Summary

Preparação da amostra para análise de Proteomics baseados em massa-espectrometria de Microvessels Ocular

Published: February 22, 2019
doi:

Summary

Caracterização do Proteome de leitos microvasculares oculares é crucial para a compreensão aprofundada de muitas patologias oculares em seres humanos. Este estudo demonstra um método eficaz, rápido e robusto para a extração de proteínas e preparação da amostra de pequenos vasos sanguíneos, empregando porcinos curtas posteriores artérias ciliares como vasos de modelo para análise proteômica de espectrometria de massa-base.

Abstract

O uso isolado ocular vasos sanguíneos in vitro para decifrar o estado fisiopatológico do olho usando abordagens tecnológicas avançadas expandiu-se enormemente nossa compreensão de certas doenças. Espectrometria de massa (MS)-baseado proteomics surgiu como uma ferramenta poderosa para desvendar as alterações nos mecanismos moleculares e proteínas de sinalização de percursos nas camas vasculares na saúde e na doença. No entanto, etapas de preparação de amostra antes MS análises são cruciais para obter resultados reprodutíveis e elucidação em profundidade o complexo proteome. Isto é particularmente importante para a preparação de microvessels ocular, onde a quantidade de amostra disponível para análise é muitas vezes limitada e assim, representa um desafio para a extração de proteína ideal. Este artigo visa fornecer um protocolo eficiente, rápido e robusto para a preparação da amostra de um leito vascular ocular retrobulbar exemplar empregando porcinos curtas posteriores artérias ciliares. O presente método concentra-se nos procedimentos de extração da proteína do sobrenadante e sedimento da amostra após a homogeneização, limpeza com dispositivos de filtro centrífugo antes unidimensional gel de eletroforese e peptídeo purificação da amostra passos para a quantificação de rótulo livre num sistema MS Orbitrap-ion trap linear-ionização electrospray-cromatografia líquida. Embora este método foi desenvolvido especificamente para proteomics análises de microvessels ocular, nós também fornecemos evidências convincentes de que pode também ser facilmente empregado para outras amostras de tecido com base em.

Introduction

O avanço no campo da proteômica, quais licenças integrado e insuperável poder de coleta de dados, extremamente tem revolucionado nossa compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes a certas condições de doença, bem como refletindo o estado fisiológico de uma célula específica população ou tecido1,2,3,4. Proteomics também provou para ser uma plataforma importante na pesquisa oftálmica devido a sensibilidade e a análise imparcial das diferentes amostras oculares que facilitou a identificação de potenciais marcadores de doença para eventual diagnóstico e prognóstico, como evidenciado elegantemente por muitos estudos nos últimos anos, incluindo alguns dos nossos1,5,6,7,8,9,10. No entanto, muitas vezes é difícil obter amostras humanas para análises de proteomic devido a razões éticas, especialmente considerando a necessidade de material de controle de indivíduos saudáveis para as análises comparativas confiáveis. Por outro lado, é também um desafio para obter a quantidade suficiente de amostras para análises de espectrometria de massa ideais e confiáveis. Isto é particularmente crucial para massa-limitada materiais biológicos como os microvasos do olho. Um tal vaso sanguíneo retrobulbar grandes que tem um papel fundamental na regulação do fluxo sanguíneo ocular é a artéria ciliar posterior curta (sPCA). Qualquer perturbação ou anomalias nesta cama vascular podem resultar em graves repercussões clínicas, que podem levar à patogênese de várias doenças fatais vista como glaucoma e nonarteritic neuropatia óptica isquêmica anterior (NAION)11 , 12. no entanto, há uma falta de estudos para elucidar as mudanças proteome nesta cama arterial devido as desvantagens acima mencionadas. Portanto, nos últimos anos, os suínos de casa (Sus scrofa domestica Linnaeus, 1758) emergiu como um bom modelo de animais na pesquisa oftálmica devido as altas semelhanças morfológicas e filogenéticas entre os seres humanos e suínos13, 14,15. Porcinos amostras oculares estão facilmente disponíveis e mais importante, são uma representação mais precisa de tecidos humanos.

Considerando o importante papel destes vasos sanguíneos nos olhos, bem como a escassez de metodologia servida para extração de proteínas eficiente e análises destes microvessels, nós anteriormente têm caracterizado a proteoma da sPCA suínos usando um in-house protocolo que resultou na identificação de um número elevado de proteínas16. Com base neste estudo, temos ainda mais otimizado e descrito em profundidade nossa metodologia neste artigo, o que permite a análise do proteoma de quantidades minuciosas de amostras usando o sPCA porcina como tecido de modelo. Embora o objetivo principal deste estudo foi estabelecer uma metodologia compatível com o MS para os vasos sanguíneos oculares de massa limitada, nós fornecemos substanciais evidências experimentais que o fluxo de trabalho descrito também pode ser amplamente aplicado a várias amostras de tecido-baseado.

Prevê-se que este fluxo de trabalho será fundamental para a preparação de amostras de alta qualidade compatível com o MS de pequenas quantidades de materiais para análises de proteome abrangente.

Protocol

Todos os procedimentos experimentais, utilizando amostras de animais foram realizados em aderência estrita para a associação para pesquisa em visão e oftalmologia (ARVO) declaração sobre a utilização dos animais em oftalmologia e visão pesquisa e pelas diretrizes institucionais. Este estudo foi realizado e aprovado no departamento de Oftalmologia, universidade médica centro de Mainz. Nota: Porcinos olhos juntamente com o nervo óptico e extra-oculares tecidos foram o…

Representative Results

Amostra limitada disponibilidade é uma das principais desvantagens na pesquisa oftálmica. Correspondentemente, métodos de extração para proteína ideal rendem de pequenas quantidades de amostras, tais como vasos oculares são muitas vezes discutíveis. Até o momento, há uma escassez de métodos servidos particularmente para a extração da proteína dos vasos sanguíneos retrobulbar. Portanto, como um primeiro passo na otimização de método e como um prova de princípio para comp…

Discussion

Proteome abrangente de perfil de uma variada gama de amostras oculares é um primeiro passo importante e indispensável para elucidar os mecanismos moleculares e vias de sinalização implicadas na saúde e na doença. Para obter dados de alta qualidade e garantir a reprodutibilidade dos resultados obtidos a partir dessas análises, as etapas de preparação de amostra anterior são cruciais, como destacado em uma revisão por Matos et al. que discutiu em profundidade os procedimentos de processamento de amostra para dif…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dr. Manicam é suportado pelo interno Universidade pesquisa financiamento (1 Stufe) do centro médico de Universidade de o Mainz de Universidade Johannes Gutenberg e uma concessão da Deutsche Forschungsgemeinschaft (MA 8006/1-1).

Materials

A. Chemicals
1, 4-Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich 1.11474
Ammonium bicarbonate (ABC, CH₅NO₃) Sigma-Aldrich 5.33005
Calcium chloride dihydrate (CaCl2  Carl Roth  5239.1 2.5 mM 
Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS)  Thermo Fisher Scientific 14190169
Formic acid (CH2O2) AppliChem A0748
HPLC-grade acetonitrile (ACN, C2H3N) AppliChem A1605
HPLC-grade methanol (CH3OH) Fisher Scientific M/4056/17
HPLC-grade water  AppliChem A1589
Iodoacetamide (IAA) Sigma-Aldrich I6125
Kalium chloride (KCl)   Carl Roth  6781.1 4.7 mM 
Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4)  Carl Roth  3904.2 1.2 mM 
LC-MS-grade acetic acid  Carl Roth  AE69.1
Magnesium sulphate (MgSO4)    Carl Roth  261.2 1.2 mM 
NuPAGE Antioxidant Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) NP0005
NuPAGE LDS Sample buffer  Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) NP0007 4x
NuPAGE MES SDS Running Buffer  Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) NP0002 20x
NuPAGE Sample reducing agent  Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) NP0004 10x
SeeBlue Plus2 pre-stained protein standard  Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) LC5925
Sequencing grade modified trypsin Promega V5111
Sodium chloride (NaCl)  Carl Roth  9265.2 118.3 mM 
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)  Carl Roth  965.3 25 mM 
Trifluoroacetic acid (TFA,  C2HF3O2) Merck Millipore 108178
α-(D)-(+)- Glucose monohydrate  Carl Roth  6780.1 11 mM 
B. Reagents and Kits
0.5mm zirconium oxide beads  Next Advance ZROB05
1.0mm zirconium oxide beads  Next Advance ZROB10
Colloidal Blue Staining  Kit Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) LC6025 To stain 25 mini gels per kit
NuPAGE 4-12 % Bis-Tri gels Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) NP0321BOX 1.0 mm, 10-well
Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay Kit  Thermo Fisher Scientific 23227
ProteoExtract Transmembrane Protein Extraction Kit, TM-PEK Merck Millipore 71772-3 20 reactions per kit
Tissue Protein Extraction Reagent (T-PER) Thermo Scientific 78510
C. Tools
96-well V-bottom plates Greiner Bio-One 651180
Corning 96-well flat-bottom plates Sigma-Aldrich CLS3595-50EA
Disposable microtome blades pfm Medical 207500014
Disposable scalpels #21 pfm Medical 200130021
Dissection pins  Carl Roth PK47.1
Extra Fine Bonn Scissors  Fine Science Tools 14084-08
Falcon conical centrifuge tubes (50 mL) Fisher Scientific 14-432-22
Mayo scissors, Tough cut  Fine Science Tools 14130-17
Precision tweezers  Fine Science Tools 11251-10 Type 5
Precision tweezers, straight with extra fine tips Carl Roth LH53.1 Type 5
Self-adhesive sealing films for microplates Ratiolab (vWR) RATI6018412
Standard pattern forceps  Fine Science Tools 11000-12
Student Vannas spring scissors  Fine Science Tools 91501-09
Vannas capsulotomy scissors   Geuder 19760  Straight, 77 mm
ZipTipC18 pipette tips Merck Millipore ZTC18S096
D. Equipment and devices
150 × 0.5 mm BioBasic C18 column Thermo Scientific, Rockford, USA 72105-150565
30 × 0.5 mm BioBasic C18 pre-column  Thermo Scientific, Rockford, USA 72105-030515
Amicon Ultra-0.5 3K Centrifugal Filter Devices  Merck Millipore UFC500396 Pack of 96.
Analytical balance Sartorius H51
Autosampler  CTC Analytics AG, Zwingen, Switzerland HTS Pal
BBY24M Bullet Blender Storm  Next Advance NA-BB-25
Eppendorf concentrator, model 5301 Sigma-Aldrich Z368172
Eppendorf microcentrifuge, model 5424 Fisher Scientific 05-403-93 Non-refrigerated
Heraeus Primo R Centrifuge Thermo Scientific 75005440 Refrigerated
Labsonic M Ultrasonic homogenizer  Sartorius BBI-8535027
LC-MS pump, model Rheos Allegro Thermo Scientific, Rockford, USA 22080
LTQ Orbitrap XL mass spectrometer  Thermo Scientific, Bremen, Germany
Multiskan Ascent plate reader  Thermo Labsystems v2.6
Rotator with vortex  neoLab 7-0045
Titanium probe (Ø 0.5mm, 80mm long) Sartorius BBI-8535612
Ultrasonic bath, type RK 31 Bandelin 329
Xcell Surelock Mini Cell Life Technologies El0001

References

  1. Mandal, N., Heegaard, S., Prause, J. U., Honoré, B., Vorum, H. Ocular proteomics with emphasis on two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry. Biological Procedures Online. 12, 56-88 (2010).
  2. Gregorich, Z. R., Ge, Y. Top-down proteomics in health and disease: Challenges and opportunities. Proteomics. 14, 1195-1210 (2014).
  3. Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422, 198-207 (2003).
  4. Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537, 347-355 (2016).
  5. Cehofski, L. J., Mandal, N., Honoré, B., Vorum, H. Analytical platforms in vitreoretinal proteomics. Bioanalysis. 6, 3051-3066 (2014).
  6. Manicam, C., et al. Proteomics Unravels the Regulatory Mechanisms in Human Tears Following Acute Renouncement of Contact Lens Use: A Comparison between Hard and Soft Lenses. Scientific Reports. 8, 11526 (2018).
  7. Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Characterization of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR 4) in human tear proteome. Proteomics. 14, 1698-1709 (2014).
  8. Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Proteomics analysis of human tears from aqueous-deficient and evaporative dry eye patients. Scientific Reports. 6, 29629 (2016).
  9. Perumal, N., Funke, S., Wolters, D., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Characterization of human reflex tear proteome reveals high expression of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR4). Proteomics. 15, 3370-3381 (2015).
  10. Perumal, N., et al. Characterization of the human aqueous humour proteome: A comparison of the genders. PloS ONE. 12, 0172481 (2017).
  11. Hayreh, S. S. Posterior ciliary artery circulation in health and disease the Weisenfeld lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 749-757 (2004).
  12. Zeitz, O., et al. Glaucoma progression is associated with decreased blood flow velocities in the short posterior ciliary artery. British Journal of Ophthalmology. 90, 1245-1248 (2006).
  13. Verma, N., Rettenmeier, A. W., Schmitz-Spanke, S. Recent advances in the use of Sus scrofa (pig) as a model system for proteomic studies. Proteomics. 11, 776-793 (2011).
  14. Foulds, W. S., Kek, W. K., Luu, C. D., Song, I. C., Kaur, C. A porcine model of selective retinal capillary closure induced by embolization with fluorescent microspheres. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, 6700-6709 (2010).
  15. Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I. The parameters of the porcine eyeball. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 249, 475-482 (2011).
  16. Manicam, C., Perumal, N., Pfeiffer, N., Grus, F. H., Gericke, A. First insight into the proteome landscape of the porcine short posterior ciliary arteries: Key signalling pathways maintaining physiologic functions. Scientific Reports. 6, 38298 (2016).
  17. Shevchenko, A., Tomas, H., Havli, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1, 2856-2860 (2006).
  18. Feist, P., Hummon, A. B. Proteomic challenges: sample preparation techniques for microgram-quantity protein analysis from biological samples. International Journal of Molecular Sciences. 16, 3537-3563 (2015).
  19. Cox, B., Emili, A. Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics. Nature Protocols. 1, 1872-1878 (2006).
  20. Zhang, L., et al. Proteomic analysis of mouse liver plasma membrane: use of differential extraction to enrich hydrophobic membrane proteins. Proteomics. 5, 4510-4524 (2005).
  21. Zhou, H., et al. Improved recovery and identification of membrane proteins from rat hepatic cells using a centrifugal proteomic reactor. Molecular & Cellular Proteomics. 10, 111 (2011).
  22. de la Cuesta, F., Mourino-Alvarez, L., Baldan-Martin, M., Moreno-Luna, R., Barderas, M. G. Contribution of proteomics to the management of vascular disorders. Translational Proteomics. 7, 3-14 (2015).
  23. Cottingham, K. 1DE proves its worth… again. Journal of Proteome Research. 9, 1636 (2010).

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Cite This Article
Perumal, N., Straßburger, L., Schmelter, C., Gericke, A., Pfeiffer, N., Grus, F. H., Manicam, C. Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels. J. Vis. Exp. (144), e59140, doi:10.3791/59140 (2019).

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