共焦点顕微鏡
注: 共焦点顕微鏡と z スタックの取得の使用は、単一セルをカウントするため重要です。
- 研究で使用するため買収パラメーターを設定: 画像の解像度 (1024 x 1024 または 2048 x 2048 ピクセル);光パスと選択された二次抗体の組み合わせの関数は、チャンネル数スキャン速度 (速度をスキャンをお勧めします: 7-8);差動干渉の対照 (DIC) チャネル。
- 一次抗体と IgG 制御ステンドのセクションを使用すると、検出器感度、レーザー出力、各チャンネルのオフセットを設定します。IgG のコントロールは、バック グラウンド信号を最小限に抑えるために使用されます。
- Z スタックの取得の上限と下限の位置を設定します。厚さと取得する履歴の数を事前に定義します。これらのパラメーター研究を通して一貫性は維持する必要があります。
注: 1 μ m の厚みのイメージングの 8 を 10 スタックをお勧めします。研究全体のイメージを作成するスタック数で一貫しているとどまります。 - 画像切片染色一次抗体と IgG DIC を含むすべてのチャンネルの制御。
- 単一セルのカウントの間イメージ校正スケール バーと少なくとも 1 つの画像にラベルを付けます。
7. 1 つのセルを数える
- インストールし、ImageJ を開きます。必要に応じて、ダウンロードのプラグインのセクションでダウンロード > 入力/出力、ImageJ のイメージ ファイルを開くことの web サイトは共焦点顕微鏡によって生成された画像の形式によって生成されます。
- ImageJ で画像ファイルを開きます。
- 6.6で生成されたイメージを使用してバーの基準縮尺を使用してイメージを調整します。
- 関心の 1 つのセルを数える実行されます DIC チャネル (図 4) を使用して領域を描きます。
注: 1 つの領域は同時に線引きすることができます。実験的質問によっては、単一のセルのカウントで実行できます全体の病斑面積 ( 7.3.1参照) 病変の sublocation および/または。たとえば、線維性被膜の区域の調査 ( 7.3.2参照) は特に関係その細胞構成は破裂する病変傾向の重要な指標。- 次の DIC イメージの内腔の境界 (図 4A; 白い矢印) と内部の弾性の板 (図 4A; 黄色の矢印) では、目に見える病変領域を描きます。
- 線維性キャップ領域の分析、内腔から 30 μ m の遠い国境を判断し、(図 4B ~ D) 境界線をトレースします。
注: 線維性被膜の領域は、ACTA2 + 細胞で基本的なルーメン (図 4B) コラーゲン濃縮領域として定義は古典的な。ACTA2 + 細胞とコラーゲン濃縮は、病変の安定性に重要な役割を果たしています。先行研究は SMC 系統の内腔から 30 μ m の厚さを ACTA2 + セル豊富な線維性被膜の領域に平均を決定したトレース アポ-/-マウス 18 に 26 週間 (図 4C) の高脂肪食を供給します。したがって、遺伝子操作や線維性被膜面積細胞構成に関する薬理学的治療の効果の細心の特性は非常に関連します。
- チャンネル ツールパネルを開きます (画像 > 色 > チャンネル ツール) と擬似カラー別染色 (図 5A; ボックス 1) チャンネル。
- カラー チャンネルの統合 (画像 > 色 > マージ色) (図 5A; ボックス 2)。すべてのチャンネルが同じイメージ (図 5B) に表示されます。オンとオフ (図 5A; ボックス 1)チャネル ツールパネルを使用して個々 のカラー チャンネルをオンにします。
- カウント ツールを設定します。
- ツール ・ バーでカウントアイコンを右クリックして (図 5C; ボックス 1)多点ツールを選択します。
- (図 5C; ボックス 2)ポイントのツールパネルを開く同じアイコンをダブルクリックします。
- 種類とサイズのセルをカウントするために使用アイテムを選択します。
- すべて表示を確認します。
- DAPI チャネルチャネル ツール] パネルでのみをオンにし、カウンター チャネル 0 (図 5C; ボックス 3) を選択します。タグは個々 の核をクリックして (図 5C Dドットに黄色など)。関心領域ですべての核をカウントする z スタックをスクロールします。ポイント ツール] パネル (図 5C; ボックス 4) でカウンター チャネル下イベントの数が示されます。
- 別の染色チャネルをオンに (例えば、eYFP 染色)。チャンネル 1 のカウンターを選択します。DAPI 染色との共存があるセルをクリックします。細胞質染色の染色を持つセルを選択しますを囲む核の全体の深さの核 (いくつか z スタックをチェック)。
- 組み合わせの染色および興味のセル人口をカウントする新しいカウンタ チャンネルの選択を変更して、繰り返します。すべてのドットの色は、異なる細胞集団 (図 5D) を表します。結果は、DAPI の合計数または領域にセルの数にセルの数として表現できます。
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Representative Results
Myh11- Cre/ERT2 R26R-EYFP アポ-/-マウスは、高脂肪食を供給されて前に年齢 6 のそして 8 週の間タモキシフェンを注入しました。高脂肪食の 18 週で 8 匹の 2 つのグループは、マウス モノクローナル抗 il-1 抗体またはアイソタイプ一致 IgG コントロールで 8 週間 (図 1)710 mg/kg で毎週扱われました。マウスは犠牲にし、4% PFA PBS 溶液を灌流しました。腕頭動脈は、解剖、処理、および断面 (図 2および図 3) 上記のようだった。
BCA の 8-10 μ m の厚さリネージュ トレース記者 (YFP) と表現型マーカー (ACTA2、LGALS3、RUNX2)、ターゲット抗体で蛍光染色共焦点顕微鏡を用いた断面をイメージしました。それぞれ個々 の染色、DAPI (核染色)、DIC の画像に買収されました。(病変、線維性被膜) を数える単一セルのための関心領域の描写は、DIC 画像 (図 4) を用いて行った。カウント別の SMC の派生集団の豊かさを決定する 1 つのセルは、ImageJ (図 5) を用いて行った。
2 代表的な免疫蛍光染色と il-1 抑制が高度な動脈硬化病変における細胞の構成に及ぼす影響評価 1 つカウントを提案します。まず、SMC リネージュ トレース記者 YFP、SMC マーカー ACTA2、BCA (480 μ m および大動脈弓から 780 μ m) の 2 つの異なる場所で断面のマクロファージ マーカー LGALS3 に行われていた染色 (図 6)。これらの断面の線維性被膜の地域の単一細胞計数解析を行い、抗 il-1 抗体を投与したマウスの間の線維性キャップ領域の細胞組成の顕著な差があったし、マウスの治療、アイソタイプ一致 IgG コントロール (図 6A)。Il-1 の抑制は、YFP + SMC の減少と LGALS3 + 細胞 (図 6B) の増加と関連付けられました。一方 SMC 人口の表現型について YFP + ACTA2 + SMC の数の減少が観測された SMC 由来マクロファージの相対番号 (YFP + LGALS3 +) 両方の BCA の場所 (図 6C) で有意に増加しました。
最後に、il-1 抑制が軟骨細胞に SMC 表現型変化に及ぼす効果を調べた。この表現型の転移、血管石灰化の重要なドライバー、末期動脈硬化症14,32,33の主要な機能です。マクロファージ マーカー LGALS3、osteochondrogenic マーカー RUNX2、SMC リネージュ トレース記者 YFP 染色 BCA 断面 (図 7A)。豊かさと RUNX2 + 軟骨細胞の起源は、私たちの 2 つの実験群の病斑面積内で特徴付けられました。Il-1 の抑制は RUNX2 + 病変内のセルの総数も SMC 由来の割合に影響しませんでしたがわかった (YFP + RUNX2 +) とマクロファージ由来 (YFP-LGALS3 + RUNX2 +) 軟骨幹細胞 (図 7B)。
図 1: 平滑筋における介入研究細胞系譜トレース マウスします。Myh11- Cre/ERT2 R26R の模式図 (A)-EYFP アポ-/-タモキシフェン誘導 SMC 特定の血統トレース マウス モデル。タモキシフェンによる治療は、R26R YFP 軌跡の組換えと終止コドンの切除、SMC、YFP の永久的な式を誘導します。(B) 図の介入の研究をMyh11- Cre/R26R ERT2-18 週間は il-1 抗体または 10 mg の濃度のアイソタイプ一致抗体の IgG コントロールを毎週注射したため、EYFP アポ-/-マウスが飼料の西部/8 週間の kg。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 腕頭動脈解離。(A) 駆動灌流システム重力の模式図。システムはマウスの平均収縮期血圧に近い圧力で血流を許可する正確な高さに設定されます。圧力は若干異なりますボリュームの高さと高さ h の間灌液体なので1 h2。(B) 静的な流体の圧力と C57Bl6 マウスの平均収縮期血圧と血流の圧力に到達する高さの決定の計算式。チョウ飼料 (左写真) C57Bl6 マウスとアポ-/-マウスで分岐動脈近位大動脈の (C) 写真は、26 週 (写真右) の高脂肪食を供給しました。アスタリスクは、アテローム性動脈硬化病変の存在を示します。近位大動脈の分枝動脈の模式図 (D)。赤い矢印は右頸動脈の隔離のためのカットを表し、腕頭動脈分離と数字はカットの順序を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: ティッシュの処理, 埋め込み, その断面します。(A) BCA 組織に埋め込みカセットの写真。BCA は、泡パッドの上に配置されます。(B) ズームでの発泡パッドに配置されている BCA の。BCA はカセットと垂直方向にまっすぐ頸動脈のラベル部分に近い大動脈弓です。スケール バー: 1 cm。 パラフィンの (C) 図は腕頭動脈の埋め込み後ブロック。(D) は、大動脈弓からの距離の表示と 10 μ m 厚の切片を持つシリアル スライドの模式図。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 動脈硬化性病変と線維性キャップ領域の描写。(A) DIC の代表的な顕微鏡画像Myh11- Cre/ERT2 R26R から腕頭動脈断面における動脈硬化病変-EYFP アポ― ―。腔と内弾性板の枠線をローカライズする白に、黄色の矢印は、それぞれ (左側のパネル)。病斑面積は破線 (右側のパネル) スケール バーで区切られます: 100 μ m。 (B) 代表的な顕微鏡写真の DIC と ACTA2 染色。両頭矢印は、基本的な線維性被膜の領域を定義する内腔領域内で染色、ACTA2 の厚さを示しています。(C) 定量発生 ACTA2 の+ Myh11- Cre/ERT2 R26R 厚-EYFP アポ-/- 18、21、26 週間高脂肪食を供給します。マウスのこの株を使用すると、繊維状のキャップは、25-30 μ m の平均厚さ事前動脈硬化病変。結果平均 ± SEM. として表されます (D) 単一のセルをカウントするための固定 30 μ m 厚い線維性被膜領域の描写。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: ImageJ を用いた単一のセルをカウントします。画面キャプチャ、共焦点顕微鏡画像を頼りに ImageJ で単一細胞の示す重要なステップです。画像の下部に z と c: のバーをスクロールでそれぞれの個々 の染色 (A) チャネルおよび個々 の z スタックが表示されます。染色チャンネル、疑似カラー チャネル パネル (1) を使用して染色チャンネル (YFP、LGALS3、ACTA2、染色性が核を DAPI と DIC) マージ チャネル パネル (2) を使用してマージされます。(B) チャネル YFP、LGALS3、ACTA2、DAPI、DIC の合併の結果。(C) 核 DAPI 染色カウント アイコン (1) を行い、ポイントのツール パネル (2) に基づいてカウントします。別のカウンターのチャネルは各細胞集団 (3) に使用されます。カウンター チャネル (4) 下記のカウント イベントの数。白い四角形: 右側の領域が拡大しました。(D) 繊維状キャップ領域 (破線) 内 DAPI (黄色の点)、YFP+細胞 (マゼンタ ドット)、YFP-LGALS3 を含む複数のセル人口を数える単一細胞の代表的な画像+細胞 (シアン ドット)YFP+LGALS3+細胞 (オレンジ ドット)、YFP+ACTA2+ (緑の点) のセルと YFP-ACTA2+細胞 (暗い青い点)。白い四角形: 右側の領域が拡大しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: Il-1 抑制 SMC 系統アポ-/-マウスのトレースの 2 つの異なる BCA 場所を線維性キャップ領域の細胞の構成に及ぼす影響の解析。Il-1 抗体を投与したマウスから大動脈弓から 480 μ m で 780 μ m 断面積 (A) BCA や YFP、LGALS3、図 1に示すように、IgG コントロール染色 DAPI (核染色) とセクションを DIC でイメージしました。蛍光チャンネルが合併 (右下)。破線は、線維性被膜の領域を線引きしたり。スケール バー: 100 μ m。 (B) 単一細胞カウント il-1 の抑制が YFP+細胞が大幅に低下し、LGALS3 の増加に関連付けられていることを明らかに+細胞線維性被膜のエリア内。YFP 内C)+携帯+ YFP+ACTA2 の減少と YFP+LGALS3+の増加人口集団が観察されます。結果平均 ± SEM. 統計解析として表されます: 複数の t 検定を対になっていません。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: 高度な動脈硬化病変による細胞の RUNX2 + 軟骨細胞数に及ぼす il-1 阻害。A) BCA 断面、YFP、LGALS3、RUNX2 と (核染色)、DAPI 染色し、すべてのチャンネルが合併 (パネル下)。破線は、病斑面積を描きます。スケール バー: 100 μ m. B) il-1 の抑制は RUNX2 の合計数には影響しませんを示しています 1 つのセルを数える+細胞内病変も RUNX2 の割合+ SMC 由来細胞 (YFP+RUNX2+;YFP+LGALS3+RUNX2+) と骨髄性の起源 (YFP-LGALS3+RUNX2+)。結果平均 SEM. 統計解析として表されます: 複数の t 検定を対になっていません。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
研究とアテローム性動脈硬化を勉強の技術進歩の数十年にもかかわらずフィールド臨床治療34,35の科学的知見を翻訳の残念な歴史があります。この現象は、動物モデル、実験デザイン、および病変の解析での不具合によって部分的に説明されるかもしれない。ここで、リネージュ トレース マウス7を使用して高度な動脈硬化病変における細胞の組成を分析するために使用私たち実験的パイプラインについて述べる。細胞運命マッピングと表現型解析、綿密な調査により、このメソッドは、高度な動脈硬化病変における再生の潜在的なメカニズムによって制御される主要なパラメーターであります。
SMC リネージュ トレース マウス モデルは、アテローム性動脈硬化発症機序に運命とこの系統およびその貢献の表現型の変調を正確に追跡する強力なツールです。タモキシフェン誘導Cre loxPシステムは、アテローム性動脈硬化の開始前に MYH11 を表現する血管の成熟の SMC のラベル付けできます。動脈硬化性プラークが非常にプラスチック製、血管 SMC 受けることができる表現型スイッチングの収縮と SMC 特異的マーカー、増殖、移行、さらにを失うことを示している説得力のある証拠は、このシステムを使用してtransdifferentiating にマクロファージのような細胞17,18。この議定書でどの系譜トレース検出を示すし、SMC と他の SMC 集団間の相対頻度によって引き受けられる表現型の遷移を正確に判断する興味のマーカーの蛍光抗体染色を統合できます。
この手法は、フィールドで頻繁に実行される他のアッセイ高い補完性です。まず、脂質スーダン IV による染色と組み合わせてen 顔大動脈製剤によるアテローム性動脈硬化病変の負担の評価は、その利便性とスピードのため使用されています。しかし、これは病巣の大きさ、内腔のサイズ、および船の改造などの重要な形態学的パラメーターの不適切な測定であります。視覚化は中性脂質成分のみとして、病変の染色に染色アン顔の大動脈、大動脈内の相対的な病変領域を定量化する脂質沈着を視覚化するスーダン IV によって準備を使用できますが、それを提供することができます一貫性のない中細胞外マトリックスなどの他の成分によって占められる領域は通常放置8です。また、本発明の顔を汚す病変形態について知らせることができない、脂肪筋と高度な病変を区別できません。容器の形態は、病巣の大きさ、内腔の直径7,36,37改造船など動脈硬化段階と破裂のリスクを評価するために使用される重要なパラメーターです。これらの解析は、適切な定量化のため容器の形態の保護を必要とします。重要なは、形態学的パラメーターの検討のためのプロトコルは大きくここで詳細なプロトコルと重複します。特に、彼らは適用される圧力の一貫性を提供するために、PBS と定着性灌流重力駆動血管灌流システムの使用に依存します。重力駆動浸透システムは、一定の流れ速度とそれぞれ独立したマウス間の圧力を保証し、独立した実験や研究者間の手動力駆動型灌流の矛盾を防ぐことができます。重力灌流システムは、(70-120 mmHg) マウス平均血圧付近の圧力で血流を誘導するを設定する必要があります。第二に、埋め込みと腕頭動脈の断面の標準化、体系的な方法を提供します。断面と腕頭動脈を通して複数の場所の病変領域の定量化の開始サイトを定義すると、限られたサンプリングに付属しているランダムな変動を制限できます。
フローサイトメトリーは、蛍光染色単一細胞数と相まって高い補完性動脈硬化病変38内細胞集団を定量化で広く使用されている別の手法です。マウス大動脈の消化と蛍光抗体と細胞のラベルで構成されています。フローサイトメトリーでは、大動脈に存在の細胞集団の定量分析を提供しています。ただし、すべての技術のような cytometry 流れの制限があります。同時マーカーの大規模な配列をフィッティングの明瞭な利点にもかかわらず空間分解能の完全な損失があるし、それは繊維状のキャップまたは壊死性コアのセル人口を濃縮するかどうか不明になります。また、フローサイトメトリー多数のセルを必要とし、しばしばアテローム性動脈硬化領域にのみ焦点ができませんので、希釈効果の危険があります。このため、蛍光抗体法およびフローサイトメトリー使用できます補完的な方法で高次元のプロファイリングと病変局在の両方を許可します。
最後に、プロトコルはパラホルムアルデヒド固定、パラフィン包埋組織切片を使用して病変を高度な BCA の SMC 個体群の定量化に焦点を当てた。ただし、大動脈や腹部大動脈の動脈硬化の進展の対象となる 2 つの血管支配領域を含むその他の血管のベッドを調査するこのプロトコルを使用することができます。体系的な処理および大動脈基部の断面は、前述もした8,39をされています。アテローム性動脈硬化を別の場所で開発するし、その遺伝子操作または治療的介入にこれらサイト21悪影響非ゆく結論を正確に可能な限り多くの血管ベッドを調査することが重要です。免疫蛍光染色し、単一のセルを数えるには凍結切片を使用しても実行できます。これはパラフィン セクションが付いている抗体の非互換性のために必要かもしれない。動物の血流と組織の埋め込みは、このプロトコルから異なるでしょう、捜査官はここに記載されている実験手順の残りの部分に従うことができます。
結論としては、テクニックは、アウトライン病変細胞集団と後期マウス動脈硬化表現型解析を体系的なアプローチを紹介します。このプロトコルは、初期と後期の動脈硬化予防と介入研究など実験的なデザインのすべてのタイプの免疫蛍光染色により病変の人口を調査するためのテンプレートとして使用できます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
彼らの支援のためピッツバーグの大学で生物学的イメージング (NIH 1S10OD019973-01 でサポート)、中心に感謝しますこの作品が支持された総局 R.A.B. に米国心臓協会からの 15SDG25860021 によって支えられた科学的な開発補助金によってサポートは NIH F30 HL136188 を付与します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | Tissue perfusion and fixation |
| 23G butterfly needle | Fisher | BD367342 | |
| 25G needle | Fisher | 14-821-13D | |
| A1 Confocal microscope | Nikon | Confocal microscope | |
| ACTA2-FITC antibody (mouse) | Sigma Aldrich | F3777 | Primary Antibody |
| Alexa-647 anti goat | Invitrogen | A-21447 | Secondary antibody |
| Antigen Unmasking solution, Citric acid based | Vector Labs | H-3300 | Antigen retrieval solution |
| Chow Diet | Harlan Teklad | TD.7012 | |
| Coverslip | Fisher | 12-544-14 | Any 50 x 24 mm cover glass |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | Nucleus fluorescent counterstaining |
| Donkey Alexa-488 anti-rabbit | Invitrogen | A-21206 | Secondary antibody |
| Donkey Alexa-555 anti-rat | Abcam | ab150154 | Secondary antibody |
| DPBS 10X without Calcium and Magnesium | Gibco | 14200166 | PBS for solution dilutions and washes. Dilute to 1x in deionized water |
| Embedding cassette | Fisher | 15-182-701D | |
| ETDA vacuum tube | Fisher | 02-685-2B | |
| Ethanol 200 proof | Decon | 2701 | |
| Foam pad | Fisher | 22-222-012 | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma Aldrich | G7765 | |
| GFP antibody (goat) | abcam | ab6673 | Primary antibody |
| goat IgG control | Vector Labs | I-5000 | IgG control |
| High Fat Diet | Harlan Teklad | TD.88137 | |
| ImageJ | NIH | Computer program https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| LGALS3 antibody (rat) | Cedarlane | CL8942AP | Primary antibody |
| LSM700 confocal microscope | Zeiss | Confocal microscope | |
| Microscope Slides, Superfrost Plus | Fisher | 12-550-15 | |
| Microtome blades | Fisher | 30-538-35 | |
| Mouse IgG control | Vector Labs | I-2000 | IgG control |
| NIS element imaging software | Nikon | Imaging software for z-stack image acquisition | |
| Normal Horse serum | Sigma Aldrich | H1270 | |
| Pap Pen | Fisher | 50-550-221 | |
| Peanut oil | Sigma | P2144 | |
| Prolong gold Antifade mountant | Invitrogen | P36930 | Mounting medium |
| Rabbit IgG control | Vector Labs | I-1000 | IgG control |
| Rat IgG control | Vector Labs | I-4000 | IgG control |
| RUNX2 antibody (rabbit) | Abcam | ab192256 | Primary Antibody |
| Syringe | BD | 309628 | 1 ml syringe |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Xylene | Fisher | X55K-4 | |
| Zen imaging software | Zeiss | Imaging software for z-stack image acquisition |
References
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