Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Kvantitativ analys av cellulära sammansättningen i avancerade aterosklerotiska lesioner av glatt muskulatur Cell härstamning-Tracing möss

Published: February 20, 2019 doi: 10.3791/59139

Summary

Vi föreslår ett standardiserat protokoll för att karakterisera den cellulära sammansättningen av sent stadium murina aterosklerotiska lesioner inklusive systematiska metoder för att animaliskt dissektion, vävnad inbäddning, snittning, färgning och analys av brachiocephalic artärer från atheroprone smidig muskel cell lineage tracing möss.

Abstract

Åderförkalkning är fortfarande den ledande dödsorsaken i världen och trots otaliga prekliniska studier som beskriver lovande terapeutiskt mål, romanen interventioner har förblivit svårfångad. Detta var sannolikt berodde delvis, ett beroende av prekliniska förebyggande modeller undersöker effekterna av genetiska manipulationer eller farmakologiska behandlingar på åderförkalkning utveckling i stället för den etablerad sjukdomen. Även är resultaten av dessa studier ofta störande på grund av användning av ytlig lesion analyser och brist på karakterisering av lesion cellpopulationer. För att överbrygga dessa translationell häck, föreslår vi ett ökat beroende av ingripande modeller som sysselsätter utredning av förändringar i cellulära sammansättningen på en enda cellnivå av Immunofluorescerande färgning och konfokalmikroskopi. Därför beskriver vi ett protokoll för att testa en förmodad terapeutiskt medel i en murin ingripande modell inklusive ett systematiskt tillvägagångssätt för djur dissektion, inbäddning, snittning, färgning och kvantifiering av brachiocephalic artär lesioner. Dessutom, på grund av fenotypiska mångfalden av celler i sent stadium aterosklerotiska lesioner kan beskriva vi vikten av att använda cell-specifik, inducerbara lineage tracing mus system och hur detta kan utnyttjas för opartisk karaktärisering av aterosklerotisk lesion cellpopulationer. Tillsammans, dessa strategier kan hjälpa vaskulär biologer att mer exakt modell terapeutiska interventioner och analysera aterosklerotisk sjukdom och förhoppningsvis kommer att leda till en högre frekvens av framgång i kliniska prövningar.

Introduction

Åderförkalkning är den vanligaste orsaken till sjuklighet och dödlighet i hela världen bakom majoriteten av kranskärlssjukdom, perifer artär sjukdomar och stroke. Sent stadium koronar åderförkalkning kan leda till allvarliga komplikationer inklusive hjärtinfarkt överträdelse redovisning för nästan 16% av världen befolkning dödlighet1,2. På grund av dess förödande inverkan på folkhälsan, har betydande ansträngningar gjorts att dechiffrera drivkrafterna bakom åderförkalkning progression, samt för att utveckla nya terapeutiska strategier. Men är sannolikheten för godkännande (LOA) kliniska prövningar för hjärt-kärlsjukdom bland de lägsta jämfört med andra kliniska fält (endast 8,7% för fas I)3. Detta kan förklaras delvis av många hinder att åderförkalkning innebär att effektiv läkemedelsutveckling inklusive dess nästan allestädes närvarande natur, kliniskt-tyst progression och betydande sjukdom heterogenitet. Suboptimal utformningen av prekliniska djurstudier kan dessutom också redovisas för bristen på framgång i kliniska översättning. Vi tror bestämt det är nödvändigt att genomföra interventionsstudier om möjligt för att undersöka effekten av terapeutiska strategier. Dessutom finns det ett kritiskt behov att utföra standardiserade förfaranden för lesionen analyser inklusive avancerad karakterisering av sent stadium aterosklerotiska lesion cellulära sammansättningen av öde kartläggning och fenotypning.

Den stora majoriteten av åderförkalkning studier fokuserar på modeller av åderförkalkning förebyggande bestående av drogen behandling eller gen manipulation (knockout eller inpressning) hos friska unga möss, innan sjukdomen initiering och progression. Dessa studier har upptäckt ett stort antal gener och signalmolekyler som spelar en roll för utveckling av åderförkalkning. Men de flesta av dessa mål inte att översätta till effektiva behandlingar i mänskliga. Det är faktiskt svårt att extrapolera effekt en terapi har på friska unga möss till äldre patienter med avancerade aterosklerotiska lesioner. Som sådan, ger genomförandet av interventionsstudier i prekliniska experimentella pipeline sannolikt en mer exakt skildring av relevans och effekten av en ny terapeutisk. Tanken stöds av påfallande divergerande effekterna av att hämma den pro-inflammatorisk cytokin Interleukin-1β (IL-1β) när anställa en förebyggande4,5,6 eller ingripande strategi7. Skillnader mellan förebyggande och ingripande studier tyder på att olika cellulära processer förekommer i olika faser av åderförkalkning utveckling och belyser det faktum att förebyggande studier sannolikt otillräcklig att modellera det kliniska scenariot tillräckligt.

American Heart Association publicerade nyligen en vetenskaplig förklaring detailing rekommendationer för korrekt experimentell design, processuella standardisering, analys och rapportering av djur åderförkalkning studier8. Det belyser fördelar och begränsningar av dominerande tekniker som används i fältet. Till exempel utförs sv ansikte Sudan IV färgning av aorta ofta som ett första avläsning. Även om sv ansikte Sudan IV färgning av lipid nedfall är en lämplig metod för bedömning av globala plack börda, det inte går att särskilja tidigt stadium fatty streak lesioner från mer avancerade sent stadium lesioner. Som sådan, är tolkningen av sv ansikte färgning ofta tvetydiga och ytliga9. Noggrann analys av vävnad tvärsnitt med hjälp av morphologic parametrar fartyget, lesion och lumen storlek och kvantifiering av index för lesionen stabilitet ger en mer exakt förståelse av effekten av ett experiment.

Slutligen, mänskliga histopatologi studier har föreslagit att cellulära sammansättningen är en bättre prediktor för bristning än lesionens storlek själv, med lesioner fattiga i glatta muskelceller (SMC) och rika i makrofager att vara mer mottagliga att brista10, 11. Dessa observationer var baserade på färgning för markörer som klassiskt används för cellen identifiering (dvs. ACTA2 för SMC och LGALS3 eller CD68 för makrofager). Uttrycket av dessa markörer är dock inte strängt begränsad till en enda celltyp i aterosklerotiska lesioner på grund av plasticitet av flera härstamningar inklusive SMC, endotelceller och myeloida celler12. I synnerhet var entydig identifiering av SMC inom aterosklerotiska lesioner praktiskt taget omöjligt tills det senaste decenniet på grund av egenskapen av dessa celler att dedifferentiate och förtränga sin härstamning-specifika markörgener (en process som kallas fenotypiska växling) i skadade eller sjuka fartyg13. Denna begränsning i SMC identifiering har kringgåtts genom utveckling av lineage tracing7,14,15,16,17,18, 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. den består av permanent märkning SMC och deras avkomma för att spåra deras öde och fenotypisk evolution under åderförkalkning progression genom att använda en kombination av uttrycket av Cre recombinase drivs av SMC-specifika initiativtagare (dvs. Myh117,15,17,18,19,20,21,22,23 , 24, Acta225,26 och SM22α14,16) och aktivering av reportrar (t.ex. fluorescerande proteiner, β-galaktosidas) [recenserade i Bentzon och Majesky 201827]. I en av de första studierna som sysselsätter SMC lineage tracing utanför embryogenes inställning, Speer et al.14 styrkt att SMC kan modulera deras fenotyp och transdifferentiate i chondrogenic celler under vaskulär förkalkning med hjälp av en SM22α Cre R26R Lindholm lineage tracing modell. Även om dessa studier banat väg för SMC lineage tracing, var de delvis tvetydiga i att någon viss icke-SMC uttrycker SM22α i inställningen av sjukdomen skulle märkas av reportern. Denna begränsning har varit kringgås genom utveckling och användning av tamoxifen-inducerbara Cre ERT/LoxP tillåter en temporal kontroll av cell märkning. Cell märkning uppstår uteslutande under tamoxifen leverans och kommer att begränsas till cellen uttrycker cell typspecifika arrangören kör Cre ERT uttryck på tamoxifen exponeringstiden, undvika spårning av alternativa celltyper aktivera Cre i den inställning av progression av sjukdomen. För lineage tracing av SMC i åderförkalkning, de tamoxifen-inducerbara Myh11- Cre/ERT2 transgenens associerade med fluorescerande reportrar (eYFP7,15,17,publiceringsrättigheter för18 , 21, mTmG19,25, konfetti20,22,23 för klonal expansion studier) har visat en anmärkningsvärd effektivitet och specificitet i SMC märkning och har använts till öde karta SMC populationer i aterosklerotiska lesioner i nyare studier. Ännu viktigare, dessa studier visade att: 1) 80% av SMC inom avancerad aterosklerotiska lesioner inte uttrycka någon konventionell SMC markörer (ACTA2, MYH11) används i immunohistological analys och därför skulle ha varit feltolkat utan lineage tracing 17. (2) delmängder av SMC express markörer alternativa celltyper inklusive makrofag markörer eller mesenkymala stamceller markörer16,17,19. och 3) SMC investera och fylla de aterosklerotiska lesionen av oligoklonala expansion och SMC kloner behålla plasticitet övergång till fenotypiskt olika populationer20,23. Sammanfattningsvis är det nu klart att glatta muskelceller presentera en anmärkningsvärd fenotypiska mångfald i aterosklerotiska lesioner och kan ha positiva eller negativa roller på lesion patogenes beroende på deras fenotypiska övergångar. Dessa upptäckter representerar en anmärkningsvärd ny terapeutisk avenue för inriktning SMC athero-främja fenotypiska övergångar i sent stadium åderförkalkning.

Häri, föreslår vi ett standardiserat protokoll för att analysera sent stadium murina aterosklerotiska lesioner inklusive systematiska metoder för djur dissektion, inbäddning, snittning, färgning och kvantifiering av brachiocephalic artär lesioner. För att avgöra effekten av Interleukin-1β hämning på SMC öde och fenotyp, använde vi SMC lineage tracing ApoE- / - möss ges en västerländsk kost för 18 veckor innan du får veckovisa injektioner av ett anti-IL1β antikropp eller isotyp-matchade IgG kontroll.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Djur avel, hantering och förfaranden godkändes av universitetar av Virginia och University of Pittsburgh institutionella djurens vård och användning kommittén.

1. generering av SMC lineage tracing möss

  1. Föder upp Myh11- Cre/ERT2 män28 (Jackson Laboratory; #019079) med R26R-EYFP Honor (Jackson Laboratory; #006148) för att erhålla Myh11- Cre/ERT2+ R26R-EYFP+/ + män.
  2. Ras den Myh11- Cre/ERT2+ R26R-EYFP+/ + hanar med ApoE- / - honmöss (Jackson laboratory; #002052). Korsa avkomman och välj genom genotypning Myh11- Cre/ERT2+ R26R-EYFP+/ + ApoE- / - hane och R26R-EYFP+/ + ApoE- / - honmöss som slutliga uppfödare. Klipp svansar och utföra genotypning på littermates. Alla manliga möss bör Myh11- Cre/ERT2+ R26R-EYFP+/ + ApoE- / - och kan användas som experimentella möss (figur 1A).
    Obs: Genotypning protokoll kan hittas på webbplatsen för Jackson Laboratory. Den Myh11 Cre/ERT2 transgenens ligger på Y-kromosomen, utgör hinder för användning av kvinnor. Andra lineage tracing system kan användas, men detta system är hittills den mest tillförlitliga lineage tracing strategin till öde karta SMC i åderförkalkning.

2. smidig muskel cell härstamning-tracing mus kost och behandlingar

  1. Har manliga Myh11- Cre/ERT2+ R26R-EYFP+/ + ApoE- / - möss får en serie 1 mg tamoxifen injektioner från sex till åtta veckors ålder att märka permanent Myh11+ SMC med YFP och spåra deras öde (figur 1 ( A).
    1. Värme jordnötsolja vid 55 ° C.
    2. Lägg till tamoxifen i förvärmda jordnötsolja att förbereda en lösning 10 mg/ml och inkubera vid 55 ° C tills fullständig upplösning av tamoxifen.
    3. Utföra en intraperitoneal injektion med 0,1 mL 10 mg/mL tamoxifen lösning för en serie av tio injektioner under två veckor.
      Obs: Tamoxifen är ett biologiskt och måste hanteras med försiktighet.
  2. Fem till sju dagar efter den sista injektionen med tamoxifen, ersätta chow kost med fettrik kost (t.ex. västerländsk kost, 42% kcal från fett, 0,2% totalt kolesterol) för en löptid på 18 veckor som möjliggör utveckling av avancerade aterosklerotiska lesioner, som konsekvent framkallar i flera kärlbäddar inklusive aortabågen, aortaroten, brachiocephalic artär och bukaorta.
  3. 18 veckor av fettrik kost utfodring, börja terapeutisk intervention under önskad (figur 1B).
    Obs: Som ett exempel, vi utfört veckovisa intraperitoneal injektioner med en anti-IL1β antikropp eller en isotyp-matchade IgG kontroll mellan 18 och 26 veckor av hög fett diet.
  4. Ta bort mat till snabb möss för 8 till 16 h före vävnad skörd för att utföra noggranna avläsningar för plasma kolesterol och triglycerider.

3. skörd av Brachiocephalic artär (BCA)

  1. Djur dödshjälp bör följa djur vård och användning kommittén (ACUC) krav och förordningar. Avliva de experimentella möss av CO2 kvävning i ungefär 5 minuter och kontrollera döden av tå nypa.
  2. Väga musen och samla in blod.
    1. Väga musen
    2. Spraya den ventrala sidan av musen med 70% etanol
    3. Utföra hjärt punktering genom kanylen 25G ansluten till en 1 mL spruta i ventrikeln från vänster sida av brösthålan. 0,1 till 1 mL blod kan samlas.
    4. Överföra blod till en EDTA vakuumrör genom spolning sprutan och placera röret på en rocker eller rotator för 10-15 min.
    5. Överföra blod i en 1,5 mL rör och Centrifugera i 10 minuter 250 x g vid 4 ° C. Försiktigt dra tillbaka den övre plasma fasen med en pipett och adekvat tips och överföra till en ny tub. Förvaras vid-20 ° C före mätning av kolesterol och triglycerider.
      Obs: helblod kan användas för ytterligare studier inklusive blodkroppar och andra blodkomponenter inklusive cytokiner eller immunceller profilering.
  3. Gör ett snitt ungefär 2 cm i huden vid mitten av buken med sax och dra huden för att exponera bukhålan. Skär bukhinnan upp till bröstbenet utan skadliga vävnader. Två kapningar på raden mitten av armhålan genom bröstkorgen, vara noga med att inte skada hjärta och lungor.
  4. Lyft bröstbenet med pincett och skär membranet för att delvis exponera hjärtat. Om hjärtat inte är lättillgänglig, klippa bort bröstkorgen nog att nå höger förmak.
  5. BEGJUTA musen med ett allvar perfusion system (figur 2A). Installera det gravitation perfusion systemet så att trycket av perfusion vätska är likvärdig med det genomsnittliga murina blodtrycket (figur 2B). Detta system möjliggör för konsekvens i perfusion och både upprätthåller fartyget morfologi och blodvallningar röda blodkroppar.
    Obs: Som referens, C57Bl6 möss har en fysiologisk blodtryck mellan 120 mmHg (genomsnittligt systoliskt blodtryck) och 70 mmHg (genomsnittligt diastoliskt blodtryck)29,30. Genomsnittligt systoliskt och diastoliskt blodtryck kan variera med musen genetisk bakgrund.
    1. Ansluta en 23 eller 25G fjäril nål till gravitation perfusion systemet och köra fosfatbuffrad saltlösning (PBS) genom nålen att utvisa luften från rören. Stick in nålen i vänster kammare och säkra nålen på plats. Med iris sax, göra ett litet snitt (< 2 mm) i höger förmak eller aorta ascendens.
    2. BEGJUTA med 5 mL PBS, därefter 10 mL 4% paraformaldehyd (PFA) lösning, sedan 5 mL PBS. Använd både PBS och 4% PFA lösning vid rumstemperatur.
    3. Samla vävnaderna av intresse (t.ex. lever, lunga, mjälte) och placera dem i 4% PFA lösningen.
  6. Exponera BCA
    1. Ren området hals genom att ta bort hud och spottkörtlar.
    2. Utföra en skär ner mittlinjen på bröstbenet genom den manubrium med sax. Var noga med att saxen bo nära baksidan av bröstbenet att undvika att skada i blodkärlen som ligger nära nedanför bröstbenet. Dra båda sidor av bröstkorgen med pincett fullt öppna brösthålan. Halspulsådern bör delvis synliga.
    3. Rensa upp genom att dra muskler och bindväv och ta bort fett med fina pincett tills den högra halspulsådern, den brachiocephalic artär subclavia bifurkationen och aortabågen rengörs och isolerade av omgivande bindväv och fett (figur 2C).
  7. Ta bort BCA
    1. Med pincett, greppa den högra halspulsådern nedanför dess bifurkation och göra en inledande snitt över tången (figur 2D).
    2. Fortfarande håller halspulsådern, göra ett andra snitt genom subclavia. De sista två snitten är genom aortabågen, på vardera sidan av brachiocephalic artär (figur 2D).
    3. Samla in andra kärlvävnader av intresse (t.ex., bukaorta, överlägsna del av hjärtat som innehåller aortaroten).
    4. Placera BCA och andra vävnader i 4% PFA lösning över natten i rumstemperatur.
      Obs: Fixering tiden bör hållas konsekvent genom hela studien.

4. vävnad behandling och snittning

  1. Ta bort vävnad från 4% PFA och plats i en märkt vävnad kassett (figur 3A). Använd skum kuddar i kassett att säkerställa vävnaden behålla sin läggning och finns kvar i kassetten genom bearbetningssteg (figur 3B). Nära korgarna och fördjupa i 70% etanol tills vävnaden bearbetning (24 till 72 h).
    1. Bearbeta BCA och andra vävnader som samlats in för histologiska och Immunofluorescerande färgning som följer (exemplet av rutinmässiga övernattning proceduren med en processor med vakuum penetration): 10% neutral buffrad formalin för 30 min vid rumstemperatur (2 x), 75% etanol för 60 min vid 30 ° C (1 x), 90% etanol för 60 min vid 30 ° C (1 x), 95% etanol för 60 min vid 30 ° C (1 x), 100% etanol för 60 min vid 30 ° C (3 x), xylen i 60 min vid 30 ° C (3 x) och paraffin vax för 80 min vid 62 ° C (3 x).
  2. Bädda in BCA vertikalt, med aortabågen som är närmast block ansiktet (figur 3C).
  3. Skär genom paraffin blocket på en roterande mikrotom (10 µm tjocklek) tills de når den inbäddade vävnaden.
  4. När vävnaden är synliga, undersöka en sektion under ett Mikroskop för att fastställa positionen. Om aortabågen är fortfarande synliga, ta bort upp till tio 10 µm avsnitt i taget, att undersöka ett avsnitt på varje intervall.
  5. När aortabågen har varit sektioneras genom och den brachiocephalic artären är synliga, justera orienteringen av blocket för att placera vävnaden som är helt vinkelrät mot bladet mikrotomen.
  6. Skär BCA vid ett snittjocklek 10 µm. På den punkten, samlas alla sektioner seriellt med tre sektioner per bild. Samla in tills de når subclavia bifurkation (figur 3D).
    Obs: Det är viktigt att klippa BCA på ett snittjocklek 10 µm för efterföljande z-stack confocal bild förvärv och enda cell räknar. Denna tjocklek kan den rigorösa och icke-cofounding bedömningen av association mellan en enda kärna och cytoplasmiska eller membran färgning men djupet i tvärsnittet.

5. Immunofluorescerande färgning

Obs: En fullständig karakterisering av aterosklerotiska lesioner omfattar bedömning av morfologiska parametrar och index för plack stabilitet eller instabilitet och cellulära sammansättningen som inte kommer att vara i fokus för detta protokoll. Lesion morfologi, kollagen innehåll och intraplaque blödningar kan analyseras med Movat7,17, PicroSirius röd 7,31, Ter119 färgning 7,18, respektive. Här kommer vi att beskriva protokollet för att analysera den cellulära sammansättningen av lesioner.

  1. Inkubera bilder i följande lösningar i rumstemperatur under en kemisk huva: xylen för 5 min (2 x), 100% etanol för 5 min (2 x), 95% etanol för 5 min (2 x), 70% etanol för 5 min (2 x) och avjoniserat vatten H2O (Dihs2O) för 5 min (2 x).
  2. Odling av objektglas i antigen retrieval lösning enligt tillverkarens anvisning.
    1. Med citronsyra baserat antigen demaskering lösning (se Tabell för material), späd 3 mL lösning i 320 mL Dihs2O. plats bilderna i en färgning reservoar och fyll upp med förberedda antigen retrieval lösningen.
    2. Fyll alla tomma platser i objektglashållaren med tomma bilder att säkerställa jämn uppvärmning. Täck kärlet med lock att tillåta antigen retrieval lösningen att koka utan avdunstning.
    3. Värma glasen i en mikrovågsugn i 20 min på ca 675-700 watt. Kolla nedsänkt bilder regelbundet och ersätta avdunstat vätska med Dihs2O så att avsnitten förbli i demaskering lösning hela tiden.
    4. Låt bilder svalna i lösningen för 1 h i rumstemperatur.
  3. Lös 6 g fisk hud Gelatin (FSG) i 1 L PBS. PBS/FSG används som tvätt buffert. Bered en blockering av 10% normala serum i PBS/FSG.
    Obs: Fisk hud Gelatin används vid utarbetandet av det blockerande buffert. FSG innehåller inte serumproteiner som kan korsreagerar med däggdjur antikroppar, minimera bakgrundsljud. Andra blockerande alternativ bör dock föredra med biotin detektionssystem som FSG innehåller endogena biotin. Typ av normala serum används är baserad på den sekundära antikroppar används. När åsnan sekundära antikroppar används, bör normal häst serum väljas för blockering och antikropp utspädningar.
  4. Odling av objektglas i PBS för 5 min i rumstemperatur. Cirkel vävnadssnitt med en hydrofob penna. Täcka avsnitten med de blockerande buffertlösning PBS/FSG/normal serum för 1 h i rumstemperatur. Bered den primär antikropp i PBS/FSG/normal serum under detta steg medan vävnader blockerar.
  5. Inkubera med primära antikroppar utspätt i PBS/FSG/normal serum över natten vid 4 ° C i en fuktkammare. Ett avsnitt per bild bör inkuberas med en blandning av IgG kontroll antikroppar i samma koncentration som de primära antikropparna mot kontroll för primär antikropp specificitet.
  6. Tvätta bilderna som följer vid rumstemperatur: PBS/FSG för 5 min (3 x), sedan PBS för 5 min (1 x).
  7. Inkubera med fluorophore-konjugerad sekundära antikroppar (se Tabell av material) och diamidin-2-fenylindol (DAPI) i nucleus counterstaining utspädd i PBS/FSG/normal serum för 1 h i rumstemperatur. Skydda bilder från ljus.
  8. Tvätta diabilder som beskrivs i steg 5,6.
  9. Montera diabilder med montering media passar fluorescens (se Tabell för material).

6. konfokalmikroskopi

Obs: Användning av en confocal mikroskopet och z-stack förvärv är kritiska för encelliga inventering.

  1. Ange parametrar för förvärvet att användas genom hela studien: bildupplösning (1024 x 1024 eller 2048 x 2048 pixlar); Optisk väg och antal kanaler, som är en funktion av kombinationen av sekundära antikroppar valt; scanningshastighet (rekommenderat skanningshastighet: 7-8); och differential störningar kontrast (DIC) kanal.
  2. Med sektioner som färgas med primära antikroppar och IgG kontroll, ange detektorkänslighet, lasereffekt och förskjutning för varje enskild kanal. IgG kontroll används för att minimera den bakgrund signalen.
  3. Ställ in de övre och lägre positionerna för z-stack förvärv. Förbestämma tjocklek och antal stackar att förvärva. Dessa parametrar bör förbli konsekvent genom hela studien.
    Obs: Vi rekommenderar imaging 8 till 10 stackar 1 µm tjockt. Vara konsekvent i antalet stackar avbildas under hela studien.
  4. Bild vävnadssnitt fläckade primära antikroppar och IgG kontroll för alla kanaler inklusive DIC.
  5. Märk minst en bild med en skala för bild kalibrering under enstaka cell inventering.

7. enda cell räknar

  1. Installera och öppna ImageJ. Om det behövs, ladda ner Plugins i avsnittet Hämta > Input/Output av ImageJ hemsida att öppna bildfilen genereras beroende av formatet för de bilder som genereras av mikroskopet confocal.
  2. Öppna bildfilen i ImageJ.
  3. Kalibrera bilden med en referens skala bar använder bilden genererade under 6.6.
  4. Avgränsa regionen av intresse som enda cell räknar kommer att utföras med hjälp av DIC channel (figur 4).
    Obs: En region kan avgränsas i taget. Beroende av de experimentella frågorna, enda cell räknar kan utföras i lesionsområdet hela (se 7.3.1) eller i en sublocation av lesionen. Undersökning av området fibrösa cap är (se 7.3.2) exempelvis särskilt relevant eftersom dess cellulära sammansättning är ett viktigt index för lesionen benägenhet att brista.
    1. Avgränsa lesionsområdet vid följande lumen gränsen (figur 4A; vita pilarna) och den interna elastisk lamina (figur 4A; gula pilar) synliga på DIC bilden.
    2. För analys av området fibrösa cap, bestämma gränsen avlägsen 30 µm från lumen och spåra gränsen ( figur 4B-D).
      Obs: Området fibrösa cap definieras klassiskt som regionen berikad i ACTA2 + celler och kollagen underlaying lumen (figur 4B). Berikning i ACTA2 + cell- och kollagen spelar en avgörande roll i lesionen stabilitet. Tidigare studier har fastställt att ACTA2 cell rik fibrösa cap området + genomsnitt en tjocklek på 30 µm från lumen i SMC-lineage tracing ApoE- / - möss ges en fettrik kost för 18 till 26 veckor (figur 4C). Noggrann karakterisering av effekterna av genetisk manipulation eller farmakologisk behandling på fibrösa cap området cellulära sammansättningen är alltså anmärkningsvärt relevanta.
  5. Öppna panelen Kanaler verktyg (Bild > färg > Channel verktyg) och pseudo färg olika färgning kanaler (figur 5A, ruta 1).
  6. Sammanfoga färgkanalerna (Bild > färg > sammanfoga färger) (figur 5A, box 2). Alla kanaler ska synas på samma bild (figur 5B). Aktivera och inaktivera enskilda färgkanaler med panelen Channel verktyg (figur 5A, ruta 1).
  7. Ställa in verktyget räknar.
    1. Högerklicka på ikonen Counting i verktygsfältet (figur 5C, box 1) och välj Flerpunkts verktyg.
    2. Dubbelklicka på ikonen samma öppna panelen Punkt verktyg (figur 5C, ruta 2).
    3. Välj typ och storlek av de objekt som används för att räkna celler.
    4. Kontrollera att Visa alla.
  8. Slå på kanalen DAPI endast på Kanal verktygspanelen och välj Counter kanal 0 (figur 5C, ruta 3). Klicka på enskilda kärnor som kommer att vara taggade (t.ex. gula prickar i figur 5C-D). Rulla z-stackar att räkna alla atomkärnor målat i regionen av intresse. Antalet händelser är nedanstående counter kanalen i Punkt verktygs -panelen (figur 5C; ruta 4).
  9. Aktivera en annan färgning kanal (t.ex. eYFP färgning). Välj den räknare kanalen 1. Klicka på celler där det finns en colocalization mellan DAPI och färgning. För cytoplasmisk färgning, Välj celler för med färgning omger kärnan på hela djupet av kärnan (kontrollera flera z-staplar).
  10. Upprepa genom att ändra den färgning kombinationer och välja ny Counter kanaler att räkna cellpopulationer av intresse. Varje dot färg representerar en annan cell befolkningen (figur 5D). Resultatet kan uttryckas som antal celler att totala antalet DAPI eller antalet celler till regionen området.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Myh11- Cre/ERT2 R26R-EYFP Apoe- / - möss injicerades med tamoxifen mellan sex och åtta vecken av ålder innan matas en fet kost. På 18 veckor av hög fett diet utfodring, behandlades två grupper av åtta möss varje vecka med antingen en mus monoklonal anti-IL-1β antikropp eller en isotyp-matchade IgG-kontroll på 10 mg/kg för 8 veckor (figur 1)7. Möss var offrade och perfusion med en lösning med 4% i PFA-PBS. Brachiocephalic artärer var dissekeras, bearbetas och sektioneras som beskrivs ovan (figur 2 och figur 3).

Efter Immunofluorescerande färgning med antikroppar riktade mot den lineage tracing reporter (YFP) och fenotypiska markörer (ACTA2, LGALS3, RUNX2), en tjocklek av 8-10 µm i BCA tvärsnitt fotograferades med confocal Mikroskop. Bilder av varje enskild färgning, DAPI (nukleär färgning) och DIC förvärvades. Avgränsning av områden av intresse för enstaka cell räknar (lesion, fibrösa cap) utfördes med hjälp av DIC bilder (figur 4). Enstaka cell inventering för att avgöra överflödet av olika SMC-derived populationer utfördes med hjälp av ImageJ (figur 5).

Vi presenterar två representanten Immunofluorescerande färgning och enda räknar att bedöma effekten av IL-1β hämning på cellulära sammansättningen i avancerade aterosklerotiska lesioner. Första färgningen var gjort för SMC lineage tracing reportern YFP, SMC markören ACTA2 och makrofag markören LGALS3 i tvärsnitt på två olika platser i BCA (480 µm och 780 µm från aortabågen) (figur 6). Enstaka cell räknande analys i regionen fibrösa cap i dessa tvärsnitt utfördes, och anmärkningsvärda skillnader i cellulära sammansättningen av fibrösa cap området mellan möss som behandlats med anti-IL-1β antikroppen och möss behandlades med den isotyp-matchade IgG kontroll(figur 6). Hämning av IL-1β associerades med en minskning av YFP + SMC och en ökning av LGALS3 +-celler (figur 6B). Angående fenotyperna av SMC populationer, observerades en minskning av antalet YFP + ACTA2 + SMC, medan det relativa antalet SMC-derived makrofager (YFP + LGALS3 +) var signifikant förhöjda vid båda BCA platserna (figur 6C).

Slutligen har vi undersökt effekten av IL-1β hämning på SMC fenotypiska övergången i chondrogenic celler. Denna fenotypiska övergång är en viktig drivkraft för vaskulär förkalkning, viktigt inslag i sent stadium åderförkalkning14,32,33. BCA tvärsnitt var färgas för SMC lineage tracing reportern YFP, osteochondrogenic markören RUNX2 och makrofag markören LGALS3(figur 7). Överflöd och beskärningen av RUNX2 + chondrogenic cellerna präglades inom lesionsområdet i våra två experimentella grupper. Vi hittade att hämning av IL-1β inte påverkade det totala antalet RUNX2 + celler inom lesionen, och inte heller andelen SMC-derived (YFP + RUNX2 +) och makrofag härledda (YFP-LGALS3 + RUNX2 +) chondrogenic celler (Fig. 7B).

Figure 1
Figur 1 : Interventionsstudier i glatt muskulatur cell lineage tracing möss. (A) Schematisk bild av den Myh11- Cre/ERT2 R26R-EYFP Apoe- / - tamoxifen-inducerbara SMC specifika lineage tracing musmodell. Behandling med tamoxifen inducerar rekombination av det R26R-YFP locus och excision av ett STOP-kodon och permanent uttrycket av YFP av SMC. (B) Schematisk bild av intervention studies i vilken Myh11- Cre/ERT2 R26R-EYFP Apoe- / - möss ges en västerländsk kost för 18 veckor injicerades varje vecka med IL-1β antikroppen eller en isotyp-matchade IgG kontroll antikropp vid en koncentration på 10 mg / kg i 8 veckor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Brachiocephalic artär dissektion. (A) Schematisk bild av ett allvar drivs perfusion system. Systemet ställs in på en exakt höjd möjliggör perfusion vid ett tryck nära det genomsnittliga systoliska blodtrycket hos möss. Trycket varierar något med volym höjd som vätska används under perfusion mellan höjd h1 och h2. (B) ekvation för beräkning av trycket av statiska vätskor och bestämning av höjden att nå ett tryck av perfusion lika med C57Bl6 mus genomsnittligt systoliskt blodtryck. (C) bilder i proximala aorta och förgrenade artärer C57Bl6 mus matas en chow kost (vänster bild) och Apoe- / - mus ges en hög fett kost under 26 veckor (högra bilden). Asterisken anger förekomsten av aterosklerotiska lesioner. (D) Schematisk bild av den proximala aorta och förgrenade artärer. Röda pilarna representerar nedskärningar för isolering av den högra halspulsådern och brachiocephalic artär isolering och nummer indikerar ordningen av nedskärningarna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Vävnad bearbetning, inbäddning och snittning. (A) fotografi av en inbäddning kassett med BCA vävnad. BCA är placerad på en skum pad. (B) zooma in av den BCA placerad på skumdynan. BCA är orienterad med aortabågen nära den etikett delen av kassetten och halspulsådern rätade vertikalt. Skalstapeln: 1 cm. (C) Schematisk bild av paraffin blocket efter inbäddning av brachiocephalic artär. (D) Schematisk bild av seriell bilder med 10 µm tjock seriell avsnitt med uppgift om avståndet från aortabågen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Avgränsning av området aterosklerotiska lesioner och fibrösa cap. (A) representativa micrographs för DIC bild aterosklerotiska lesion i brachiocephalic artär tvärsnitt från Myh11- Cre/ERT2 R26R-EYFP Apoe- / -. Den luminala och intern elastisk lamina gränsar lokaliseras av vita och gula pilar, respektive (till vänster). Lesionsområdet avgränsas av en streckad linje (höger panel) skalstapeln: 100 µm. (B) representativa micrographs av DIC och ACTA2 färgning. Dubbel-head pilarna visar tjockleken på ACTA2 färgning inom området underlaying lumen definiera området fibrösa cap. (C) kvantifiering av subluminal ACTA2+ tjocklek i Myh11- Cre/ERT2 R26R-EYFP Apoe- / - matas en fettrik diet 18, 21 och 26 veckor. Den fibrösa cap använder denna stam av möss, och har en genomsnittlig tjocklek på 25-30 µm i förväg aterosklerotiska lesioner. Resultaten uttrycks som medelvärde ± SEM. (D) avgränsning av ett fast 30 µm tjock fibrös cap område för enstaka cell inventering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : Enda cell räknar med ImageJ. Skärmdumpar som illustrerar viktiga steg i cell räknar med ImageJ bilder förvärvats av konfokalmikroskopi. (A) varje enskild färgning kanal och individuella z-stack är synliga genom rullning c: och z: barer längst ned på bilden. Färgningen kanaler är pseudo färgade med panelen kanal (1) färgningen kanaler (YFP, LGALS3, ACTA2, DAPI för nukleär färgning och DIC) slås samman med panelen Merge kanal (2). (B) resultaten av kanal sammanslagning för YFP, LGALS3, ACTA2, DAPI och DIC. (C) kärnan räknar utifrån DAPI färgning med Counting ikonen (1) och punkt verktygs-panelen (2). En annan counter kanal används för varje cell befolkningen (3). Antalet händelser räknas indikeras nedanför kanalen counter (4). Vit rektangel: regionen utvidgade till höger. (D) representativ bild av enstaka cell räknar inom området fibrösa cap (streckad linje) för flera cellpopulationer inklusive DAPI (gula prickar), YFP+ celler (magenta prickar), YFPLGALS3+ celler (cyan prickar), YFP+LGALS3+ celler (orange prickar), YFP+ACTA2+ celler (gröna prickar) och YFPACTA2+ celler (mörk blå prickar). Vit rektangel: regionen utvidgade till höger. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6 : Karakterisering av effekterna av IL-1β hämning på cellulära sammansättningen av fibrösa cap området på två distinkta BCA platser av SMC lineage tracing Apoe-/-möss. (A) BCA tvärsnitt på 480 µm och 780 µm från aortabågen från möss som behandlats med IL-1β antikroppen eller IgG kontroll som visas i figur 1 var färgas för YFP, LGALS3, och DAPI (nukleär färgning) och avsnittet fotograferades av DIC. Immunofluorescerande kanaler slogs (nedre högra panelerna). De streckade linjerna avgränsa Regionkommittén fibrösa cap. Skala barer: 100 µm. (B) enda cell räknar avslöjar att hämning av IL-1β är associerade med en signifikant minskning YFP+ celler och en ökning av LGALS3+ celler inom området fibrösa cap. C) inom the YFP+ cell befolkningen, en minskning YFP+ACTA2+ och en ökning av YFP+LGALS3+ populationer observeras. Resultaten uttrycks som medelvärde ± SEM. statistisk analys: oparade flera t-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7 : Effekten av IL-1β hämning på numrera av RUNX2 + chondrogenic celler med avancerade aterosklerotiska lesioner. A) BCA tvärsnitt färgas för YFP, LGALS3, RUNX2 och DAPI (nukleär färgning), och alla kanaler slogs (nedre paneler). De streckade linjerna avgränsa lesionsområdet. Skala barer: 100 µm. B) enda cell visar att hämning av IL-1β inte påverkar det totala antalet RUNX2+ celler inom lesionen eller andelen RUNX2+ celler från SMC ursprung (YFP+RUNX2+; YFP+LGALS3+RUNX2+) och myeloisk ursprung (YFPLGALS3+RUNX2+). Resultaten uttrycks som genomsnittlig SEM. statistisk analys: oparade flera t-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Trots decennier av forskning och tekniska framsteg i att studera ateroskleros, har fältet en nedslående historia av att omsätta forskningsresultat till kliniska behandlingar34,35. Detta fenomen kan delvis förklaras av skillnader i djurmodeller, experimentell design och lesion analyser. Häri, beskriver vi en experimentell pipeline som vi använde för att analysera den cellulära sammansättningen i avancerade aterosklerotiska lesioner använder lineage tracing möss7. Denna metod möjliggör en noggrann undersökning av cell öde kartläggning och fenotypning, vilka är viktiga parametrar kontrolleras av potentiella mekanismer på spela i avancerade aterosklerotiska lesioner.

SMC-lineage tracing musmodellen är ett kraftfullt verktyg för att spåra den öde och fenotypiska modulationer av denna härstamning och deras bidrag till åderförkalkning patogenes. Tamoxifen-inducerbara Cre-loxP systemet möjliggör märkning av mogen vaskulär SMC uttrycker MYH11 före inledandet av åderförkalkning. Övertygande bevis med detta system har visat att aterosklerotiska plack är mycket plast och vaskulär SMC kan genomgå fenotypiska växling, att förlora sin kontraktila fenotyp och SMC-specifika markörer, prolifererande, migrering och även transdifferentiating till makrofag-liknande celler17,18. I detta protokoll, vi visar hur härstamning-tracing upptäckt och Immunofluorescerande färgning markörer av intresse kan integreras för att exakt bestämma fenotypiska övergångar som genomförs av SMC och deras relativa frekvens bland andra SMC populationer.

Denna metod är mycket kompletterande med andra analyser som ofta utförs i fältet. Första används bedömning av aterosklerotiska lesion bördan av sv ansikte aorta preparat kombineras med lipid färgning av Sudan IV allmänt på grund av sin bekvämlighet och snabbhet. Detta är dock ett otillräckligt mått på viktiga morfologiska parametrar såsom lesionsstorleken, lumen storlek och fartyget remodeling. Färgning av sv ansikte aorta förberedelse av Sudan IV att visualisera lipid nedfall kan användas för att kvantifiera relativa lesionsområdet inom aorta, men det kan ge inkonsekventa färgning av lesioner, som bara komponenten neutrala lipid visualiseras medan regioner som upptas av andra beståndsdelar, såsom extracellulärmatrix, är vanligtvis försummade8. Dessutom sv ansikte färgning inte kan informera om lesionen morfologi och inte kan skilja mellan feta ränder och avancerade lesioner. Fartyget morfologi är en viktig parameter som används för att bedöma risk för åderförkalkning scenen och bristning, inbegripet lesionsstorleken, lumen diameter, fartyget remodeling7,36,37. Dessa analyser kräver bevarande av fartyget morfologi för korrekt kvantifiering. Ännu viktigare, överlappar protokoll för utredning av morfologiska parametrar kraftigt i protokollet som beskrivs här. I synnerhet de förlitar sig på användningen av ett allvar-driven vaskulär perfusion system för PBS och fixativ perfusion att ge större enhetlighet i trycket. Gravitation-driven infiltration systemet garanterar en konstant flöde hastighet och tryck mellan varje oberoende mus och förhindrar inkonsekvensen i manuell kraft-driven perfusion mellan oberoende experiment eller forskare. Gravitation perfusion systemet bör inrättas för att inducera perfusion vid ett tryck nära det genomsnittliga murina blodtrycket (70-120 mmHg). För det andra, vi gav en standardiserad och systematisk metod för inbäddning och snittning för den brachiocephalic artären. Genom att definiera start platsen för snittning och kvantifiera lesionsområdet på flera platser i hela den brachiocephalic artären, kan vi begränsa den slumpmässiga variationen som kommer med begränsad provtagning.

Flödescytometri är en annan teknik mycket kompletterande med Immunofluorescerande färgning kopplat med enstaka cell räknar som allmänt har använts i kvantifiera cellpopulationer inom aterosklerotiska lesioner38. Den består av matsmältningen av mus aorta och märkning av utgivna cellerna med fluorescerande antikroppar. Flödescytometri erbjuder en kvantitativ analys av cellulära befolkningarna i aorta. Men liksom alla tekniker har flödescytometri begränsningar. Det finns en fullständig förlust av rumslig upplösning trots distinkta fördelen med passande ett stort utbud av samtidiga markörer, och blir det oklart huruvida en cell befolkningen anrikas i fibrösa locket eller nekrotiska kärnan. Dessutom finns det en risk för utspädningseffekt eftersom flödescytometri kräver ett stort antal celler och ofta fokuserar inte bara på aterosklerotisk områden. Av denna anledning, kan immunofluorescens och flödescytometri användas som ett komplement för att både hög tredimensionell profilering och lesion lokalisering.

Slutligen, protokollet är inriktad på kvantifiering av SMC populationer i BCA avancerade lesion med paraformaldehyd-fasta och paraffin-inbäddat vävnadssnitt. Detta protokoll kan dock användas för att undersöka andra kärlbäddar inklusive aortaroten eller bukaorta, två vaskulära territorier omfattas av åderförkalkning utveckling. Systematisk bearbetning och snittning av aortaroten har varit tidigare väl beskrivna8,39. Som åderförkalkning utvecklas på olika platser och att genmanipulation eller terapeutisk intervention kan icke-likartad inverkan dessa platser21, är det viktigt att undersöka så många kärlbäddar som möjligt att dra korrekta slutsatser. Immunofluorescerande färgning och enda cell räknar kan också utföras med frusna snitt. Detta kan vara nödvändigt på grund av oförenligheten av antikroppar med paraffin avsnitt. Även om de animaliska perfusion och vävnad inbäddning skiljer sig från detta protokoll, kan utredare följa resten av de experimentella procedurer som beskrivs här.

Sammanfattningsvis beskrivs teknikerna som här skissera en systematisk metod att analysera lesion cellpopulationer och fenotyper i sent stadium murina åderförkalkning. Detta protokoll kan fungera som en mall för att undersöka lesion populationer av Immunofluorescerande färgning i alla typer av experimentell design inklusive tidigt och sent stadium ateroskleros, samt prevention och intervention studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar centrum för biologiska Imaging (stöds av NIH 1S10OD019973-01) vid University of Pittsburgh för deras hjälp. Detta arbete fick stöd av stöds av vetenskapliga utveckling Grant 15SDG25860021 från American Heart Association att D.G. R.A.B. stöddes av NIH bevilja F30 HL136188.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% Paraformaldehyde aqueous solution Electron Microscopy Sciences RT 15710 Tissue perfusion and fixation
23G butterfly needle Fisher BD367342
25G needle Fisher 14-821-13D 
A1 Confocal microscope Nikon Confocal microscope
ACTA2-FITC antibody (mouse) Sigma Aldrich F3777 Primary Antibody
Alexa-647 anti goat Invitrogen A-21447 Secondary antibody
Antigen Unmasking solution, Citric acid based Vector Labs H-3300 Antigen retrieval solution
Chow Diet Harlan Teklad TD.7012
Coverslip Fisher 12-544-14 Any 50 x 24 mm cover glass
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen D1306 Nucleus fluorescent counterstaining
Donkey Alexa-488 anti-rabbit Invitrogen A-21206 Secondary antibody
Donkey Alexa-555 anti-rat Abcam ab150154 Secondary antibody
DPBS 10X without Calcium and Magnesium Gibco 14200166 PBS for solution dilutions and washes. Dilute to 1x in deionized water
Embedding cassette Fisher 15-182-701D
ETDA vacuum tube Fisher 02-685-2B
Ethanol 200 proof Decon 2701
Foam pad Fisher 22-222-012
Gelatin from cold water fish skin Sigma Aldrich G7765
GFP antibody (goat) abcam ab6673 Primary antibody
goat IgG control Vector Labs I-5000 IgG control
High Fat Diet Harlan Teklad TD.88137
ImageJ NIH Computer program https://imagej.nih.gov/ij/ 
LGALS3 antibody (rat) Cedarlane CL8942AP Primary antibody
LSM700 confocal microscope Zeiss Confocal microscope
Microscope Slides, Superfrost Plus Fisher 12-550-15
Microtome blades Fisher 30-538-35
Mouse IgG control Vector Labs I-2000 IgG control
NIS element imaging software Nikon Imaging software for z-stack image acquisition
Normal Horse serum Sigma Aldrich H1270
Pap Pen Fisher 50-550-221
Peanut oil Sigma P2144
Prolong gold Antifade mountant Invitrogen P36930 Mounting medium 
Rabbit IgG control Vector Labs I-1000 IgG control
Rat IgG control Vector Labs I-4000 IgG control
RUNX2 antibody (rabbit) Abcam ab192256 Primary Antibody
Syringe BD 309628 1 ml syringe
Tamoxifen Sigma T5648
Xylene Fisher X55K-4
Zen imaging software Zeiss Imaging software for z-stack image acquisition

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. GBD DALYs and HALE Collaborators. Global, regional, and national disability-adjusted life-years (DALYs) for 315 diseases and injuries and healthy life expectancy (HALE), 1990-2015: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2015. Lancet. 388 (10053), 1603-1658 (2016).
  2. Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2018 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 137 (12), 67-92 (2018).
  3. Hay, M., Thomas, D. W., Craighead, J. L., Economides, C., Rosenthal, J. Clinical development success rates for investigational drugs. Nature Biotechnology. 32 (1), 40-51 (2014).
  4. Bhaskar, V., et al. Monoclonal antibodies targeting IL-1 beta reduce biomarkers of atherosclerosis in vitro and inhibit atherosclerotic plaque formation in Apolipoprotein E-deficient mice. Atherosclerosis. 216 (2), 313-320 (2011).
  5. Isoda, K., et al. Lack of interleukin-1 receptor antagonist modulates plaque composition in apolipoprotein E-deficient mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (6), 1068-1073 (2004).
  6. Kirii, H., et al. Lack of interleukin-1beta decreases the severity of atherosclerosis in ApoE-deficient mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 23 (4), 656-660 (2003).
  7. Gomez, D., et al. Interleukin-1β has atheroprotective effects in advanced atherosclerotic lesions of mice. Nature Medicine. 24, 1418-1429 (2018).
  8. Daugherty, A., et al. Recommendation on Design, Execution, and Reporting of Animal Atherosclerosis Studies: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circulation Research. 121 (6), 53-79 (2017).
  9. Baylis, R. A., Gomez, D., Owens, G. K. Shifting the Focus of Preclinical, Murine Atherosclerosis Studies From Prevention to Late-Stage Intervention. Circulation Research. 120 (5), 775-777 (2017).
  10. Kolodgie, F. D., et al. Pathologic assessment of the vulnerable human coronary plaque. Heart. 90 (12), 1385-1391 (2004).
  11. Virmani, R., Kolodgie, F. D., Burke, A. P., Farb, A., Schwartz, S. M. Lessons from sudden coronary death: a comprehensive morphological classification scheme for atherosclerotic lesions. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 20 (5), 1262-1275 (2000).
  12. Gomez, D., Owens, G. K. Smooth muscle cell phenotypic switching in atherosclerosis. Cardiovascular Research. 95 (2), 156-164 (2012).
  13. Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease. Physiological Reviews. 84 (3), 767-801 (2004).
  14. Speer, M. Y., et al. Smooth muscle cells give rise to osteochondrogenic precursors and chondrocytes in calcifying arteries. Circulation Research. 104 (6), 733-741 (2009).
  15. Gomez, D., Shankman, L. S., Nguyen, A. T., Owens, G. K. Detection of histone modifications at specific gene loci in single cells in histological sections. Nature Methods. 10 (2), 171-177 (2013).
  16. Feil, S., et al. Transdifferentiation of vascular smooth muscle cells to macrophage-like cells during atherogenesis. Circulation Research. 115 (7), 662-667 (2014).
  17. Shankman, L. S., et al. KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis. Nature Medicine. 21, 628 (2015).
  18. Cherepanova, O. A., et al. Activation of the pluripotency factor OCT4 in smooth muscle cells is atheroprotective. Nature Medicine. 22, 657 (2016).
  19. Albarran-Juarez, J., Kaur, H., Grimm, M., Offermanns, S., Wettschureck, N. Lineage tracing of cells involved in atherosclerosis. Atherosclerosis. 251, 445-453 (2016).
  20. Chappell, J., et al. Extensive Proliferation of a Subset of Differentiated, yet Plastic, Medial Vascular Smooth Muscle Cells Contributes to Neointimal Formation in Mouse Injury and Atherosclerosis Models. Circulation Research. 119 (12), 1313-1323 (2016).
  21. Newman, A. A., et al. Irradiation abolishes smooth muscle investment into vascular lesions in specific vascular beds. JCI Insight. 3 (15), (2018).
  22. Dobnikar, L., et al. Disease-relevant transcriptional signatures identified in individual smooth muscle cells from healthy mouse vessels. Nature Communications. 9 (1), 4567 (2018).
  23. Misra, A., et al. Integrin beta3 regulates clonality and fate of smooth muscle-derived atherosclerotic plaque cells. Nature Communications. 9 (1), 2073 (2018).
  24. Majesky, M. W., et al. Differentiated Smooth Muscle Cells Generate a Subpopulation of Resident Vascular Progenitor Cells in the Adventitia Regulated by Klf4. Circulation Research. 120 (2), 296-311 (2017).
  25. Herring, B. P., Hoggatt, A. M., Burlak, C., Offermanns, S. Previously differentiated medial vascular smooth muscle cells contribute to neointima formation following vascular injury. Vascular Cell. 6, 21 (2014).
  26. Sheikh, A. Q., Misra, A., Rosas, I. O., Adams, R. H., Greif, D. M. Smooth muscle cell progenitors are primed to muscularize in pulmonary hypertension. Science Translational Medicine. 7 (308), (2015).
  27. Bentzon, J. F., Majesky, M. W. Lineage tracking of origin and fate of smooth muscle cells in atherosclerosis. Cardiovascular Research. 114 (4), 492-500 (2018).
  28. Wirth, A., et al. G12-G13-LARG-mediated signaling in vascular smooth muscle is required for salt-induced hypertension. Nature Medicine. 14 (1), 64-68 (2008).
  29. Mattson, D. L. Comparison of arterial blood pressure in different strains of mice. American Journal of Hypertension. 14 (5), Pt 1 405-408 (2001).
  30. Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D'Alecy, L. G. Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (6), 2408-2415 (2004).
  31. Durgin, B. G., et al. Smooth muscle cell-specific deletion of Col15a1 unexpectedly leads to impaired development of advanced atherosclerotic lesions. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312 (5), 943-958 (2017).
  32. Durham, A. L., Speer, M. Y., Scatena, M., Giachelli, C. M., Shanahan, C. M. Role of smooth muscle cells in vascular calcification: implications in atherosclerosis and arterial stiffness. Cardiovascular Research. 114 (4), 590-600 (2018).
  33. Lin, M. E., et al. Runx2 Deletion in Smooth muscle Cells Inhibits Vascular Osteochondrogenesis and Calcification but not Atherosclerotic Lesion Formation. Cardiovascular Research. , (2016).
  34. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving Bioscience Research Reporting: The ARRIVE Guidelines for Reporting Animal Research. PLoS Biology. 8 (6), 1000412 (2010).
  35. Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).
  36. Nishioka, T., et al. Contribution of inadequate compensatory enlargement to development of human coronary artery stenosis: An in vivo intravascular ultrasound study. Journal of the American College of Cardiology. 27 (7), 1571-1576 (1996).
  37. Pasterkamp, G., et al. Paradoxical Arterial-Wall Shrinkage May Contribute to Luminal Narrowing of Human Atherosclerotic Femoral Arteries. Circulation. 91 (5), 1444-1449 (1995).
  38. Galkina, E., et al. Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent. The Journal of Experimental Medicine. 203 (5), 1273-1282 (2006).
  39. Venegas-Pino, D. E., Banko, N., Khan, M. I., Shi, Y., Werstuck, G. H. Quantitative analysis and characterization of atherosclerotic lesions in the murine aortic sinus. Journal of Visual Experiments. (82), 50933 (2013).

Tags

Medicin fråga 144 åderförkalkning aterosklerotiska lesion brachiocephalic artär vävnad förberedelse och snittning immunohistokemi immunofluorescens konfokalmikroskopi
Kvantitativ analys av cellulära sammansättningen i avancerade aterosklerotiska lesioner av glatt muskulatur Cell härstamning-Tracing möss
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mahan, S., Liu, M., Baylis, R. A.,More

Mahan, S., Liu, M., Baylis, R. A., Gomez, D. Quantitative Analysis of Cellular Composition in Advanced Atherosclerotic Lesions of Smooth Muscle Cell Lineage-Tracing Mice. J. Vis. Exp. (144), e59139, doi:10.3791/59139 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter