Summary
Proteomet karakterisering av okulär mikrovaskulära sängar är avgörande för fördjupad förståelse av många okulär sjukdomar hos människor. Denna studie visar en effektiv, snabb och robust metod för protein utvinning och provberedning från små blodkärl som sysselsätter den svin korta bakre ciliära artärer som modell fartyg för mass-spektrometri-baserad proteomik analyser.
Abstract
Användningen av isolerade okulära blodkärl in vitro-att dechiffrera det patofysiologiska tillståndet i ögat med hjälp av avancerade tekniska metoder har kraftigt expanderat vår förståelse av vissa sjukdomar. Masspektrometri (MS)-baserad proteomik har vuxit fram som ett kraftfullt verktyg att nysta upp ändringar i molekylära mekanismer och protein signalering utbildningsavsnitt i vaskulär sängarna i hälsa och sjukdom. Provberedningssteg innan MS analyser är dock avgörande för att få reproducerbara resultat och djupgående utredning av det komplexa proteomet. Detta är särskilt viktigt för beredning av okulär microvesselsna, där mängden prov tillgängliga för analyser är ofta begränsat och således utgör en utmaning för optimal protein utvinning. Denna artikel strävar efter att tillhandahålla en effektiv, snabb och robust protokoll för provberedning från en exemplarisk retrobulbär okulär vaskulär säng sysselsätter den svin korta bakre ciliära artärer. De nuvarande metoden fokuserar på protein utvinning förfaranden från både supernatanten och pellets av provet efter homogenisering, prova rengöring med centrifugal filter enheter före endimensionell gel elektrofores och peptid rening steg för etikett-fri kvantifiering i ett flytande kromatografi-elektrospray jonisering-linjära ion trap-Orbitrap MS system. Även om denna metod har utvecklats specifikt för proteomik analys av okulär microvesselsna, har vi också gett övertygande bevis för att det kan även lätt användas för andra tissue-baserade prover.
Introduction
Befordran i fältet av proteomik, som möjliggör integrerad och oöverträffad data collection makt, kraftigt har revolutionerat vår förståelse av de molekylära mekanismerna bakom vissa sjukdomstillstånd samt som återspeglar den fysiologiska tillstånd av en viss cell befolkningen eller vävnad1,2,3,4. Proteomik har också visat sig vara en viktig plattform i oftalmologiska forskning på grund av känsligheten och förutsättningslös analys av olika okulära prover som underlättade identifieringen av potentiella sjukdomsmarkörer för eventuell diagnos och prognos, som framgår elegant av många studier under de senaste åren, inklusive några av våra1,5,6,7,8,9,10. Det är dock ofta svårt att få mänskliga prover för proteomiska analyser på grund av etiska skäl, särskilt med tanke på behovet av kontrollmaterial från friska individer för tillförlitlig jämförande analyser. Däremot, är det också utmanande att få tillräcklig mängd prover för optimal och pålitlig massa spektrometriska analyserna. Detta är särskilt avgörande för mass-begränsad biologiska material såsom mikro-blodkärlen i ögat. En sådan stor retrobulbär blodkärl som spelar avgörande roller i regleringen av okulära blodflödet är den korta bakre ciliära artären (sPCA). Någon störning eller anomalier i denna vaskulära sängen kan leda till allvarliga kliniska konsekvenser, vilket kan leda till patogenesen av flera synhotande sjukdomar som glaukom och nonarteritic främre ischemisk optikusneuropati (NAION)11 , 12. det finns dock en brist på studier belysa förändringarna i proteomet i denna arteriell sängen på grund av ovan nämnda nackdelarna. Därför under senare år har parlamentet svin (Sus scrofa domestica Linnaeus, 1758) har vuxit fram som en bra djurmodell i oftalmologiska forskning på grund av de höga morphologic och fylogenetiska likheterna mellan människor och grisar13, 14,15. Svin okulär prover är lätt tillgängliga och viktigast av allt, är mer exakt representation av mänskliga vävnader.
Med tanke på den viktiga rollen som dessa blodkärl i ögat, liksom bristen på metodik tillgodosedda effektiv protein utvinning och analyser från dessa microvesselsna, har vi tidigare präglat proteomet av de svin sPCA använder en egen protokoll som resulterade i identifieringen av ett stort antal proteiner16. Baserat på denna studie, vi har ytterligare optimerad och beskrivs ingående vår metod i denna artikel, som tillåter proteomet analys från minuten mängder prover med de svin sPCA som modell vävnad. Även om det främsta syftet med denna studie var att fastställa en MS-kompatibel metod för mass-begränsad okulära blodkärl, har vi tillhandahållit omfattande experimentella bevis att beskrivs arbetsflödet också kan tillämpas i huvudsak på olika tissue-baserade prover.
Det är tänkt att arbetsflödet kommer att vara avgörande för beredning av hög kvalitet MS-kompatibel prover från små kvantiteter av material för omfattande proteomet analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella procedurer använder animaliskt prover utfördes i strikt följsamhet till förbundet för forskning i Vision och oftalmologi (ARVO) uttalande om användning av djur i oftalmologiska och Vision forskning och institutionella riktlinjer. Denna studie genomfördes och godkänt på den Department of Ophthalmology, University Medical Centre Mainz.
Obs: Svin ögon tillsammans med synnerven och extraocular vävnader erhölls färskt från det lokala slakteriet omedelbart efter slakt. Utan ögon var transporteras till laboratoriet i iskall fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och användas omedelbart. En schematisk översikt över arbetsflödet anställd är som avbildas i figur 1.
1. lösningar
- För att förbereda Krebs-Henseleit (K-H) buffert, väger de följande kemikalierna (27.68 g NaCl, 8,4 g NaHCO3, 1.4 g av KCl, 1.18 g MgSO4och 0,64 g KH2PO4) i en torr och ren 50 mL koniskt centrifugrör och , 1,47 g CaCl2 och 8,0 g glukos i ett annat rör.
Obs: Pulverblandningen av dessa kemikalier ska förvaras på en sval och torr plats. CaCl2 och glukos pulverblandningen är bäst förberedda färska att förhindra absorption av fukt och klumpar. - För att förbereda 200 µL utvinning buffert 2A per pellet prov, mix 100 µL av utvinning buffert 2 och 100 µL av reagens A från transmembrane protein utvinning kit (se B6 i Tabellen för material).
Obs: Alikvotens komponenterna av transmembrane protein utvinning kit bestående av utvinning buffert 2, reagens A och proteashämmare cocktail i arbetande delar och förvaras vid-20 ° C för långvarig användning. Undvik upprepad frysning och upptining. Tina reagenserna till rumstemperatur (RT) före starten av den pellet extraktionsmetod. - För att förbereda ammoniumbikarbonatlösning (ABC, 100 mM), Lös 0,39 g ABC i 50 mL avjoniserat vatten.
- För att förbereda 10 mM Lös 1, 4-Ditiotreitol (DTT) lösning, 30 mg DTT i 20 mL 100 mM ABC.
- För att förbereda 55 mM Iodoacetamide (IAA) lösning, lös 200 mg IAA i 20 mL 100 mM ABC.
Obs: IAA måste hållas i mörkret. Använd en aluminiumfolie för att Linda rören med ljuskänsliga lösningar. - Förbereda trypsin buffert innehållande 10 mM ABC och 10% (vol / vol) acetonitril (ACN). Tillsätt 1,5 mL trypsin buffert i en injektionsflaska med 20 µg av trypsin att upplösa dess innehåll att förbereda en 13 ng/µL trypsin fungerande lösning.
Obs: Sekvensering grade modified trypsin tillhandahålls frystorkade och måste förvaras i-20 ° C till användning. - För att förbereda peptid utvinning buffert, blanda 1:2 (v/v) 5% myrsyra med ACN.
Obs: Förbereda alla lösningar i steg 1,3-1,7 färska strax före användning och kassera alla oanvända volymer. - För att förbereda 0,1% trifluorättiksyra (TFA), blanda 10 µL av TFA med 10 mL avjoniserat vatten.
2. isolering av korta bakre ciliär artärer
Obs: Svin ögat är i princip uppdelad i de främre (figur 2A) och bakre delar (figur 2B).
- Placera i ögat världen i en dissektion kammare som innehåller iskall K-H buffert. Skär försiktigt bort omgivande muskler och vävnader med en skarp Mayo sax.
- Gör ett snitt med en skalpell och skära i världen längs det ekvatoriella-hyvlar med en skarp Mayo sax tills ögat avskiljs i de främre och bakre halvorna. Ta bort som mycket glaskroppen som möjligt från den bakre halvan av ögat med hjälp av ett par standardmönster pincett.
Obs: Separation av ögat världen i två halvor underlättar isolering av sPCA med lätthet utan att ha ett rörligt öga i dissektion skålen. Detta steg är dock inte obligatoriskt. Fartygen kan också isoleras utan att öppna ögat världen. - Använda dissektion pins till noggrant stift ner den bakre halvan av ögat med den näthinna sidan vänd nedåt och synnerven uppåt mot experimenter.
- Försiktigt skära bort den bindväv som omger synnerven för att exponera den underliggande retrobulbär kärlsystemet med en Student Vännäs våren sax.
- SPCA kan ses som korta grenar av fartyg (mellan 5-8 grenar) som tränger in i sklera och maskrad omger synnervspapillen (figur 2C). Isolera paraoptic och distala sPCA tillsammans med omgivande bindväv med ett par typ 5 precision pincett och Vännäs capsulotomi sax (figur 2D).
Obs: Säkerställa att K-H bufferten förblir iskall i hela förfarandet för isolering. Det rekommenderas starkt att ändra bufferten varje 20-30 min, beroende på omgivningstemperaturen.
3. provberedning
- Försiktigt bort bindväv från arteriell segment med hjälp av extra spetsig typ 5 precision pincett och Vännäs capsulotomi sax under ett stereomikroskop och skölj isolerade artärerna i iskall PBS ta bort föroreningar och blod rester.
Obs: Om proverna inte utsätts för nästa steg omedelbart, snapin-frysa dem i flytande kväve och butik i-80 ° C tills vidare användning. - Poolen artärer från två ögon för att erhålla en biologisk replikera och överföra dem i 1,5 mL mikrocentrifugrör väga proverna med en Analysvåg.
- Till varje rör, tillsätt en blandning av 0,5 mm och 1,0 mm zirkoniumoxid pärlor, följt av vävnad protein utvinning reagens (T-PER; se B7 i Tabellen för material).
Obs: Volymen av T-PER är beroende av vikten av proverna i varje rör, med ett förhållande på 1 mL reagens 50 mg av provet. En allmän tumregel att följa när du fyller rören för homogenisering är volymförhållandet 1:1:2 = prov: pärlor: T-PER (figur 3A). Använd inte för stor en volym av utvinning bufferten och för lite av en mängd pärlor för att förhindra ineffektiva homogenisering. - Ladda provrör i en blender Homogenisatorer (se D6 i Tabellen för material). Ställ in timern på 2 min och hastighet nivå 6 och starta homogenisering. Efter löpning, kontrollera proverna för fullständig homogenisering och upprepa cykeln tills prover är helt homogeniserad (figur 3B).
Obs: Sammanlagt 24 provrör kan homogeniseras i en kör. Det är viktigt att hålla proverna kall under förfarandet homogenisering för att minimera protein denaturering. Bullet mixer homogenisatorn används i denna studie har en inneboende kylande funktion som håller proverna kallt. I fall där inga interna kylning funktionen är tillgänglig i homogenisatorn, kan prover hållas på isen mellan varje körning. - Pipettera omsorgsfullt Homogenatet i färska mikrocentrifugrör. Centrifugera proverna vid 10 000 x g i 20 minuter vid 4 ° C till pellet olösliga proteiner och separat supernatanten innehållande lösliga proteiner. Pipettera omsorgsfullt ut supernatanten i färska mikrocentrifugrör utan att vidröra pellet lagret (figur 3C).
Obs: Både supernatanten och pellet kan lagras i-80 ° C tills vidare användning.
4. pellet matsmältningen
- Lägga till 200 µL utvinning buffert 2A och 5 µL av proteashämmare cocktail varje pellet prov. Centrifugerade flera gånger med en pipett.
Obs: Blanda extraktionsreagens väl innan du lägger i pelleten. Hålla utvinning buffert 2A på is och proteashämmare RT under hela förfarandet för utvinning. -
Använd ett ultraljud Homogenisatorer att helt homogenisera pelleten.
- Ställ in amplituden på 60 och cykeln till 1. Använd en sond i Titan (Ø 0,5 mm, 80 mm lång), som är lämplig för homogenisering av prov med små volymer (10-500 µL).
- Sänk ner sonden i pellets och utvinning buffert blandningen och tryck på startknappen att exponera provet med ultraljudsvågor.
- Sonikera provet tills pellets klumpar är helt homogeniseras. Paus i några sekunder mellan varje ultraljudsbehandling.
- Kontrollera fullständig homogenisering visuellt. Blanda Homogenatet flera gånger med en pipett för att säkerställa att det inte finns några klumpar.
Obs: Förfarandet pellet extraktion bör utföras på is för att förhindra protein denaturering på grund av värme som alstras under homogenisering (figur 4).
5. prova rengöring och buffert Exchange
- Använda centrifugal filter enheter med 3 kDa cutoff (se D3 i Tabellen för material) för detta förfarande enligt tillverkarens anvisningar med ändringar tillämpliga. Först infoga filterenheten i en mikrocentrifug rör (tillhandahålls i filter pack).
- Pipettera 200 µL prov Homogenatet till ett Filterenhet och tillsätt 200 µL avjoniserat vatten i samma filter. Råga ordentligt (figur 5A).
- Placera filtret i en centrifug och spin för 14 000 x g under 15 minuter vid 4 ° C.
- Ta bort enheten från centrifugen och separata filterenheten innehållande prov koncentrat ur mikrocentrifug rör innehållande filtratet. Kassera filtratet (figur 5B).
- Beredes koncentratet genom att lägga till 400 µL avjoniserat vatten i filtret. Upprepa steg 5.3 och 5.4 tre gånger. Pipettera omsorgsfullt 'rensade' prov koncentratet i en ren mikrorör.
Obs: Vanligtvis ett 200 µL rå prov kommer att ge ~ 50-70 µL koncentrat efter filtrering. - Upprepa steg 5.1-5.5 för den återstående prov homogenates.
6. protein mätning
- Använda den bicinchoninic syra (BCA) protein assay kit (se B5 i Tabellen för material) för att fastställa protein koncentrationer av supernatanten och pellet fraktioner av sPCA proverna på en tallrik-läsare.
- Bered de albumin standard (BSA) utspädningarna (slutliga BSA koncentrationer intervall mellan 25 till 2 000 µg/mL) från en 1 mL-ampull bestående av 2 mg/mL BSA, enligt tillverkarens instruktioner.
- Pipettera 10 µL av varje BSA standard utspädning och prov replikerar (supernatanten och pellets) till varje brunn av en 96 brunnar platt-botten mikroplattan.
- Förbereda den BCA arbetar reagens genom att lägga till 50 delar av BCA reagens A 1 del av BCA reagens B.
Obs: Beräkna den totala volymen av arbetande reagens som krävs för varje mätning före beredning och nymalen förbereda tillräcklig volym baserat på antalet prover och standard utspädningar att analyseras. - Noggrant Pipettera 200 µL av den BCA arbetar reagens i varje brunn. Täcka mikroplattan och inkubera vid 37 ° C i 30 min. Efter kylning plattan till RT Mät absorbansen vid 562 nm på en Plattläsare (se D13 i Tabellen för material).
- Baserat på standardkurvan genereras för varje BSA standard koncentration (µg/mL), bestämma protein koncentrationerna av proverna.
7. endimensionell gelelektrofores (1DE)
- Bereda proverna för 1DE som visas i tabell 1 (för ett prov). Blanda provet blandningen väl med en pipett. Värm proverna vid 70 ° C i 15 min och coolt att RT.
- Laga 1 x kör buffert genom att lägga till 50 mL MES SDS kör buffert 950 mL avjoniserat vatten. Blanda väl.
-
Förbereda förtillverkade 4-12% Bis-Tris protein gels (se B4 i tabellen av material).
- Uppskuren i plast påse för att ta bort gel kassetten och skölj kassett med avjoniserat vatten.
- Ta bort kammen ur gel kassetten i en flytande rörelse, noga med att inte skada brunnarna.
- Skölj försiktigt lastning brunnarna 2 - 3 gånger med 1 x Running Buffer med pipett. Vänd och skaka försiktigt gel kassetten för att ta bort den bufferten, att säkerställa att det inga luftbubblor i brunnarna.
- Ta bort den vita tejpen på botten av gel kassetter.
- Infoga geler (maximalt två kassetter) in i gel som kör tank och när färdigmonterade, låsa gel spänning kilen.
- Fyll övre (katod) bufferten kammare med 200 mL kör buffert tills brunnarna är helt täckt. Kolla efter eventuella läckor.
- Tillsätt 500 µL av antioxidant (se A14 i Tabellen för material) till kör bufferten.
Obs: Antioxidanten är en anständighet reagens som måste användas med prover minskas med reduktionsmedel (se tabell 1) att upprätthålla de reducerande förhållandena under elektrofores och förhindra re-oxidation av känsliga amino syror såsom tryptofan och metionin. - Noggrant läsa 50 µg prov per körfält med pipett. Fyll sedan, före färgade protein standarden som molekylär massa markör (se A18 i Tabellen för material).
- Fyll den nedre (anod) buffert kammaren med 600 mL kör buffert.
- Kör gelen i ~ 60 min vid en konstant spänning på 175 V. I slutet av körningen, ta försiktigt bort gelen från kassett plattan med en gel-kniv.
-
Försiktigt över gelerna till en gel färgning box.
- Bered den fastställande färska baserat på det totala antalet geler som behöver färgas, enligt tillverkarens instruktioner som beskrivs i tabell 2.
- Skaka gel(s) i fastställande lösningen för 10 min vid RT på en gungande plattform.
-
Kassera den fastställande lösningen och fläcken gelerna med kolloidal blå färgning kit.
- Förbereda färgning lösningar färska baserat på det totala antalet geler som behöver färgas, enligt tillverkarens instruktioner som beskrivs i tabell 3.
- Först mäta lämplig volym och blanda direkt komponenterna markerade med en asterisk (*) i gel färgning box. Skaka gel(s) i färglösningen utan Stainer B för 10 min vid RT på en gungande plattform.
- Lägg till Stainer B direkt i den färgning box som innehåller den * färgning lösning. Se till att skaka Stainer B väl före användning.
Varning: Utför förberedelser 7.10.1 och 7.11.1 under ett dragskåp.
- Skaka gel(s) i färglösningen över natten för bästa övergripande resultat.
Obs: De färgade band kommer att bli synlig inom 10 min efter tillägg av Stainer B. färgning kräver minst 3 h och intensitet varierar inte om kvar längre timmar i färglösningen. - Noggrant Häll färglösningen och ersätta med 200 mL avjoniserat vatten. Skaka gel(s) för minst 7-8 tim i vatten att rensa bakgrunden.
Obs: Avjoniserat vatten måste ändras flera gånger under det destaining förfarandet att bättre ta bort överdriven fläcken. Gel(s) kan också lämnas i vatten upp till 3 dagar utan att kompromissa med protein band intensiteten. Om gel(s) inte utsätts för nästa steg omedelbart, kan det lagras i 20% lösning av ammoniumsulfat vid 4 ° C för långsiktig lagring.
8. i-gel Tryptic matsmältningen
Obs: Detta protokoll är enligt metoden av Shevchenko et al.17, med smärre ändringar. Detta förfarande bör utföras i en laminär huva och använda särskild uppsättning Pipetter, tips, rör och glasvaror speciellt för detta ändamål. Använd handskar och lämpliga lab kläder hela tiden att förhindra keratin och andra föroreningar. Förbereda alla lösningar och reagenser som används i den här proceduren strax före användningen.
- Punktskatt banden protein från gelen med ren, ny mikrotomen blad. Klippa bandet i små bitar (ca 1 x 1 mm till 2 x 2 mm). Försiktigt över gel bitarna i 1,5 mL mikrocentrifugrör.
Obs: Bitar som är för små kan täppa pipettspetsar och större bitar kommer att minska peptid återhämtning. Var försiktig när du använder mikrotomen blad, som är extremt vassa. -
Avfärgning
- Tillsätt 500 μl av avfärgning lösning innehållande 100 mM ABC lösning/ACN (1:1, v/v) och inkubera prover på RT för 30 min med enstaka skakar eller vortexa.
- Pipettera omsorgsfullt ut destaining lösningen. Kontrollera visuellt för eventuella tuber med kvarstående fläck. Upprepa steg 8.2.1 om gel bitar fortfarande färgas blå.
-
Minskning och alkylering
- Tillsätt ~ 400 µL av nylagade DTT lösning och inkubera vid 56 ° C för 30 min. se till att lösningen helt täcker gel bitar. Noggrant Pipettera minska lösning och kassera.
- Tillsätt ~ 400 µL av nylagade IAA lösning och inkubera i mörker vid RT för 30 min. ta bort de alkylerande buffert med en pipett och kassera.
-
Matsmältningen
- Tillsätt 500 µL av snyggt ACN på RT för 10-15 min tills gel bitar krympa och bli ogenomskinlig. Pipettera ut ACN och lufttorka gel stycken för 5-10 min under huven.
- Överför med pipett 50 μl av trypsin lösning till varje tub att helt täcka gel bitar. Inkubera rören i 4 ° C i 30 min.
- Efter 30 min, kontrollera varje tub om alla trypsin lösning har absorberats av gel bitar. Lägg till tillräcklig volym av trypsin buffert (50-100 µL, beroende på volymen i röret) för att helt täcka gel bitar, om nödvändigt. Inkubera proverna över natten vid 37 ° C.
-
Peptid utvinning
- Noggrant Pipettera extraherade peptid lösningen från rör och överföring till ren mikrorör. Torka supernatanten i en centrifugal vakuum evaporator.
Obs: Kasta inte resterande gel bitar. - Tillsätt 100 µL av utvinning buffert (se steg 1,7) till varje rör och inkubera i 30 minuter vid 37 ° C under skakning.
- Pipettera supernatanten i den samma mikrorör som innehåller de extraherade peptiderna enligt respektive banden och torka ned i en vakuum centrifug.
Obs: Inte används omedelbart, kan torkade peptid extrakt förvaras i-20 ° C upp till flera månader tills vidare användning.
- Noggrant Pipettera extraherade peptid lösningen från rör och överföring till ren mikrorör. Torka supernatanten i en centrifugal vakuum evaporator.
9. peptid rening
Obs: Denna peptid exempel avsaltning och rening procedur utförs med användning av C18 pipettspetsar (se C15 i Tabellen för material). Använd ett nytt tips för varje prov.
- Förbereda de följande lösningar färska i koniskt centrifugrör och delprov i 2 mL mikrocentrifugrör för peptid rening förfarandet, som visas i tabell 4. En sammanfattning av rören för peptid rening är följande: Tube en (provlösning), Tube B (vätning lösning), Tube C (Jämviktstiden lösning), Tube D (tvättlösningen), Tube E (eluering lösning), Tube F (en tom 2 mL eller 5 mL mikrocentrifug rör, beroende på antalet prover som skall rengöras, för avfallshantering), och Tube G (en ren, Tom mikrorör, kapacitet 0,2 mL).
- Rekonstituera torkade peptid extrakt från steg 8.6.3 med 10 µL 0,1% Transfettsyror. Detta rör designeras Tube A.
- Sonikera rör A i ultraljudsbad med is i 5 min.
- Snurra ner provlösningen i en bänkmonterade Centrifugera vid 1 000 x g i 1 min.
- Ange en P10 mikropipett till maximal volyminställning av 10 µL och fäst en C18 pipettspetsen säkert.
- Sänk ner pipettspetsen i vätning lösningen (Tube B) och sug noga upp i förpackningsmaterialet. Långsamt fördela avfallet till Tube F. Upprepa detta steg minst 7 - 8 gånger.
Obs: Sänka pipett kolven stanna och långsamt släppa eller avstå från kolven under hela förfarandet. Vidta försiktighetsåtgärder för att inte införa luftbubblor i tipsen under pipettering för att säkerställa maximal peptid bindning till C18 kolonnen. - Temperera tipset för peptid bindande av utvärderingsenheten 10 µL Jämviktstiden lösning i Tube C. Ignorera lösningen och upprepa proceduren 3 till 4 gånger.
- Nästa, aspirera och avstå från provlösningen i röret A flera gånger (beroende motsvarande gel band tjocklek) om du vill binda peptiderna till spets kolumn.
Varning: I aspiration och dispensering steg under förfarandet för bindande (steg 9,8) genomförs inom Tube A. Inte att avstå från provlösningen till avfall. - Tvätta C18 pipettspetsen genom att aspirera tvättlösningen i Tube D och kasta det avfall (Tube F) 4 till 5 gånger.
- Slutligen eluera de bundna peptiderna genom pipettering eluering lösningen (Tube E) och dispenseras i eluant i tube G.
- Upprepa hela steg 2 till 3 cykler per prov att öka urvalet.
- Kassera spets efter ett prov rening och använda ett nytt tips för nästa provet.
- Torka de renade peptid eluat i en vakuum koncentrator.
Obs: Renat proverna är nu redo för LC-MS/MS analyser i LC-ESI-LTQ-Orbitrap MS-systemet. Lagra de torkade proverna i-20 ° C tills vidare användning.
10. flytande kromatografi-elektrospray jonisering-MS/MS analyser
Obs: Etikett-fri Kvantitativ proteomik analys utförs på ett flytande kromatografi-elektrospray jonisering-linjära ion trap-Orbitrap (LC-ESI-LTQ-Orbitrap) MS system. LC är sammansatt av Rheos Allegro Kvartära pump utrustad med en online degasser (kopplade till en HTS PAL autosampler och systemet består av en 30 x 0,5 mm C18 före kolumn ansluten till en 150 x 0,5 mm C18 kolumn. Använd omvänd fas aqueous lösningsmedel A bestående av LC-MS grade vatten med 0,1% (v/v) myrsyra och organiska lösningsmedel B bestående av LC-MS grade acetonitril med 0,1% (v/v) myrsyra. Använda övertoningen med en rinnande tid av 60 min per gel band, som beskrivs i detalj i våra tidigare studier6,16.
- Upplösa renat peptid proverna i 10 µL 0,1% Transfettsyror. Sonikera proverna på is för 5 min.
- Pipettera 10 µL prov i en V-botten 96 brunnar tallrik och förslut med en tydlig, självhäftande locket film.
- Överföra plattan till autosampler.
- Använd följande övertoningen för varje speltid 60 min: 0-35 min (15-40% lösningsmedel B), 35-40 min (40-60% lösningsmedel B), 40-45 min (60-90% lösningsmedel B), 45-50 min (90% lösningsmedel B), 50-53 min (90-10% lösningsmedel B) och 53-60 min (10% lösningsmedel B).
- Använd följande massa spektrometriska villkor för instrumentet: positiv jon elektrospray jonisering läge, spray spänning (2.15 kV), kapillär temperatur (220 ° C), data-beroende förvärv läge, automatisk förvärv växling mellan Orbitrap-MS och LTQ MS/MS, orbitrap upplösning (30 000), m/z utbud (300 till 1 600), target automatisk förstärkningskontroll (AGC, 1,0 x 106 joner), interna omkalibrering (polydimethlycyclosiloxane [PCM] på m/z 445.120025 joner i realtid), låsa massa alternativet aktiverat i MS-läge, Tandem uppgifter som erhållits genom att välja de topp fem mest intensiva föregångare joner, ytterligare fragmentering av kollision-inducerad dissociation (CID), normaliserade kollision energi (NCE, 35% aktiveringen tid av 30 ms med upprepningsantalet 3) och dynamiska utslagning varaktighet (600 s).
Obs: De resulterande fragmenterade jonerna registreras i LTQ. - Kör minst tre biologiska replikat för varje prov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Begränsade prov tillgänglighet är en av de stora nackdelarna i oftalmologiska forskning. På motsvarande sätt ge extraktionsmetoder för optimal protein från små mängder prover såsom okulära blodkärl är ofta diskutabla. I dag finns det en brist på metoder särskilt tillgodosedda protein utvinning från retrobulbär blodkärl. Därför, som ett första steg i metoden optimering och som ett proof-of-principle att jämföra effekt och robusthet av flera vanligen anställd protein utvinning rengöringsmedel till en relativt ny reagens, T-PER, genomförde vi en pilotstudie med hjärtats vävnader från möss (på grund av lätt och tillräckligt prov tillgänglighet för optimering steg). Vi jämförde protein avkastningen genom att jämföra den totala protein koncentrationer och totala proteiner identifieras med hjälp av följande reagenser: T-PER, 0,02% n-dodecyl-β-D-maltoside (DDM), 1% 3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio] -1-propan sulfonat (KÄKAR), 1% amidosulfobetaine-14 (ASB-14) och en blandning av ACN och TFA (20% ACN / 1% TFA). Den totala mängden proteiner i prover extraheras med var och en av dessa rengöringsmedel är som avbildas i figur 6A, med den högsta avkastningen från vävnader extraheras med T-PER (56,4 µg/mg vävnad), följt av DDM (22.88 µg/mg vävnad), KÄKAR (16.01 µg/mg vävnad), ASB-14 (11.56 µg/mg vävnad) och den lägsta avkastningen från ACN/TFA (4,38 µg/mg vävnad). Konsekvent, de totala proteiner identifierats var också den högsta i T-PER-extraheras provet (1649 proteiner) > DDM (1310 proteiner) > KÄKAR (1319 proteiner) > ASB-14 (1121 proteiner) > ACN/TFA (924 proteiner), som visas i figur 6B. Baserat på dessa resultat, vi fortsatte med protein utvinning från sPCA prover med T-PER.
Nästa, optimering av prov förberedelse protokoll före före fraktionering i 1DE är ett mycket avgörande steg för att få väl separerade protein band och mycket reproducerbara resultat mellan prover och replikat. Betydelsen av dessa steg är återspeglas och markerat i resultaten av 1DE. Figur 7 visar jämförelsen mellan 1DE protein profiler av sPCA före och efter utsätts för optimerad provpreparering och rengöringssteg. Sammantaget en hög grad av smetning och dålig separation av de protein-band observerades vid lane 3. Denna profil visar att proverna kan innehålla utvinning reagens och också föroreningar såsom lipider och cellulära skräp. Dock sPCA proverna som avskildes i supernatanten och pellet och utsätts för den optimerade protokoll resulterade i exemplariskt 1DE profiler, som representerade i lane 1 och 2 (figur 7).
I gist, baserat på dessa lovande resultat, är metoden optimerad för snabb, robust och effektiv lösligt protein utvinning från okulär microvesselsna att anställa vävnad protein utvinning reagens (T-PER) och använda utvinning buffert 2A (TM-PEK) för att extrahera membran-baserade proteiner som finns i provet pelleten. Därefter prova homogenates (T-PER fraktion) utsätts för buffert exchange och prov rengöring med 3 kDa centrifugal filterenheter före 1DE. Optimal prov koncentrationen är 50 µg per brunn. Däremot, måste det betonas här att detta protokoll gäller inte bara för små vävnader såsom blodkärl, men är också möjligt för andra tissue-baserade prover. Detta framgår av 1DE profiler av murina hjärnan och hjärtat vävnader, som visade att det finns ett stort antal proteiner som kan extraheras från både supernatanten (figur 8A, B) och pellet fraktioner (figur 8C, D ).
Figur 1 : Arbetsflöde, översikt. En schematisk representation av de protokoll som används för etikett-fri kvantitativa proteomet analys av de svin sPCA. Denna procedur är i allmänhet uppdelad i två stora delar bestående av microvessel provberedningssteg och MS-baserad proteomik strategi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Representativa fotografier av svin ögonen. (A) laterala Visa av ögat världen visar hornhinnan, som är belägen i den främre delen av ögat, sklera, omgivande muskler och synnerven. (B) bakre Visa av ögat visar synnerven. (C) grenar av sPCA sett längst bak i ögat världen består av paraoptic och distala grenar. (D) isolerade sPCA med omgivande fett och bindväv. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Provet homogenisering. Representativa fotografier visar provet (A) innan och (B) efter homogenisering. (C) den homogeniserade prover var ytterligare separeras i supernatanten innehållande lösliga proteiner och pellets som innehåller olösliga, transmembrana-baserade proteiner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Pellet protein extraktionsmetod. För att förhindra protein denaturering, extraheras pellet prover på is. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Prov rengöring. Buffert exchange utförs med 3 kDa cutoff centrifugal filter Rengör proverna före MS analys. Representativa fotografier visar Homogenatet (A) innan och (B) efter filtrering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 : Jämförelse av protein utvinning effekt och robusthet mellan T-PER och fyra gemensamma protein utvinning rengöringsmedel. Stapeldiagram som skildrar (A) protein belopp och (B) totalt antal proteiner som identifieras med hjälp av T-PER, 0,02% DDM, 1% KÄKAR, 1% ASB-14 och 20% ACN / 1% Transfettsyror. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7 : Representativa 1DE gel av svin sPCA protein profilerna före och efter optimering. Lane 3 skildrar 1DE profilen av provet som inte utsattes för något föregående rengöringssteg. Lane 1 och 2 visar exemplariskt protein profiler av sPCA supernatanten och pellet, respektive, efter att utsätta proverna för optimerad provpreparering och rengöringssteg. Gel var fläckad med kolloidal blå färgning kit. M = markör. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8 : Representativa kolloidal blå-färgade 1DE gel av exemplarisk tissue-baserade prover. Protein profiler av supernatanten (A, B) och pellet (C, D) av murina hjärnan och hjärtvävnad stickprov, respektive, på 50 µg per brunn. Supernatanten och pellet proteiner utvanns sysselsätter T-PER och transmembrane protein utvinning kit, respektive. M = markör. R1-R3 representerar tre replikat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Komponent | Volym (µL) |
| Prov (supernatanten eller pellet) | x |
| LDS prov buffert (4 x) | 2.5 |
| Reduktionsmedel (10 x) | 1 |
| Avjoniserat vatten | Upp till 6,5 (beroende på provets volym) |
| Totala volymen per prov | 10 |
| Obs: x beräknas baserat på protein koncentrationen (50 µg totalt protein per prov). | |
Tabell 1:1 dimensionella gelelektrofores (1DE). Information om de komponenter som krävs för provberedning att utföra 1DE.
| Lösning | För 1 gel (mL) | För 2 geler (mL) | För 4 geler (mL) |
| Avjoniserat vatten | 40 | 80 | 160 |
| Metanol | 50 | 100 | 200 |
| Ättiksyra | 10 | 20 | 40 |
Tabell 2: Gel fixering. Information om de komponenter som krävs för att förbereda fastställande lösning för 1DE.
| Lösning | För 1 gel (mL) | För 2 geler (mL) | För 4 geler (mL) |
| * Avjoniserat vatten | 55 | 110 | 220 |
| * Metanol | 20 | 40 | 80 |
| * Stainer A | 20 | 40 | 80 |
| Stainer B | 5 | 10 | 20 |
Tabell 3: Gel färgning. Detaljer av komponenter för beredning av den kolloidal blå färgning lösning.
| Lösningen (för) | Sammansättning | ACN ** | H2O ** | TFA | Totala volym * |
| Vätning | 100% ACN | 2 mL | 2 mL | ||
| #Washing och Jämviktstiden | 0,1% TFA | 10 mL | 10 ΜL | ~ 10 mL | |
| Peptid eluering | 0,1% Transfettsyror i 60: 40 = ACN: H2O | 6 mL | 4 mL | 10 ΜL | ~ 10 mL |
| Obs: * den totala volymen bör anpassas efter det totala antalet prover att utsättas för Zip spets rengöring. | |||||
| ** Använd HPLC-kvalitet eller LC-MS-grade. | |||||
| # Förbereda två separata Eppendorf-rör för tvätt och Jämviktstiden, respektive. | |||||
Tabell 4: peptid rening. Detaljer av komponenter och deras respektive kompositioner för peptid rening förfarande med hjälp av C18 pipett tips.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Omfattande proteomet profilering av ett varierat utbud av okulär prover är ett viktigt och nödvändigt första steg för att klarlägga de molekylära mekanismer och signalvägar involverade i hälsa och sjukdom. För att få data av hög kvalitet och säkerställa reproducerbarheten för resultaten från dessa analyser, de föregående provberedningssteg är avgörande, som framhållits i en recension av Mandal et al. som diskuterade ingående prov bearbetning förfaranden anställa tvådimensionell gel elektrofores och mass spectrometry strategi1för olika delar av ögat. I raden av dessa utredningar ger vår nuvarande studie en optimerad stegvisa protokoll för snabb, robust och högeffektiv MS-kompatibel provberedning med de svin sPCA som modell okulär microvesselsna. Denna undersökning inleddes till följd av bristen på specifik metod att extrahera tillräckliga mängder proteiner från kvantitet-begränsad arteriell prover att generera data för MS av hög kvalitet. Vår metod är också en strävan att bidra till den befintliga samlade kunskap om användning av mikroskala tekniker som möjliggör utmärkta proteomet mappning18.
I området i närheten finns det flera kritiska aspekter i detta experimentellt protokoll som behöver beaktas för optimal prestanda för en kvantitativ proteomet analys. Först, är det viktigt att proven, oavsett belopp, utsätts för fullständig homogenisering att säkerställa optimal protein utvinning. I vår metodik bidrog användningen av en blandning av olika storlek pärlor och bullet mixer Homogenisatorer för komplett vävnad lysis. Typ och storlek av pärlor används beror på Provtyp och mängd. Pärlor med högre densiteter, som för närvarande utnyttjas ZrO2 och rostfritt stål, är lämpliga för medium-tuff vävnader och fungerat speciellt bra för blodkärlen.
Det andra är det nödvändigt att skilja supernatanten från pellets och, att utsätta den senare för matsmältningen och extraktion med hjälp av angivna kit. Detta steg är avgörande för att extrahera hög molekylvikt proteiner såsom transmembrana proteiner, som annars är svåra att homogenisera med milda tvättmedel19,20,21. Utfällda pellet löses bäst med ultraljudsbehandling för att undvika prov förlust av splash-up introduceras under kraftig agitation eller skakningar metoder.
För det tredje är det anmärkningsvärt att alla prov förberedelse procedurer utförs vid låg temperatur (4 ° C), om inte annat anges i metodik. Detta är att säkerställa minimal protein denaturering under förfarandena som utvinning. Fjärde, upprepad frysning-upptining av prover bör undvikas för att förhindra proteinnedbrytning och försämring av provets kvalitet.
Slutligen, borttagning av föroreningar och rengöringsmedel är nödvändigt efter protein utvinning till nedströms att störningar förhindras under i-gel fraktionering, enzymatisk nedbrytning och MS analys18,22. Dessa föroreningar störa ofta resolution av elektroforetiska separationen och på motsvarande sätt påverka visualisering av resultatet, som visas i 1DE profilen (figur 7). För att kringgå problemet, gynnas användning av centrifugal cutoff filter enheter för sin användarvänlighet och minimal protein förlust.
Även om de nuvarande experimentella rutiner ger en djupgående outlook till de viktiga provberedningssteg för optimal etikett-fri kvantitativa MS analyser, finns det två begränsningar. Först, sPCA prover var poolats från två svin ögon att tillhandahålla tillräckliga mängder vävnader för efterföljande analys. Eftersom ögonen från det lokala slakteriet är randomiserade och därför, det är inte känt om blodkärlen är att vara isolerad från ögonen på samma djur, mildrar prov pooling interindividuella variationer5,6. Dock kan den nuvarande metoden även anpassas för individuella provberedning beroende på antalet prover tillgängliga. För det andra, den presenterade metoden har utvecklats speciellt för 1DE gel-baserad fraktionering. Även om den nuvarande metoden för integration förenlighet med uppifrån och ned och andra fraktionering metoder garanterar utredning, valde vi 1DE på grund av flera faktorer alltifrån bra reproducerbarhet, användarvänlighet kvalitetskontroll till bättre djup av analyser , särskilt för komplexa prover, såsom för närvarande exemplifieras okulära blodkärl1,5,23.
Sammanfattningsvis, trots de begränsningar som lyfts fram ovan, representerar beskrivs arbetsflödet en enkel men robust förhållningssätt till stränga provberedningssteg som tillgodoses specifikt för analys av liten mängd blodkärl. Det är också viktigt att framhålla här att denna metod kan lätt integreras för mass spectrometry-baserade proteomiska analys av andra cell - och tissue-baserade prover.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Dr. Manicam stöds av den interna universitet forskningsmedel (Stufe 1) från universitet medicinska centrum av Mainz Johannes Gutenberg universitet och ett bidrag från den Deutsche Forschungsgemeinschafts (MA 8006/1-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A. Chemicals | |||
| 1, 4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 1.11474 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Carl Roth | 5239.1 | 2.5 mM |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190169 | |
| Formic acid (CH2O2) | AppliChem | A0748 | |
| HPLC-grade acetonitrile (ACN, C2H3N) | AppliChem | A1605 | |
| HPLC-grade methanol (CH3OH) | Fisher Scientific | M/4056/17 | |
| HPLC-grade water | AppliChem | A1589 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| Kalium chloride (KCl) | Carl Roth | 6781.1 | 4.7 mM |
| Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth | 3904.2 | 1.2 mM |
| LC-MS-grade acetic acid | Carl Roth | AE69.1 | |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | Carl Roth | 261.2 | 1.2 mM |
| NuPAGE Antioxidant | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0005 | |
| NuPAGE LDS Sample buffer | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0007 | 4x |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0002 | 20x |
| NuPAGE Sample reducing agent | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0004 | 10x |
| SeeBlue Plus2 pre-stained protein standard | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | LC5925 | |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth | 9265.2 | 118.3 mM |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Carl Roth | 965.3 | 25 mM |
| Trifluoroacetic acid (TFA, C2HF3O2) | Merck Millipore | 108178 | |
| α-(D)-(+)- Glucose monohydrate | Carl Roth | 6780.1 | 11 mM |
| B. Reagents and Kits | |||
| 0.5 mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB05 | |
| 1.0 mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB10 | |
| Colloidal Blue Staining Kit | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | LC6025 | To stain 25 mini gels per kit |
| NuPAGE 4-12 % Bis-Tri gels | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0321BOX | 1.0 mm, 10-well |
| Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| ProteoExtract Transmembrane Protein Extraction Kit, TM-PEK | Merck Millipore | 71772-3 | 20 reactions per kit |
| Tissue Protein Extraction Reagent (T-PER) | Thermo Scientific | 78510 | |
| C. Tools | |||
| 96-well V-bottom plates | Greiner Bio-One | 651180 | |
| Corning 96-well flat-bottom plates | Sigma-Aldrich | CLS3595-50EA | |
| Disposable microtome blades | pfm Medical | 207500014 | |
| Disposable scalpels #21 | pfm Medical | 200130021 | |
| Dissection pins | Carl Roth | PK47.1 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Falcon conical centrifuge tubes (50 mL) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Mayo scissors, Tough cut | Fine Science Tools | 14130-17 | |
| Precision tweezers | Fine Science Tools | 11251-10 | Type 5 |
| Precision tweezers, straight with extra fine tips | Carl Roth | LH53.1 | Type 5 |
| Self-adhesive sealing films for microplates | Ratiolab (vWR) | RATI6018412 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Student Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 91501-09 | |
| Vannas capsulotomy scissors | Geuder | 19760 | Straight, 77 mm |
| ZipTipC18 pipette tips | Merck Millipore | ZTC18S096 | |
| D. Equipment and devices | |||
| 150 × 0.5 mm BioBasic C18 column | Thermo Scientific, Rockford, USA | 72105-150565 | |
| 30 × 0.5 mm BioBasic C18 pre-column | Thermo Scientific, Rockford, USA | 72105-030515 | |
| Amicon Ultra-0.5 3K Centrifugal Filter Devices | Merck Millipore | UFC500396 | Pack of 96. |
| Analytical balance | Sartorius | H51 | |
| Autosampler | CTC Analytics AG, Zwingen, Switzerland | HTS Pal | |
| BBY24M Bullet Blender Storm | Next Advance | NA-BB-25 | |
| Eppendorf concentrator, model 5301 | Sigma-Aldrich | Z368172 | |
| Eppendorf microcentrifuge, model 5424 | Fisher Scientific | 05-403-93 | Non-refrigerated |
| Heraeus Primo R Centrifuge | Thermo Scientific | 75005440 | Refrigerated |
| Labsonic M Ultrasonic homogenizer | Sartorius | BBI-8535027 | |
| LC-MS pump, model Rheos Allegro | Thermo Scientific, Rockford, USA | 22080 | |
| LTQ Orbitrap XL mass spectrometer | Thermo Scientific, Bremen, Germany | ||
| Multiskan Ascent plate reader | Thermo Labsystems | v2.6 | |
| Rotator with vortex | neoLab | 7-0045 | |
| Titanium probe (Ø 0.5 mm, 80 mm long) | Sartorius | BBI-8535612 | |
| Ultrasonic bath, type RK 31 | Bandelin | 329 | |
| Xcell Surelock Mini Cell | Life Technologies | El0001 |
References
- Mandal, N., Heegaard, S., Prause, J. U., Honoré, B., Vorum, H. Ocular proteomics with emphasis on two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry. Biological Procedures Online. 12, 56-88 (2010).
- Gregorich, Z. R., Ge, Y. Top-down proteomics in health and disease: Challenges and opportunities. Proteomics. 14, 1195-1210 (2014).
- Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422, 198-207 (2003).
- Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537, 347-355 (2016).
- Cehofski, L. J., Mandal, N., Honoré, B., Vorum, H. Analytical platforms in vitreoretinal proteomics. Bioanalysis. 6, 3051-3066 (2014).
- Manicam, C., et al. Proteomics Unravels the Regulatory Mechanisms in Human Tears Following Acute Renouncement of Contact Lens Use: A Comparison between Hard and Soft Lenses. Scientific Reports. 8, 11526 (2018).
- Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Characterization of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR 4) in human tear proteome. Proteomics. 14, 1698-1709 (2014).
- Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Proteomics analysis of human tears from aqueous-deficient and evaporative dry eye patients. Scientific Reports. 6, 29629 (2016).
- Perumal, N., Funke, S., Wolters, D., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Characterization of human reflex tear proteome reveals high expression of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR4). Proteomics. 15, 3370-3381 (2015).
- Perumal, N., et al. Characterization of the human aqueous humour proteome: A comparison of the genders. PloS ONE. 12, 0172481 (2017).
- Hayreh, S. S. Posterior ciliary artery circulation in health and disease the Weisenfeld lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 749-757 (2004).
- Zeitz, O., et al. Glaucoma progression is associated with decreased blood flow velocities in the short posterior ciliary artery. British Journal of Ophthalmology. 90, 1245-1248 (2006).
- Verma, N., Rettenmeier, A. W., Schmitz-Spanke, S. Recent advances in the use of Sus scrofa (pig) as a model system for proteomic studies. Proteomics. 11, 776-793 (2011).
- Foulds, W. S., Kek, W. K., Luu, C. D., Song, I. C., Kaur, C. A porcine model of selective retinal capillary closure induced by embolization with fluorescent microspheres. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, 6700-6709 (2010).
- Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I. The parameters of the porcine eyeball. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 249, 475-482 (2011).
- Manicam, C., Perumal, N., Pfeiffer, N., Grus, F. H., Gericke, A. First insight into the proteome landscape of the porcine short posterior ciliary arteries: Key signalling pathways maintaining physiologic functions. Scientific Reports. 6, 38298 (2016).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havli, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1, 2856-2860 (2006).
- Feist, P., Hummon, A. B. Proteomic challenges: sample preparation techniques for microgram-quantity protein analysis from biological samples. International Journal of Molecular Sciences. 16, 3537-3563 (2015).
- Cox, B., Emili, A. Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics. Nature Protocols. 1, 1872-1878 (2006).
- Zhang, L., et al. Proteomic analysis of mouse liver plasma membrane: use of differential extraction to enrich hydrophobic membrane proteins. Proteomics. 5, 4510-4524 (2005).
- Zhou, H., et al. Improved recovery and identification of membrane proteins from rat hepatic cells using a centrifugal proteomic reactor. Molecular & Cellular Proteomics. 10, 111 (2011).
- de la Cuesta, F., Mourino-Alvarez, L., Baldan-Martin, M., Moreno-Luna, R., Barderas, M. G. Contribution of proteomics to the management of vascular disorders. Translational Proteomics. 7, 3-14 (2015).
- Cottingham, K. 1DE proves its worth... again. Journal of Proteome Research. 9, 1636 (2010).
