Summary
Характеристика протеома глазной микрососудистой кровати имеет решающее значение для глубокого понимания многих глазной патологии в организме человека. Это исследование показывает, эффективный, быстрый и надежный метод для извлечения белков и подготовки проб из мелких кровеносных сосудов, используя свинину короткие задней цилиарной артерии как модель судов для масс спектрометрии основе протеомики анализов.
Abstract
Использование изолированной глазной кровеносных сосудов в пробирке расшифровать патофизиологических состояние глаз, используя передовые технологические подходы значительно расширил наше понимание некоторых заболеваний. Масс-спектрометрия (МС)-на основе протеомики стала мощным инструментом, чтобы разгадать изменения в молекулярных механизмов и белка, сигнальные пути в сосудистой кровати в здоровье и болезни. Однако решающее значение для получения воспроизводимых результатов и углубленного разъяснения сложных протеома шаги подготовки образца до MS анализы. Это особенно важно для приготовления глазных микрососудов, где количество образцов, доступных для анализа часто ограничено и таким образом, представляет собой вызов для оптимального белка добычу. Эта статья стремится обеспечить эффективный, быстрый и надежный протокол для пробоподготовки от образцового ретробульбарная глазной сосудистого русла, используя свинину короткие задней цилиарной артерии. Настоящий метод фокусируется на процедур извлечения белков от супернатант и Пелле образца после гомогенизации, образец очистки с центробежным фильтром устройства до очистки электрофореза и пептида одномерный гель шаги для количественного определения свободной этикетки в системе MS ионизации линейной ионной ловушки Орбитрэп жидкость хроматографии электроспрей. Хотя этот метод был разработан специально для протеомики анализов глазной микрососудов, мы также предоставили убедительные доказательства того, что он может также легко применяться для других образцов ткани.
Introduction
Улучшения в области протеомики, какие разрешения интегрированы и непревзойденную мощность сбора данных, значительно изменила наше понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе определенных условий болезни, а также как отражающие физиологического состояния определенной ячейке населения или ткани1,2,3,4. Протеомика также оказалась важной платформой в офтальмологических исследований из-за чувствительности и объективного анализа различных глазных образцов, которые способствовали выявлению потенциальных болезней маркеров для окончательного диагноза и прогноза, как подтверждается элегантно многих исследований в последние годы, в том числе некоторые из наших1,5,6,,78,9,10. Однако часто трудно получить человека образцы для протеомных анализов этическим причинам, особенно учитывая необходимость контроля материалов от здоровых лиц для надежной сравнительного анализа. С другой стороны это также сложно получить достаточное количество образцов для оптимального и надежный масс-спектрометрических анализа. Это особенно важно для массы ограниченной биологических материалов, таких как микро кровеносных сосудов глаза. Один из таких крупных ретробульбарная кровеносных сосудов, что играет ключевую роль в регуляции глазной кровотока является короткий задний цилиарной артерии (sPCA). Любое возмущений или аномалии в этом сосудистого русла может привести к тяжелой клинические последствия, которые могут привести к патогенезу несколько прицел опасных заболеваний, таких как глаукома и nonarteritic передней ишемической оптической невропатии (NAION)11 , 12. Однако, есть отсутствие исследований, изучение протеома изменения в этом артериальной постели из-за вышеупомянутых недостатков. Таким образом в последние годы, дом свиньи (Sus scrofa domestica Linnaeus, 1758) стала хорошей модели на животных, в офтальмологических исследований благодаря высокой морфологических и филогенетических сходства между люди и свиньи в13, 14,15. Свинину глазной образцы легко доступны, и самое главное, более точное представление о тканях человека.
Учитывая важную роль этих кровеносных сосудов в глаз, а также нехватка методологии, удовлетворяются за эффективным белка извлечения и анализа от этих микрососудов мы ранее характеризовались протеома свинину sPCA, с использованием собственного Протокол, что привело к идентификации большое количество белков16. На основе этого исследования, мы далее оптимизированный и описал углубленного Наша методология в этой статье, которая позволяет протеома анализ от мизерных количествах образцов, используя свинину sPCA как модель ткани. Хотя основной целью данного исследования было установить MS-совместимых методологии для масс ограниченной глазной кровеносных сосудов, мы обеспечили существенные экспериментальные доказательства того, что описывается рабочий процесс может широко применяется также для различных образцов ткани.
Предполагается, что этот процесс будет способствовать для подготовки образцов MS-совместимых высокого качества от небольших количествах материалов для анализа всеобъемлющих протеома.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные процедуры с использованием животных образцы были выполнены в строгом соответствии с Ассоциацией исследований в видении и офтальмологии (Арво) заявление для использования животных в глазной и видение исследований и институциональных руководящих принципов. Это исследование было проведено и одобрены на отделение офтальмологии, Университет медицинского центра Майнца.
Примечание: Свинину глаза вместе с зрительного нерва и экстраокулярных тканей были получены свежие из местных скотобойни сразу после смерти. Энуклеированные глаза были доставлены в лабораторию в ледяной фосфатный буфер (PBS) и использованы немедленно. Схематический обзор рабочего процесса, работу, как показано на рисунке 1.
1. решения
- Подготовить Кребса-Henseleit (K-H) буфера, весят следующие химические вещества (27.68 г NaCl, 8.4 g NaHCO3, 1,4 г KCl, 1,18 г MgSO4и 0,64 г х2PO4) в один сухой и чистой 50 мл конические пластиковых пробирок и , 1.47 g CaCl2 и 8,0 г глюкозы в другую трубу.
Примечание: Смесь порошка этих химических веществ должны храниться в прохладном и сухом месте. Смесь порошка CaCl2 и глюкозы лучше всего свеже предотвратить поглощение влаги и слипания. - Подготовить 200 мкл извлечения буфер 2A на пеллетах сэмпл, смесь 100 мкл извлечения буфер 2 и 100 мкл Реагента A от добычи белка трансмембранного комплекта (см. В6 в Таблице материалы).
Примечание: Аликвота компоненты комплекта экстракции белка трансмембранного составе извлечения буфер 2, реагент A и ингибитор протеазы коктейль в рабочей части и хранить при-20 ° C для длительного использования. Избегайте повторного замораживания и оттаивания. Оттепель реагенты до комнатной температуры (RT) до начала процедуры извлечения Пелле. - Для приготовления раствора бикарбоната аммония (ABC, 100 мм), растворяют 0,39 г ABC в 50 мл деионизованной воды.
- Подготовить 10 мм 1, 4-Дитиотреитол (DTT) решение, растворяют 30 мг DTT в 20 мл 100 мм ABC.
- Подготовить 55 мм раствор Iodoacetamide (IAA), растворяют 200 мг в 20 мл 100 мм ABC МАА.
Примечание: IAA должны храниться в темноте. Используйте алюминиевой фольги для упаковки труб с светочувствительные решения. - Подготовить трипсина буфер, содержащий ABC 10 мм и 10% (vol / vol) Ацетонитрил (АКС). Добавьте 1,5 мл буфера трипсина в один флакон 20 мкг трипсина распустить его содержание подготовить рабочий раствор трипсина 13 нг/мкл.
Примечание: Последовательность класса изменения трипсина поставляется лиофилизированные и должны храниться в-20 ° C до использования. - Подготовить пептид извлечения буфер, смешайте 1:2 (v/v) 5% муравьиной кислоты с АКС.
Примечание: Подготовить все решения в шагах 1,3-1,7 свежие непосредственно перед использованием и отменить любые неиспользованные объемы. - Подготовить 0,1% trifluoroacetic кислоты (ТФК), Смешайте 10 мкл TFA с 10 мл деионизованной воды.
2. изоляция короткий задний цилиарных артерий
Примечание: Свинину глаз в основном делится на передней (рисA) и задней секции (рис. 2B).
- Место глаз глобус в камере рассечение, содержащие ледяной K-H буфера. Тщательно Отрежьте окружающих мышц и тканей с острыми ножницами Mayo.
- Сделать надрез с помощью скальпеля и вырезать глобус в экваториальной плоскости с острыми ножницами Mayo, до тех пор, пока глаза разделяется на передней и задней половинок. Удалите, как много стекловидного тела как можно дальше от задней половине глаза с помощью пары стандартный шаблон щипцов.
Примечание: Не имея движущихся глаз в блюдо рассечение разделение земного шара глаз на две половинки облегчает изоляции sPCA с легкостью. Однако этот шаг не является обязательным. Судов могут быть изолированы также без открытия глаз глобус. - Использование вскрытия ПИН тщательно pin вниз в задней части глаза с сетчатки стороной вниз и вверх к экспериментатору зрительного нерва.
- Аккуратно отрежьте соединительной тканей, окружающих зрительного нерва для предоставления базовой сосудистую ретробульбарная с беззаботными Студенческая весна ножницами.
- SPCA можно рассматривать как короткие ветви судов (между ветвями 5-8), которые проникают склеры и окружности вокруг головы зрительного нерва (рис. 2C). Изолируйте paraoptic и дистальной sPCA вместе с окружающей соединительной ткани с парой тип 5 точности пинцета и беззаботными Капсулотомия ножницы (Рисунок 2D).
Примечание: Убедитесь, что K-H буфера остается ледяной на протяжении всей процедуры изоляции. Настоятельно рекомендуется изменить буфера каждые 20-30 мин, в зависимости от температуры окружающей среды.
3. Пробоподготовка
- Осторожно удалить соединительной ткани из артериальной сегментов, используя дополнительные острым концом типа 5 пинцеты прецизионные и беззаботными Капсулотомия ножницы под стереомикроскопом и промыть изолированных артерий в ледяной PBS для удаления загрязнений и остатков крови.
Примечание: Если образцы не подвергаются следующие шаги сразу, snap заморозить их в жидком азоте и хранить в-80 ° C до дальнейшего использования. - Бассейн артерии от два глаза, чтобы получить один из биологических реплицировать, перенести их в 1,5 мл microcentrifuge трубы и взвесить образцы с помощью аналитического баланса.
- Для каждой трубы, добавьте смесь 0,5 мм и 1,0 мм Бусины оксида циркония, следуют ткани белка добычу реагента (T-за; см. B7 Таблица материалов).
Примечание: Объем T-за зависит от веса образцов в каждой тюбике с соотношением 1 mL реагента до 50 мг образца. Общее правило большого пальца следовать при загрузке трубы для гомогенизации тома в соотношении 1:1:2 = Образец: бисер: T-за (рисA). Не используйте слишком большой объем добычи буфера и слишком мало количество бисера для предотвращения неэффективного гомогенизации. - Загрузить образец трубки в блендере гомогенизатора (см. D6 в Таблице материалы). Установите таймер на 2 мин и скорость уровня 6 и начать гомогенизации. После запуска, проверьте образцы для полной гомогенизации и повторите цикл до образцы полностью гомогенизированные (рис. 3B).
Примечание: В общей сложности 24 пробоотборные трубки можно гомогенизированные за один проход. Важно сохранить образцы холодного во время гомогенизации процедуры для сведения к минимуму денатурации белков. Гомогенизатор блендер пули, используемые в данном исследовании имеет присущие охлаждения функция, которая сохраняет образцы холодного. В тех случаях, когда нет внутреннего охлаждения особенность в гомогенизатор образцы могут храниться на льду между каждого запуска. - Тщательно Пипетка огневки в свежие microcentrifuge трубы. Центрифугуйте образцы на 10000 x g 20 мин при 4 ° C для пеллет нерастворимые белки и отдельные супернатанта, содержащего растворимые белки. Тщательно Пипетка, супернатант в свежие microcentrifuge трубы без касатьться Пелле слой (рис. 3C).
Примечание: Супернатант и гранулы могут храниться в-80 ° C до дальнейшего использования.
4. Пелле пищеварение
- Добавьте 200 мкл извлечения буфер 2A и 5 мкл ингибитора протеазы коктейль для каждого образца Пелле. Приостановите Пелле несколько раз с пипеткой.
Примечание: Смешайте реактивы извлечения хорошо перед добавлением гранул. Держите извлечения буфер 2A на льду и ингибитор протеазы на RT на протяжении всей процедуры извлечения. -
Используйте ультразвуковой гомогенизатор для полностью гомогенизировать гранулы.
- Значение амплитуды цикла 1 и 60. Используйте зонд из титана (Ø 0,5 мм, длиной 80 мм), который подходит для гомогенизации образцов с небольшими объемами (10-500 мкл).
- Погружать зонд в буфер смесь гранул и извлечения и нажмите кнопку Пуск, чтобы разоблачить образца для ультразвуковых волн.
- Sonicate образец до тех пор, пока сгустки гранулах полностью гомогенизации. Сделать паузу на несколько секунд между каждым sonication.
- Визуально проверьте для полной гомогенизации. Смешайте огневки несколько раз с пипеткой обеспечить, что есть нет сгустки.
Примечание: Процедура извлечения Пелле должен осуществляться на льду во избежание денатурации белков из-за тепла во время гомогенизации (рис. 4).
5. Пример очистки и буфера обмена
- Используйте центробежного фильтра устройства с 3 кДа отсечки (см. D3 в Таблице материалы) для выполнения этой процедуры в соответствии с инструкциями производителя с изменениями там, где это применимо. Во-первых Вставьте фильтр microcentrifuge трубки (предоставляется в пакет фильтров).
- Пипетка 200 мкл пример огневки до одного фильтра устройства и 200 мкл обессоленной воды в тот же фильтр. Крышка надежно (рис. 5A).
- Установите фильтр в центрифуге и спина для 14.000 x g 15 мин при 4 ° C.
- Удалите устройство из центрифуги и отдельные фильтр, содержащий образец концентрата из microcentrifuge трубка, содержащая фильтрата. Выбросите фильтрата (рис. 5B).
- Воссоздать концентрат, добавив 400 мкл обессоленной воды в фильтр. Повторите шаги 5.3 и 5.4 три раза. Тщательно Пипетка концентрат «уборка» образца в чистой микропробирок.
Примечание: Как правило, 200 мкл пример сырой даст ~ 50-70 мкл концентрированного препарата после фильтрации. - Повторите шаги 5.1 5.5 для оставшихся гомогенатах образца.
6. белка измерения
- Используйте bicinchoninic кислоты assay протеина (BCA) комплект (см. B5 в Таблице материалы) для определения концентрации белка супернатант и Пелле фракций sPCA образцов на тарелку читателя.
- Подготовьте Стандартный (BSA) разведений альбумина (окончательный БСА концентрации диапазоне от 25 до 2000 мкг/мл) от одной ампулы 1 мл, состоящий из 2 мг/мл BSA, согласно инструкциям производителя.
- Пипетка 10 мкл каждого стандарта разведения BSA и пример реплицирует (супернатант и Пелле) в каждой скважине плоскодонные 96-луночных микропланшетов.
- Подготовить BCA работает реагента, добавляя 50 частей BCA реагента A 1 часть BCA реагент б.
Примечание: Вычислить суммарный объем рабочего реагента, необходимых для каждого измерения до подготовки и свежезаваренным подготовить основанный на количество образцов и стандартных растворов, чтобы быть assayed достаточного объема. - Тщательно Пипетка 200 мкл BCA Рабочая реагента в каждой скважине. Обложка микроплиты и инкубировать при 37 ° C за 30 мин. После охлаждения пластины для RT, измерения поглощения в 562 Нм на тарелку читателя (см. D13 в Таблице материалы).
- На основе стандартной кривой генерируется для каждой стандартной концентрации BSA (мкг/мл), определите концентрацию белка образцов.
7. одномерный гель-электрофорез (1DE)
- Подготовьте образцы для 1DE, как показано в таблице 1 (для одного образца). Смешайте смесь образца с пипеткой. Тепло образцов при 70 ° C 15 мин и здорово RT.
- Подготовка 1 x работает буфер, добавляя 50 мл буфера под управлением МЧС SDS 950 мл деионизированной водой. Хорошо перемешайте.
-
Подготовьте сборного 4-12% бис-трис белка гели (см. B4 в таблице материалов).
- Разрежьте пластиковый мешочек для удаления геля кассеты и промойте кассету с дейонизированной водой.
- Снимите гребень из геля кассету в одно движение жидкости, стараясь не повредить скважин.
- Осторожно промывайте лунки загрузки 2 - 3 раза с 1 x работает буфер с помощью пипетки. Инвертировать и осторожно встряхивайте кассетный гель для удаления буфера, обеспечивая там нет пузырьков воздуха в скважинах.
- Снимите белые ленты в нижней части кассеты геля.
- Вставьте гели (максимум две кассеты) в гель работает танк и полностью собранном, замок гель напряженности клина.
- Заполнения буфера верхних (катод) камеры с 200 мл работает буфера до тех пор, пока полностью покрыты скважин. Проверить на наличие течи.
- Добавьте 500 мкл антиоксидант (см. A14 в Таблице материалы) работает буфер.
Примечание: Антиоксидант является приличия реагент, который должен использоваться с образцами, сократилось с восстанавливающего агента (см. таблицу 1) для поддержания сокращение условий во время электрофореза и предотвращения ре окисление чувствительных аминокислот например триптофана и метионин. - Тщательно нагрузки 50 мкг образца в пер. с помощью пипетки. Затем загрузить предварительно окрашенные белка стандарт как маркер молекулярной массы (см. A18 в Таблице материалы).
- Заполните в нижней палате буфера (анод) с 600 мл работает буфера.
- Запустите гели для ~ 60 мин при постоянном напряжении 175 V. В конце выполнения тщательно удалите гель от кассеты пластины с помощью геля нож.
-
Тщательно перенесите гели в гель, окрашивание коробки.
- Подготовьте крепежные решения, свежие основанного на общее количество гели, которые должны быть окрашены в соответствии с инструкциями производителя как описано в таблице 2.
- Встряхните gel(s) в решении крепления для 10 мин на RT на качающейся платформе.
-
Отменить решение фиксации и пятно гели с голубой коллоидное окрашивание комплект.
- Подготовить окрашивание свежие решения, основанные на общее количество гели, которые должны быть окрашены, согласно инструкциям производителя, как описано в таблице 3.
- Во-первых измерить соответствующий объем и непосредственно смешивать компоненты, помеченные звездочкой (*) в геле окраски окно. Встряхните gel(s) в решении окрашивание без Stainer B 10 мин на RT на качающейся платформе.
- Добавьте Stainer B непосредственно в окрашивание коробки, содержащий * окрашивание раствора. Убедитесь, что встряхнуть Stainer B хорошо перед использованием.
ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Осуществлять действия по подготовке 7.10.1 и 7.11.1 под вытяжного шкафа.
- Встряхните gel(s) в решении окрашивание ночь для наиболее общих результатов.
Примечание: Окрашенных полос станут видимыми в течение 10 мин, после добавления Stainer B. Окрашивание требует минимум 3 часа и интенсивность не меняются, если оставить больше часов в растворе окрашивание. - Тщательно сцеживаться окрашивание раствора и замените 200 мл деионизованной воды. Встряхните gel(s) для по крайней мере 7-8 ч в воде, чтобы очистить фон.
Примечание: Деионизированной воды необходимо изменить несколько раз во время destaining процедура лучше удалить чрезмерного пятно. Gel(s) можно также оставить в воде до 3 дней без ущерба для белок интенсивность группы. Если gel(s) не подвергается последующие шаги сразу, она может храниться в 20% растворе сульфата аммония на 4 ° C для длительного хранения.
8. в гель Tryptic пищеварение
Примечание: Этот протокол согласно методу Шевченко et al.17, с небольшими изменениями. Эта процедура должна осуществляться в ламинарного потока капот и использовать выделенный набор пипетки, советы, труб и посуда специально для этой цели. Надевайте перчатки и соответствующие лаборатории одежда во все времена для предотвращения кератин и другие загрязнения. Подготовьте все решения и реактивы, используемые в данной процедуре незадолго перед использованием.
- Акцизный белка полосы от геля с чистой, новой микротомных лезвий. Группа мелко нарежьте (примерно 1 мм x 1 мм до 2 мм х 2 мм). Тщательно перенесите куски гель в 1,5 мл пробирок microcentrifuge.
Примечание: Куски, которые слишком малы может засорить наконечники и большие куски уменьшит пептид восстановления. Соблюдать осторожность при использовании микротомных лезвий, которые являются крайне острыми. -
Минигелей
- Добавьте 500 мкл раствора минигелей, содержащий 100 мм ABC решения/АКС (1:1, v/v) и Проинкубируйте образцы на RT 30 мин с случайные встряхивания или vortexing.
- Тщательно пипетки, destaining решение. Визуально проверьте для любых труб с остаточной пятно. Повторите шаг 8.2.1, если гель штук по-прежнему являются окрашенные синий.
-
Сокращение и алкилирования
- ~ 400 мкл свежеприготовленного раствора DTT и Инкубируйте на 56 ° C за 30 мин убедитесь, что решение полностью покрывает гель штук. Тщательно Пипетка, сокращение решение и отменить.
- ~ 400 мкл свежеприготовленного раствора МАА и инкубировать в темноте на RT на 30 мин удалить алкилирующие буфер с пипетки и отбросить.
-
Пищеварение
- Мкл 500 аккуратные АКС в РТ за 10-15 мин до тех пор, пока гель штук сокращаться и становятся непрозрачными. Пипетка, АКС и просушите гель штук 5-10 мин под капотом.
- Пипетка 50 мкл раствора трипсина в каждую пробирку, чтобы полностью покрыть куски геля. Инкубируйте труб в 4 ° C на 30 мин.
- После 30 минут Проверьте каждую пробирку, если весь раствор трипсина вобрала гель штук. При необходимости добавьте чтобы полностью покрыть куски гель, достаточный объем буфера трипсина (50-100 мкл, в зависимости от объема в трубе). Проинкубируйте образцы на ночь на 37 ° C.
-
Пептид добыча
- Тщательно Пипетка извлеченные пептид решение от труб и передача для очистки пробирок. Сухие супернатант в центробежных вакуум-испарителе.
Примечание: Не снимайте оставшиеся части гель. - Добавить 100 мкл буфера извлечения (обратитесь к шагу 1.7) каждой трубки и Инкубируйте 30 минут при 37 ° C при встряхивании.
- Пипетка супернатант в же пробирки, содержащие извлеченные пептиды согласно соответствующих групп и сухой вниз в вакуумной центрифуги.
Примечание: Если не используется сразу, сушеные пептидных экстрактов могут храниться в-20 ° C до несколько месяцев до дальнейшего использования.
- Тщательно Пипетка извлеченные пептид решение от труб и передача для очистки пробирок. Сухие супернатант в центробежных вакуум-испарителе.
9. пептидные очистки
Примечание: Этот пептид образца опреснения и очистки процедура проводится с использованием C18 наконечники (см. C15 в Таблице материалы). Используйте новый наконечник для каждого образца.
- Подготовьте следующие свежие решения в конической пробирок и Алиготе в 2 мл microcentrifuge трубы для процедуры очищения пептида, как показано в таблице 4. Резюме трубки для очищения пептида является следующим: трубки (пример решения), трубки B (смачивающий раствор), трубки C (уравновешивания раствор), труба D (моющий раствор), трубки E (Элюирующий раствор), трубка F (пустой 2 мл и 5 мл microcentrifuge трубки, в зависимости от количество образцов, чтобы быть очищены, для удаления отходов) и G трубки (чистый, пустой Микропробирка, емкость 0,2 мл).
- Воссоздания сушеные пептидных экстрактов из шага 8.6.3 с 10 мкл 0,1% TFA. Эта трубка обозначается метро а.
- Sonicate трубы A в ультразвуковой ванне со льдом на 5 мин.
- Спин вниз пример решения в настольная центрифуга на 1000 x g за 1 мин.
- Установите P10 микропипеткой максимальный объем 10 мкл и надежно присоедините наконечник пипетки18 C.
- Погрузите кончик пипеткой в смачивающий раствор (метро B) и тщательно аспирационная в упаковочный материал. Постепенно отказаться от отходов в трубу F. Повторите этот шаг по крайней мере 7 - 8 раз.
Примечание: Отпустите поршень пипеткой остановиться мертвых и медленно релиз или обойтись поршень на протяжении всей процедуры. Принять меры предосторожности, чтобы не ввести пузырьков воздуха в советы во время дозирование для обеспечения максимальной пептид привязки к столбцу C18. - Сбалансировать подсказка для привязки пептид аспирационных 10 мкл раствора уравновешивания в трубе C. отменить решение и повторите эту процедуру 3-4 раза.
- Далее аспирационная и распределять решение примера в трубке A несколько раз (в зависимости от соответствующей толщины полосы гель) для связывания пептиды давать чаевые столбец.
ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Стремление и дозирования шаги в процедуре привязки (шаг 9.8) осуществляется в трубу а. Не обойтись примера решения для отходов. - Вымойте наконечник пипетки18 C, аспирационных моющего раствора в труба D и отменяя его тратить (трубки F) 4-5 раз.
- Наконец элюировать привязанного пептиды, закупорить Элюирующий раствор (трубки E) и дозирования элюанта в трубу G.
- Повторите шаги, всего 2-3 циклов на сэмпл увеличить пример восстановления.
- Отменить отзыв после очистки одного образца и использовать новый наконечник для следующего примера.
- Сухой очищенный пептид элюаты в вакуумной концентратор.
Примечание: Очищенный образцы теперь готовы для анализа LC-MS/MS в системе LC-уни-LTQ-Орбитрэп МС. Храните сушеные образцы в-20 ° C до дальнейшего использования.
10. Жидкие хроматографии электроспрей ионизации-MS/MS анализы
Примечание: Этикетка бесплатно количественных протеомики анализ выполняется на систему MS жидкого хроматографии электроспрей ионизации линейной ионной ловушки Орбитрэп (LC-уни-LTQ-Орбитрэп). LC состоит из Rheos Аллегро четвертичных насос оснащен онлайн дегазатор (в сочетании с HTS PAL Автоматический пробоотборник и система включает 30 мм x 0,5 мм C18 предварительно столбец подключен к 150 мм x 0,5 мм C18 столбец. Использовать обратный фаза водного растворителя A состоящий из воды класса LC-MS с муравьиной кислоты 0,1% (v/v) и органических растворителей B, состоящий из LC-MS класс ацетонитриле с муравьиной кислоты 0,1% (v/v). Используйте градиент с продолжительность 60 мин за гель-группы, как описано подробно в наших предыдущих исследований6,16.
- Распустить образцов очищенной пептида в 10 мкл 0,1% TFA. Sonicate образцы на льду на 5 мин.
- Пипетка 10 мкл образцов в V-дно 96-луночных плиту и печать с ясным, Самоклеящиеся обложки фильма.
- Передать пластину Автоматический пробоотборник.
- Используйте следующий градиент для каждого время выполнения 60 мин: 0-35 мин (15-40% растворителя B), 35-40 мин (40-60% растворителя B), 40-45 минут (60-90% растворителя B), 45-50 мин (90% растворителя B), 50-53 мин (90-10% растворителем B) и 53-60 мин (10% растворителем B).
- Используйте следующие условия масс-спектрометрических инструмента: положительных ионов электроспрей режима ионизации, спрей напряжения (2.15 кв), капиллярные температуры (220 ° C), приобретение данных зависит от режима, автоматическое приобретение, переключение между Орбитрэп-MS и LTQ МС/МС, Орбитрэп резолюции (30000), m/z диапазон (от 300 до 1600), автоматическая целевой контроль (AGC, 1,0 x 106 ионов), Внутренняя калибровка (polydimethlycyclosiloxane [PCM] на m/z 445.120025 ионов в режиме реального времени), блокировка массового опция включена в режиме MS, Тандем данные, полученные путем выбора пятерку самых интенсивных прекурсоров ионов, дальнейшей фрагментации путем столкновения индуцированной диссоциации (CID), нормированный энергию столкновения (NCE, 35% с время активации 30 мс с повторений 3) и динамического исключения продолжительность (600 s).
Примечание: Результате фрагментации ионов записываются в LTQ. - Запустите по крайней мере три биологических репликация для каждого образца.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ограниченной выборке доступность является одним из основных недостатков в офтальмологических исследований. Соответственно методы добычи для оптимального белка доходности с небольшое количество образцов таких как глазные кровеносных сосудов часто спорны. На сегодняшний день, является нехватка методов, особенно для извлечения белков из ретробульбарная кровеносных сосудов. Таким образом, в качестве первого шага в метод оптимизации и как доказательство принцип сравнить эффективность и надежность нескольких часто используемых моющих средств экстракции белка к относительно нового реагента, T-за, мы провели экспериментальные исследования с использованием сердечной ткани от мышей (благодаря наличию легко и достаточно образца для шагов оптимизации). Мы сравнили урожайность белка, сравнивая концентрации общего белка и общего белка, определены с использованием следующих реагентов: T-пер, 0,02% n додецил β-D-maltoside (DDM), 1% 3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio] -1-пропан сульфонат (главы), 1% amidosulfobetaine-14 (ASB-14) и смесь ACN и TFA (20% АКС / 1% TFA). Общее количество белков в образцах, извлеченные с каждым из этих моющих средств, как показано на рисунке 6A, с высокой доходности от тканей, экстрагируют T-за (56,4 мкг/мг ткани), а затем DDM (22.88 мкг/мг ткани), главы (16.01 мкг/мг ткани), АСБ-14 (11.56 мкг/мг ткани) и низкая доходность от АКС/TFA (4.38 мкг/мг ткани). Последовательно, гербера определены также были самыми высокими в образце T-за извлечены (1649 белки) > DDM (1310 белки) > главы (1319 белки) > ASB-14 (1121 белки) > АКС/TFA (924 белки), как показано на рисунке 6B. На основе этих результатов, мы исходили с извлечением белка от sPCA образцов с T-за.
Далее оптимизация образца подготовка протоколов до предварительно фракционирование в 1DE является очень важным шагом для получения хорошо разделенных белка полосы и высокую воспроизводимость результатов между образцами и реплицирует. Важность этих шагов является отражение и выделены в результатах 1DE. Рисунок 7 показывает сравнение профилей 1DE белка sPCA до и после подвергается оптимизированный пробоподготовки и очистки шагов. В целом, высокая степень намазочной и бедными разделение белков полос было отмечено на переулок 3. Этот профиль показывает, что образцы могут содержать реагент добычи, а также такие загрязнители, как липиды и сотовой мусора. Однако, sPCA образцы, были разделены на супернатант и окатышей и, подвергается оптимизированный протокол привело к образцовой 1DE профилей, как представлено в переулок, 1 и 2 (рис. 7).
В ГИСТ, основанный на эти обнадеживающие результаты, оптимизированный метод для извлечения быстрой, надежной и эффективной растворимого белка из глазной микрососудов занято ткани белка добычу реагента (T-в) и с помощью извлечения буфер 2A (ТМ-PEK) для извлечения на основе мембранных белков, обнаруженных в Пелле образца. Впоследствии, образец гомогенатах (T-за фракция) подвергаются буфера обмена и очистка с 3 единицы кДа центробежного фильтра до 1DE образца. Оптимальный образец концентрация составляет 50 мкг на хорошо. С другой стороны он имеет подчеркнул здесь, что этот Протокол применяется не только для малых тканей, таких как кровеносные сосуды, но также возможно для других образцов ткани. Это проявляется в 1DE профили мышиных мозга и сердца тканей, которые продемонстрировали, что существует большое количество белков, которые могут быть извлечены из супернатант (Рисунок 8A, B) и Пелле дроби (Рисунок 8C, D ).
Рисунок 1 : Обзор рабочего процесса. Схематическое представление протоколов, используемых для анализа лейбл бесплатно количественных протеома свинину sPCA. В общем эта процедура состоит из двух основных разделов, включая этапы подготовки образца microvessel и подход на основе MS протеомики. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Представитель фотографии свинину глаз. (A) боковой вид глаз глобус показывает роговицы, который расположен в передней части глаза, склера, окружающие мышцы и зрительного нерва. (B) задний вид глаз показывает зрительного нерва. (C) отделений sPCA, видели на задней части глаз глобус состоит из paraoptic и дистальных ветвей. (D) изолированные sPCA с окружающими жира и соединительной ткани. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Пример гомогенизации. Представитель фотографии показаны в примере (A) перед и (B) после гомогенизации. (C) гомогенизированных образцов были далее разделены на супернатанта, содержащего растворимые белки и Пелле, содержащих нерастворимые, трансмембранного на основе белков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Гранулы процедура извлечения белков. Во избежание денатурации белков, пеллет образцы извлекаются на льду. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Очистка образца. Буфер обмена осуществляется с 3 кДа отсечки центробежные фильтры для очистки образцов до масс-Спектральный анализ. Представитель фотографии показаны перед огневки (A) и (B) после фильтрации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6 : Сравнение эффективности извлечения белков и надежности между T-за и четыре общих моющих средств извлечения белков. Линейчатые диаграммы, изображающие количеств белка (A) и (B) общее количество белков, определены с использованием T-в, 0,02% DDM, главы 1%, 1% ASB-14 и 20% АКС / 1% TFA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7 : Представитель 1DE гель свинину sPCA белка профилей до и после оптимизации. Майна 3 изображает профиль 1DE образца, который не был подвергнут любого предварительного очистки шагов. Лейн 1 и 2 показаны профили образцовое белка sPCA супернатанта и Пелле, соответственно, после подвергая образцы оптимизированный пробоподготовки и очистки шагов. Гель был окрашенных коллоидных голубой комплект для окрашивания. M = маркер. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 8 : Представитель коллоидных сине окрашенных 1DE гель образцовую образцов ткани. Белка профили супернатант (A, B) и Пелле (C, D) мышиных мозга и сердечной ткани образцов, соответственно, на 50 мкг на хорошо. Супернатант и Пелле белки были извлечены, используя T-за и трансмембранный белок добыча комплект, соответственно. M = маркер. R1-R3 представляют три реплицирует. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Компонент | Объем (мкл) |
| Пример (супернатант или гранулы) | x |
| LDS пример буфера (4 x) | 2.5 |
| Восстановитель (10 x) | 1 |
| Деионизированная вода | До 6,5 (в зависимости от объема образца) |
| Общий объем на сэмпл | 10 |
| Примечание: x рассчитывается на основе белков концентрация (50 мкг общего белка на сэмпл). | |
Электрофорез размерные таблицы 1:1 (1DE). Подробная информация о компонентах, необходимых для подготовки проб для выполнения 1DE.
| Решение | Для 1 gel (мл) | Для 2 гелей (мл) | Для 4 гелей (мл) |
| Деионизированная вода | 40 | 80 | 160 |
| Метанол | 50 | 100 | 200 |
| Уксусная кислота | 10 | 20 | 40 |
Таблица 2: гель для фиксации. Данные компоненты, необходимые для подготовки Фиксирующий раствор для 1DE.
| Решение | Для 1 gel (мл) | Для 2 гелей (мл) | Для 4 гелей (мл) |
| * Деионизированной воды | 55 | 110 | 220 |
| * Метанола | 20 | 40 | 80 |
| * Стайнер A | 20 | 40 | 80 |
| Ситечко B | 5 | 10 | 20 |
Таблица 3: пятнать геля. Детали компонентов для приготовления коллоидных синего окрашивания раствора.
| Решение (для) | Состав | ACN ** | H2O ** | TFA | Общий объем * |
| Смачивание | 100% ACN | 2 мл | 2 мл | ||
| #Washing и уравновешивания | 0,1% TFA | 10 мл | 10 МКЛ | ~ 10 мл | |
| Элюирующий пептида | 0,1% TFA в переработке = АКС: H2O | 6 мл | 4 мл | 10 МКЛ | ~ 10 мл |
| Примечание: * общий объем должен корректироваться с учетом общее количество образцов, чтобы подвергаться Zip Совет очистки. | |||||
| ** Используйте ВЭЖХ класса или LC-MS-класса. | |||||
| # Подготовить два отдельных труб Eppendorf для мытья и уравновешивания, соответственно. | |||||
Таблица 4: очищения пептида. Компоненты и их соответствующие составы для процедура очищения пептида с помощью C18 Пипетка советы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Всеобъемлющие протеома профилирование различных глазных образцов является важным и необходимым первым шагом для выяснения молекулярных механизмов и сигнальных путей, замешанных в здоровье и болезни. Для того, чтобы получить высокое качество данных и обеспечить воспроизводимость результатов, полученных из этих анализов, предыдущие шаги подготовки образца решающее значение, как подчеркивается в обзоре, et al. Мандал, что обсуждали углубленного процедур обработки образцов для различных частей глаза использованием двумерного гель электрофореза и масс спектрометрии стратегия1. В линии этих расследований наши текущие исследования предоставляет оптимизированный протокол, шаг за шагом для быстрых, надежных и высокоэффективных MS-совместимых пробоподготовки используя свинину sPCA как модель глазных микрососудов. Это расследование было начато после нехватка конкретной методологии для получения достаточного количества белков из ограниченного количества артериальной образцов для создания высококачественных данных MS. Наш метод является также попыткой внести вклад существующего свода знаний на использование методов микро масштабе, позволяющих отлично протеома сопоставления18.
Есть несколько важных аспектов в этот экспериментальный протокол, которые должны быть приняты во внимание для достижения оптимальной производительности для анализа количественных протеома. Во-первых важно, что образцы, независимо от сумм, подвергаются полной гомогенизации для обеспечения оптимального белка добычу. В нашей методологии использование смеси различных размеров бисера и пуля блендер гомогенизатор сыграл для лизиса полное ткани. Тип и размер бисера используется зависят образец типа и суммы. Бусины с более высокой плотности, например в настоящее время используются ZrO2 и нержавеющей стали, пригодны для средне жесткая тканей и особенно хорошо для кровеносных сосудов.
Во-вторых важно, чтобы отделить супернатант от гранул и, подвергать последний пищеварение и извлечения, используя указанный набор. Этот шаг имеет решающее значение для извлечения высокомолекулярные белки, например трансмембранные белки, которые иначе трудно однородный, используя мягкий моющих19,,2021. Осажденный Пелле растворяется лучше всего использовать sonication, чтобы избежать образца потери, понесенные всплеск вверх во время активной агитации или тряска методы.
В-третьих стоит отметить, что все процедуры подготовки образца осуществляется при низкой температуре (4 ° C), если не указано иное в методологии. Это обеспечить денатурации белков минимальной во время процедуры извлечения. Четвертых, неоднократные замораживания оттаивания образцов следует избегать для предотвращения деградации белка и ухудшение качества образца.
Наконец удаление загрязнений и моющих средств необходим после экстракции белка для предотвращения течению помех во время-гель фракционирования, ферментативного пищеварения и MS анализ18,22. Эти загрязнители часто мешают резолюции электрофоретического разделения и соответственно, влияние визуализации результата, как показано в 1DE профиле (рис. 7). Чтобы обойти эту проблему, использование центробежных среза фильтра устройств благоприятствования для их простоты использования и потери минимальными белка.
Хотя текущие экспериментальные процедуры обеспечивают углубленное outlook в шаги подготовки важный пример для оптимального лейбл бесплатно количественных анализов MS, существуют два ограничения. Во-первых sPCA образцы были объединены из двух свиного глаза, чтобы обеспечить достаточное количество тканей для последующего анализа. Поскольку глаза, полученные от местных бойни являются рандомизированные и таким образом, не известно, если кровеносные сосуды находятся изолироваться от глаз же животного, пример объединения смягчает между индивидуальные вариации5,6. Однако нынешняя методология также может быть адаптирована для подготовки отдельных проб в зависимости от количества образцов, доступных. Во-вторых представлена методология специально разработан для 1DE на основе геля фракционирования. Хотя совместимость текущего метода для интеграции с сверху вниз и другие методы ректификации требуют расследования, мы выбрали 1DE вследствие ряда факторов, начиная от хорошей воспроизводимости, простота контроля качества лучше глубину анализа , особенно для сложных образцов таких в настоящее время свидетельствует глазной кровеносных сосудов1,5,23.
В заключение несмотря на ограничения, перечисленные выше, процесс описан представляет собой простой, но надежный подход к строгие образцы шагов подготовки обслуживает специально для анализа небольшое количество кровеносных сосудов. Важно также подчеркнуть здесь, что этот метод может быть легко интегрирована для массы на основе спектрометрии протеомного анализа других образцов на основе клеток и тканей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Д-р Manicam поддерживается внутренним университета финансирование исследований (Stufe 1) из медицинского центра Университета Йоханнеса Гутенберга Университета Майнца и Грант от Deutsche Forschungsgemeinschaft (MA 8006/1-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A. Chemicals | |||
| 1, 4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 1.11474 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Carl Roth | 5239.1 | 2.5 mM |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190169 | |
| Formic acid (CH2O2) | AppliChem | A0748 | |
| HPLC-grade acetonitrile (ACN, C2H3N) | AppliChem | A1605 | |
| HPLC-grade methanol (CH3OH) | Fisher Scientific | M/4056/17 | |
| HPLC-grade water | AppliChem | A1589 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| Kalium chloride (KCl) | Carl Roth | 6781.1 | 4.7 mM |
| Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth | 3904.2 | 1.2 mM |
| LC-MS-grade acetic acid | Carl Roth | AE69.1 | |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | Carl Roth | 261.2 | 1.2 mM |
| NuPAGE Antioxidant | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0005 | |
| NuPAGE LDS Sample buffer | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0007 | 4x |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0002 | 20x |
| NuPAGE Sample reducing agent | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0004 | 10x |
| SeeBlue Plus2 pre-stained protein standard | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | LC5925 | |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth | 9265.2 | 118.3 mM |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Carl Roth | 965.3 | 25 mM |
| Trifluoroacetic acid (TFA, C2HF3O2) | Merck Millipore | 108178 | |
| α-(D)-(+)- Glucose monohydrate | Carl Roth | 6780.1 | 11 mM |
| B. Reagents and Kits | |||
| 0.5 mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB05 | |
| 1.0 mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB10 | |
| Colloidal Blue Staining Kit | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | LC6025 | To stain 25 mini gels per kit |
| NuPAGE 4-12 % Bis-Tri gels | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0321BOX | 1.0 mm, 10-well |
| Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| ProteoExtract Transmembrane Protein Extraction Kit, TM-PEK | Merck Millipore | 71772-3 | 20 reactions per kit |
| Tissue Protein Extraction Reagent (T-PER) | Thermo Scientific | 78510 | |
| C. Tools | |||
| 96-well V-bottom plates | Greiner Bio-One | 651180 | |
| Corning 96-well flat-bottom plates | Sigma-Aldrich | CLS3595-50EA | |
| Disposable microtome blades | pfm Medical | 207500014 | |
| Disposable scalpels #21 | pfm Medical | 200130021 | |
| Dissection pins | Carl Roth | PK47.1 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Falcon conical centrifuge tubes (50 mL) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Mayo scissors, Tough cut | Fine Science Tools | 14130-17 | |
| Precision tweezers | Fine Science Tools | 11251-10 | Type 5 |
| Precision tweezers, straight with extra fine tips | Carl Roth | LH53.1 | Type 5 |
| Self-adhesive sealing films for microplates | Ratiolab (vWR) | RATI6018412 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Student Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 91501-09 | |
| Vannas capsulotomy scissors | Geuder | 19760 | Straight, 77 mm |
| ZipTipC18 pipette tips | Merck Millipore | ZTC18S096 | |
| D. Equipment and devices | |||
| 150 × 0.5 mm BioBasic C18 column | Thermo Scientific, Rockford, USA | 72105-150565 | |
| 30 × 0.5 mm BioBasic C18 pre-column | Thermo Scientific, Rockford, USA | 72105-030515 | |
| Amicon Ultra-0.5 3K Centrifugal Filter Devices | Merck Millipore | UFC500396 | Pack of 96. |
| Analytical balance | Sartorius | H51 | |
| Autosampler | CTC Analytics AG, Zwingen, Switzerland | HTS Pal | |
| BBY24M Bullet Blender Storm | Next Advance | NA-BB-25 | |
| Eppendorf concentrator, model 5301 | Sigma-Aldrich | Z368172 | |
| Eppendorf microcentrifuge, model 5424 | Fisher Scientific | 05-403-93 | Non-refrigerated |
| Heraeus Primo R Centrifuge | Thermo Scientific | 75005440 | Refrigerated |
| Labsonic M Ultrasonic homogenizer | Sartorius | BBI-8535027 | |
| LC-MS pump, model Rheos Allegro | Thermo Scientific, Rockford, USA | 22080 | |
| LTQ Orbitrap XL mass spectrometer | Thermo Scientific, Bremen, Germany | ||
| Multiskan Ascent plate reader | Thermo Labsystems | v2.6 | |
| Rotator with vortex | neoLab | 7-0045 | |
| Titanium probe (Ø 0.5 mm, 80 mm long) | Sartorius | BBI-8535612 | |
| Ultrasonic bath, type RK 31 | Bandelin | 329 | |
| Xcell Surelock Mini Cell | Life Technologies | El0001 |
References
- Mandal, N., Heegaard, S., Prause, J. U., Honoré, B., Vorum, H. Ocular proteomics with emphasis on two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry. Biological Procedures Online. 12, 56-88 (2010).
- Gregorich, Z. R., Ge, Y. Top-down proteomics in health and disease: Challenges and opportunities. Proteomics. 14, 1195-1210 (2014).
- Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422, 198-207 (2003).
- Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537, 347-355 (2016).
- Cehofski, L. J., Mandal, N., Honoré, B., Vorum, H. Analytical platforms in vitreoretinal proteomics. Bioanalysis. 6, 3051-3066 (2014).
- Manicam, C., et al. Proteomics Unravels the Regulatory Mechanisms in Human Tears Following Acute Renouncement of Contact Lens Use: A Comparison between Hard and Soft Lenses. Scientific Reports. 8, 11526 (2018).
- Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Characterization of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR 4) in human tear proteome. Proteomics. 14, 1698-1709 (2014).
- Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Proteomics analysis of human tears from aqueous-deficient and evaporative dry eye patients. Scientific Reports. 6, 29629 (2016).
- Perumal, N., Funke, S., Wolters, D., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Characterization of human reflex tear proteome reveals high expression of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR4). Proteomics. 15, 3370-3381 (2015).
- Perumal, N., et al. Characterization of the human aqueous humour proteome: A comparison of the genders. PloS ONE. 12, 0172481 (2017).
- Hayreh, S. S. Posterior ciliary artery circulation in health and disease the Weisenfeld lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 749-757 (2004).
- Zeitz, O., et al. Glaucoma progression is associated with decreased blood flow velocities in the short posterior ciliary artery. British Journal of Ophthalmology. 90, 1245-1248 (2006).
- Verma, N., Rettenmeier, A. W., Schmitz-Spanke, S. Recent advances in the use of Sus scrofa (pig) as a model system for proteomic studies. Proteomics. 11, 776-793 (2011).
- Foulds, W. S., Kek, W. K., Luu, C. D., Song, I. C., Kaur, C. A porcine model of selective retinal capillary closure induced by embolization with fluorescent microspheres. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, 6700-6709 (2010).
- Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I. The parameters of the porcine eyeball. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 249, 475-482 (2011).
- Manicam, C., Perumal, N., Pfeiffer, N., Grus, F. H., Gericke, A. First insight into the proteome landscape of the porcine short posterior ciliary arteries: Key signalling pathways maintaining physiologic functions. Scientific Reports. 6, 38298 (2016).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havli, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1, 2856-2860 (2006).
- Feist, P., Hummon, A. B. Proteomic challenges: sample preparation techniques for microgram-quantity protein analysis from biological samples. International Journal of Molecular Sciences. 16, 3537-3563 (2015).
- Cox, B., Emili, A. Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics. Nature Protocols. 1, 1872-1878 (2006).
- Zhang, L., et al. Proteomic analysis of mouse liver plasma membrane: use of differential extraction to enrich hydrophobic membrane proteins. Proteomics. 5, 4510-4524 (2005).
- Zhou, H., et al. Improved recovery and identification of membrane proteins from rat hepatic cells using a centrifugal proteomic reactor. Molecular & Cellular Proteomics. 10, 111 (2011).
- de la Cuesta, F., Mourino-Alvarez, L., Baldan-Martin, M., Moreno-Luna, R., Barderas, M. G. Contribution of proteomics to the management of vascular disorders. Translational Proteomics. 7, 3-14 (2015).
- Cottingham, K. 1DE proves its worth... again. Journal of Proteome Research. 9, 1636 (2010).
