Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Udvinding af ekstracellulære vesikler fra hele væv

Published: February 7, 2019 doi: 10.3791/59143
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biomedical Sciences, Florida State University College of Medicine

Summary

Her give vi en detaljeret protokol for at isolere lille ekstracellulære vesikler (EVs) fra hele væv, herunder hjerne og tumor prøver. Denne metode giver en reproducerbar teknik for at udtrække evt fra solid væv for videre downstream analyse.

Abstract

Cirkulerende og interstitiel lille membran-bundet ekstracellulære vesikler (evt) udgør lovende mål for udviklingen af nye diagnostiske eller prognostiske biomarkør assays, og sandsynligvis fungere som vigtige aktører i udviklingen af et stort spektrum af sygdomme. Aktuelle forskning er fokuseret på karakterisering af vesikler udskilles fra flere celle og vævstyper for bedre at kunne forstå evt rolle i patogenesen af betingelser herunder neurodegeneration, betændelse og cancer. Globalt konsekvent og reproducerbar teknikker til at isolere og rense vesikler er dog stadig i gang. Derudover beskrives metoder til udvinding af evt fra solid væv ex vivo næppe. Her give vi en detaljeret protokol til at udtrække lille evt interesse fra hele frisk eller frossen væv, herunder hjerne og tumor prøver, for yderligere karakterisering. Vi demonstrere tilpasningsevne af denne metode for flere downstream analyser, herunder Elektron Mikroskopi og immunophenotypic karakterisering af vesikler og kvantitativ massespektrometri af proteiner, EV.

Introduction

Lille ekstracellulære vesikler (EVs) omfatter endosomal-afledte exosomes og lille membran-stald microvesicles, der er af bred biomedicinsk interesse. Lille evt består af en heterogen population af 50-250 nm membran-bundet vesikler indeholdende biologisk aktive proteiner, lipider og nukleinsyrer, der kollektivt menes at spille en vigtig rolle i et væld af sygdomsprocesser. Fremme forskning har særligt impliceret disse vesikler i neurodegenerative og prion sygdomme, smitsomme processer, autoimmune eller inflammatoriske betingelser, og tumorvækst og metastase1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. hastigt voksende biomedicinsk forskning i betydningen af evt i sygdom patogenese har genereret parallelle interesse i at udvikle reproducerbare og strenge metoder til isolering og oprensning af disse vesikler.

En historiske og aktuelle udfordring i EV karakterisering har været den manglende evne til fuldt adskille små EV delpopulationer. Denne udfordring er hovedsagelig på grund af vores begrænsede forståelse af de forskellige molekylære mekanismer for Biogenese af særskilte vesikler. Overlappende størrelse, tæthed og biologiske gods mellem delpopulationer yderligere convolutes disse sondringer. En del af denne udfordring har også været brugen af almindeligt afvigende berigelse teknikker, giver inkonsistens i downstream analyse af isolerede vesikler på tværs af laboratorier og undergrave den globale indsats for at belyse kategorisk EV populationer.

Det er værd at bemærke, at størstedelen af EV karakterisering er blevet udført fra in vitro-samling af cellekultur supernatanten, med nyere in vivo-undersøgelser beskriver teknikker til at isolere vesikler fra dyr eller humane legemsvæsker, herunder plasma, urin , og spyt. Mens evt er til stede i store mængder i omløb, anerkendes det også at disse vesikler spiller en vigtig rolle i celle-til-celle kommunikation begivenheder og er til stede i interstitium af cellulære væv. I forbindelse med kræft, kan interstitiel evt være særlig vigtig i modulerende tumor mikromiljø for kræftcelle såning og metastatisk vækst14,15. Derfor er der værdi i udvikling og optimering af teknikker til at udvinde vesikler fra solid væv prøver. Disse metoder vil være et middel til direkte studerer orgel - eller tumor - afledt evt høstet fra klinisk prøvemateriale, herunder små biopsier og delvis eller fuldstændig orgel resektion.

I denne undersøgelse, og i en tidligere rapport udgivet af vores laboratorium16, vi sigter mod at løse flere store aktuelle bekymringer i EV berigelse metode: 1) til at beskrive en reproducerbar teknik for at isolere og rense evt til de højeste standarder i øjeblikket accepteret i feltet. 2) at forsøge at isolere lille EV delpopulationer stærkt beriget i endosomal-afledte exosomes; og 3) til at give en protokol til udvinding af disse vesikler fra solid væv prøver med henblik på yderligere karakterisering.

Kowal og kolleger beskrev for nylig, en forholdsvis små iodixanol tæthed farveforløb for at adskille og rense EV delpopulationer med større effekt end sammenlignelige saccharose tæthed gradienter17. I den citerede undersøgelse, var dendritiske celle-afledte evt fanget i en relativt let tæthed brøkdel, i overensstemmelse med en massefylde på 1,1 g/mL, stærkt beriget i endosomal proteiner menes at være mest konsistente med en høj andel af exosomes i dette brøk. Ifølge forfatterne omfattede disse "bona fide" exosomal proteiner tumor modtagelighed gen 101 (TSG101), syntenin-1, CD81, ADAM10, EHD4 og flere annexin proteiner17. Vi er senere tilpasset denne teknik for at lykkes en metode af væv dissociation beskrevet af Perez-Gonzalez mfl18 og en efterfølgende differential centrifugering protokol at isolere hele hjernen-afledte evt-16. Vi viste også nytte af denne metode i kendetegner EV proteomes ved at kombinere en sekventiel protokol for downstream kvantitative og sammenlignende massespektrometri af vesikulære protein, tidligere beskrevet af vores laboratorium19. Dette arbejde sideløbende at fra Hill laboratorium, hvor evt blev beriget fra den frontale cortex af hjerner20.

I denne undersøgelse, vi uddybe denne teknik og udvide anvendelsen af protokollen for nylig offentliggjort fra vores laboratorium til dyrkning af evt fra solid lunge tumorer. Til vores viden er dette den første undersøgelse til at beskrive en protokol for at berige evt fra ex vivo tumor prøver. Givet den udbredte interesse i evt som roman diagnostiske biomarkører og deres rolle i tumordannelse, denne metode vil sandsynligvis vise sig værdifulde til et stigende antal forskere. Fra et klinisk perspektiv, kunne interstitiel evt havnen stor diagnostisk værdi, især i enheder hvor histologisk vurdering er begrænset. Vores håb er, at metoden beskrevet her vil give et fundament for en reproducerbar teknik til høst evt fra frisk eller frossen dyrs eller menneskers kirurgiske enheder, baner vejen for fremtidige arbejde til at afdække de betydelige roller i sygdom patogenese disse små blærer kan spille.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Hele hjerner blev indhentet med samtykke fra institutionelle dyr brug og pleje udvalg (IACUC) af Florida State University. Tolv mus hjerner i alt (3 hjerner fra hver aldersgruppe: 2, 4, 6 og 8 måneder) fra en C57BL/6 J baggrund blev brugt til EV udvinding, som tidligere beskrevet16. Lunge tumor prøver var generøst doneret af Dr. Mandip Sachdeva under godkendelse af Florida landbrugs og mekaniske Universitet IACUC. Lunge tumorer blev afledt fra menneskelige adenocarcinom cellelinie H1975 dyrkes i immundefekte Balb/c nu/nu nøgen mus. Data fra to repræsentative tumor replikater fremhæves i denne undersøgelse.

Bemærk: En skematisk oversigt over vesikel isolation og rensning metode er fastsat i figur 1.

1. Vævscentre Dissociation og differentieret centrifugering

  1. Forberede 10 mL af dissociation buffer (10 mg af papain 5,5 mM L-Cystein 67 µM 2-mercaptoethanol; 1,1 mM EDTA) i dvale-E medium pr. cirka 0,4-1,0 g væv. Bemærk at alle løsninger anvendes til EV berigelse og rensning skal fortyndes i ultrarent filtreret vand.
  2. Tilføje helt frisk eller frossen væv til dissociation buffer i en 50 mL konisk slange, og Inkuber i et varmt vand bad ved 37 ° C i 20 min. væv kan skæres i mindre fragmenter før inkubation, hvis nødvendigt.
  3. Efter inkubation, tilføje protease og fosfatase hæmmere for en endelige 1 x koncentration til dissociation bufferen indeholder væv.
  4. Hæld den løsning, der indeholder væv i en loose-fit Dounce homogeniseringsapparat, og forsigtigt adskille væv ved hjælp af cirka 30 langsom slag pr. prøve. Antallet af slagtilfælde kan justeres baseret på væv konsistens.
  5. Overførsel dissocieres væv i buffer til en 50 mL konisk rør og centrifugeres 500 x g i 5 min. ved 4 ° C at sammenpresse cellerne og resterende fiber eller sammenhængende væv fragmenter.
  6. Overføre supernatanten til en ren 50 mL konisk rør og centrifugeres ved 2.000 x g i 10 min. ved 4 ° C til pellet og kassere store celleaffald.
  7. Overføre supernatanten igen til en ren 50 mL konisk rør og centrifuger på 10.000 x g i 40 min ved 4 ° C til pellet uønskede større blærer eller små apoptotiske organer.
    Bemærk: Denne pellet kan gemmes til yderligere undersøgelse af større vesikler, hvis det ønskes.
  8. Dekanteres overføres gennem et 0,45 µm filter i en ren 12 mL ultracentrifugering tube.
    Bemærk: Tæt fibrotisk vævsprøver kan ikke være let filtreret. Disse prøver kan være filtreret gennem en 40 µm celle si, så passerede gennem seriefremstillede mindre nåle (18 G, 20 G, 22 G) inden filtrering gennem et 0,45 µm filter.
  9. Ultracentrifuge prøven på 100.000 x g i 2 timer ved 4 ° C og pellet lille evt.
  10. Den dekanteres og forlade ultracentrifugering rør inverteret for 5-10 min, trykke ofte for at fjerne resterende væske på siderne af rørene. Resterende væske kan også være indsugning ved hjælp af en aspirating vakuum pipette.
  11. Genopslæmmes EV pellet i 1,5 mL 0,25 M saccharose buffer (10 mM Tris, pH 7,4). Det er vigtigt at sikre fuld resuspension af toerstoffet i dette trin. For at gøre det, omfatte rør med parafilm før vortexing evt i løsning. Rock ultracentrifuge rør til 15-20 min. ved stuetemperatur før en endelig vortex mix.
  12. Kort centrifugeres rør ved en hastighed ikke mere end 1.000 x g hen til genoprette den flydende suspension i bunden af røret.
  13. Fortsæt til gradient rensning trinene nedenfor, eller du kan eventuelt gemme EV suspension ved 4 ° C natten over.

2. massefylde Gradient rensning

  1. Tilsættes 1,5 mL 60% iodixanol (stamopløsning i vand) til 1,5 mL saccharose/Tris bufferen indeholder evt for at oprette en endelig løsning, der indeholder 30% iodixanol. Pipetteres op og ned flere gange for at blande løsning grundigt. Være forsigtige for at undgå at miste løsning i pipette tip, som den høje iodixanol koncentration er meget tyktflydende.
  2. Overføre 30% iodixanol bufferopløsning indeholdende evt til bunden af en 5,5 mL ultracentrifugering tube.
  3. Forbered mindst 1,5 mL 20% og 10% iodixanol løsninger per prøve i ultrarent vand fra 60% iodixanol stamopløsning.
  4. Foranstaltning 1.3 mL 20% iodixanol og omhyggeligt lag på den nederste gradient lag ved hjælp af en sprøjte og en 18 G kanyle. For at undgå at blande lagene på grænsefladen tæthed, holde facet af nålen i kontakt med indersiden af ultracentrifugering røret lige over menisken og tilføje løsningen dråbevis.
  5. Lag 1,2 mL 10% iodixanol løsning på toppen af de 20% iodixanol lag ved hjælp af samme teknik som ovenfor.
  6. Nøje afveje og indlæse ultracentrifugering rør i rotoren spande og centrifugeres i en gynge-spand rotor på 268,000 x g i 50 min. ved 4 ° C. Angiv acceleration og deceleration øger i centrifugen til minimumssatserne lov til at undgå afbrydelser i tæthed lag.
  7. Mærk ti 1,5 mL microcentrifuge rør til hver prøve skal svare til brøker 1 til 10 af tæthed farveforløb. Fraktion 1 er udpeget som den øverste fraktion, der vil være først fjernet, mens brøkdel 10 er bunden brøkdel sidst fjernet.
  8. Når den gradient ultracentrifugering har afsluttet, forsigtigt fjerne rør fra rotoren spande og placere i en stabil indehaveren. En synlig band af vesikler ses ofte i brøkdel af interesse. Der afpipetteres ti serie brøkdele af 490 µL fra toppen af farveforløbet i de tilsvarende rør. Der vil være en lille mængde væske tilbage i bunden af røret, der sandsynligvis indeholder forurenende proteiner. Denne prøve kan kasseres eller bevaret som brøk 11, hvis det ønskes.
  9. Måle brydningsindeks indeksene af fraktioner ved hjælp af et refraktometer. Dette kan også udføres med en kontrol gradient køre parallelt, hvis prøven bevaring er nødvendig. Med pipette overfoeres 20-30 µL af hver fraktion indeholdende iodixanol overfladen, refraktometret, og beregne massefylden ved at sammenligne de refraktive indeks til kendte iodixanol tætheder. Bemærk, at fraktioner kan oplagres natten over i den iodixanol-holdige løsning hvis det er nødvendigt, før du fortsætter til næste ultracentrifugering vaske trin.
  10. Overføre hver fraktion til en ren 12 mL ultracentrifugering tube. Tilsættes 5 mL af 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4) til tube og mix af pipettering langsomt op og ned.
    Bemærk: PBS føjet til prøverne bør partikel-fri, sikret ved filtrering steril PBS gennem et 0,22 µm filter og opbevaring ved stuetemperatur til at undgå salt nedbør.
  11. Tilføje en yderligere 6 mL 1 x PBS til toppen og igen blandes omhyggeligt.
  12. Ultracentrifuge rør på 100.000 x g i 2 timer ved 4 ° C til re pellet små blærer. Den dekanteres og tryk rør tørre før lysering af vesikler til proteinanalyse (trin 3) eller resuspension af elbiler til morfologiske analyse (trin 5).

3. lysis og immunblot bekræftelse af EV proteiner

Bemærk: Hvis bevarelse af hele vesikler til morfologiske karakteristika eller biologiske aktivitet ønskes, kan forskere fortsætte direkte til trin 5. I indledende forsøg, eller før massespektrometri analyse, bør alle fraktioner inddrives analyseres af immunblot at bekræfte fraktioner med EV proteiner.

  1. For at lyse evt til proteinanalyse, tilføje 40 µL af stærk lysisbuffer (5% SDS, 10 mM EDTA, 120 mM Tris-HCl pH 6,8, 2,5% 2-mercaptoethanol, 8 M urinstof) med tilføjelse af protease hæmmer EV pellet i ultracentrifuge tube.
    Bemærk: Eventuelt ikke-reducerende forhold til påvisning af antistof af proteiner, erstatte ultrarent vand til 2-mercaptoethanol i den stærke lysisbuffer.
  2. Sikre fuldstændig re-suspension af pellet og lysis af elbiler i buffer ved at placere parafilm over ultracentrifugering tube, vortexing kraftigt, derefter vuggende i 20 min. ved stuetemperatur før en endelig vortex.
  3. Kort centrifugeres ved 1.000 x g for 30-60 s at inddrive hele prøven volumen. Overføre prøven til en ny 1,5 mL microcentrifuge rør og opbevares ved-20 ° C til-80 ° C indtil videre forarbejdning.
  4. For at forberede immunblot analyse renset lysates, tilføje 5 x Laemmli prøvebuffer (10% SDS, 250 mM Tris pH 6,8, 1 mg/mL bromophenol blå, 0,5 M DTT, 50% glycerol, 5% 2-mercaptoethanol) til prøverne til en endelig koncentration på 1 x.
    Bemærk: Hvis ikke-reducerende forhold er ønsket, skal du erstatte DTT og 2-mercaptoethanol med ultrarent vand.
  5. Hvis hele væv homogenatet kontrolelementer er ønsket, lyse væv i den urea-holdige stærk lysisbuffer beskrevet ovenfor med protease inhibitor, derefter centrifugeres ved 10.000 x g i 10 min. til at skille sig af med den resterende ekstracellulære matrix, hele celler eller intakt celleaffald. Tilføj 5 x Laemmli prøvebuffer til væv homogenatet til en endelig koncentration på 1 x.
  6. Kog prøvebuffer indeholdende EV eller væv homogenatet prøver på 95 ° C i 5-10 min og derefter indlæse lige saa stort volumen (fra svarende til 0,1-0,3 g starter væv materiale; 1-2 µg renset EV protein) af brøker 1-10 i en 10% SDS-PAGE gel. Indlæse lig massen af væv homogenatet. Større volumen af prøver, der måtte være nødvendige for afsløring af mindre følsomme antistoffer.
  7. Fortsætte med gelelektroforese og Western blot analyse som tidligere detaljerede21 at bekræfte EV proteiner i den renset lysates og sammenligne relative EV overflod i fraktioner.
    Bemærk: Når EV protein har påvist reproducerbar i ensartede fraktioner, kan den endelige ultracentrifugering vask beskrevet i trin 2.12 begrænses til gradient fraktioner af interesse.

4. EV Protein kvantificering

  1. Brug et vaske - og urinstof-kompatible fluorescens-baseret analyse, hvis følsomme kvantificering af EV proteiner ønskes til yderligere analyse (Se Tabel af materialer). Bemærk, at nogle fluorescens-baserede assays er forenelige med bromophenol blå i Laemmli prøvebuffer, lette direkte lysering af EV pellet (i trin 2.12) i denne buffer, hvis det foretrækkes.
  2. Hvis ovennævnte fluorescens-baseret protein kvantificering kit bruges, spot 1 µL af prøven eller standard i mindst duplikere på den medfølgende filtrerpapir, og fortsætte protein kvantificering ifølge producentens anvisninger.

5. karakterisering af EV morfologi

  1. For at undersøge hele vesikler, efter den sidste centrifugering vaske i trin 2.12, re grundigt suspendere EV pellet i partikel-fri 1 x PBS. Gemme evt ved 4 ° C i længere end en uge før behandling for at undgå at fryse-tø cykler.
    Bemærk: Det er gavnligt at har tidligere bekræftet fraktioner konsekvent indeholdende beriget EV protein af immunblot analyse at begrænse morfologiske analyser til brøkdele af interesse.
  2. Udføre nanopartikel tracking analyse på hele EV prøver at bestemme koncentrationen og størrelse af vesikler i præparater, som tidligere detaljerede22.
  3. Karakterisere EV morfologi og bekræfte størrelse målinger ved elektronmikroskopi af vesikler, hvis det ønskes. EM gitre kan tilberedes fra vesikel suspensioner efter trin 5.123, eller alternativt kan behandles som blok præparater24 fra pellets efter trin 2.12.

6. i-gel rensning og Trypsin fordøjelsen for massespektrometri analyse

  1. Hvis karakterisering af EV proteomes ved massespektrometri ønskes, indlæse lig massen (mindst 10 µg protein) af fraktioner der indeholder evt i en færdigstøbte polyacrylamid gel til at adskille og rense proteiner. Fabrikanten leverede færdigstøbte gel er foretrukket at reducere niveauet af potentiale forurener proteiner (f.eks. keratin) indføres i prøverne.
  2. Kør prøve mindst 0,5 tommer i Polyacrylamiden for protein oprensning, derefter fix og pletten med Coomassie farvning, som tidligere beskrevet i detaljer25.
  3. Skåret i baner i 1 mm3 terninger for trypsin fordøjelsen, som tidligere detaljerede19,26.
  4. Indlæse 5 µL af fordøjet peptid prøve i LC-MS/MS instrument for adskillelse på den analytiske kolonne og efterfølgende analyse af massespektrometri overensstemmelse med parametrene angivet i detaljer16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En skematisk oversigt over væv dissociation, differential centrifugering og gradient rensning af vesikler vises i figur 1. Den morfologiske og immunophenotypic bekræftelse af gradient-renset evt er fremhævet i figur 2. Et diagram over reproducerbare tætheder efter ultracentrifugering af 10-30% iodixanol gradient er vist, med to særskilte vesikel befolkningen migrerer opad til fraktion 2 (light EVs) og brøkdel 5 (tætte EVs), afhængig af vævstype. Repræsentant immunoblots af gradient fraktioner udstille effektiv adskillelse og rensning af lille tumor-afledte evt i brøkdel 5. Af note, lunge tumor prøver syntes beriget i tætte evt i forhold til lys evt (i fraktion 2) tidligere høstet fra hele hjernevæv, igen fremhævet her. Som en global væv analyse af evt-opstår, vil det være interessant at bestemme de forskellige tætheder af evt produceret af unikke væv. Repræsentant nanopartikel tracking analyser og elektronmikroskopi af væv-afledte vesikler i de fremherskende vesikel-holdige brøkdel demonstrere berigelse og bevarelse af hele vesikler i overensstemmelse med den kendte størrelse og struktur lille evt. Endelig, figur 3 understreger nytten af denne metode til at lette downstream massespektrometri karakterisering af gradient-renset vesikel proteiner, demonstrerer påvisning af mange proteiner tidligere identificerede i små evt. Mange af disse identificerede proteiner er i overensstemmelse med dem, beriget med lille endosomal-afledte evt tidligere foreslået af Théry og Hill labs17,20.

Figure 1
Figur 1 : Skematisk oversigt over vesikel isolering og oprensning fra hele væv. Følgende væv dissociation, før clearing differential centrifugering trin, filtrering og ultracentrifugering, rå EV pellets kan være genopslemmes på bunden af en iodixanol tæthed farveforløb for flydemidler adskillelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Repræsentant morfologiske og immunophenotypic analyse af væv-afledte evt. (A) beregnet tætheder af iodixanol gradient følgende ultracentrifugering, gennemsnit over uafhængige eksperimenter, fremhæve fraktioner der indeholder lys og tætte evt. (B) repræsentant immunoblots af væv-afledte vesikler demonstrere dyrkning af overvejende tætte tumor evt og lys hjernen evt. Vesikel isolater er forarmet af ikke-EV protein calnexin. Hansen, væv homogenatet. (C) nanopartikel tracking analyse (NTA) repræsentant gradient-renset væv evt. Den mindste detekterede partikel i denne prøve var 78 nm, og ca. 92% af vesikler opdaget var 250 nm eller mindre, i overensstemmelse med en høj berigelse af små evt. (D) repræsentative elektronmikroskopi billeder af hjernen væv-afledte evt. Skalere barer = 200 nm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Oversigt over fremhævet vesikel proteiner opdaget af massespektrometri af en repræsentant væv-afledte EV prøven. Efter EV udvinding og gradient rensning, 10 µg EV protein i beriget fraktion blev indlæst i en polyacrylamid gel elektroforese og i-gel trypsin fordøjelsen. I dette væv-afledte EV repræsentativ, alt 918 proteiner blev identificeret af LC-MS/MS analyse. Peptider blev identificeret, analyseret og fundet at være beriget med exosomal, lysosomale, og plasma Membranproteiner som tidligere beskrevet16. Her, viser vi tilstedeværelse af små EV eller exosomal proteiner i vores forberedelser, der er blevet beskrevet af Théry og Hill labs17,20. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Meget videnskabelig interesse er blevet genereret med hensyn til de roller, små evt spille i tumor mikromiljø og i orgel udvikling, modning og funktion. Samlet set giver denne undersøgelse en optimeret arbejdsgang for udvinding af intakt evt fra hele hjernen eller tumor prøver. Mens her vi blot demonstrere anvendeligheden af denne teknik til lunge tumor-afledte evt, kunne denne metode nemt være tilpasset til arbejde på andre solid væv, giver muligheder for yderligere ex vivo karakterisering af små udskilles blærer, der er af bred biomedicinsk interesse. Uden for rammerne af denne undersøgelse, vil fremtidige sammenligning af EV indhold som oprindelse væv udtryk også være vigtigt at etablere nytte af isolerede vesikler som væv og sygdom biomarkører.

I den tidligere offentliggjort undersøgelse fra vores laboratorium, påvist vi klart fordele ved flydemidler-baserede tæthed farveforløb over sedimentering forløb for rensning af beriget små blærer. I det væsentlige forbedrer en opdrift-baseret adskillelse rensning af blærer ved at undgå forurenende migration gennem fraktioner af interesse. Dette princip vises særlig vigtigt, når du starter fra komplekse prøver som hele væv. Uanset hvad, understrege vi betydningen af de pre analytiske bekræftelse undersøgelser af isolerede vesikler beskrevet, herunder undersøgelse af EV morfologi gennem supplerende teknikker som Elektron Mikroskopi og nanopartikel tracking analyse, samt som biokemiske analyser herunder immunoblotting. EV proteiner i beriget fraktioner skal bekræftes med mindst tre anerkendte EV markører, herunder et tetraspanin protein, som anbefalet af Minimal Information til undersøgelser af evt (MISEV) rapport offentliggjort i Journal af ekstracellulære Vesikler27. En negativ EV markør bør påvises for at være fraværende eller stærkt reduceret i EV fraktioner i forhold til væv homogeniseret. Alle trinene anført ovenfor er afgørende for kvalitetssikring af små vesikel rensning. Desuden kan hurtig demonstration af laboratorie - og bruger-specifik konsekvens i EV-indeholdende befolkningstæthed fraktioner spare værdifuld tid og omkostninger i forbindelse med forarbejdning og analysere alle fraktioner efter tæthed gradient ultracentrifugering trin.

Det er klart, at blærer fra forskellige væv kan flyde til lidt forskellige tæthed fraktioner, eller kan adskille i overvejende lys eller tætte delpopulationer. Disse forskelle har tidligere set i hele hjernen-afledte evt i forhold til evt høstet fra dendritiske celler dyrkes i kultur16,17, og er yderligere demonstreret i denne undersøgelse. Vi viser, at lunge tumor prøver kan havnen overvejende tætte små elbiler i forhold til de lettere evt isoleret fra hjernevæv. Disse forskelle, fremhævet af den metode, der foreslås i denne undersøgelse kan fremme værdifulde undersøgelse af differentiale sammensætningen af evt, herunder tumor evt, der kan pakkes med tætte DNA-strenge28,29,30. På grund af disse forskelle i EV sammensætning understrege vi kraftigt betydningen af disse indledende tekniske eksperimenter. Fremtidig anvendelse af denne teknik på evt isolation fra forskellige tumor enheder vil være vigtigt at afgøre, om tætte evt er overvejende udskilles i interstitium af andre tumortyper.

Mens en komplet rensning af små elbiler og isolation af særskilte vesikel delpopulationer forbliver en strømbegrænsning på tværs af laboratorier, giver denne metode et grundlag for yderligere undersøgelser for at karakterisere små blærer fra en mangfoldighed af væv eller tumor typer, og derfor kan fremme en større forståelse af EV mangfoldighed. Nylige adskillelse af EV partikler af asymmetriske-flow felt-strømmen fraktionering har belyst muligheden for særskilte last og funktioner af små (60-80 nm) versus større (90-120 nm) exosomes, og yderligere identificeret et undersæt af ikke-membran bundet < 50 nm partikler denomineret som "exomeres"31,32. Dog gods emballeret i disse unikke vesikel populationer varierede på tværs af cellelinjer, fremhæver den betydelige uensartethed udskilles vesikler, og støtter vigtigheden af omfattende in vitro eller ex vivo vesikel analyse. I denne undersøgelse berige vi højst sandsynligt for begge klasser af exosomes identificeret. En del af lille microvesicles med lignende tætheder til exosomes kan være til stede i isolater samt. Selv om vi ikke kan udelukke muligheden for exomeres i vores isolater, var membran-bundet vesikler helt sikkert mest rigelige i de gradient fraktioner beriget i vesikel protein. Ud over små evt, store oncosomes (> 1.000 nm) har været de seneste interesse for kræft biologer33. Mens protokollen beskrevet i denne undersøgelse filtrerer vesikler større end 450 nm, udelukkelse af dette skridt kan fremme undersøgelse af disse større evt beskrevet. Kommende gennemgang af tætheder tilknyttet forskellige vesikel delpopulationer vil være vigtigt at skelne mellem disse enheder ud over deres beskrevet størrelser.

Endelig, selv om vi sætter pris på de begrænsninger, herunder omkostninger og tid er forbundet med denne foreslåede teknik, vi også anerkende behovet for strenge grundlagsforskning metoder til at karakterisere væv evt og tjene som et slutprodukt sammenligning for konstant udviklingen og mere avancerede metoder fremover. Disse fremme teknologier vil forhåbentlig belyse mere hurtig og klinisk-kompatible teknikker til at udvinde evt fra medicinsk eller kirurgisk prøver.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne takke Dr. Richard Nowakowski og Florida State University laboratorium dyr ressourcer for at levere og pasning af de dyr, der anvendes til at udvikle denne protokol, respektfuldt. Vi takker Xia Liu, Dr. Rakesh Singh og de Florida State University translationel videnskab laboratorium for bistand med massespektrometri arbejde anvendes til downstream vesikel karakterisering, samt FSU biologisk videnskab Imaging Resource facilitet for brugen af transmissions-elektronmikroskop i denne undersøgelse. Endelig vil takke vi Dr. Mandip Sachdeva (Florida A & M University) for donation af tumor prøver, der anvendes i udviklingen af denne metode. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Florida Department of Health Ed og Ethel Moore Alzheimer's Disease Research Program tildelt til D.G.M. og J.M.O (6AZ11) og National Cancer Institute af National Institutes of Health under Award nummer R01CA204621 tildeles D.G.M.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 µm filter VWR 28145-505
12 mL ultracentrifuge tubes Beckman Coulter 331372
5.5 mL ultracentrifuge tubes Beckman Coulter 344057
anti-Alix antibody Santa Cruz sc-7129
anti-Calnexin antibody Santa Cruz sc-11397
anti-CD63 antibody Abcam ab59479
anti-CD81 antibody Santa Cruz sc-9158
anti-Flotillin 2 antibody Santa Cruz sc-25507
anti-HSC70 antibody Santa Cruz sc-7298
anti-Syntenin-1 antibody Santa Cruz sc-100336
anti-TSG101 antibody Santa Cruz sc-7964
EZQ protein quantification kit ThermoFisher Scientific R33200
FA-45-6-30 rotor  Eppendorf 5820715006
FEI CM120 Electron Microscope TSS Microscopy
goat anti-rabbit IgG (Fab fragment) Genetex 27171
HALT phosphatase inhibitor (100x solution) ThermoFisher Scientific 78420
HALT protease inhibitor (100x solution) ThermoFisher Scientific 78438
Hibernate E medium ThermoFisher Scientific A1247601
MLS-50 swinging-bucket rotor Beckman Coulter 367280
NanoSight LM10 Malvern
Optima MAX-XP Benchtop Ultracentrifuge  Beckman Coulter 393315
Optima XE-100 ultracentrifuge Beckman Coulter A94516
Optiprep Sigma D1556 60% iodixanol in sterile water solution
Q Exactive HF Mass Spectrometer ThermoFisher Scientific
rabbit anti-goat IgG Genetex 26741
rabbit anti-mouse IgG Genetex 26728
Refracto 30PX (refractometer) Mettler Toledo 51324650
S-4-104 rotor Eppendorf 5820759003
SW 41 Ti swinging-bucket Rotor Beckman Coulter 333790
Tabletop 5804R centrifuge Eppendorf 22623508

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bobrie, A., Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Exosome secretion: molecular mechanisms and roles in immune responses. Traffic. 12 (12), 1659-1668 (2011).
  2. Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
  3. Howitt, J., Hill, A. F. Exosomes in the Pathology of Neurodegenerative Diseases. Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26589-26597 (2016).
  4. Sardar Sinha, M., et al. Alzheimer's disease pathology propagation by exosomes containing toxic amyloid-beta oligomers. Acta Neuropathologica. 136 (1), 41-56 (2018).
  5. Meckes, D. G., Raab-Traub, N. Microvesicles and viral infection. Journal of Virology. 85 (24), 12844-12854 (2011).
  6. Meckes, D. G. Exosomal communication goes viral. Journal of Virology. 89 (10), 5200-5203 (2015).
  7. Schorey, J. S., Cheng, Y., Singh, P. P., Smith, V. L. Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions. EMBO Reports. 16 (1), 24-43 (2015).
  8. Zhang, X., et al. Exosomes in cancer: small particle, big player. Journal of Hematology Oncology. 8, 83 (2015).
  9. Janas, A. M., Sapoń, K., Janas, T., Stowell, M. H. Exosomes and other extracellular vesicles in neural cells and neurodegenerative diseases. Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (6), 1139-1151 (2016).
  10. Chahar, H. S., Bao, X., Casola, A. Exosomes and Their Role in the Life Cycle and Pathogenesis of RNA Viruses. Viruses. 7 (6), 3204-3225 (2015).
  11. Pegtel, D. M., Peferoen, L., Amor, S. Extracellular vesicles as modulators of cell-to-cell communication in the healthy and diseased brain. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1652), (2014).
  12. Raposo, G., et al. B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles. Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).
  13. Katsiougiannis, S. Extracellular Vesicles: Evolving Contributors in Autoimmunity. Forum on immunopathological diseases and therapeutics. 6 (3-4), 163-170 (2015).
  14. Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).
  15. Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
  16. Hurwitz, S. N., et al. An optimized method for enrichment of whole brain-derived extracellular vesicles reveals insight into neurodegenerative processes in a mouse model of Alzheimer's disease. Journal of Neuroscience Methods. 307, 210-220 (2018).
  17. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).
  18. Perez-Gonzalez, R., Gauthier, S. A., Kumar, A., Levy, E. The exosome secretory pathway transports amyloid precursor protein carboxyl-terminal fragments from the cell into the brain extracellular space. Journal of Biological Chemistry. 287 (51), 43108-43115 (2012).
  19. Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. An Adaptable Polyethylene Glycol-Based Workflow for Proteomic Analysis of Extracellular Vesicles. Methods in Molecular Biology. 1660, 303-317 (2017).
  20. Vella, L. J., et al. A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885 (2017).
  21. Hurwitz, S. N., et al. CD63 Regulates Epstein-Barr Virus LMP1 Exosomal Packaging, Enhancement of Vesicle Production, and Noncanonical NF-.κB Signaling. Journal of Virology. 91 (5), (2017).
  22. Hurwitz, S. N., Conlon, M. M., Rider, M. A., Brownstein, N. C., Meckes, D. G. Nanoparticle analysis sheds budding insights into genetic drivers of extracellular vesicle biogenesis. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 31295 (2016).
  23. Lässer, C., Eldh, M., Lötvall, J. Isolation and characterization of RNA-containing exosomes. Journal of Visualized Experiments. (59), e3037 (2012).
  24. Jung, M. K., Mun, J. Y. Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (131), (2018).
  25. Meckes, D. G. Affinity purification combined with mass spectrometry to identify herpes simplex virus protein-protein interactions. Methods in Molecular Biology. 1144, 209-222 (2014).
  26. Rider, M. A., Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. ExtraPEG: A Polyethylene Glycol-Based Method for Enrichment of Extracellular Vesicles. Scientific Reports. 6, 23978 (2016).
  27. Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
  28. Thakur, B. K., et al. Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection. Cell Research. 24 (6), 766-769 (2014).
  29. Balaj, L., et al. Tumour microvesicles contain retrotransposon elements and amplified oncogene sequences. Nature Communications. 2, 180 (2011).
  30. Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nature Cell Biology. 10 (12), 1470-1476 (2008).
  31. Zhang, H., et al. Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation. Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).
  32. Zijlstra, A., Di Vizio, D. Size matters in nanoscale communication. Nature Cell Biology. 20 (3), 228-230 (2018).
  33. Meehan, B., Rak, J., Di Vizio, D. Oncosomes - large and small: what are they, where they came from. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 33109 (2016).

Tags

Kræftforskning spørgsmålet 144 exosomes ekstracellulære vesikel væv hjerne tumor massespektrometri tæthed farveforløb ex vivo oncosomes biomarkører
Udvinding af ekstracellulære vesikler fra hele væv
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hurwitz, S. N., Olcese, J. M.,… More

Hurwitz, S. N., Olcese, J. M., Meckes Jr., D. G. Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue. J. Vis. Exp. (144), e59143, doi:10.3791/59143 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter