Summary
Hier presenteren we een protocol voor de sequentiële gerichte kwantificering en niet-gerichte analyse van gefluoreerde verbindingen in water door de Spectrometrie van de massa. Deze methode biedt kwantitatieve niveaus van bekende fluorochemical verbindingen en identificeert onbekende chemicaliën in verwante monsters met semi-kwantitatieve ramingen van hun overvloed.
Abstract
Historische en opkomende per- en polyfluoroalkyl stoffen (PFASs) hebt opgeslaen aanzienlijke belangstelling van het publiek en overheidsinstellingen van de lokaal op federaal niveau. De voortdurende evolutie van PFAS oplossingen uitdaging een aan de milieubewaking, waar de verdere ontwikkeling van doelgerichte methoden noodzakelijkerwijs de ontdekking van nieuwe chemische stoffen achterblijft. Er is daarom een noodzaak, dat toekomstgericht methodologieën die kunnen detecteren van opkomende en onverwachte verbindingen, deze soorten na verloop van tijd controleren en oplossen van details van hun chemische structuur om toekomstige werken voor menselijke gezondheid. Te dien einde, niet-doelgerichte analyse door hoge-resolutie massa spectrometrie biedt een brede basis detectie-benadering die kan gecombineerd worden met vrijwel elk monster voorbereiding regeling en biedt belangrijke mogelijkheden voor de samengestelde identificatie na detectie. Hierin, wij beschrijven een solid-phase extraction (SPE) gebaseerd monster concentratie methode tuned voor kortere keten en meer hydrofiele PFAS chemicaliën, zoals per gefluoreerde ether zuren en ervan, en beschrijven van de analyse van monsters voorbereid op deze manier in zowel gerichte en niet-doelgerichte modi. Gerichte methoden een superieure kwantificering als referentie standaarden beschikbaar zijn maar intrinsiek beperkt tot de verwachte verbindingen bij het uitvoeren van de analyse. Daarentegen kan een niet-gerichte aanpak de aanwezigheid van onverwachte verbindingen te identificeren en sommige informatie verstrekken over hun chemische structuur. Informatie over chemische functies kan worden gebruikt voor correleren verbindingen over monster locaties en bijhouden van overvloed en voorkomen na verloop van tijd.
Introduction
De klasse van per- en polyfluoroalkyl stoffen (PFASs) zijn persistente organische verontreinigende stoffen met belangrijke openbare gezondheids-zorg. De specifieke verbindingen perfluorooctanoic zuur (PFOA) en perfluorooctanesulfonate (PFOS) hebben drinkwater gezondheid Raadgevend niveaus die door de EPA1,2 en hun grote Amerikaanse productie gestaakt in de 2000s3,4 . Om te krijgen van een belangrijke begrip voor de eigenschappen van PFAS zijn materialen in de textiel- en consument product manufacturing bollen, honderden, zo niet duizenden, van alternatieve PFAS oplossingen ontwikkeld om te vullen van niches in product, met inbegrip van vervangingen voor de afgekeurde stoffen5,6,7,8. Er is een voortdurende wilt controleren van de milieu-niveaus van rechte ketting perfluorinated carbonzuren en sulfonates dergelijke PFOS, PFOA en hun gekoppelde homologe reeksen, maar opkomende chemische verbindingen vallen niet door de gevestigde methodes zoals EPA Methode 5379 en vaak gebrek aan analytische normen voor traditionele gerichte analyse. De bedoeling van dit protocol is dus tweeledig. Het biedt een traject voor de gerichte LC-MS/MS-analyse van fluorochemical soorten in water waar analytische normen beschikbaar zijn en details van de naadloze integratie van een niet-gerichte, hoge-resolutie massa spectrometrie gebaseerde benadering voor data-analyse waarmee de detectie van onbekende of onverwachte stoffen in de dezelfde monsters.
Solid-phase extraction (SPE) is een gevestigde techniek voor de steekproef cleanup and concentratie met veel analyten en monster matrices10,-11-applicaties. P.a. van PFAS, meerdere vaste nulspanningsveilig fasen, met inbegrip van niet-polaire, matiemaatschappij polar en ionenwisseling kolommen zijn gebruikt om verschillende mate voor subklassen van gefluoreerde soorten in een breed scala van matrices9,12, 13,14,15,16. Voorschotten in SPE monster analyse met behulp van on-line opstellingen sterk verhogen de doorvoer van de aanpak en de reproduceerbaarheid van monster behandeling te verbeteren, maar de fundamentele proces blijft consistent17. Sommige inspanningen om de offline concentratie van SPE met groot volume injecties hebben ook plaatsgevonden, maar daarvoor aangebrachte wijzigingen in de chromatografie die ze buiten het domein van casual analyse18,19 plaatst . Onze analyse van het monster maakt gebruik van een polymere zwakke anion uitwisseling (WAX) nulspanningsveilig fase grondig zure PFAS materialen te scheiden van de traditionele organische contaminanten terwijl verwezenlijking van substantiële steekproef concentratie factoren. Deze WAX fase is het belangrijk om vast te leggen van de korte keten perfluorinated zuren zoals Perfluorbutaan sulfonaat (PFBS) of perfluorinated ethers zoals hexafluoropropylene oxide dimeer zuur (HFPO-DA) die meer polar dan de langere ketting oudere perfluorinated soorten20,21. Zoals in recente PFAS chemie5is er een significante verschuiving naar kortere gefluoreerde ketens en ether integratie zijn, kan deze fase selectie grondiger worden hersteld van nieuwe verbindingen voor MS-analyse.
Gerichte gebruik van LC-MS/MS kwantificatie geverifieerd normen en stabiele isotoop interne standaarden label biedt een ongeëvenaard niveau van gevoeligheid voor de kwantitatieve analyse en specificiteit. Hoewel deze aanpak wenselijk in veel situaties is, is het onpraktisch voor all-too-common situaties in de analyse. Gerichte aanpak werkt uitsluitend voor soorten die worden verwacht in het monster, en voor welke methoden zijn eerder vastgesteld. Voor nieuwe en opkomende verbindingen, deze benadering is niet in staat om zelfs het opsporen van soorten die van belang, ongeacht hun chemie of de concentratie, kunnen zijn en met een lage resolutie massaspectrometers zijn bijna niet in staat voldoende informatie om te maken ondubbelzinnige chemische toewijzingen van onbekende produkten. Bijgevolg, het gebied van niet-doelgerichte analyse ontstaan gebruik te maken van de kracht van high-resolution moderne massaspectrometers analyseren van monsters zonder een veronderstelde hypothese en met terugwerkende kracht het toewijzen van chemische stoffen aan detecteerbare functies in de steekproef. Deze aanpak is gebruikt uitgebreid op het gebied van biologie22,23,24 en Milieukunde25,26,27 op vele soorten chemicaliën. Perfluorinated chemische stoffen zijn bijzonder eenvoudig te identificeren in deze methode vanwege hun unieke massa spectrale patronen, en honderden verbindingen zijn beschreven in enkel de afgelopen paar jaar5,28.
Het protocol hier besproken is bedoeld om het uitlijnen van gerichte PFAS LC-MS/MS kwantificatie met de noodzaak om te identificeren en semi-kwantitatief opkomende verbindingen van belang te controleren. De SPE fase selectie en monster voorbereiding technieken zijn bedoeld om de vangst van meer hydrofiele opkomende PFAS zuren uit het water en kan worden minder geschikt voor langere ketting polymere soorten en niet-ionogene soorten. Verder is de gegevens die zijn gegenereerd door niet-gerichte analyse is dicht en van hoge dimensionaliteit, die het gebruik van de software van de analyse van de gegevens vereist. Dergelijke softwarepakketten zijn vaak specifieke leverancier en worden gewijzigd om te werken tussen instrument platformen. Waar mogelijk, het analyseproces is beschreven in een generieke mode en open bron/freeware alternatieven wordt verwezen, maar de efficiëntie en nauwkeurigheid van iedere software-benadering moeten worden beoordeeld op individuele basis.
Protocol
1. verzameling van watermonsters
- Voorbereiding van PFAS standaard voorraden
- Bereid een mengsel PFAS standaard in methanol met een gerichte verbindingen van belang (bijv. PFOA, PFOS, HFPO-DA) 1 ng/µL. Dit is het Native PFAS mengsel. Commercieel bereide mengsels zijn ook beschikbaar (dat wil zeggen, PFAC Mix A en Mix B).
- Een standaard mengsel met gecompenseerde stabiele isotoop label (SIL) PFAS verbindingen (bijvoorbeeld 13C4- PFOA, 13C8- PFOS, 13C3- HFPO-DA) voor te bereiden op 1 ng/µL. Dit is het mengsel PFAS IS. Commercieel bereide mengsels zijn ook beschikbaar (dat wil zeggen, MPAFC Mix A en Mix B).
Opmerking: Als een SIL-versie van de gerichte PFAS niet beschikbaar is, een surrogaat met vergelijkbare structuur en ketting lengte kan worden gebruikt (bijvoorbeeld 13C2- PFHxA voor HFPO-DA)
- Voorbereiding van veld leeg (FB), Spike leeg (SB) monsters
- Vul twee, schoon high-density polypropyleen (HDPE) of polypropyleen (PP) flessen met 1000 mL van laboratorium gede¨ uoniseerd water van de (DI), bekend als PFAS gratis.
Let op: PFAS materialen vaak hebben undefined toxiciteit en/of carcinogeniteit. Zorg moet worden genomen om te voorkomen dat mondeling of huid blootstelling aan normen of stamoplossingen. - Een hoeveelheid PFAS standaard mengsel toevoegen aan een van de flessen op een eindconcentratie gelijk aan de verwachte monsterconcentraties (bijvoorbeeld 100 ng/L). Dit is de Spike leeg (SB).
- Voeg 5 mL salpeterzuur 35% conserveermiddel de Spike leeg.
- De uitvoering van de SB monster en de blanco unspiked veld naar de locatie van de bemonstering als besturingselementen.
- Vul twee, schoon high-density polypropyleen (HDPE) of polypropyleen (PP) flessen met 1000 mL van laboratorium gede¨ uoniseerd water van de (DI), bekend als PFAS gratis.
- Veld bemonstering
Opmerking: Monster verzamelaar moet dragen nitril handschoenen en monster uit vloeiende systemen waar mogelijk. Kraan monsters mogen vloeien en equilibreer vóór de bemonstering (2-3 min).- 500-1000 mL water ophalen op de veldlocatie in een schone fles HDPE of PP.
- Voeg 5 mL salpeterzuur 35% conserveermiddel monsterflessen en veld leeg.
Let op: salpeterzuur is corrosief en een sterke oxidator
2. voorbeeld extractie
Opmerking: PFAS zijn alomtegenwoordige en voortdurende. Ervoor zorgen dat alle oplosmiddelen zijn van de hoogste rang hebben geanalyseerd voor lage niveau PFAS besmetting. Spoel alle laboratoriumapparatuur die wordt gebruikt voor het opstellen van normen voordat u spaties en monsters voorbereidt.
- Voorbehandeling van het monster
- Giet elk monster in een afzonderlijke, vooraf gereinigd 1 L HDPE studeerde aan de cilinder en record het exacte volume.
- Voeg 10 mL van methanol aan de leeggemaakte monster fles, het kapje en schud krachtig om te spoelen geadsorbeerde PFAS van het interieur van de fles.
- De gemeten watermonster terugkomen in de gespoeld fles met de methanol spoelen.
- Standaard curve voor kwantificatie
- Vul acht, 1 L HDPE/PP flessen met DI PFAS-gratis water.
- Selecteer acht gelijkmatig verdeelde concentraties die de gewenste kwantificatie scala. Bijvoorbeeld: 10, 25, 50, 100, 250, 500, 750 en 1000 ng/L voor een bereik van 10-1000 ng/L.
- Een hoeveelheid van inheemse PFAS mix toevoegen aan elke fles de eindconcentraties van de PFAS in punt 2.2.2 oplevert (bijvoorbeeld 100 µL PFAS Mix-A tot en met 1L DI water = 100 ng/L).
- Interne standaard toevoeging
Opmerking: Toevoeging van stabiele isotoop label interne standaard (IS) is alleen nodig als kwantitatieve resultaten worden gewenst naast niet-doelgerichte analyse.- Het IS PFAS mengsel toevoegen aan elk monster met een concentratie tot onderlinge aanpassing van het middelpunt van de ijkcurve (bijvoorbeeld 250 µL van IS PFAS mix = 250 ng/L)
- Filtratie
- Filtreer monsters door GF/A glasvezel filters (47 mm, 1.6 µm poriegrootte) onder zachte vacuüm in een vooraf gereinigd maatkolf van 1 L HDPE vacuüm.
- Als zwevende deeltjes in de fles blijft, spoel met extra gedeïoniseerd water in de filter. Het gefilterde water terug naar de monster fles of een nieuwe container voor vaste fase extractie.
- Vaste fase extractie (SPE)
Opmerking: Cartridge concentratie beschreven hier maakt gebruik van een constante stroom zuigerpomp. Alternatieve methoden van concentratie met behulp van een vacuüm spruitstuk20 of met behulp van een on-line SPE-LC-MS17 setup zijn mogelijk maar niet besproken.- Voorwaarde een zwakke anion uitwisseling (WAX) cartridge met 25 mL van methanol.
- Conditie van de WAX cartridge met een extra 25 mL gedeïoniseerd water.
- Positie pomp slang trekken in gefilterde monsterflessen en SPE cartridges met de namen van de steekproef van de bijbehorende label.
- Pomp 500 mL monster water door de cartridge tempo een gestage stroom van 10 mL/min (500 mL totaal), doorstroom vloeistof om afval te verwijderen.
Opmerking: De grotere of kleinere volumes kunnen worden geconcentreerd is afhankelijk van de verwachte monsterconcentraties. - Verwijder de cassette uit zuigerpomp voor elutie.
Opmerking: Indien extra monsters met behulp van de dezelfde pomp concentreren, de zuigerpomp moet worden gespoeld met 25 mL van methanol voordat u installeert de volgende patroon voor evenwichtsinstelling. - SPE cartridge overbrengen in een vacuüm variëteit en uitrusten met externe glazen reservoir.
- Flush SPE cartridge met 4 mL 25 mM, pH 4.0 natrium acetaat buffer onder zachte vacuüm. Stroom door negeren. Wassen SPE cartridge met 4 mL neutrale methanol.
Opmerking: Neutraal wassen breuk kan worden verzameld als specifieke nonionic polar analyten wordt verwacht. Anders, wegdoen om te verspillen - Plaats een 15 mL polypropyleen centrifugebuis onder elke cartridge SPE eluens verzamelen. Elueer monster met 4 mL 0,1% ammoniumhydroxide in methanol.
- Verwijder elutie buis en eluaat volume te verlagen tot 500-1.000 µL door verdamping onder droge stikstof stream in een waterbad bij licht verhoogde temperatuur (40 ° C).
- Geconcentreerd monster extracten kunnen vóór de analyse bij kamertemperatuur worden opgeslagen.
- Gerichte LC-MS/MS kwantificatie
- Verdunde 100 µL van monster extraheren met 300 µL van 2 mM ammonium acetaat buffer in een flacon van HPLC monster.
- Kalibreren en equilibreer een HPCL-samenstelling en MS systemen volgens de instructies van de fabrikant.
Opmerking: Achtergrond PFAS worden vaak gedetecteerd als gevolg van het gebruik van fluorpolymeer componenten van de meeste LC systemen en in monster flacon septa. Controleer of de detecteerbare niveaus in blanco te verwaarlozen vóór gebruik. Wijziging van de LC-systeem te vervangen door Teflon componenten wordt voorgesteld waar mogelijk. Het gebruik van een analytische "hold-up"-kolom naast de LC mengen klep is ook voorgestelde29. - Bereiden een analytische composities uit de standaard curve, voorbeelden en een extra kopie van de standaard curve te beoordelen van instrumentele drift over de run. De composities van een voorbeeld wordt weergegeven in tabel 1.
- Analyseer de monsters met behulp van de methoden van LC en MS voor de gerichte verbinding(en) van belang. Het verloop van de LC voorbeeld is weergegeven in tabel 2 en MS methodeparameters worden weergegeven in tabel 3 en tabel 4. Verdere kan gedetailleerde bespreking worden gevonden in McCord et al.21.
- Een standaard curve genereren uit de standaard monsters met behulp van de ratio gebied piek van de analyt de interne standaard ten opzichte van de concentratie van de analyt. Het genereren van een kwadratische regressie-formule met 1 / x weging voor concentratie voorspelling9.
- Kwantificeren van gerichte analyten in elk monster met behulp van de voorbereide standaard curven en gebied verhouding (standaardgebied / gebied) voor iedere meting.
- Als de concentratie hoger is dan het kalibratietraject, Verdun het oorspronkelijke monster met DI water verrijkt met de juiste IS concentratie en opnieuw uitpakken om de concentratie in het juiste bereik.
- Niet-gerichte LC-MS/MS gegevensverzameling
- Verdunde 100 µL van monster extraheren met 300 µL van 2 mM ammonium acetaat buffer in een flacon van HPLC monster.
- Kalibreren en equilibreer een HPCL-samenstelling en hoge resolutie MS volgens de instructies van de fabrikant.
- Bereiden een analytische composities zoals 2.6.2.
- Using naar de software instrument, het verzamelen van gegevens van de LC-MS met een brede scan MS1 in gegevens-afhankelijke modus voor het verzamelen van MS/MS. voorbeeld LC verloop in tabel 5. Verdere bespreking van instrumentele instellingen kan worden gevonden in Strynar et al.30 en Newton et al.31.
Opmerking: Voor verbeterde MS/MS analyse van de gegevens afhankelijk van de kwaliteit kan worden uitgevoerd met een voorkeur ion-lijst van een subset van functies die overblijven na de verwerking van de gegevens in 2.8.1-2.8.8.
- Verwerking van de gegevens van de niet-gerichte
Opmerking: Data-analyse kan worden uitgevoerd met een breed scala aan software en deze methoden weerspiegelen niet de enige of beste methode voor een willekeurige dataset. Waar mogelijk, bieden stappen een generieke beschrijving die in alternatieve software kan worden uitgevoerd. Verwerking van de voorbeeldgegevens van de in het volgende gebruikt in dit manuscript werd uitgevoerd met behulp van specifieke software leverancier (Software-1 en 2 van de Software) zoals beschreven in Newton et al..31.- Uitvoeren van moleculaire functie extractie van chemische eigenschappen met behulp van een van verschillende open source software pakketten32,33 of leverancier software te identificeren exacte missen, retentietijden en geïntegreerde piek gebieden van chemische functies.
- Selecteer in Software-1, de voorbeeldbestanden toevoegen/verwijderen > bestanden toevoegen en selecteer de onbewerkte gegevens uit het experiment niet-doelgerichte en druk op OK.
- In Software-1 Selecteer Batch recursieve functie extractie > Open methode... om te laden van een preestablished methode, of software-instellingen handmatig te bewerken. Profinder instellingen voor extractie van de functie vindt u in tabel 6.
- Software-1, na extractie van de functie, Selecteer in bestand > exporteren als CSV-bestand..., bestand > exporteren als CEF..., of bestand > exporteren als PFA... voor verdere verwerking. CEF bestanden wordt verondersteld dat voor de rest van de beschrijving.
- In Software 2 (MPP) Maak een nieuw experiment met Type Unidentified en type werkstroom Wizard gegevens importeren en klik op OK.
- In MPP Gegevensbestanden selecteren en zoek de geëxporteerde Software 1 resultaten (CEF of PFA) importeren; Klik vervolgens op volgende totdat de Uitlijning parameteropties worden weergegeven.
- In MPP, stel de uitlijning samengestelde waarden op 0.0 (uitlijning werd reeds uitgevoerd in de winning van functie van Software-1, stap 2.8.1.2) en klik op volgende door de stappen totdat de einddatum is beschikbaar.
- Filteren op basis van analytische reproduceerbaarheid identificaties. Wanneer meerdere monsters beschikbaar zijn, functies aanwezig moeten zijn in > 80% van het individu wordt gerepliceerd en hebben een analytische variatiecoëfficiënt (CV) van < 30%
- In MPP selecteren experimentele opzet > Experiment groepering en elke raw-bestand een groep die betrekking hebben op de oorsprong steekproef (dat wil zeggen, duplo's uit dezelfde bron in dezelfde groep moeten worden). Meerdere groepen kunnen worden gemaakt, overeenkomt met de genestelde variabelen (bijvoorbeeld instrumentaal vs. technische wordt gerepliceerd).
- In MPP selecteren experimentele opzet > maken interpretatie selecteert u de parameter experiment (dat wil zeggen, groep) en klik op volgende totdat de einddatum is beschikbaar. Hierdoor ontstaat een categorie die van toekomstige filteren kunt bedienen.
- In MPP selecteren kwaliteitscontrole > Filter per frequentie. Entiteit lijst instellen voor Alle entiteiten en de interpretatie aan het monster Group(non-averaged) gemaakt in 2.8.2.2, en klik op volgende.
- Voor invoerparameters, entiteit retentie vastgesteld op 80% van de bemonsterde in minstens één voorwaarde en klik op volgende totdat de einddatum is beschikbaar. Naam van de lijst frequentie gefilterd functies
- In MPP selecteren kwaliteitscontrole > Filter op monster variabiliteit. Stel de entiteit lijst aan de frequentie gefilterd kenmerken van 2.8.2.4 en de interpretatie te Group(non-averaged), vervolgens treffer volgende.
- Selecteer het keuzerondje voor Onbewerkte gegevens en het bereik van belang aan coëfficiënt van de variatie < 30%. Klik op volgende > voltooien en de lijst opslaan als CV gefilterd functies.
- Verwijderen van functies waar geen monsters beduidend hoger hebben (> 3 vouwen) overvloed dan het veld leeg (FB) monster.
- In MPP selecteren Analyse > verandering vouwen. Setlist CV gefilterd kenmerken in de entiteit en de interpretatie aan het monster groep vervolgens treffer volgende. Selecteer de optie wijzigen Vouw allemaal tegen één voorwaarde en voorwaarde selecteren FB of wat de naam van de groep voor de verwerkte blancomonster was.
- Stel de Fold-Change cutoff naar 3.0 op het volgende scherm en doorklikken naar het einde van de aanwijzingen op het scherm. De lijst opslaan als FC gefilterde lijst.
- Uitvoeren van binaire vergelijkingen van afzonderlijke monsters van belang tegen een passende achtergrond monster (bijvoorbeeld upstream vs. stroomafwaarts van een puntbron) vouw-wijzigingen voor individuele chemische eigenschappen bepalen.
- In MPP selecteren Analyse > Filter op het uitzetten van de vulkaan. Stel de lijst entiteit op FC gefilterde lijst en de interpretatie aan groep.
- Voor de fold-change voorwaarde paar kiezen twee monsters voor vergelijking (bijvoorbeeld een gepaarde upstream- en downstream steekproef) en selecteer test Ongepaarde Mann-Whitney.
- Voor voorlopige analyse, niet een waarde voor meerdere test correctie op het volgende scherm selecteert, doorklikken naar de plot van het resultaat.
- Selecteer op het scherm van de resultaten een vouw-change cutoff van 3.0 en een p-waarde cutoff tot 0,1. Vervolgens Voltooien en export de lijst als Kwalificatie resultaten.
- Voor elke functie die overblijft na filteren, voorspelde chemische formula(s) uit de exacte massa en samengestelde massaspectrum te genereren.
- Selecteer in MPP, interpretatie van de resultaten > identificatie van de IDBrowser en de Kwalificatie resultatenlijst entiteit.
- Selecteer in de IDBrowser identificeren alle verbindingen met behulp van moleculaire formule generator (MFG) als de identificatiemethode.
- In de formule genereren opties F toevoegen aan de kolom van elementen en het Maximum op 50 instelt, dan Selecteer Finish. Selecteer Opslaan en terug te keren naar MPP na formule generatie.
- MPP, rechts klik in de gefilterde en MFG gematched entiteit lijst en selecteer Lijst exporteren. De resultaten opslaan.
- Onderzoeken van de exacte massa van soorten in de minder belangrijke chemische eigenschaplijst voor scripts die massa gebreken indicatieve van fluorering; Zie soort en Fiehn34.
- Opmerking chemische serie met gemeenschappelijke polyfluorination motieven (CF-2 (m/z 49.9968), CF2O (m/z 65.9917), CH2CF2O (m/z 80.0074), enz.) met behulp van een massa defect plot of software algoritme; Zie de sectie discussie, Liu et al.17, Loos et al.35 en36van de Dimzon et al..
- Zoek voorspelde chemische formules of neutrale massa's tegen de EPA chemie Dashboard database en/of andere databases om terug te keren van potentiële chemische structuren.
- Open de EPA Comptox chemicaliën Dashboard Batch Search tool (https://comptox.epa.gov/dashboard/dsstoxdb/batch_search) en plak de lijst van identificatienummers (formules of massa's) in het vak ID na het selecteren van het ID-type (d.w.z., MS-klaar Formule of exacte massa).
- Selecteer Download chemische Data... en ook alle gegevens van de fysische/chemische/toxicologie gewenst voor mogelijke overeenkomende items afkomstig uit de dropdown te selecteren.
- Met behulp van chemische intuïtie en beschikbare verwijzingsgegevens, onwaarschijnlijk wedstrijden te verwijderen uit de lijst met mogelijke chemische structuur voor elke formule gebaseerd op haalbaarheid als gevolg van chemische stabiliteit, fysische eigenschappen zoals ionizability of hydrophobicity, de aanwezigheid van de productie van chemische stoffen uit nabijgelegen bronnen, enz. Bij het ontbreken van aanvullende gegevens, kan spectrale haalbaarheid positie krijgen puur op basis van de literatuur prevalentie; Zie McEachran et al.37.
- Bevestigen van structuren met behulp van beschikbare normen en/of gerichte high-resolution MS/MS matching van fragmenten tegen spectra van databases, in silico theoretische spectra of handmatige curatie.
- Uitvoeren van moleculaire functie extractie van chemische eigenschappen met behulp van een van verschillende open source software pakketten32,33 of leverancier software te identificeren exacte missen, retentietijden en geïntegreerde piek gebieden van chemische functies.
Representative Results
Kwantitatieve resultaten van de LC-MS/MS zijn in de vorm van ion-chromatogrammen voor het totale ion chromatogram (TIC) en de uitgepakte ion chromatogrammen (EIC) van specifieke chemische overgangen voor gemeten chemicaliën (Figuur 1). De geïntegreerde piekoppervlakte van een chemische overgang betrekking heeft op de samengestelde overvloed en kan worden gebruikt voor de berekening van de exacte concentratie met behulp van een ijkcurve genormaliseerd naar een interne standaard (Figuur 2). Lage of plat reactie van individuele analyten geeft aan dat het kalibratietraject zich buiten de lineaire bereik van de massaspectrometer, of dat het instrument vereist tuning/calibratie. Arme precisie van replicatieonderzoeken duidt op een probleem met monster injectie of inconsistent chromatografie die wijziging van LC parameters vereist.
Niet-gerichte analyse met behulp van een volledige scan van de MS1 levert een TIC voor monsters (Figuur 3), waarmee een ad hoc-generatie van EIC's voor individuele ionen (Figuur 4). Elk punt gegeven chromatografische tijd bevat signalen voor chemische soorten, en bij gebruik van een hoge-resolutie massa spectrometer, de isotopische vingerafdruk van de compound. Identificatie van de stoffen uit de MS1 scan wordt programmatisch uitgevoerd door een piek-picking algoritme met behulp van een van verschillende benaderingen38,-39,40. Piek plukken levert chemische eigenschappen met een gemeten nauwkeurige massa en HPLC-retentietijd, evenals de massaspectrum van het ion en de chromatografische piekoppervlakte. Deze informatie wordt meestal opgeslagen in een digitale database-indeling voor verdere verwerking en filteren, maar de geneste en onderling verbonden aard van de gegevens kan worden begrepen conceptueel (Figuur 5).
De feature lijst is gefilterd voor verbindingen die voldoen aan een van verschillende criteria worden geselecteerd voor verder onderzoek. De eerste en eenvoudigste is filteren op massa defect (het verschil tussen de exacte massa van een functie en haar nominale massa). PFAS stoffen hebben negatieve massa gebreken (Figuur 6) als gevolg van hun overwicht van fluor atomen, en polyfluorinated verbindingen hebben positieve, maar aanzienlijk kleinere massa dan homologe organische materialen31,34 . Een tweede methode filteren stap is het identificeren van homologe serie met herhalende eenheden gemeen PFAS soorten, zoals CF2 of CF2O. identificeren dit kan worden gedaan met behulp van Kendrick massa defect percelen17,36, of Softwarepakketten zoals R's nontarget pakket35 (Figuur 7).
Volgende filteren, toewijzing van chemische identiteit op de shortlist van zeer differentieel waargenomen en/of voorlopig per / polyfluorinated soorten kunnen beginnen. Nauwkeurige massa biedt een relatief kleine lijst van potentiële chemische formules voor het afstemmen van maar is onvoldoende voor identificatie zonder toevoeging van spectrale matching naar het patroon van de isotopen van de massaspectrum-41. Van hoge resolutie MS1 gegevens, zijn een of meer vermeende chemische formules vergeleken met de isotopische vingerafdruk van de massaspectrum en scoorde (Figuur 8). Formules voor het afstemmen van ab initio met behulp van een bepaalde pool van atomen kunnen worden gegenereerd of kan worden gekapt uit een combinatie van literatuur gemeld verbindingen en de inhoud van een of meer databases. De ons EPA chemie Dashboard (https://comptox.epa.gov/dashboard/) gastheren een voortdurend bijgewerkte lijst van PFAS verbindingen geïdentificeerd door het Agentschap, evenals lijsten gecompileerde door andere organisaties, zoals de NORMAN Network42.
Chemische formules kunnen verder worden bevestigd, en wat structurele informatie kan worden garnered uit MS/MS-spectra (Figuur 9). Kandidaat-structuren zijn verkrijgbaar bij grote chemische databases zoals de EPA chemie dashboard, Pubchem, de CAS register, enz. Voorspelde spectra kunnen worden gegenereerd of verworven met behulp van een verscheidenheid van programma's van versnippering en toegewezen,43 of MS/MS-spectra kunnen geïnterpreteerd worden handmatig.
Een voorbeeld data matrix is verkrijgbaar in de aanvullende informatie die bevat een matrix van de gehele functie van tien monsters (5 stroomopwaarts, stroomafwaarts 5) verzameld stroomopwaarts en stroomafwaarts van een puntbron fluorochemical. Elke rij vertegenwoordigt een chemische functie met bijbehorende retentietijd, neutrale massa massaspectrum en ruwe overvloed voor elk monster. (Aanvullende tabel, blad 1). Eerste filtering (Aanvullende tabel, blad 2) voor negatieve massa defect en statistische significantie in een ongepaard t-test tussen stroomopwaarts en stroomafwaarts vermindert het aantal "interessante" chemische eigenschappen ~ 120. Voorspelde chemische formules werden verkregen van Agilent IDBrowser en zocht tegen het Dashboard van het chemische stoffen van de Comptox van de EPA, dat leverde mogelijk items (Aanvullende tabel, blad 3). De "top-hit" voor elke chemische formule gebaseerd op gegevens bronnen37 werd toegewezen (Aanvullende tabel, Sheet 4). Merk op dat meer dan de helft van de resterende functies geen hoge kwaliteit wedstrijden. Geïdentificeerde functies met geen wedstrijden kunnen het resultaat van de in-source fragmentatie/adduct vorming, slechte formule toewijzing, of de identificatie van PFASs niet gevonden in de brondatabase. Interpretatie van de ruwe spectra om te valideren toewijzingen valt buiten het bestek van dit manuscript maar meer informatie kan worden gevonden in de werken geciteerde15,30,31,44, 45.
| ID | Monster naam | Voorbeeld Type | Std Conc | Flacon | LC-methode | MS methode |
| 1 | DB_001 | Leeg | 1:A, 1 | PFAS grad 400uL/min - 9 min lopen | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 2 | DB_002 | Leeg | 1:A, 1 | PFAS grad 400uL/min - 9 min lopen | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 3 | DB_003 | Leeg | 1:A, 1 | PFAS grad 400uL/min - 9 min lopen | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 4 | DB_004 | Leeg | 1:A, 1 | PFAS grad 400uL/min - 9 min lopen | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 5 | DB_005 | Leeg | 1:A, 1 | PFAS grad 400uL/min - 9 min lopen | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 6 | FB | Leeg | 1:A, 2 | PFAS grad 400uL/min - 9 min lopen | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 7 | 10 std | Standaard | 10 | 1:A, 3 | PFAS grad 400uL/min - 9 min lopen | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 8 | 25 std | Standaard | 25 | 1:A, 4 | PFAS grad 400uL/min - 9 min lopen | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 9 | 50 std | Standaard | 50 | 1:A, 5 | PFAS grad 400uL/min - 9 min lopen | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 10 | 100 std | Standaard | 100 | 1:A, 6 | PFAS grad 400uL/min - 9 min lopen | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 11 | 250 std | Standaard | 250 | 1:A, 7 | PFAS grad 400uL/min - 9 min lopen | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 12 | 500 std | Standaard | 500 | 1:A, 8 | PFAS grad 400uL/min - 9 min lopen | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 13 | 750 std | Standaard | 750 | 1:B, 1 | PFAS grad 400uL/min - 9 min lopen | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 14 | 1000 std | Standaard | 1000 | 1:B, 2 | PFAS grad 400uL/min - 9 min lopen | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 15 | DB_006 | Leeg | 1:B, 3 | PFAS grad 400uL/min - 9 min lopen | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 16 | SB_DUP1 | Analyt | 1:B, 4 | PFAS grad 400uL/min - 9 min lopen | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 17 | SB_DUP2 | Analyt | 1:B, 5 | PFAS grad 400uL/min - 9 min lopen | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 18 | SW Site 03 | Analyt | 1:B, 6 | PFAS grad 400uL/min - 9 min lopen | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 19 | SW Site 16 | Analyt | 1:B, 7 | PFAS grad 400uL/min - 9 min lopen | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 20 | SW Site 30 | Analyt | 1:B, 8 | PFAS grad 400uL/min - 9 min lopen | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 21 | DB_007 | Analyt | 1:C, 1 | PFAS grad 400uL/min - 9 min lopen | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 22 | SW Site 19 | Analyt | 1:C, 2 | PFAS grad 400uL/min - 9 min lopen | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 23 | SW Site 48 | Analyt | 1:C, 3 | PFAS grad 400uL/min - 9 min lopen | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 24 | SW Site 49 | Analyt | 1:C, 4 | PFAS grad 400uL/min - 9 min lopen | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 25 | SW Site 05 | Analyt | 1:C, 5 | PFAS grad 400uL/min - 9 min lopen | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 26 | SW Site 47 | Leeg | 1:C, 6 | PFAS grad 400uL/min - 9 min lopen | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 27 | DB_008 | Analyt | 1:C, 7 | PFAS grad 400uL/min - 9 min lopen | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 28 | SW Site 19_DUP | Analyt | 1:C, 8 | PFAS grad 400uL/min - 9 min lopen | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 29 | SW Site 20 | Analyt | 1:D, 1 | PFAS grad 400uL/min - 9 min lopen | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 30 | SW Site 21 | Analyt | 1:D, 2 | PFAS grad 400uL/min - 9 min lopen | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 31 | SW Site 46 | Analyt | 1:D, 3 | PFAS grad 400uL/min - 9 min lopen | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 32 | SW Site 47 | Analyt | 1:D, 4 | PFAS grad 400uL/min - 9 min lopen | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 33 | DB_009 | Leeg | 1:D, 5 | PFAS grad 400uL/min - 9 min lopen | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 28 | SW Site 32 | Analyt | 1:D, 6 | PFAS grad 400uL/min - 9 min lopen | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 29 | SW Site 50 | Analyt | 1:D, 7 | PFAS grad 400uL/min - 9 min lopen | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 30 | SW Site 25 | Analyt | 1:D, 8 | PFAS grad 400uL/min - 9 min lopen | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 31 | SW Site 21_DUP | Analyt | 1:E, 1 | PFAS grad 400uL/min - 9 min lopen | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 32 | SW Site 52 | Analyt | 1:E, 2 | PFAS grad 400uL/min - 9 min lopen | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 33 | DB_010 | Leeg | 1:E, 3 | PFAS grad 400uL/min - 9 min lopen | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 34 | FB | Leeg | 1:A, 2 | PFAS grad 400uL/min - 9 min lopen | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 35 | 10 std | Standaard | 10 | 1:A, 3 | PFAS grad 400uL/min - 9 min lopen | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 36 | 25 std | Standaard | 25 | 1:A, 4 | PFAS grad 400uL/min - 9 min lopen | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 37 | 50 std | Standaard | 50 | 1:A, 5 | PFAS grad 400uL/min - 9 min lopen | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 38 | 100 std | Standaard | 100 | 1:A, 6 | PFAS grad 400uL/min - 9 min lopen | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 39 | 250 std | Standaard | 250 | 1:A, 7 | PFAS grad 400uL/min - 9 min lopen | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 40 | 500 std | Standaard | 500 | 1:A, 8 | PFAS grad 400uL/min - 9 min lopen | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 41 | 750 std | Standaard | 750 | 1:B, 1 | PFAS grad 400uL/min - 9 min lopen | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 42 | 1000 std | Standaard | 1000 | 1:B, 2 | PFAS grad 400uL/min - 9 min lopen | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 43 | DB_011 | Leeg | 1:B, 2 | PFAS grad 400uL/min - 9 min lopen | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 44 | DB_012 | Leeg | 1:E, 4 | PFAS grad 400uL/min - 9 min lopen | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
Tabel 1: Voorbeeld composities voor gerichte analyse en kwantificatie van PFAS met LC-MS/MS
| Tijd (min) 0 |
% A (2.5 mM ammoniumacetaat op in 5% MeOH) 90 |
% B (2.5 mM ammoniumacetaat op in 95% MeOH) 10 |
| 5 | 15 | 85 |
| 5.1 | 0 | 100 |
| 7 | 0 | 100 |
| 7.1 | 90 | 10 |
| 9 | 90 | 10 |
Tabel 2: Voorbeeld kleurovergang voor LC scheiding in gerichte analyse
| Capilary spanning (kv) | 1.97 |
| Kegel Voltage (V) | 15 |
| Extractor Voltage (V) | 3 |
| RF Lens (V) | 0.3 |
| Bron Temp | 150 |
| Desolvation Temp | 40 |
| Desolvation Gas Flow (L/hr) | 300 |
| Kegel gasstroom (L/hr) | 2 |
Tabel 3: Ionisatie bron parameters voor gerichte analyse
| CMP | Voorloper | Product | Nadruktijd | Kegel Voltage (V) | Botsing energie (eV) |
| PFBA | 212.80 | 168.75 | 0,01 | 15 | 10 |
| 13C 4-PFBA IS | 216.80 | 171.75 | 0,01 | 15 | 10 |
| PFPeA | 262.85 | 218.75 | 0,01 | 15 | 9 |
| PFBS ° 1 | 298.70 | 79.90 | 0,01 | 40 | 30 |
| PFBS ° 2 | 298.70 | 98.80 | 0,01 | 40 | 28 |
| PFHxA ° 1 | 312.70 | 118.70 | 0,01 | 13 | 21 |
| PFHxA ° 2 | 312.70 | 268,70 | 0,01 | 13 | 10 |
| 13C 2-PFHxA IS | 314.75 | 269.75 | 0,01 | 13 | 9 |
| HFPO-DA 1° | 329.16 | 168.90 | 0,01 | 10 | 12 |
| HFPO-DA 2° | 329.16 | 284.90 | 0,01 | 10 | 6 |
| HFPO-DA IS 1° | 332.16 | 168.90 | 0,01 | 10 | 12 |
| HFPO-DA IS 2° | 332.16 | 286.90 | 0,01 | 10 | 6 |
| PFHpA ° 1 | 362.65 | 168.65 | 0,01 | 14 | 17 |
| PFHpA ° 2 | 362.65 | 318.70 | 0,01 | 14 | 10 |
| PFHxS ° 1 | 398.65 | 79.90 | 0,01 | 50 | 38 |
| PFHxS ° 2 | 398.65 | 98.80 | 0,01 | 50 | 32 |
| 13C 4-PFHxS IS | 402.65 | 83.90 | 0,01 | 50 | 38 |
| PFOA ° 1 | 412.60 | 168.70 | 0,01 | 15 | 18 |
| PFOA ° 2 | 412.60 | 368.65 | 0,01 | 15 | 11 |
| 13C 4-PFOA IS | 416.75 | 371.70 | 0,01 | 15 | 11 |
| PFNA ° 1 | 462.60 | 218.75 | 0,01 | 15 | 17 |
| PFNA ° 2 | 462.60 | 418.60 | 0,01 | 15 | 11 |
| PFNA IS | 467.60 | 422.60 | 0,01 | 15 | 11 |
| PFOS ° 1 | 498.65 | 79.90 | 0,01 | 60 | 48 |
| PFOS ° 2 | 498.65 | 98.80 | 0,01 | 60 | 38 |
| 13C 4-PFOS IS | 502.60 | 79.70 | 0,01 | 60 | 48 |
| PFDA ° 1 | 512.60 | 218.75 | 0,01 | 16 | 18 |
| PFDA ° 2 | 512.60 | 468.55 | 0,01 | 16 | 12 |
| 13C 2 - IS PFDA | 514.60 | 469.55 | 0,01 | 16 | 12 |
Tabel 4: Voorbeeld van de overgang tabel en MS/MS parameters voor de inhoud van PFAC-MXA, samen met HFPO-DA
| Tijd (min) |
% A (2.5 mM ammoniumacetaat op in 5% MeOH) |
% B (2.5 mM ammoniumacetaat op in 95% MeOH) |
| 0 | 90 | 10 |
| 0,5 | 90 | 10 |
| 3 | 50 | 50 |
| 3.5 | 50 | 50 |
| 5.5 | 40 | 60 |
| 6 | 40 | 60 |
| 7 | 0 | 100 |
| 11 | 0 | 100 |
Tabel 5: Voorbeeld kleurovergang voor LC scheiding in niet-doelgerichte analyse
| Profinder Parameter | Waarde van de instelling |
| Extractie piek hoogte Filter | 800 graven |
| Toegestane Ion(s) | -H / + H |
| Functie extractie isotoop Model | Gemeenschappelijke organische moleculen |
| Toegestane lading Staten | 2 - Jan |
| Samengestelde drempelwaarde voor het aantal van de Ion | Twee of meer ionen |
| Uitlijning RT tolerantie | 0,40 min + 0.0% |
| Uitlijning massa tolerantie | 20.00 ppm + 2.0mDa |
| Post-processing Absolute hoogte Filter | > = 10000 graven in één monster |
| Post-processing MFE Score Filter | > = 75 in een monster |
| Piek integratie algoritme | Behendig 2 |
| Piek integratie hoogte Filter | > = 5000 graven |
| Zoek van Ion Absolute hoogte Filter | > = 7500 graven in één monster |
| Zoek van Ion Score Filter | > = 50,00 in één monster |
Tabel 6: Moleculaire functie extractie instellingen en uitlijning voor Profinder software. Alle niet-vermelde waarden behouden hun standaardinstellingen voor gegevensverwerking.
| Drempel van de overvloed van Ion | Functie drempels | Repliceren drempel (n = 5) | Bewerkingstijd | Functies | Pass repliceren drempel | Pass CV drempel | Functies voor 90% van de TIC |
| 1 x S/N | 2000 | Geen | 8.15 | 987 | 505 | 421 | 91 |
| 2 x S/N | 5000 | Geen | 5.02 | 707 | 357 | 313 | 93 |
| 3 x S/N | 10000 | Geen | 2.3 | 308 | 249 | 230 | 93 |
| 1 x S/N | 2000 | 100% | 3.3 | 603 | 339 | 297 | 92 |
| 2 x S/N | 35000 | 100% | 1.58 | 310 | 248 | 229 | 93 |
| 3 x S/N | 10000 | 100% | 1.45 | 202 | 190 | 182 | 92 |
Tabel 7: Vergelijking van monster verwerkingstijd en chemische functie identificaties voor verschillende functiesets extractie drempels.
Figuur 1 : Totale ion chromatografische en uitgepakte ion chromatogrammen voor een subset van perfluorinated ether normen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Representatief kalibratiekrommen voor verbindingen aan te tonen de afnemende kwaliteit van analytische kromme bouw. Meest linkse paneel geeft aan een hoge kwaliteit kalibratie; Middelste paneel geeft een verbinding met slechte precisie in voorbereiding duplicaten, vooral bij de hogere concentraties; Recht paneel geeft een curve met slechte precisie en een lage lineaire dynamisch bereik, wat resulteert in vlakke respons aan het hoge einde van het kalibratietraject, en geen opspoorbaar signaal aan de onderkant. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Totale ion chromatogrammen (TIC) bedekt voor oppervlaktewater verzamelde stroomopwaarts en stroomafwaarts van een productielocatie voor de fluorochemical extracten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Uitgepakte ion chromatogrammen (EIC) voor alle geïdentificeerde chemische kenmerken van een oppervlaktewater-monster met meerdere klassen van de fluorochemical. Elke chemische trace is een verschillende kleur voor differentiatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Conceptueel diagram van ruwe en voorspelde informatie voor een chemische functie geïdentificeerd als hexafluoropropylene oxide dimeer zuur (HFPO-DA). Chemische functies zijn samengesteld uit software extractie van ruwe data van MS metingen en chromatografische bevatten (bijvoorbeeld retentietijd (RT)) en massa spectrometrie informatie. Voorspelde formule, structuren en chemische identiteiten worden gegenereerd uit ruwe meetgegevens voor elke functie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6 : Massa defect plot voor chemische eigenschappen geïdentificeerd in een productie monding (rood, links) en de referentie oppervlaktewater (blauw, juiste). Gefluoreerde verbindingen vallen in de buurt van en onder de onderbroken nullijn. Opmerking de persistente PFOA/PFOS-serie in de achtergrond oppervlaktewater steekproef (rechts). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7 : Massa vs massa defect plot voor niet-geïdentificeerde chemische kenmerken van een oppervlaktewater monster met homologe serie geïdentificeerd en gelabeld door de nontarget R package. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 8 : Spectrum van de massa van een onbekende chemische eigenschappen met voorspelde isotopische intensiteiten van drie mogelijke chemische formule met de dezelfde exacte mass. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 9 : Versnippering spectrum van een perfluorinated ether verbinding met geannoteerde fragment pieken. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 10 : Grafische weergave van het filteren van drempels. Van links naar rechts, ion overvloed drempel voor chemische functie massaspectra, voorzien van overvloed drempel voor uitgepakte chromatografische functies en repliceren drempel voor functie detectie frequentie in een drievoudige injectie-experiment. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Voorbeeld behandeling en voorbereiding
De opneming van een verwijzing/piek normen zijn van het allergrootste belang een gerichte analyse, aangezien zij bieden een backstop om analytische geldigheid te controleren. Ontbreken van QC-monsters voorkomt dat een beoordeling van de juistheid van de resultaten; de alomtegenwoordige aard van fluorochemicaliën betekent dat kans besmetting van veldmonsters, verwerking van de materialen, of LC-MS systeem niet ongewoon is en administratief moet worden verwerkt. Verder, het zorgt voor de validatie van het protocol ongeacht variatie in het dagelijkse monster verwerking, zoals vele van deze stappen kunnen zeer variabel zijn, met name de SPE en monster concentratie stappen. De winning van zowel oude en nieuwe perfluorinated chemicaliën kan sterk worden beïnvloed door de keuze van de stationaire fase voor concentratie, en onderdelen van de bron-monsters, zoals pH en zoutgehalte46. De invloed van monster voorwaarden moet worden beschouwd als bepaalde klassen van pefluorinated chemische stoffen van belang zijn. Alternatieve monster voorbereiding regelingen voor water extracten kunnen worden gebruikt als de laboratorium-opstelling beschikbaar is en de stroomafwaartse gegevensanalyse vergelijkbaar blijft.
Doelgerichte Data-analyse
Voor verbindingen met beschikbare normen en gecompenseerde, stabiele isotoop label interne standaarden, de primaire zorgen voor gegevensanalyse zijn instrumentaal en bepaling van de methode detectiegrenzen en geschikt rapportage bereiken kunnen worden bepaald op een laboratorium-door-laboratorium basis met behulp van standaard benaderingen, zoals signal-to-noise verhouding van low-level standaard pieken47. Bij gebrek aan gecompenseerde interne standaarden van niet-overeenkomende matrixeffecten fouten kunnen optreden en nauwkeurige rug-voorspelling van verrijkte monsters kan worden gebruikt voor de schatting van de nauwkeurigheid van de metingen. Wanneer het gebrek aan normen ter voorbereiding van een curve, een kwantitatieve schatting van een onbekende kan worden gemaakt door behandelen identiek aan een nauw gecompenseerde standaard samengestelde, maar fouten in de schatting zijn over de volgorde van 10 + vouw met beperkte mogelijkheid om te kwantificeren van de onzekerheid, zie McCord, Newton en Strynar21. In deze gevallen trendgegevens kan nog steeds worden verzameld, maar concentratie schattingen zijn inherent onbetrouwbaar.
Niet-doelgerichte Data-analyse
Piek plukken instellingen hebben een aanzienlijke invloed op het aantal chemische eigenschappen geïdentificeerd, maar de kwaliteit van de functie selectie is ook sterk beïnvloed. De beslissingen van belang in piek plukken zijn 1) intensiteit van individuele massa's moeten worden opgenomen in de spectra, de drempel voor het overvloed van ion 2) de intensiteit van de uitgepakte chromatografische pieken te worden beschouwd als functies, de functie overvloed drempel 3) functie detectie frequentie, de repliceren drempel en 4) analytische variatie, de CV-drempel (Figuur 10).
Instelling onrealistisch lage drempels voor piek plukken resultaten in een exponentiële toename van de steekproef tijd om op te lossen van de extra functies van steeds lagere overvloed (tabel 7). De ion-overvloed drempel filters massa spectrale kenmerken waar genoeg van de individuele isotoop abundanties de drempel niet doorgeven. Hiermee wordt een ideale alleen voor eigenschappen met kwaliteit MS spectra, ervoor te zorgen zij echte chemische eigenschappen in plaats van instrumentale lawaai, en rekening houdend met de formule voorspelling in downstream processing. Een passende drempel is gebaseerd op de instrumentale lawaai, ideaal minstens 3 x de Ruisdrempel voor MS1 scant. Functie overvloed drempel filters chemische functies op basis van de intensiteit of het gebied van de chromatografische functie geëxtraheerd. Deze stap maakt afwijzing van lage overvloed pieken, die zijn meestal van slechte chromatografische kwaliteit hoge afwijkingen, of problemen hebben zijn het resultaat van de extractie van andere slechte software. Een passende drempel moet worden bepaald per experiment, en matrix gebaseerd op een aanvaardbaar niveau van slechte functie generatie (bijvoorbeeld functies onder de drempel tentoonstelling onaanvaardbaar slechte chromatografie). Verder kan analytical QC worden gebruikt voor het verwerpen van de functies op de chromatografische niveau gebaseerd op inconsistente identificatie in analytische en/of voorbereidende replicatieonderzoeken (repliceren drempel) of op basis van arme reproduceerbaarheid over replicatieonderzoeken (CV drempel). Passende niveaus, is afhankelijk van de kwaliteit van de gebruikte software van de piek-integratie en de chemische entiteiten onderzochte. Voor water oplosbare perfluorinated verbindingen en licht geoptimaliseerde integratie protocollen, functies moeten worden geïdentificeerd 80 + % van analytische gerepliceerd en CVs worden verwacht om te vallen minder dan 30%, zoals beschreven in de sectie methoden.
De toppen ontdekt van niet-doelgerichte analyse opleveren kwantitatieve schattingen van de concentraties van de materialen gedetecteerd. Verder, de identiteit van de ware onbekenden kunnen moeilijk te bevestigen omdat nieuwe verbindingen afwezig zijn uit openbaar beschikbare databases. Nieuwe structurele bepaling een uitgebreide analyse vereist met meerdere methoden en vereist expertise in zowel de Spectrometrie van de massa en de chemie. Normaliseren van de gebieden van de piek van chemische eigenschappen kan evenwel semi-kwantitatieve ramingen van concentraties van onbekenden van gekende soorten21. Als consistente bemonstering en bereiding stappen werkzaam zijn, kan tijd trend informatie voor afzonderlijke soorten worden gegenereerd voor het controleren van de persistentie van een chemische stof in de toekomst als het antwoord voor een afzonderlijke soorten in overeenstemming zijn behoudens groot moeten variaties in de matrix21.
Het belangrijkste voordeel van deze methode is de uitbreidbaarheid van de behandeling van het monster om zowel nontargeted als gerichte analyse. Terwijl gerichte analyse gelijkwaardig of superieure kwantitatieve informatie biedt, mist het sterk breedte van analyse gewenst bij de behandeling van nieuwe en opkomende materialen, alsook hun relatie op de materialen van de matrix. Toepassing van een gerichte methodologie, of zelfs een verdachte screening methode alleen gebaseerd op bekende materialen en beperkte databases is volledig blind aan eerder onopgemerkt soort, zelfs als ze wellicht belangrijke gezondheidseffecten. Als software verbetert en databases krachtiger worden, zal de nauwkeurigheid van onbekende identificatie blijven toenemen, met een daarmee gepaard gaande daling van de tijdsinvestering en de mate van deskundigheid die nodig is voor het analyseren van de multidimensionale gegevens die zijn gegenereerd door dit aanpak. Gegevens die momenteel zijn gegenereerd is echter aanzienlijke toekomstige waarde omdat gegevens banking voor een post-hoc analyse met nieuw ontwikkelde software zorgt en vergelijking over de tijd, kunt zelfs als de identiteit van een gedetecteerde compound momenteel niet bekend is.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De US Environmental Protection Agency, via haar Bureau voor onderzoek en ontwikkeling, gefinancierd en beheerd het hier beschreven onderzoek. Dit document is beoordeeld door het US Environmental Protection Agency, Office of Research en ontwikkeling, en goedgekeurd voor publicatie. De standpunten in dit artikel zijn die van de auteurs en geven niet noodzakelijkerwijs de standpunten of het beleid van de US Environmental Protection Agency. Dit onderzoek werd gedeeltelijk ondersteund door een afspraak op het postdoctoraal onderzoeksprogramma de nationale blootstelling Research Laboratory beheerd door het Oak Ridge Instituut voor wetenschap en opvoeding door Interagency DW89992431601 van de overeenkomst tussen de Amerikaanse ministerie van energie en de US Environmental Protection Agency.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acqity ultra-high performance liquid chromatography system | Waters Corporation | Modified with PFCs analysis kit (176001744); equivalent UPLC system is acceptible if PFAS background is checked and confirmed to be low | |
| Ammonium acetate | Fluka | 17836 | Mass spectrometry grade >99% pure |
| Ammonium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 | |
| Balance | Mettler | AB204S | |
| BEH C18 reverse phase UPLC column, 2.1×50 mm, 1.7 μm | Waters Corporation | 186002350 | |
| Dual piston syringe pump | Waters Corporation | SPC10-C | |
| Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | ARK2183 | |
| Glass Microfiber Filters | Whatman | 1820-070 | |
| High density polyethelye sample bottle | Nalgene | 2189-0032 | |
| High Resolution Mass Spectrometer | Various | Mass Spectrometer should be capable of providing accurate mass to <10ppm and collecting MS/MS data. Agilent 6530 qTOF and Thermo Fisher Orbitrap Fusion were used in this work | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | ||
| Nitric Acid (35% w/w) | Thermo Fisher Scientific | SVCN-5-1 | Can be prepared in house using concentrated nitric acid and reagent water |
| Polypropylene Buchner funnel | ACE Glass | 12557-09 | |
| Polypropylene cenitrfuge tube and cap | BD Falcon | 352096 | |
| Polypropylene Vacuum Flask (1 L) | Nalgene | DS4101-1000 | |
| Quattro Premier XE triple quadrupole mass spectrometer | Waters Corporation | Equivalent triple-quadrupole or better system can be used instead, should provide high sensitivity and stability for targeted analysis | |
| Reagent Water | Any source determined to be PFAS free | ||
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | W302406 | |
| TurboVap nitrogen evaporator | Caliper Life Sciences | 103198 | Equivalent systems or rotary vacuum evaporator may be used instead |
| Weak anion exchange SPE cartridge (Oasis WAX Plus) | Waters Corporation | 186003519 | |
| Standard Solutions | |||
| 2,3,3,3-Tetrafluoro-2-(1,1,2,2,3,3,3-heptafluoropropoxy)propanoic acid (HFPO-DA) | Wellington | HFPO-DA | |
| Additional targeted compound standards of interest | to be determined based on preliminary analysis and standard availability | ||
| Mass labeled HFPO-DA | Wellington | M2HFPO-DA | |
| Native PFCA/PFAS Mixture (2 ug/mL) | Wellington | PFAC-MXA | or PFAC-MXB; or individually prepared mixture containing compounds of interest |
| Stable Isotope Labeled PFCA/PFAS Mixture (2 ug/mL) | Wellington | MPFAC-MXA | or MPFAC-MXB; or individually prepared mixture containing compounds of interest as appropriate for Native PFASs |
| Software | |||
| Mass Profiler Professional | Agilent | Or open source software packages | |
| Profinder | Agilent | Or open source software packages |
References
- Provisional Health Advisories for Perfluorooctanoic Acid (PFOA) and Perfluorooctane Sulfonate (PFOS). United States Environmental Protection Agency. , Washington, DC. (2009).
- Lifetime Health Advisories and Health Effects Support Documents for Perfluorooctanoic Acid and Perfluorooctane Sulfonate. United States Environmental Protection Agency. , Washington DC. 33250-33251 (2016).
- Fact Sheet: 2010/2015 PFOA Stewardship Program. , Available from: https://www.epa.gov/assessing-and-managing-chemicals-under-tsca/fact-sheet-20102015-pfoa-stewardship-program (2006).
- EPA and 3M Announce phase out of PFOS. Environmental Protection Agency. , Available from: https://yosemite.epa.gov/opa/admpress.nsf/0/33aa946e6cb11f35852568e1005246b4 (2000).
- Wang, Z., Cousins, I. T., Scheringer, M., Hungerbühler, K. Fluorinated alternatives to long-chain perfluoroalkyl carboxylic acids (PFCAs), perfluoroalkane sulfonic acids (PFSAs) and their potential precursors. Environment International. 60, 242 (2013).
- Scheringer, M., et al. Helsingør Statement on poly- and perfluorinated alkyl substances (PFASs). Chemosphere. 114, 337-339 (2014).
- Wang, Z., DeWitt, J. C., Higgins, C. P., Cousins, I. T. A Never-Ending Story of Per- and Polyfluoroalkyl Substances (PFASs). Environmental Science & Technology. 51 (5), 2508-2518 (2017).
- Xiao, F., Golovko, S. A., Golovko, M. Y. Identification of novel non-ionic, cationic, zwitterionic, and anionic polyfluoroalkyl substances using UPLC-TOF-MSE high-resolution parent ion search. Analytica Chimica Acta. 988, 41-49 (2017).
- Shoemaker, J., Grimmett, P., Boutin, B. Method 537. Determination of selected perfluorinated alkyl acids in drinking water by solid phase extraction and liquid chromatography/tandem mass spectrometry (LC/MS/MS). US Environmental Protection Agency. , Washington, DC. (2009).
- Poole, C. F., Gunatilleka, A. D., Sethuraman, R. Contributions of theory to method development in solid-phase extraction. Journal of Chromatography A. 885 (1), 17-39 (2000).
- Ahrens, L. Polyfluoroalkyl compounds in the aquatic environment: a review of their occurrence and fate. Journal of Environmental Monitoring. 13 (1), 20-31 (2011).
- Higgins, C. P., Field, J. A., Criddle, C. S., Luthy, R. G. Quantitative Determination of Perfluorochemicals in Sediments and Domestic Sludge. Environmental Science & Technology. 39 (11), 3946-3956 (2005).
- Szostek, B., Prickett, K. B., Buck, R. C. Determination of fluorotelomer alcohols by liquid chromatography/tandem mass spectrometry in water. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 20 (19), 2837-2844 (2006).
- Alzaga, R., Bayona, J. M. Determination of perfluorocarboxylic acids in aqueous matrices by ion-pair solid-phase microextraction-in-port derivatization-gas chromatography-negative ion chemical ionization mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1042 (1-2), 155-162 (2004).
- Schaider, L. A., et al. Fluorinated Compounds in U.S. Fast Food Packaging. Environmental Science & Technology Letters. 4 (3), 105-111 (2017).
- Lindstrom, A. B., Strynar, M. J., Libelo, E. L. Polyfluorinated Compounds: Past, Present, and Future. Environmental Science & Technology. 45 (19), 7954 (2011).
- Liu, Y., Pereira, A. D. S., Martin, J. W. Discovery of C5-C17 Poly-and Perfluoroalkyl Substances in Water by In-Line SPE-HPLC-Orbitrap with In-Source Fragmentation Flagging. Analytical Chemistry. 87 (8), 4260 (2015).
- Backe, W. J., Day, T. C., Field, J. A. Zwitterionic, Cationic, and Anionic Fluorinated Chemicals in Aqueous Film Forming Foam Formulations and Groundwater from U.S. Military Bases by Nonaqueous Large-Volume Injection HPLC-MS/MS. Environmental Science & Technology. 47 (10), 5226-5234 (2013).
- Mazzoni, M., Rusconi, M., Valsecchi, S., Martins, C. P. B., Polesello, S. An on-line solid phase extraction-liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the determination of perfluoroalkyl acids in drinking and surface waters. Journal of Analytical Methods in Chemistry. 2015, 942016 (2015).
- Li, F., et al. Method development for analysis of short- and long-chain perfluorinated acids in solid matrices. International Journal of Environmental Analytical Chemistry. 91 (12), 1117-1134 (2011).
- McCord, J., Newton, S., Strynar, M. Validation of quantitative measurements and semi-quantitative estimates of emerging perfluoroethercarboxylic acids (PFECAs) and hexfluoroprolyene oxide acids (HFPOAs). J Chromatoqr A. , (2018).
- Wang, Y., Liu, S., Hu, Y., Li, P., Wan, J. -B. Current state of the art of mass spectrometry-based metabolomics studies - a review focusing on wide coverage, high throughput and easy identification. RSC Advances. 5 (96), 78728-78737 (2015).
- Cajka, T., Fiehn, O. Toward Merging Untargeted and Targeted Methods in Mass Spectrometry-Based Metabolomics and Lipidomics. Analytical Chemistry. 88 (1), 524-545 (2016).
- Mann, M., Kelleher, N. L. Precision proteomics: The case for high resolution and high mass accuracy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (47), 18132-18138 (2008).
- Sobus, J. R., et al. Integrating tools for non-targeted analysis research and chemical safety evaluations at the US EPA. Journal of Exposure Science & Environmental Epidemiology. , (2017).
- Bletsou, A. A., Jeon, J., Hollender, J., Archontaki, E., Thomaidis, N. S. Targeted and non-targeted liquid chromatography-mass spectrometric workflows for identification of transformation products of emerging pollutants in the aquatic environment. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 66, 32-44 (2015).
- Viant, M. R., Sommer, U. Mass spectrometry based environmental metabolomics: a primer and review. Metabolomics. 9 (1), 144-158 (2013).
- Xiao, F. Emerging poly- and perfluoroalkyl substances in the aquatic environment: A review of current literature. Water Research. 124, 482-495 (2017).
- Nakayama, S. F., Strynar, M. J., Reiner, J. L., Delinsky, A. D., Lindstrom, A. B. Determination of perfluorinated compounds in the Upper Mississippi River Basin. Environmental Science & Technology. 44 (11), 4103 (2010).
- Strynar, M., et al. Identification of novel perfluoroalkyl ether carboxylic acids (PFECAs) and sulfonic acids (PFESAs) in natural waters using accurate mass time-of-flight mass spectrometry (TOFMS). Environmental Science & Technology. 49 (19), 11622 (2015).
- Newton, S., et al. Novel Polyfluorinated Compounds Identified Using High Resolution Mass Spectrometry Downstream of Manufacturing Facilities near Decatur, Alabama. Environmental Science & Technology. 51 (3), 1544-1552 (2017).
- Forsberg, E. M., et al. Data processing, multi-omic pathway mapping, and metabolite activity analysis using XCMS Online. Nature Protocols. 13, 633 (2018).
- Sturm, M., et al. OpenMS - An open-source software framework for mass spectrometry. BMC Bioinformatics. 9 (1), 163 (2008).
- Kind, T., Fiehn, O. Seven Golden Rules for heuristic filtering of molecular formulas obtained by accurate mass spectrometry. BMC Bioinformatics. 8, 105-105 (2007).
- Loos, M., Singer, H. Nontargeted homologue series extraction from hyphenated high resolution mass spectrometry data. Journal of Cheminformatics. 9, 12 (2017).
- Dimzon, I. K., et al. High Resolution Mass Spectrometry of Polyfluorinated Polyether-Based Formulation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27, 309 (2016).
- McEachran, A. D., Sobus, J. R., Williams, A. J. Identifying known unknowns using the US EPA's CompTox Chemistry Dashboard. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (7), 1729-1735 (2017).
- French, W. R., et al. Wavelet-Based Peak Detection and a New Charge Inference Procedure for MS/MS Implemented in ProteoWizard's msConvert. Journal of Proteome Research. 14 (2), 1299-1307 (2015).
- Tautenhahn, R., Böttcher, C., Neumann, S. Highly sensitive feature detection for high resolution LC/MS. BMC Bioinformatics. 9, 504 (2008).
- Rafiei, A., Sleno, L. Comparison of peak-picking workflows for untargeted liquid chromatography/high-resolution mass spectrometry metabolomics data analysis. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (1), 119-127 (2015).
- Kind, T., Fiehn, O. Metabolomic database annotations via query of elemental compositions: Mass accuracy is insufficient even at less than 1 ppm. BMC Bioinformatics. 7, 234-234 (2006).
- Brack, W., Dulio, V., Slobodnik, J. The NORMAN Network and its activities on emerging environmental substances with a focus on effect-directed analysis of complex environmental contamination. Environmental Sciences Europe. 24 (1), 29 (2012).
- Blaženović, I., et al. Comprehensive comparison of in silico MS/MS fragmentation tools of the CASMI contest: database boosting is needed to achieve 93% accuracy. Journal of Cheminformatics. 9, 32 (2017).
- Rager, J. E., et al. Linking high resolution mass spectrometry data with exposure and toxicity forecasts to advance high-throughput environmental monitoring. Environment International. 88, Supplement C 269-280 (2016).
- Munoz, G., et al. Environmental Occurrence of Perfluoroalkyl Acids and Novel Fluorotelomer Surfactants in the Freshwater Fish Catostomus commersonii and Sediments Following Firefighting Foam Deployment at the Lac-Mégantic Railway Accident. Environmental Science & Technology. 51 (3), 1231-1240 (2017).
- Brumovský, M., Bečanová, J., Karásková, P., Nizzetto, L. Retention performance of three widely used SPE sorbents for the extraction of perfluoroalkyl substances from seawater. Chemosphere. 193, 259-269 (2018).
- Definition, Definition and Procedure for the Determination of the Method Detection Limit (Revision 2). Environmental Protection Agency. , Federal Regester (2016).
