Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Kvantitativ analyse av mobilnettet komposisjon i avansert aterosklerotisk lesjoner av glatt muskel celle avstamning-Tracing mus

Published: February 20, 2019 doi: 10.3791/59139
Automatic Translation
1, 1, 2,3, 1,4
1Heart, Lung, Blood and Vascular Medicine Institute, University of Pittsburgh, 2Robert M. Berne Cardiovascular Research Center, University of Virginia, 3Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Virginia, 4Division of Cardiology, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

Vi foreslår en standardisert protokoll betegner mobilnettet sammensetningen av sent murine aterosklerotisk lesjoner inkluderer systematisk dyr disseksjon, vev innebygging, skjæring, flekker og analyse av truncus arterier fra atheroprone glatt muskel celle avstamning sporing mus.

Abstract

Atherosclerosis er fortsatt den ledende dødsårsaken som er over hele verden, og til tross for utallige prekliniske studier som beskriver lovende terapeutiske mål, romanen intervensjoner har vært unnvikende. Dette er sannsynlig skyldes, delvis, til en avhengighet av prekliniske forebygging modeller undersøker virkningene av genetisk manipulasjon eller farmakologiske behandlinger på aterosklerose utvikling i stedet for etablerte sykdommen. Resultatene av disse studiene er også ofte forvirrende på grunn av bruk av overfladiske lesjon analyser og manglende karakterisering av lesjon celle populasjoner. For å overvinne disse translasjonsforskning hekk, foreslår vi en økt avhengighet på tiltak som bruker undersøkelse av endringer i mobilnettet komposisjon ved en enkeltcelle nivå av immunofluorescent flekker og AC confocal mikroskopi. Dette beskriver vi en protokoll for å teste en antatte terapeutisk agent i murine intervensjon modell inkludert en systematisk tilnærming for dyr disseksjon, innebygging, skjæring, flekker og kvantifisering av truncus lesjoner. I tillegg på grunn av fenotypiske mangfoldet av celler i sent aterosklerotisk lesjoner beskriver vi viktigheten av å bruke celle-spesifikke, induserbart avstamning sporing musen systemer og hvordan dette kan utnyttes for upartiske karakteristikk av aterosklerotisk lesjon celle populasjoner. Sammen disse strategiene kan hjelpe vaskulær biologer mer nøyaktig modell terapeutisk intervensjon og analysere atherosclerotic sykdommer og vil forhåpentligvis føre til en høyere rate av suksess i kliniske forsøk.

Introduction

Atherosclerosis er den ledende årsaken til sykelighet og dødelighet verden underliggende flertallet av coronary arterien sykdom, perifer arterien sykdommer og slag. Sent koronar aterosklerose kan føre til alvorlige komplikasjoner inkludert hjerteinfarkt brudd sto for nesten 16% av verdens befolkning dødelighet1,2. På grunn av dens ødeleggende innvirkning på folkehelsen, har betydelig innsats blitt gjort å dechiffrere mekanismer kjøring aterosklerose progresjon, samt for å utvikle nye strategier. Likevel, sannsynligheten av godkjenning (LOA) kliniske studier for hjerte-og karsykdommer er blant de laveste sammenlignet med andre kliniske felt (bare 8.7% for fase I)3. Dette kan forklares i del av mange hindringer at aterosklerose utgjør for effektiv narkotika utvikling inkludert nesten allestedsnærværende natur, klinisk lydløs fremdrift, og vesentlige sykdom heterogenitet. Videre kan suboptimal utformingen av prekliniske dyrestudier også gjøres rede for mangel på suksess i klinisk oversettelse. Spesielt mener vi det er nødvendig å implementere intervensjon studier mulig å undersøke effekten av strategier. Dessuten finnes det et kritisk behov for å utføre standardisert prosedyrer for lesjon analyser inkludert avanserte karakteristikk av sent aterosklerotisk lesjon mobilnettet sammensetning av skjebnen kartlegging og phenotyping.

Majoriteten av aterosklerose studier fokuserer på modeller av aterosklerose forebygging bestående av narkotika behandling eller genet manipulasjon (knockout eller knock-i) i friske unge mus, før sykdom Debutalder og progresjon. Disse studiene har avdekket en rekke gener og signalnettverk molekyler som spiller en rolle i aterosklerose utvikling. Men kunne de fleste av disse målene oversette til effektiv behandling i menneskelig. Det er faktisk vanskelig å ekstrapolere effekten terapi har på sunn ung mus til eldre pasienter med avansert aterosklerotisk lesjoner. Som sådan, gir gjennomføringen av intervensjonen studier i preklinisk eksperimentelle rørledningen sannsynlig et mer nøyaktig bilde av relevans og effekten av en ny terapeutisk. Er støttet av påfallende divergerende virkningene av hemme pro-inflammatoriske cytokin Interleukin-1β (IL-1β) når ansette en forebygging4,5,6 eller intervensjon strategi7. Forskjeller mellom forebygging og intervensjon studier tyder på at ulike cellulære prosesser oppstå i forskjellige faser av aterosklerose utvikling og understreker at forebygging studier er sannsynligvis nok til å modellere klinisk scenariet tilstrekkelig.

American Heart Association nylig publisert en vitenskapelig uttalelse detaljering anbefalinger for riktig eksperimentell design, fremgangsmåter for standardisering, analyse og rapportering av dyr aterosklerose studier8. Det fremhever fordelene og ulempene av dominerende teknikker som brukes i feltet. For eksempel utføres en ansikt Sudan IV farging av aorta ofte som en første lese-out. Men no ansikt Sudan IV flekker lipid program er en egnet metode for vurdering av globale plakk byrden, er det ikke kan skille tidlig stadium fet strek lesjoner fra mer avanserte sent lesjoner. Slik er tolkning av en ansikt flekker ofte uklare og overfladiske9. Forsiktig analyse av vev tverrsnitt morfologiske parametere båten leksjonen og lumen størrelse og kvantifisering av indekser lesjon stabilitet gir en mer nøyaktig forståelse av virkningen av et eksperiment.

Til slutt, menneskelige histopatologi studier har antydet at mobilnettet sammensetning er en bedre prediktor for ruptur enn lesjon, med lesjoner fattige i glatte muskelcellene (SMC) og rike i makrofager er mer utsatt for brudd10, 11. Disse observasjonene var basert på flekker for markører klassisk brukes til celle identifikasjon (dvs. ACTA2 for SMC og LGALS3 eller CD68 for makrofager). Uttrykket av disse markørene er imidlertid ikke strengt begrenset til en enkelt celle type i aterosklerotisk lesjoner på grunn av plastisitet av flere overleveringslinjer inkludert SMC, endotelceller og myeloide celler12. Spesielt var entydig identifikasjon av SMC innen aterosklerotisk lesjon praktisk talt umulig inntil det siste tiåret på grunn av for disse cellene til dedifferentiate og undertrykke deres slektslinje kundespesifikk markør gener (en prosess kalt fenotypiske bytte) i skadet eller syke fartøy13. Denne begrensningen i SMC identifikasjon har vært circumvented ved utviklingen av avstamning sporing7,14,15,16,17,18, 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. består av permanent merking SMC og deres avkom å spore deres skjebne og fenotypiske utviklingen under aterosklerose progresjon ved hjelp av en kombinasjon av uttrykk for grobunn recombinase drevet av SMC-spesifikke arrangører (dvs. Myh117,15,17,18,19,20,21,22,23 , 24, Acta225,26 og SM22α14,16) og aktivering av journalister (f.eks fluorescerende proteiner, β-galactosidase) [gjennomgått i Bentzon og Majesky 201827]. I en av de første studiene ansette SMC avstamning sporing utenfor embryogenesis innstilling, Speer et al.14 gitt bevis at SMC kan modulerer deres fenotypen og transdifferentiate til chondrogenic celler under vaskulær forkalkninger ved hjelp av en SM22α grobunn R26R LacZ avstamning sporing modell. Selv om disse studiene banebrytende SMC avstamning sporing, var de delvis tvetydig i at noen gitt ikke-SMC uttrykke SM22α i innstillingen av sykdommen vil merkes med reporteren. Denne begrensningen har blitt forbigått av utvikling og bruk av tamoxifen-induserbart grobunn ERT/LoxP tillater en timelig kontroll av cellen merking. Cellen merking skjer utelukkende i tamoxifen levering og vil være begrenset til cellen uttrykke celle spesifikk arrangøren kjøring Cre ERT uttrykk ved tamoxifen eksponering, unngå sporing av alternative celletyper aktivere grobunn i den innstilling av sykdomsprogresjon. For avstamning sporing av SMC i aterosklerose, tamoxifen-induserbart Myh11- grobunn/ERT2 transgene forbundet med fluorescerende journalister (eYFP7,15,17,18 , 21, mTmG19,25, konfetti20,22,23 for klonal ekspansjon studier) har vist en bemerkelsesverdig effektivitet og spesifisitet i SMC merking og har brukt til skjebnen kart SMC befolkninger i aterosklerotisk lesjoner i studier. Viktigere, disse studiene avslørte at: 1) 80% av SMC innen avansert aterosklerotisk lesjoner gjør ikke uttrykker alle konvensjonelle SMC markører (ACTA2, MYH11) i immunohistological analyse og derfor ville ha vært feilidentifisert uten avstamning sporing 17; 2) delsett av SMC express markører alternative celletyper inkludert macrophage markører eller mesenchymal stamceller markører16,17,19; og 3) SMC investere og fylle aterosklerotisk lesjonen ved oligoclonal ekspansjon og SMC kloner beholde plastisitet overgang til svært ulike befolkningsgrupper20,23. For å oppsummere, er det nå klart at glatte muskelcellene presentere et bemerkelsesverdig fenotypiske mangfold i aterosklerotisk lesjoner og kan ha gunstig eller ødeleggende roller på lesjon patogenesen avhengig av deres fenotypiske overganger. Disse funnene representerer en bemerkelsesverdig ny terapeutiske vei for målretting SMC athero-fremme fenotypiske overganger i sent åreforkalkning.

Her foreslår vi en standardisert protokoll for å analysere sent murine aterosklerotisk lesjoner inkludert systematisk metoder for dyr disseksjon, innebygging, skjæring, flekker og kvantifisering av truncus lesjoner. For å fastslå effekten av Interleukin-1β hemming på SMC skjebne og fenotype, brukte vi SMC avstamning sporing ApoE- / - mus matet en vestlig kosthold for 18 uker før ukentlige injeksjoner av en anti-IL1β antistoffer eller isotype-matchet IgG kontroll.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Avl, håndtering og prosedyrer ble godkjent av University of Virginia og University of Pittsburgh institusjonelle dyr omsorg og bruk komiteen.

1. generasjon SMC avstamning sporing mus

  1. Rase Myh11- grobunn/ERT2 menn28 (Jackson laboratorium, #019079) med R26R-EYFP kvinner (Jackson laboratorium, #006148) for å få Myh11- grobunn/ERT2+ R26R-EYFP/ + menn.
  2. Rase Myh11- grobunn/ERT2+ R26R-EYFP/ + menn med ApoE- / - kvinnelige mus (Jackson laboratorium, #002052). Krysse avkommet og velg genotyperingteknologi Myh11- grobunn/ERT2+ R26R-EYFP/ + ApoE- / - mann og R26R-EYFP/ + ApoE- / - kvinnelige musene som endelig oppdrettere. Klipp halen og utføre genotyperingteknologi på littermates. Alle mannlige mus skal Myh11- grobunn/ERT2+ R26R-EYFP/ + ApoE- / - og kan brukes som eksperimentelle mus (figur 1A).
    Merk: Genotyperingteknologi protokoller finner på webområdet Jackson laboratorium. Myh11 grobunn/ERT2 transgene ligger på Y-kromosom, slik at bruk av kvinner. Andre avstamning sporing systemer kan brukes, men dette systemet er hittil mest pålitelige avstamning sporing strategien til skjebnen kart SMC i åreforkalkning.

2. glatt muskel celle avstamning-sporing musen kosthold og behandlinger

  1. Har mannlige Myh11- grobunn/ERT2+ R26R-EYFP/ + ApoE- / - mus mottar en rekke 1 mg tamoxifen injeksjoner fra seks å åtte ukens av alderen å merke permanent Myh11+ SMC YFP og spore deres skjebne (figur 1 A).
    1. Varme peanøttolje på 55 ° C.
    2. Legge til tamoxifen i forvarmet peanøttolje å forberede en løsning på 10 mg/mL og ruge ved 55 ° C til komplett oppløsning av tamoxifen.
    3. Utføre en intraperitoneal injeksjon med 0,1 mL 10 mg/mL tamoxifen løsning for en serie med ti injeksjoner over to uker.
      Merk: Tamoxifen er en biohazard og må håndteres med forsiktighet.
  2. Fem til sju dager etter siste injeksjon med tamoxifen, erstatte chow diett med fettrikt kosthold (f.eks vestlig kosthold, 42% kcal fra fett, 0,2% total kolesterol) for en varighet på 18 uker å tillate utviklingen av avanserte aterosklerotisk lesjoner, som konsekvent utvikler i flere vaskulær senger inkludert aortabuen, aorta roten, truncus og abdominal aorta.
  3. 18 uker fettrikt kosthold fôring, begynn terapeutisk intervensjon for inn ønsket varighet (figur 1B).
    Merk: Som et eksempel, vi spilte ukentlig intraperitoneal injeksjoner med et anti-IL1β antistoff eller en isotype-matchet IgG kontroll mellom 18 og 26 uker høy fett diett.
  4. Fjerne mat til rask mus 8 til 16 h før vev høsting for å utføre nøyaktige målinger for plasma kolesterol og triglyserider.

3. høsting av truncus brachiocephalicus (BCA)

  1. Dyr euthanasia bør følge Animal Care og bruk Committee (ACUC) krav og forskrifter. Euthanize eksperimentelle musene av CO2 kvelning i approximatively 5 minutter og bekrefte døden ved toe knipe.
  2. Veie musen og samle blod.
    1. Veie musen
    2. Spray på ventral side av musen med 70% etanol
    3. Utføre cardiac punktering ved å sette inn en 25G nål koblet til en 1 mL sprøyte i ventrikkel fra venstre side av brystet hulrom. 0,1 til 1 mL blod kan samles.
    4. Overføre blodet til en EDTA vakuumrør ved flushing sprøyten og sett røret på en rocker eller rotator i 10-15 min.
    5. Overføre blod til en 1,5 mL rør og sentrifuge for 10 minutter 250 x g på 4 ° C. Nøye trekke den beste plasma fasen med en pipette og tilstrekkelig tips, og overføre til en ny tube. Lagre på 20 ° C før måling av kolesterol og triglyserider.
      Merk: fullblod kan brukes for ytterligere studier inkludert blod celletall og andre blod komponenter inkludert cytokiner eller immun celle profilering.
  3. Gjør en snitt approximatively 2 cm i huden på midten av magen ved hjelp av saks og huden å avsløre bukhulen. Kuttet peritoneum til sternum uten skade vev. Gjøre to kutt på midten av aksillær linjen gjennom thorax, være forsiktig med å skade hjertet og lungene.
  4. Løft sternum med pinsett og kuttet membranen å delvis avsløre hjertet. Hvis hjertet ikke er lett tilgjengelig, kuttet bort brystkasse nok å nå riktig atriet.
  5. Perfuse musen med tyngdekraften perfusjon system (figur 2A). Installere tyngdekraften perfusjon systemet slik at trykket av perfusjon væsken tilsvarer gjennomsnittlig murine blodtrykk (figur 2B). Dette systemet gir konsekvent perfusjon og begge holder fartøyet morfologi og flush røde blodceller.
    Merk: Som referanse, C57Bl6 mus har en fysiologiske blodtrykk mellom 120 mmHg (gjennomsnittlig systolisk blodtrykk) og 70 mmHg (gjennomsnittlig diastolisk blodtrykk)29,30. Gjennomsnittlig systolisk og diastolisk blodtrykk kan variere med musen genetisk bakgrunn.
    1. Koble en 23 eller 25G sommerfugl nål tyngdekraften perfusjon systemet og kjøre fosfat-bufret saltvann (PBS) gjennom nålen å utvise luften fra rørene. Sett inn nålen i venstre ventrikkel og sikre nålen i stedet. Bruker iris saks, lag et lite innsnitt (< 2 mm) til høyre atriet eller stigende aorta.
    2. Perfuse med 5 mL PBS, deretter 10 mL av 4% Paraformaldehyde (PFA) løsning, deretter 5 mL av PBS. Bruk både PBS og 4% PFA løsningen ved omgivelsestemperatur.
    3. Samle vev av interesse (f.eks lever, lunge, milt) og plassere dem i 4% PFA løsningen.
  6. Utsette BCA
    1. Rengjør nakke-området ved å fjerne huden og spyttkjertler.
    2. Utføre en hugge midtlinjen av sternum gjennom manubrium ved hjelp av saks. Vær forsiktig at saksen bo nær baksiden av sternum å unngå å skade blodkar ligger tett under sternum. Trekk begge sider av brystkasse med tang å fullt ut åpne brystet hulrom. Carotis skal delvis synlige.
    3. Rydde opp ved å trekke muskler og bindevev og fjerne fett med fine pinsett til høyre carotis, arteria truncus subclavian bifurkasjonen aortabuen renset og er isolert av bindevev og fett (figur 2C).
  7. Fjerne BCA
    1. Ved hjelp av pinsett, fange høyre carotis under sin bifurkasjonen og foreta en første kutt over tang (figur 2D).
    2. Fortsatt holder carotis, gjør en andre klippe gjennom arteria subclavia. De siste to kuttene er gjennom aortabuen, på hver side av brachicephalica (figur 2D).
    3. Samle andre vaskulær vev av interesse (f.eks abdominal aorta, overlegen delen av hjertet som inneholder aorta roten).
    4. Plass BCA og andre vev i 4% PFA løsning over natten i romtemperatur.
      Merk: Fiksering tiden burde være holdt konsekvent gjennom hele studiet.

4. vev behandling og snitting

  1. Fjern vev fra 4% PFA og sted i en merket vev kassett (Figur 3A). Bruk skum puter i kassetten for å sikre vevet beholde sin retning og forblir i kassetten til det behandling (Figur 3B). Lukk kassettene og dyppe i 70% etanol til vev behandling (24 til 72 h).
    1. Behandle BCA og andre vev samlet histologiske og immunofluorescent flekker som følger (eksempel på rutinemessig overnatting prosedyre med en prosessor med vakuum penetrasjon): 10% nøytrale fullbufrede formalin i 30 min ved omgivelsestemperatur (2 x), 75% etanol for 60 min på 30 ° C (1 x), 90% etanol for 60 min på 30 ° C (1 x), 95% etanol for 60 min på 30 ° C (1 x), 100% etanol for 60 min på 30 ° C (3 x), xylen for 60 min på 30 ° C (3 x) og parafin voks for 80 min. ved 62 ° C (3 x).
  2. Legge BCA vertikalt, med aortabuen nærmest blokk ansiktet (Figur 3C).
  3. Skjære gjennom parafin blokken på en roterende mikrotom (10 µm tykkelse) fram den innebygde vev.
  4. Når vev er synlig, undersøke en inndeling under et mikroskop for å fastslå posisjon. Hvis aortabuen er fortsatt synlig, Fjern opptil 10 µm deler om gangen, undersøker en inndeling ved hvert intervall.
  5. Når aortabuen har blitt delt gjennom og arteria truncus vises, justere retningen på blokken plassere vevet helt vinkelrett på mikrotomen bladet.
  6. Klipp av BCA en snittykkelse på 10 µm. På dette punktet, er alle inndelinger samlet serielt med tre deler per lysbilde. Samle fram subclavian bifurkasjonen (Figur 3D).
    Merk: Det er viktig å kutte BCA på en snittykkelse på 10 µm for påfølgende z stabel AC confocal image vinningen og enkelt celle teller. Denne tykkelsen tillater streng og ikke-cofounding vurdering av tilknytningen mellom en enkelt kjerne og cytoplasmatiske eller membran farging om dybden på tverrprofilen.

5. immunofluorescent flekker

Merk: Komplett karakteristikk av aterosklerotisk lesjoner inkluderer vurdering av morfologiske parametere og indeksene av plakk stabilitet eller ustabilitet og mobilnettet sammensetning som ikke vil være fokus for den nåværende protokollen. Lesjonen morfologi, kollagen innhold og intraplaque blødning kan analyseres av Movat7,17, PicroSirius Red 7,31, Ter119 flekker 7,18, henholdsvis. Her vil vi beskrive protokollen for å analysere mobilnettet sammensetningen av lesjoner.

  1. Inkuber lysbildene i følgende løsninger i romtemperatur under kjemiske hette: xylen for 5 min (2 x), 100% etanol i 5 min (2 x), 95% etanol i 5 min (2 x), 70% etanol for 5 min (2 x) og deionisert H2O (di2O) i 5 min (2 x).
  2. Inkuber lysbilder i antigen henting løsning i henhold til produsentens instruksjoner.
    1. Med sitronsyre basert antigen avsløre løsning (se Tabell for materiale), fortynne 3 mL løsning i 320 mL di2O. sted lysbildene i en flekker reservoaret og fyll til toppen med forberedt antigen henting løsning.
    2. Fylle tomme plasser i objektglasstativet med tomme lysbilder å sikre selv oppvarming. Dekk beholderen med lokk for å tillate antigen henting løsningen å koke uten fordampning.
    3. Varme lysbildene i en mikrobølgeovn for 20 min på ca 675-700 watt. Sjekk neddykket lysbilder regelmessig og erstatt fordampet væske med di2O slik at delene være i avsløre løsning til alle tider.
    4. Tillate lysbilder avkjølt i løsning 1 h ved romtemperatur.
  3. Oppløse 6 g fisk huden Gelatin (FSG) i 1 L PBS. PBS/FSG er brukt som vask buffer. Forberede en blokkering løsning av 10% normal serum i PBS/FSG.
    Merk: Fisk huden Gelatin brukes i utarbeidelsen av blokkering bufferen. FSG inneholder ikke serumproteiner som kan cross-react med pattedyr antistoffer, minimere bakgrunnsstøy. Men være andre blokkerer alternativet foretrukket med biotin oppdagingssystemer som FSG inneholder endogene biotin. Typen normal serum brukes er basert på det sekundære antistoffet brukes. Når esel sekundære antistoffer brukes, bør normal hest serum velges for blokkering og antistoff fortynninger.
  4. Inkuber lysbilder i PBS for 5 min ved romtemperatur. Sirkel vev deler med en hydrofobe penn. Dekk avsnittene med blokkering bufferen PBS/FSG/normal serum 1t ved romtemperatur. Forberede den primære antistoff løsningen i PBS/FSG/normal serum under dette trinnet mens vev blokkerer.
  5. Inkuber med primære antistoffer fortynnet i PBS/FSG/normal serum overnatting på 4 ° C i en fuktighet kammer. En del per lysbilde skal være inkubert med en blanding av IgG kontroll antistoffer i samme konsentrasjonen som de primære Antistoffene mot kontroll for primære antistoff spesifisitet.
  6. Vask lysbildene som følger ved romtemperatur: PBS/FSG i 5 min (3 x), deretter PBS i 5 min (1 x).
  7. Inkuber med fluorophore-konjugerte sekundære antistoffer (se Tabell for materiale) og diamidino-2-phenylindole (DAPI) for kjernen counterstaining fortynnet i PBS/FSG/normal serum 1t ved romtemperatur. Beskytte lysbilder fra lys.
  8. Vask lysbilder som beskrevet i trinn 5.6.
  9. Montere lysbilder ved hjelp av monterer medier egnet til fluorescens (se Tabell for materiale).

6. AC confocal mikroskopi

Merk: Bruk av en AC confocal mikroskop og z-stack oppkjøp er avgjørende for enkeltceller teller.

  1. Angi oppkjøpet parametere brukes gjennom hele studiet: bilde oppløsning (1024 x 1024 eller 2048 x 2048 piksler); Optiske banen og antall kanaler, som er en funksjon av kombinasjonen av sekundær antistoffer merket. skannehastighet (anbefalt skannehastighet: 7-8); og differensial forstyrrelser kontrast (DIC) kanal.
  2. Bruke deler med den primære antistoffer og IgG kontroll, angi detektor følsomhet, laser makt og forskyvning for hver enkelt kanal. Kontrollen IgG brukes til å minimere bakgrunn signalet.
  3. Angi øvre og nedre stillingene for z-stack oppkjøpet. Forhåndsbestemme tykkelse og antall stakker å erverve. Parameterne skal være konsekvent gjennom hele studiet.
    Merk: Vi anbefaler tenkelig 8 til 10 stabler av 1 µm tykkelse. Være konsekvent i antall stakker avbildet gjennom hele studiet.
  4. Vev bildedeler farget med primære antistoffer og IgG kontroll for alle kanaler inkludert DIC.
  5. Merk minst ett bilde med en skala bar for bildet kalibrering under enkeltcelle teller.

7. enkeltcelle teller

  1. Installer og åpne ImageJ. Eventuelt laste ned Plugins i delen Last ned > Input/Output av ImageJ nettsted å åpne bildefilen generert avhengig av formatet for bildene genereres av AC confocal mikroskop.
  2. Åpne bildefilen i ImageJ.
  3. Kalibrere bildet med referanse skala bar bruke bildet generert i 6.6.
  4. Avgrense regionen rundt der enkeltcelle telle utføres med DIC kanalen (Figur 4).
    Merk: En region kan angis samtidig. Avhengig av eksperimentelle spørsmål, enkeltcelle teller kan utføres innen hele leksjonen (se 7.3.1) og/eller i en sublocation av lesjonen. For eksempel er undersøkelse av området fibrøs cap (se 7.3.2) spesielt relevant siden komposisjonen mobilnettet er en viktig indeks på lesjon tilbøyelighet til å sprekke.
    1. Avgrense lesjon området ved å følge lumen grensen (Figur 4A, hvite pilene) og den interne elastisk lamina (Figur 4A, gule piler) synlig på DIC bildet.
    2. For analyse av området fibrøs cap, bestemmer grensen fjernt på 30 µm fra lumen og spore rammen ( Figur 4B-D).
      Merk: Fibrøs cap området er klassisk definert som regionen beriket i ACTA2 + celler og kollagen underlaying lumen (Figur 4B). Anriking i ACTA2 + celler og kollagen spiller en avgjørende rolle i lesjon stabilitet. Tidligere studier har fastslått at ACTA2 + celle rik fibrøs cap området gjennomsnitt tykkelse på 30 µm fra lumen i SMC-slekten sporing ApoE- / - mus matet en høy-fett diett for 18 til 26 uker (Figur 4C). Dermed er grundig karakteristikk av virkningene av genetisk manipulasjon eller farmakologisk behandling på fibrøs cap området mobilnettet sammensetningen bemerkelsesverdig relevant.
  5. Åpne Kanaler verktøypanelet (bilde > farge > kanal verktøy) og pseudo farge forskjellig flekker kanaler (figur 5et, boks 1).
  6. Flette fargekanalene (bilde > farge > flette farger) (figur 5et, boks 2). Alle kanaler skal vises på det samme bildet (figur 5B). Aktivere og deaktivere enkelte fargekanalene i Kanalen verktøy -panelet (figur 5et, boks 1).
  7. Definere verktøyet telling.
    1. Høyreklikk på ikonet Counting på verktøylinjen (figur 5C, boks 1) og velg Flere punkter.
    2. Dobbeltklikk på det samme ikonet å åpne Punkt-verktøyet -panelet (figur 5C, boks 2).
    3. Velg typen og størrelsen av elementene som brukes til å telle celler.
    4. Sjekk Vis alle.
  8. Slå på DAPI kanal bare i Kanalen verktøy -panelet, og velg Counter kanalen 0 (figur 5C, boks 3). Klikk på individuelle atomkjerner som vil bli merket (f.eks gule prikker i figur 5C-D). Bla z-stabler telle alle atomkjerner beiset i regionen rundt. Antall hendelser som angis under counter kanalen i Punkt-verktøyet -panelet (figur 5C, boks 4).
  9. Slå på en annen flekker kanal (f.eks eYFP flekker). Velg en Counter kanal 1. Klikk celler der det er en colocalization mellom DAPI og flekker. For cytoplasma flekker, Velg celler for med flekker omgir kjernen på hele dybden av kjernen (se flere z-stabler).
  10. Gjenta ved å endre flekker kombinasjoner og velge ny Counter kanaler telle celle populasjoner av interesse. Alle dot farge representerer en annen celle befolkningen (figur 5D). Resultatene kan uttrykkes som antall celler til totalt antall DAPI eller antall celler til regionen området.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Myh11- grobunn/ERT2 R26R-EYFP Apoe- / - musene ble injisert med tamoxifen mellom seks og åtte ukens av alderen før matet en høy fett diett. 18 uker høy fett diett fôring, ble to grupper av åtte mus behandlet ukentlig med en musen monoklonale anti-IL-1β antistoffer eller en isotype-matchet IgG kontroll ved 10 mg/kg for 8 uker (figur 1)7. Mus ble ofret og parfyme med en 4% PFA-PBS løsning. Truncus arterier ble dissekert, behandlet og delt som beskrevet ovenfor (figur 2 og Figur 3).

Etter immunofluorescent farging med antistoffer rettet mot avstamning sporing reporter (YFP) og fenotypiske markører (ACTA2, LGALS3, RUNX2), en tykkelse på 8-10 µm for BCA tverrsnitt ble avbildet med AC confocal mikroskop. Bilder av hver individuelle flekker, DAPI (kjernefysisk farging) og DIC ble anskaffet. Avgrensning av regioner av interesse for enkeltcelle teller (lesjon, fibrøs cap) ble utført ved hjelp av DIC bilder (Figur 4). Enkelt celle teller for å finne ut av ulike SMC-avledet befolkningsgrupper ble utført ImageJ (figur 5).

Vi presenterer to representative immunofluorescent flekker og enkelt teller vurdere effekten av IL-1β hemming på mobilnettet komposisjon i avansert aterosklerotisk lesjoner. Først flekker ble gjort for SMC avstamning sporing reporteren YFP og SMC markøren ACTA2 macrophage markøren LGALS3 i tverrsnitt på to ulike steder for BCA (480 µm og 780 µm fra aortabuen) (figur 6). Enkelt celle telling analyse i regionen fibrøs cap i disse tverrsnitt ble utført, og bemerkelsesverdige forskjeller ble funnet i mobilnettet sammensetningen av fibrøst cap området mellom mus behandlet med anti-IL-1β antistoffer og mus behandlet med den isotype-matchet IgG kontroll (figur 6en). Hemming av IL-1β var forbundet med en nedgang i YFP + SMC og en økning i LGALS3 + celler (figur 6B). Om av fenotyper SMC befolkninger, en nedgang i antallet YFP + ACTA2 + SMC ble observert, mens den relative antallet SMC-avledet makrofager (YFP + LGALS3 +) ble betydelig økt på plasseringene BCA (figur 6C).

Til slutt, vi undersøkt effekten av IL-1β hemming på SMC fenotypiske overgangen i chondrogenic celler. Denne fenotypiske overgangen er en viktig driver av vaskulær forkalkninger, hovedfunksjon for sent aterosklerose14,32,33. BCA tverrsnitt var farget for SMC avstamning sporing reporteren YFP, den osteochondrogenic markøren RUNX2 og macrophage markøren LGALS3 (figur 7et). Overflod og opprinnelsen til RUNX2 + chondrogenic cellene var preget innen leksjonen i våre to eksperimentell grupper. Vi fant at hemming av IL-1β ikke innvirkning på det samlede antallet RUNX2 + celler innenfor lesjonen eller andelen SMC-avledet (YFP + RUNX2 +) og macrophage-avledet (YFP-LGALS3 + RUNX2 +) chondrogenic celler (figur 7B).

Figure 1
Figur 1 : Intervensjon studier i glatt muskel celle avstamning sporing mus. (A) skjematisk fremstilling av Myh11- grobunn/ERT2 R26R-EYFP Apoe- / - tamoxifen-induserbart SMC bestemt avstamning sporing musemodell. Behandling med tamoxifen induserer rekombinasjon av R26R-YFP locus og excision av en STOP codon og faste uttrykk for YFP av SMC. (B) skjematisk intervensjon studier i som Myh11- grobunn/ERT2 R26R-EYFP Apoe- / - mus matet en vestlig kosthold for 18 uker ble injisert ukentlig med IL-1β antistoffer eller en isotype-matchet IgG kontroll antistoff i en konsentrasjon av 10 mg / kg i 8 uker. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Truncus disseksjon. (A) skjematisk av en tyngdekraft drevet perfusjon system. Systemet er satt opp på en nøyaktig høyde slik at perfusjon ved trykk nær gjennomsnittlig systolisk blodtrykk i mus. Trykket varierer litt med volum høyde som flytende brukes under perfusjon mellom høyde h1 og h2. (B) formel for beregning av presset av statisk væsker og fastsetting av høyden til et trykk av perfusjon lik C57Bl6 musen gjennomsnittlig systolisk blodtrykk. (C) bilder av den proksimale del av aorta og forgrening arteries i C57Bl6 mus matet en chow diett (venstre bilde) og Apoe- / - mus matet en høy fett diett i 26 uker (høyre bilde). Stjernen angir at aterosklerotisk lesjoner. (D) skjematisk oversikt over den proksimale del av aorta og forgrening arterier. Røde piler representerer kutt for isolering av høyre carotis og truncus isolasjon og tall angir rekkefølgen på kutt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Vev behandling, innebygging og snitting. (A) fotografi av en innebygging kassett med BCA vev. BCA er plassert på en skum pute. (B) zoome inn for BCA plassert på skum puten. BCA er orientert med aortabuen nær etiketten delen av kassetten og carotis rettet loddrett. Skala bar: 1 cm. (C) skjematisk av parafin blokkere etter innebygging av arteria truncus. (D) skjematisk av føljetong lysbilder med 10 µm tykke føljetong seksjoner med angivelse av avstanden fra aortabuen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Avgrensning av det aterosklerotisk lesjon og fibrøs cap. (A) Representative micrographs av DIC bilde aterosklerotisk lesjon i truncus tverrsnitt fra Myh11- grobunn/ERT2 R26R-EYFP Apoe- / -. Den luminal og interne elastisk lamina kantlinjene er lokalisert av hvite og gule piler, henholdsvis (venstre panel). Lesjonen området er preget av en stiplet linje (høyre panel) skala bar: 100 µm. (B) representant micrographs DIC og ACTA2 flekker. Dobbel-head pilene viser tykkelsen på ACTA2 flekker i området underlaying lumen definere området fibrøs cap. (C) kvantifisering av subluminal ACTA2+ tykkelse i Myh11- grobunn/ERT2 R26R-EYFP Apoe- / - matet en høy-fett diett for 18, 21 og 26 uker. Bruker denne stammen av mus, har fibrøs cap en gjennomsnittlig tykkelse på 25-30 µm forhånd aterosklerotisk lesjoner. Resultatene er uttrykt som gjennomsnittlig ± SEM. (D) avgrensning av en fast 30 µm tykt fibrøst cap område for enkeltcelle opptelling. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Enkelt celle teller bruker ImageJ. Skjermdumper illustrerer viktige trinn av enkelt celle regner med ImageJ bilder av AC confocal mikroskopi. (A) hvert individuelle flekker kanal og personlige z stabel er synlige ved å bla c: og z: barer på bunnen av bildet. Beising kanaler er pseudo farget i kanal-panelet (1) Beising kanaler (YFP, LGALS3, ACTA2, DAPI for kjernefysisk flekker og DIC) flettes med flettingen kanal-panelet (2). (B) resultater av sammenslåing for YFP, LGALS3, ACTA2, DAPI og DIC. (C) kjernen teller basert på DAPI flekker med opptelling ikonet (1) og punkt-verktøyet-panelet (2). En annen skranke kanal brukes til hver celle befolkningen (3). Antall hendelser som telles angis under counter kanalen (4). Hvitt rektangel: regionen forstørret til høyre. (D) representativt bilde av enkeltcelle teller innen fibrøs cap (stiplet linje) for flere celle populasjoner inkludert DAPI (gule prikker), YFP+ celler (magenta prikker), YFP-LGALS3+ celler (cyan prikker), YFP+LGALS3+ celler (oransje prikker), YFP+ACTA2+ celler (grønne prikker) og YFP-ACTA2+ celler (mørk blå prikker). Hvitt rektangel: regionen forstørret til høyre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 : Karakteristikk av virkningen av IL-1β hemming på mobilnettet sammensetningen av området fibrøs cap på to forskjellige BCA steder av SMC avstamning sporing Apoe/mus. (A) BCA tverrsnitt på 480 µm og 780 µm fra aortabuen fra mus behandlet med IL-1β antistoffer eller kontrollen IgG som vist i figur 1 var farget for YFP, LGALS3, og DAPI (kjernefysisk farging) og delen ble avbildet av DIC. Immunofluorescent kanaler ble flettet (nederste høyre panel). De stiplede linjene avgrense regionene fibrøs cap. Skalere barer: 100 µm. (B) enkeltcelle teller avslører at hemming av IL-1β er forbundet med en betydelig reduksjon i YFP+ celler og en økning i LGALS3+ celler i området fibrøs cap. C) i YFP+ celle befolkningen, en nedgang i YFP+ACTA2+ og en økning i YFP+LGALS3+ populasjoner er observert. Resultatene er uttrykt som gjennomsnittlig ± SEM. statistisk analyse: unpaired flere t-test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7 : Effekten av IL-1β hemming på antall RUNX2 + chondrogenic celler med avansert aterosklerotisk lesjoner. A) BCA tverrsnitt er farget for YFP, LGALS3, RUNX2 og DAPI (kjernefysisk farging), og alle kanaler ble slått sammen (nedre paneler). De stiplede linjene avgrense lesjon området. Skalere barer: 100 µm. B) enkeltcelle teller viser at hemming av IL-1β ikke påvirker antall RUNX2+ celler i lesjonen eller andelen RUNX2+ celler fra SMC opprinnelse (YFP+RUNX2+; YFP+LGALS3+RUNX2+) og myelogen opprinnelse (YFP-LGALS3+RUNX2+). Resultatene er uttrykt som mener SEM. statistisk analyse: Unpaired flere t-test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Til tross for tiår med forskning og tekniske fremskritt i å studere aterosklerose, har feltet en skuffende historie oversette vitenskapelige funn til klinisk behandling34,35. Dette fenomenet kan delvis forklares med avvik i dyremodeller og eksperimentell design lesjon analyser. Her beskriver vi en eksperimentell rørledningen som vi pleide å analysere mobilnettet sammensetningen i avansert aterosklerotisk lesjoner bruker avstamning sporing mus7. Denne metoden gir en grundig undersøkelse av cellen skjebne kartlegging og phenotyping, som er viktige parametre styres av potensielle mekanismer på spill i avansert aterosklerotisk lesjoner.

SMC-lineage sporing musemodell er et kraftig verktøy for å nøyaktig spore skjebne og fenotypiske modulasjoner denne linjen og deres bidrag til åreforkalkning patogenesen. Tamoxifen-induserbart grobunn-loxP systemet kan merking av modne vaskulær SMC uttrykke MYH11 før oppstart av aterosklerose. Overbevisende bevis med dette systemet har vist at aterosklerotisk plaketter er svært plast og vaskulær SMC kan gjennomgå fenotypiske bytte, å miste sin kontraktile fenotypen og SMC-spesifikke markører, voksende, overføre, og selv transdifferentiating i macrophage som cellene17,18. I stede protokollen, viser vi hvordan avstamning-sporing gjenkjenning og immunofluorescent flekker for markører rundt kan integreres for å nøyaktig fastslå fenotypiske overganger av SMC og deres relative hyppigheten blant andre SMC populasjoner.

Denne metoden er svært utfyllende med andre analyser i feltet. Først er vurdering av aterosklerotisk lesjon byrden av no ansikt aorta forberedelser kombinert med lipid farging av Sudan IV mye brukt på grunn av sin brukervennlighet og hastighet. Dette er imidlertid et utilstrekkelig mål morfologiske nøkkelparameterne som lesjon størrelse, lumen størrelse og fartøy remodeling. Farging av no aorta forberedelse av Sudan IV å visualisere lipid deponering kan brukes å kvantifisere relative lesjon område i aorta, men det kan gi inkonsekvent farging av lesjoner, som bare nøytrale lipid komponenten er visualisert mens områdene okkupert av andre bestanddeler, som ekstracellulær matrix, er vanligvis forsømt8. Videre no ansikt flekker kan ikke informere om lesjon morfologi og ikke kan skille mellom fet striper og avanserte lesjoner. Fartøyet morfologi er en viktig parameter brukt for å evaluere aterosklerose scenen og ruptur risiko, herunder lesjon størrelse, lumen diameter, fartøy remodeling7,36,37. Disse analysene krever bevaring av fartøyet morfologi for riktig kvantifisering. Viktigere, overlappe protokoller for etterforskning av morfologiske sterkt med protokollen finnesher. Spesielt stoler de på bruk av et gravitasjon-drevet vaskulær perfusjon system for PBS og etappe, den stabiliserende perfusjon å gi mer konsekvent stort trykk som brukes. Gravitasjon-drevet infiltrasjon systemet garanterer en konstant flyt hastighet og trykket mellom hver uavhengige musen og hindrer uten manuell kraft-drevet perfusjon mellom uavhengige eksperimenter eller forskere. Tyngdekraften perfusjon systemet bør settes opp for å indusere perfusjon ved trykk nær gjennomsnittlig murine blodtrykk (70-120 mmHg). Andre gitt vi en standardisert og systematisk metode for innebygging og snitting for brachicephalica. Ved å definere startwebstedet snitting og kvantifisere lesjon området på flere steder i truncus brachiocephalicus, kan vi begrense tilfeldig variasjonen som kommer med begrenset utvalg.

Flowcytometri er en annen teknikk svært utfyllende med immunofluorescent flekker kombinert med enkeltcelle teller som har vært mye brukt i kvantifisere celle populasjoner i aterosklerotisk lesjoner38. Det består av fordøyelsen av musen aorta og merking av utgitt cellene med fluorescerende antistoffer. Flowcytometri tilbyr en kvantitativ analyse av mobilnettet befolkningen i aorta. Men som alle teknologier har flowcytometri begrensninger. Til tross for tydelig fordel av passende et stort utvalg av samtidige markører, det er en fullstendig tap av romlig oppløsning, og det blir uklart om en celle befolkningen er beriket fibrøs cap eller nekrose kjernen. I tillegg er det en risiko for fortynning effekt siden flowcytometri krever et stort antall celler og ofte fokuserer ikke bare på aterosklerotisk områder. Derfor, immunofluorescence og flowcytometri kan brukes på en utfyllende måte for både høy dimensjonal profilering og lesjon lokalisering.

Til slutt, protokollen er fokusert på kvantifisering av SMC populasjoner i BCA avansert lesjon bruker paraformaldehyde-fast og parafin-embedded vev deler. Denne protokollen kan imidlertid brukes til å undersøke andre vaskulær senger inkludert aorta roten eller abdominal aorta, to vaskulære territorier underlagt aterosklerose utvikling. Systematisk behandling og snitting av aorta roten har vært godt beskrevet tidligere8,39. Som åreforkalkning utvikler seg på forskjellige steder og at genetisk manipulasjon eller terapeutisk intervensjon kan ikke-homogenously påvirke disse nettstedene21, er det viktig å undersøke så mange vaskulær senger som mulig å trekke riktig konklusjon. Immunofluorescent flekker og enkelt celle teller kan også utføres med frosne snitt. Dette kan være nødvendig på grunn av inkompatibilitet antistoffer med parafinsnitt. Selv om dyr perfusjon og vev innebygging skiller seg fra denne protokollen, kan etterforskere følge resten av eksperimentelle prosedyrene som er beskrevet her.

Avslutningsvis beskrevet teknikker her disposisjon en systematisk tilnærming til å analysere lesjon celle populasjoner og fenotyper i sent murine åreforkalkning. Denne protokollen kan tjene som en mal for å undersøke lesjon bestander av immunofluorescent flekker i alle typer eksperimentell design inkludert tidlig og sent aterosklerose, samt forebygging og intervensjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi takker senter for biologisk Imaging (støttet av NIH 1S10OD019973-01) ved University of Pittsburgh for deres hjelp. Dette arbeidet ble støttet av støttes av vitenskapelige Development Grant 15SDG25860021 fra American Heart Association til D.G. R.A.B. ble støttet av NIH gi F30 HL136188.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% Paraformaldehyde aqueous solution Electron Microscopy Sciences RT 15710 Tissue perfusion and fixation
23G butterfly needle Fisher BD367342
25G needle Fisher 14-821-13D 
A1 Confocal microscope Nikon Confocal microscope
ACTA2-FITC antibody (mouse) Sigma Aldrich F3777 Primary Antibody
Alexa-647 anti goat Invitrogen A-21447 Secondary antibody
Antigen Unmasking solution, Citric acid based Vector Labs H-3300 Antigen retrieval solution
Chow Diet Harlan Teklad TD.7012
Coverslip Fisher 12-544-14 Any 50 x 24 mm cover glass
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen D1306 Nucleus fluorescent counterstaining
Donkey Alexa-488 anti-rabbit Invitrogen A-21206 Secondary antibody
Donkey Alexa-555 anti-rat Abcam ab150154 Secondary antibody
DPBS 10X without Calcium and Magnesium Gibco 14200166 PBS for solution dilutions and washes. Dilute to 1x in deionized water
Embedding cassette Fisher 15-182-701D
ETDA vacuum tube Fisher 02-685-2B
Ethanol 200 proof Decon 2701
Foam pad Fisher 22-222-012
Gelatin from cold water fish skin Sigma Aldrich G7765
GFP antibody (goat) abcam ab6673 Primary antibody
goat IgG control Vector Labs I-5000 IgG control
High Fat Diet Harlan Teklad TD.88137
ImageJ NIH Computer program https://imagej.nih.gov/ij/ 
LGALS3 antibody (rat) Cedarlane CL8942AP Primary antibody
LSM700 confocal microscope Zeiss Confocal microscope
Microscope Slides, Superfrost Plus Fisher 12-550-15
Microtome blades Fisher 30-538-35
Mouse IgG control Vector Labs I-2000 IgG control
NIS element imaging software Nikon Imaging software for z-stack image acquisition
Normal Horse serum Sigma Aldrich H1270
Pap Pen Fisher 50-550-221
Peanut oil Sigma P2144
Prolong gold Antifade mountant Invitrogen P36930 Mounting medium 
Rabbit IgG control Vector Labs I-1000 IgG control
Rat IgG control Vector Labs I-4000 IgG control
RUNX2 antibody (rabbit) Abcam ab192256 Primary Antibody
Syringe BD 309628 1 ml syringe
Tamoxifen Sigma T5648
Xylene Fisher X55K-4
Zen imaging software Zeiss Imaging software for z-stack image acquisition

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. GBD DALYs and HALE Collaborators. Global, regional, and national disability-adjusted life-years (DALYs) for 315 diseases and injuries and healthy life expectancy (HALE), 1990-2015: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2015. Lancet. 388 (10053), 1603-1658 (2016).
  2. Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2018 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 137 (12), 67-92 (2018).
  3. Hay, M., Thomas, D. W., Craighead, J. L., Economides, C., Rosenthal, J. Clinical development success rates for investigational drugs. Nature Biotechnology. 32 (1), 40-51 (2014).
  4. Bhaskar, V., et al. Monoclonal antibodies targeting IL-1 beta reduce biomarkers of atherosclerosis in vitro and inhibit atherosclerotic plaque formation in Apolipoprotein E-deficient mice. Atherosclerosis. 216 (2), 313-320 (2011).
  5. Isoda, K., et al. Lack of interleukin-1 receptor antagonist modulates plaque composition in apolipoprotein E-deficient mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (6), 1068-1073 (2004).
  6. Kirii, H., et al. Lack of interleukin-1beta decreases the severity of atherosclerosis in ApoE-deficient mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 23 (4), 656-660 (2003).
  7. Gomez, D., et al. Interleukin-1β has atheroprotective effects in advanced atherosclerotic lesions of mice. Nature Medicine. 24, 1418-1429 (2018).
  8. Daugherty, A., et al. Recommendation on Design, Execution, and Reporting of Animal Atherosclerosis Studies: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circulation Research. 121 (6), 53-79 (2017).
  9. Baylis, R. A., Gomez, D., Owens, G. K. Shifting the Focus of Preclinical, Murine Atherosclerosis Studies From Prevention to Late-Stage Intervention. Circulation Research. 120 (5), 775-777 (2017).
  10. Kolodgie, F. D., et al. Pathologic assessment of the vulnerable human coronary plaque. Heart. 90 (12), 1385-1391 (2004).
  11. Virmani, R., Kolodgie, F. D., Burke, A. P., Farb, A., Schwartz, S. M. Lessons from sudden coronary death: a comprehensive morphological classification scheme for atherosclerotic lesions. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 20 (5), 1262-1275 (2000).
  12. Gomez, D., Owens, G. K. Smooth muscle cell phenotypic switching in atherosclerosis. Cardiovascular Research. 95 (2), 156-164 (2012).
  13. Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease. Physiological Reviews. 84 (3), 767-801 (2004).
  14. Speer, M. Y., et al. Smooth muscle cells give rise to osteochondrogenic precursors and chondrocytes in calcifying arteries. Circulation Research. 104 (6), 733-741 (2009).
  15. Gomez, D., Shankman, L. S., Nguyen, A. T., Owens, G. K. Detection of histone modifications at specific gene loci in single cells in histological sections. Nature Methods. 10 (2), 171-177 (2013).
  16. Feil, S., et al. Transdifferentiation of vascular smooth muscle cells to macrophage-like cells during atherogenesis. Circulation Research. 115 (7), 662-667 (2014).
  17. Shankman, L. S., et al. KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis. Nature Medicine. 21, 628 (2015).
  18. Cherepanova, O. A., et al. Activation of the pluripotency factor OCT4 in smooth muscle cells is atheroprotective. Nature Medicine. 22, 657 (2016).
  19. Albarran-Juarez, J., Kaur, H., Grimm, M., Offermanns, S., Wettschureck, N. Lineage tracing of cells involved in atherosclerosis. Atherosclerosis. 251, 445-453 (2016).
  20. Chappell, J., et al. Extensive Proliferation of a Subset of Differentiated, yet Plastic, Medial Vascular Smooth Muscle Cells Contributes to Neointimal Formation in Mouse Injury and Atherosclerosis Models. Circulation Research. 119 (12), 1313-1323 (2016).
  21. Newman, A. A., et al. Irradiation abolishes smooth muscle investment into vascular lesions in specific vascular beds. JCI Insight. 3 (15), (2018).
  22. Dobnikar, L., et al. Disease-relevant transcriptional signatures identified in individual smooth muscle cells from healthy mouse vessels. Nature Communications. 9 (1), 4567 (2018).
  23. Misra, A., et al. Integrin beta3 regulates clonality and fate of smooth muscle-derived atherosclerotic plaque cells. Nature Communications. 9 (1), 2073 (2018).
  24. Majesky, M. W., et al. Differentiated Smooth Muscle Cells Generate a Subpopulation of Resident Vascular Progenitor Cells in the Adventitia Regulated by Klf4. Circulation Research. 120 (2), 296-311 (2017).
  25. Herring, B. P., Hoggatt, A. M., Burlak, C., Offermanns, S. Previously differentiated medial vascular smooth muscle cells contribute to neointima formation following vascular injury. Vascular Cell. 6, 21 (2014).
  26. Sheikh, A. Q., Misra, A., Rosas, I. O., Adams, R. H., Greif, D. M. Smooth muscle cell progenitors are primed to muscularize in pulmonary hypertension. Science Translational Medicine. 7 (308), (2015).
  27. Bentzon, J. F., Majesky, M. W. Lineage tracking of origin and fate of smooth muscle cells in atherosclerosis. Cardiovascular Research. 114 (4), 492-500 (2018).
  28. Wirth, A., et al. G12-G13-LARG-mediated signaling in vascular smooth muscle is required for salt-induced hypertension. Nature Medicine. 14 (1), 64-68 (2008).
  29. Mattson, D. L. Comparison of arterial blood pressure in different strains of mice. American Journal of Hypertension. 14 (5), Pt 1 405-408 (2001).
  30. Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D'Alecy, L. G. Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (6), 2408-2415 (2004).
  31. Durgin, B. G., et al. Smooth muscle cell-specific deletion of Col15a1 unexpectedly leads to impaired development of advanced atherosclerotic lesions. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312 (5), 943-958 (2017).
  32. Durham, A. L., Speer, M. Y., Scatena, M., Giachelli, C. M., Shanahan, C. M. Role of smooth muscle cells in vascular calcification: implications in atherosclerosis and arterial stiffness. Cardiovascular Research. 114 (4), 590-600 (2018).
  33. Lin, M. E., et al. Runx2 Deletion in Smooth muscle Cells Inhibits Vascular Osteochondrogenesis and Calcification but not Atherosclerotic Lesion Formation. Cardiovascular Research. , (2016).
  34. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving Bioscience Research Reporting: The ARRIVE Guidelines for Reporting Animal Research. PLoS Biology. 8 (6), 1000412 (2010).
  35. Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).
  36. Nishioka, T., et al. Contribution of inadequate compensatory enlargement to development of human coronary artery stenosis: An in vivo intravascular ultrasound study. Journal of the American College of Cardiology. 27 (7), 1571-1576 (1996).
  37. Pasterkamp, G., et al. Paradoxical Arterial-Wall Shrinkage May Contribute to Luminal Narrowing of Human Atherosclerotic Femoral Arteries. Circulation. 91 (5), 1444-1449 (1995).
  38. Galkina, E., et al. Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent. The Journal of Experimental Medicine. 203 (5), 1273-1282 (2006).
  39. Venegas-Pino, D. E., Banko, N., Khan, M. I., Shi, Y., Werstuck, G. H. Quantitative analysis and characterization of atherosclerotic lesions in the murine aortic sinus. Journal of Visual Experiments. (82), 50933 (2013).

Tags

Medisin problemet 144 atherosclerosis aterosklerotisk lesjon truncus vev forberedelse og skjæring immunohistochemistry immunofluorescence AC confocal mikroskopi
Kvantitativ analyse av mobilnettet komposisjon i avansert aterosklerotisk lesjoner av glatt muskel celle avstamning-Tracing mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mahan, S., Liu, M., Baylis, R. A.,… More

Mahan, S., Liu, M., Baylis, R. A., Gomez, D. Quantitative Analysis of Cellular Composition in Advanced Atherosclerotic Lesions of Smooth Muscle Cell Lineage-Tracing Mice. J. Vis. Exp. (144), e59139, doi:10.3791/59139 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter