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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Gewinnung von extrazellulären Vesikel aus ganze Gewebe

Published: February 7, 2019 doi: 10.3791/59143
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biomedical Sciences, Florida State University College of Medicine

Summary

Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll um kleine extrazelluläre Vesikel (EVs) aus dem ganzen Gewebe, einschließlich Gehirn und Tumor Proben zu isolieren. Diese Methode bietet eine reproduzierbare Technik um EVs aus festen Gewebe für weitere nachgelagerte Analysen zu extrahieren.

Abstract

Zirkulierenden und interstitielle kleine Membrane-springen extrazelluläre Vesikel (EVs) stellen viel versprechende Ziele für die Entwicklung von neuartigen diagnostische oder prognostische Biomarker Assays und wahrscheinlich dienen als wichtige Akteure bei der Progression von ein breites Spektrum von Krankheiten. Die aktuelle Forschung konzentriert sich auf die Charakterisierung von Vesikeln aus mehreren Zelle sezerniert und Gewebetypen um besser zu verstehen, welche Rolle der EVs in der Pathogenese der Bedingungen, einschließlich Neurodegeneration, Entzündungen und Krebs. Bleiben jedoch weltweit konsistente und reproduzierbare Techniken zu isolieren und reinigen Vesikel im Gange. Darüber hinaus werden Methoden zur Gewinnung von EVs aus festen Gewebe ex Vivo kaum beschrieben. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll zum Extrahieren von kleinen EVs von Interesse aus ganz frischen oder gefrorenen Gewebe, einschließlich Gehirn und Tumor Proben zur weiteren Charakterisierung. Wir zeigen die Anpassungsfähigkeit dieser Methode für mehrere nachgeschaltete Analysen, einschließlich Elektronenmikroskopie und Immunophenotypic Charakterisierung von Vesikeln sowie quantitative Massenspektrometrie EV Proteine.

Introduction

Kleinen extrazelluläre Vesikel (EVs) gehören Endosomal abgeleitet Exosomen und kleine Membran-Schuppen-Microvesicles, die von breiten biomedizinischen Interesse sind. Kleinen EVs bestehen aus einer heterogenen Bevölkerung von 50-250 nm Membrane-springen Vesikeln mit biologisch aktiven Proteine, Lipide und Nukleinsäuren, die kollektiv geglaubt werden, um in einer Vielzahl von Krankheiten eine wichtige Rolle spielen. Förderung der Forschung hat diese Vesikel in Neurodegenerative und Prion-Erkrankungen, infektiöse Prozesse, Autoimmun- oder entzündlichen Bedingungen und Tumorwachstum und Metastasierung1,2,3 besonders verwickelt. , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. schnell wachsenden biomedizinischen Forschung in die Bedeutung der EVs in der Pathogenese der Krankheit hat parallel Interesse an der Entwicklung reproduzierbarer und rigoroser Methoden zur Isolierung und Reinigung von diesen Bläschen erzeugt.

Eine historische und aktuelle Herausforderung in EV Charakterisierung wurde die Unfähigkeit, kleine EV Subpopulationen vollständig zu trennen. Diese Herausforderung ist im Wesentlichen auf unser begrenztes Verständnis der unterschiedlichen molekularen Mechanismen für die Biogenese von unterschiedlichen Vesikeln. Überlappende Größe, Dichte und biologischen Fracht zwischen Subpopulationen weitere Umdrehungen diese Unterscheidungen. Teil dieser Herausforderung wurde auch die Verwendung weit unterschiedliche Anreicherung Techniken, Inkonsistenz in nachgelagerte Analyse der isolierten Vesikel in Laboratorien und aufrechtzuerhalten, und untergräbt die globale Anstrengungen zur kategorische EV Populationen zu beleuchten.

Es ist erwähnenswert, dass die Mehrheit der EV Charakterisierung von in-vitro-Sammlung der Zellkultur überstand, mit neueren Studien in vivo Beschreibung Techniken zur Isolierung von Vesikeln aus tierischen oder menschlichen Körperflüssigkeiten, einschließlich Plasma, Urin durchgeführt wurde , und Speichel. EVs in großen Mengen im Umlauf sind, erkannte sie auch, dass diese Vesikel spielen eine wichtige Rolle in der Zell-Zell-Kommunikationsveranstaltungen und in das Interstitium der zellulären Gewebe vorhanden sind. In Zusammenhang mit Krebs möglicherweise interstitielle EVs Modulation der Tumor Mikroumgebung für Krebszelle Aussaat und metastasiertem Wachstum14,15besonders wichtig. Infolgedessen gibt es Wert bei der Entwicklung und Optimierung von Techniken, um Bläschen aus soliden Gewebeproben zu extrahieren. Diese Methoden bieten eine Möglichkeit direkt Orgel - Studium oder Tumor - EVs geerntet von klinischen Proben, einschließlich kleinen Biopsien und teilweise oder vollständige Orgel Resektionen abgeleitet.

In dieser Studie und in einem früheren Bericht, herausgegeben von unserem Labor16wollen wir mehrere wichtige aktuelle EV Bereicherung Methodik Bedenken: 1) um eine reproduzierbare Technik zu isolieren und reinigen EVs nach den höchsten Standards derzeit zu beschreiben auf dem Fachgebiet anerkannt; (2) zu versuchen, kleine EV Subpopulationen hochangereichertes im Endosomal abgeleitet Exosomen zu isolieren; und 3), ein Protokoll für die Gewinnung von diesen Bläschen aus massivem Gewebeproben zur weiteren Charakterisierung zur Verfügung zu stellen.

Vor kurzem, Kowal und Kollegen beschrieben eine relativ kleine Iodixanol Dichtegradient zu trennen und zu reinigen EV Subpopulationen mit größerer Wirksamkeit als vergleichbare Saccharose Dichte Gradienten17. In der zitierten Studie wurden dendritische Zelle abgeleitet EVs, eingefangen in Sekundenbruchteilen relativ geringer Dichte, mit einer Dichte von 1,1 g/mL, in Endosomal Proteine als konsequenteste mit einem hohen Anteil von Exosomen vorhanden in diesem hochangereichertes Bruchteil. Nach Ansicht der Autoren enthalten dieser "bona fide" Exosomal Proteine Tumor Anfälligkeit gen 101 (TSG101), Syntenin-1, CD81 ADAM10, EHD4 und mehrere annexin Proteine17. Diese Technik, um eine Methode der Gewebe Dissoziation von Perez Gonzalez Et al.18 und eine nachfolgende differentielle Zentrifugation Protokoll zum ganzen Gehirn abgeleitet EVs16isolieren beschrieben gelingt später angepasst Wir zeigten auch die Nützlichkeit dieser Methode bei der Charakterisierung EV Proteome durch die Kombination eine sequenzielle Protokoll für nachgeschaltete quantitative und vergleichende Massenspektrometrie vesikuläre Protein, zuvor von unserem Labor19beschrieben. Diese arbeiten parallel, die aus dem Hill-Labor, in dem EVs aus der frontalen Kortex des Gehirns20angereichert wurden.

In dieser Studie wir näher auf diese Technik und die Anwendung des Protokolls vor kurzem von unserem Labor auf die Isolation der EVs aus massivem Lungentumoren zu verlängern. Nach unserer Kenntnis ist dies die erste Studie zu beschreiben, ein Protokoll zur EVs aus ex-Vivo Tumor Proben zu bereichern. Das breite Interesse im Rahmen des EFD als neuartige diagnostischen Biomarkern und ihre Rolle in der Tumorgenese gegeben, wird diese Methode wahrscheinlich für eine wachsende Zahl von wissenschaftlichen Forscher wertvoll erweisen. Aus klinischer Sicht könnte interstitielle EVs großen diagnostischen Wert, vor allem bei Exemplaren Hafen wo histologische Auswertung begrenzt ist. Unsere Hoffnung ist, dass die hier beschriebene Methode eine Grundlage für eine reproduzierbare Technik EVs aus frischen oder gefrorenen tierischen oder menschlichen chirurgische Proben, ebnet den Weg für die künftige Arbeit aufzudecken die bedeutende Rolle in der Pathogenese der Krankheit diese kleine Ernte Bläschen können spielen.

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Protocol

Ganze Köpfe wurden mit Genehmigung von der institutionellen Tier Nutzung und Pflege Committee (IACUC) von der Florida State University erhalten. Insgesamt zwölf Mäusegehirnen (3 Gehirne aus jeder Altersgruppe: 2, 4, 6 und 8 Monate) aus einem C57BL/6 J Hintergrund für EV-Extraktion, wie zuvor beschrieben16dienten. Lung Tumor Proben wurden von Dr. Mandip Sachdeva unter Zustimmung des Florida Agricultural and Mechanical University IACUC großzügig gespendet. Lungentumore stammen aus der menschlichen Adenokarzinom-Zell-Linie H1975 in immungeschwächte nackten Mäusen Balb/c Nu/Nu angebaut. Daten aus zwei repräsentativen Tumor repliziert werden in dieser Studie hervorgehoben.

Hinweis: Eine schematische Übersicht der Vesikel Isolierung und Reinigung Methode ist in Abbildung 1zur Verfügung gestellt.

(1) Gewebe Dissoziation und differentielle Zentrifugation

  1. Vorbereitung 10 mL Dissoziation-Puffer (10 mg Papain; 5,5 mM L-Cystein; 67 µM 2-Mercaptoethanol; 1,1 mM EDTA) in Hibernate-E Medium pro ca. 0,4 bis 1,0 g des Gewebes. Beachten Sie, dass alle Lösungen bei der EV-Anreicherung und Reinigung gefilterte Reinstwasser verdünnt werden sollte.
  2. Dissoziation-Puffer in einem 50 mL konische Rohr ganz frisches oder gefrorenes Gewebe hinzu, und inkubieren Sie in warmem Wasser Bad bei 37 ° C für 20 min. Gewebe kann in kleinere Bruchstücke vor der Inkubation geschnitten werden, wenn nötig.
  3. Fügen Sie nach der Inkubation Protease und Phosphatase Inhibitoren für eine endgültige 1 X Konzentration des Dissoziation Puffers, enthält das Gewebe hinzu.
  4. Gießen Sie die Lösung mit dem Gewebe in ein Locker geschnittenes Dounce-Homogenisator, und distanzieren Sie sanft das Gewebe mit ca. 30 langsamen Schlägen pro Probe zu. Die Anzahl der Schläge kann je nach Gewebe Konsistenz eingestellt werden.
  5. Transfer dissoziiert Gewebe im Puffer ein 50 mL konische Rohr und Zentrifuge bei 500 X g für 5 min bei 4 ° C, die Zellen und die restlichen faserige oder kohäsiven Gewebefragmente pellet.
  6. Übertragen Sie den Überstand auf eine saubere 50 mL konische Rohr und Zentrifuge bei 2.000 X g für 10 min bei 4 ° C, pellet und entsorgen Sie große Zelltrümmer.
  7. Übertragen Sie den Überstand auf eine saubere 50 mL konische Rohr und Zentrifuge bei 10.000 X g 40 min bei 4 ° C zu unerwünschten größere Bläschen oder kleine Apoptotic stellen Pellets wieder.
    Hinweis: Dieser Pellet kann für zusätzliche Studie von größeren Vesikeln gespeichert werden, falls gewünscht.
  8. Dekantieren Sie den Überstand durch einen 0,45 µm-Filter in einem sauberen 12 mL Ultrazentrifugation Röhrchen.
    Hinweis: Dicht fibrotische Gewebeproben möglicherweise nicht leicht gefiltert werden. Diese Proben können durch ein 40 µm Zelle Sieb gefiltert und dann seriell kleinere Nadeln (18 G, 20 G, 22 G) vor der Filterung durch den 0,45 µm-Filter durchlaufen.
  9. Ultrazentrifugen der Probe bei 100.000 X g für 2 h bei 4 ° C zu kleinen EVs Pellets.
  10. Überstand abgießen und die Ultrazentrifugation Rohre invertiert für ca. 5-10 min, klopfen häufig zu Restflüssigkeit auf den Seiten von Röhren entfernen lassen. Restflüssigkeit kann auch mit einem Absaugnadeln Vakuum Pipette abgesaugt werden.
  11. Wieder aussetzen Sie EV Pellet in 1,5 mL 0,25 M Saccharose-Puffer (10 mM Tris, pH 7.4). Es ist wichtig, die vollständige Resuspension des Pellet-in diesem Schritt zu gewährleisten. Dazu decken Sie die Rohre mit Parafilm vor vortexen EVs in Lösung. Rock die Ultrazentrifuge Rohre für 15-20 min bei Raumtemperatur vor einer endgültigen Wirbel-Mix.
  12. Zentrifugieren Sie kurz die Rohre bei einer Geschwindigkeit nicht mehr als 1.000 X g flüssige Suspension an der Unterseite des Rohres zu erholen.
  13. Fahren Sie mit der gradient Reinigungsschritte unten, oder bei Bedarf speichern Sie EV Aussetzung bei 4 ° C über Nacht.

2. Dichte Gradienten Reinigung

  1. 1,5 mL Saccharose/Tris-Puffer mit EVs zum Erstellen einer endgültigen Lösung mit 30 % Iodixanol fügen Sie 1,5 mL 60 % Iodixanol (Stammlösung in Wasser hinzu). Pipette oben und unten mehrmals um Lösung gründlich zu mischen. Seien Sie vorsichtig zu verlieren in der Pipettenspitze Lösung, da die hohen Iodixanol Konzentration ziemlich dickflüssig ist.
  2. Die 30 % Iodixanol Pufferlösung mit EVs auf den Boden einer 5,5 mL Ultrazentrifugation Röhre zu übertragen.
  3. Mindestens 1,5 mL 20 % und 10 % Iodixanol Lösungen pro Probe Reinstwasser aus 60 % Iodixanol Vorratslösung vorzubereiten.
  4. Messen Sie 1,3 mL 20 % Iodixanol und sorgfältig Schicht über der unteren Verlaufsebene mit Hilfe einer Spritze und Nadel eine 18 G. Um zu vermeiden, mischen die Schichten an der Schnittstelle von Dichte, halten Sie die schräge der Nadel in Kontakt mit der Innenseite des Rohres oberhalb der Meniskus Ultrazentrifugation und fügen Sie die Lösung tropfenweise hinzu.
  5. Layer 1,2 mL 10 % Iodixanol Lösung auf die 20 % Iodixanol Schicht mit der gleichen Technik wie oben beschrieben.
  6. Sorgfältig balancieren Sie und laden Sie die Ultrazentrifugation Rohre in Rotor Eimer und Zentrifuge in ein Schaukel-Eimer-Rotor bei 268.000 X g 50 min bei 4 ° c Legen Sie die Beschleunigungs- und Verzögerungswerte Geschwindigkeiten der Zentrifuge auf die Mindestsätze zulässig, Unterbrechungen der Dichte Schichten zu vermeiden.
  7. Beschriften Sie zehn 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen für jede Probe zu Bruchteilen 1 bis 10 von der Dichtegradient entsprechen. Bruchteil 1 bezeichnet man als die obersten Bruch, der zuerst entfernt wird, während Bruch 10 der unteren Anteil zuletzt entfernt ist.
  8. Nach Abschluss der gradient Ultrazentrifugation sanft entfernen Sie die Rohre aus dem Rotor-Eimern und in einer stabilen Halterung. Eine sichtbare Band von Vesikeln wird oft in der Fraktion von Interesse gesehen werden. Pipette 10 serielle Bruchteile von 490 µL von der Spitze des Farbverlaufs in die entsprechenden Röhren. Es wird eine kleine Menge Flüssigkeit bleiben an der Unterseite des Rohres, die wahrscheinlich kontaminierende Proteine enthält. In diesem Beispiel kann verworfen, oder als Bruchteil 11 beibehalten, falls gewünscht.
  9. Messen Sie die Brechungsindizes der Fraktionen mit einem Refraktometer. Dies kann auch durchgeführt werden, mit einem Steuerelement Verlauf parallel laufen, wenn Probe Erhaltung notwendig ist. 20-30 µL der einzelnen Fraktionen Iodixanol auf die Oberfläche der Refraktometer mit Pipette, und schätzen die Dichte durch den Vergleich der Brechungsindizes zu bekannten Iodixanol dichten. Beachten Sie, dass Brüche in die Iodixanol-haltige Lösung über Nacht gespeichert werden können, ggf. vor dem fortfahren mit dem nächsten Schritt der Ultrazentrifugation waschen.
  10. Übertragen Sie jede Fraktion auf eine saubere 12 mL Ultrazentrifugation Rohr. 5 mL 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4) am Rohr und fügen Sie Mischung von Pipettieren langsam rauf und runter hinzu.
    Hinweis: PBS hinzugefügt, um die Proben sollten partikelfreie, werden gewährleistet durch sterile PBS durch einen 0,22 µm Filter Filterung und Lagerung bei Raumtemperatur Salz Niederschlag zu vermeiden.
  11. Fügen Sie eine zusätzliche 6 mL 1 X PBS nach oben und wieder umrühren Sie vorsichtig.
  12. Ultrazentrifugen der Rohre bei 100.000 X g für 2 h bei 4 ° C zu kleinen Bläschen wieder Pellets. Abgießen Sie den Überstand und tippen Sie auf die Rohre trocken ist, bevor die lyse von Vesikeln für Proteinanalytik (Schritt 3) oder Resuspension des EFD zur morphologischen Analyse (Schritt 5).

(3) lyse und Immunoblot Bestätigung der EV-Proteine

Hinweis: Erhaltung der ganzen Vesikel für Morphologische Charakterisierung oder biologische Aktivität erwünscht, können Forscher direkt mit Schritt 5 fortfahren. In ersten Experimenten oder vor der Massenspektrometrie Analyse sollte allen Fraktionen erholt durch Immunoblot Brüche mit EV Proteine bestätigen analysiert werden.

  1. Fügen Sie 40 µL starke Lyse Puffer (5 % SDS, 10 mM EDTA, 120 mM Tris-HCl pH 6,8, 2,5 % 2-Mercaptoethanol, 8 M Harnstoff) mit dem Zusatz von Protease-Inhibitor um EFD für Proteinanalytik lysieren hinzu, EV Pellet in Ultrazentrifuge Rohr.
    Hinweis: Wenn nicht-reduzierenden Bedingungen für Antikörpernachweis von Proteinen gewünscht werden, ersetzen Sie Reinstwasser für 2-Mercaptoethanol in der starken Lyse-Puffer.
  2. Vollständige Resuspension der Pellet und lyse der EVs im Puffer zu gewährleisten, indem man Parafilm über die Ultrazentrifugation tube, vortexen kräftig rocken dann für 20 min bei Raumtemperatur vor einem endgültigen Wirbel.
  3. Kurz Zentrifugieren Sie bei 1.000 X g für 30-60 s, um das gesamte Sample Volume wiederherzustellen. Übertragen Sie die Probe auf eine neue 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und speichern bei-20 ° C bis-80 ° C bis Weiterverarbeitung.
  4. Die Proben für eine Endkonzentration von 1 X um gereinigte Lysates Immunoblot Analyse vorzubereiten, 5 X Laemmli Probenpuffer (10 % SDS, 250 mM Tris pH 6.8, 1 mg/mL Bromophenol blue, 0,5 M DVB-t, 50 % Glycerin, 5 % 2-Mercaptoethanol) hinzugefügt.
    Hinweis: Wenn nicht-reduzierenden Bedingungen gewünscht werden, ersetzen Sie die DVB-t und 2-Mercaptoethanol mit Reinstwasser.
  5. Wenn ganze Gewebe Homogenat Kontrollen sind erwünscht, lösen Sie das Gewebe in der Harnstoff-haltige starke Lyse Puffer oben erläuterten mit Protease-Inhibitor, anschließend Zentrifugieren bei 10.000 X g für 10 min die restlichen extrazellulären Matrix, ganze Zellen zu verwerfen oder intakte Zelltrümmer. Die Gewebe-Homogenat für eine Endkonzentration von 1 X 5 X Laemmli Probenpuffer hinzufügen.
  6. Die Probenpuffer mit EV oder Gewebe homogenisierte Proben bei 95 ° C für 5-10 min kochen, dann gleich Ladevolumen (aus den Gegenwert von 0,1-0,3 g Gewebe Ausgangsmaterial; 1-2 µg des gereinigten EV Protein) der Fraktionen 1-10 zu einem 10 % SDS-PAGE Gel. Laden Sie gleich Masse von Gewebe Homogenat. Größeres Volumen der Proben wird möglicherweise für die Erkennung von unempfindlicher Antikörper benötigt.
  7. Gehen Sie mit Gelelektrophorese und Western-Blot Analyse wie zuvor detaillierte21 EV Proteine in den gereinigten Lysates bestätigen und relative Häufigkeit der EV in Sekundenbruchteilen zu vergleichen.
    Hinweis: Sobald EV Protein in Einklang Bruchteilen reproduzierbar nachgewiesen wurde, kann die endgültige Ultrazentrifugation Wäsche im Schritt 2.12 beschrieben auf Farbverlauf Bruchteile von Interesse beschränkt werden.

(4) EV Protein Quantifizierung

  1. Ein Waschmittel und Harnstoff-kompatibel Fluoreszenz basierende Assays zu verwenden, wenn sensible Quantifizierung der EV Proteine zur weiteren Analyse gewünscht wird (siehe Tabelle der Materialien). Beachten Sie, dass einige Fluoreszenz basierende Assays kompatibel mit dem Bromophenol Blue im Probenpuffer Laemmli sind, direkte lyse des Pellet-EV (in Schritt 2.12) in diesem Puffer zu erleichtern, falls gewünscht.
  2. Wenn die oben genannten Fluoreszenz-basierte Protein Quantifizierung Kit verwendet wird, vor Ort 1 µL der Probe oder Standards in mindestens auf dem mitgelieferten Filterpapier duplizieren und weiter Protein Quantifizierung nach Herstellerangaben.

5. Charakterisierung von EV Morphologie

  1. Um ganze Vesikel untersuchen nach der abschließende Zentrifugationsschritt in Schritt 2.12 waschen, auszusetzen Sie gründlich neu EV Pellet in partikelfreie 1 X PBS. Store EVs bei 4 ° C nicht länger als eine Woche bis Verarbeitung, Frost-Tau-Zyklen zu vermeiden.
    Hinweis: Es ist vorteilhaft, Brüche, die konsequent mit angereicherten EV Protein durch Immunoblot Analyse, morphologische Analysen zu Bruchteilen von Interesse zu begrenzen zuvor bestätigt haben.
  2. Führen Sie Nanopartikel tracking-Analyse auf ganze EV-Proben, die Konzentration und Größe von Vesikeln in Vorbereitungen, wie zuvor detaillierte22bestimmen.
  3. Charakterisieren Sie EV Morphologie zu und bestätigen Sie Größenmessungen durch Elektronenmikroskopie von Vesikeln, zu, falls gewünscht. EM-Raster aus Vesikel Suspensionen nach Schritt 5.123zubereitet werden oder alternativ als Block Vorbereitungen24 von Pellets nach Schritt 2.12 verarbeitet werden können.

6. in-Gel Reinigung und Trypsin-Verdauung für Massenspektrometrie Analyse

  1. Charakterisierung von EV Proteome durch Massenspektrometrie gewünscht, laden Sie gleich Masse (mindestens 10 µg Protein) der Fraktionen, die EVs in einer vorgegossenen Polyacrylamid-Gel zu trennen und zu reinigen Proteine enthalten. Hersteller gelieferten vorgegossenen Gele werden bevorzugt, die Verringerung der Potenzial kontaminierende Proteine (z.B. Keratin) in den Proben eingeführt.
  2. Führen Sie das Beispiel mindestens 0,5 Zoll in das Polyacrylamid-Gel für Proteinreinigung, dann fix und Flecken mit Coomassie-Färbung, wie oben beschrieben im Detail25.
  3. Schneiden Sie die Bahnen in 1 mm3 Würfel für Trypsin-Verdauung, als zuvor detaillierte19,26.
  4. LC-MS/MS-Instrument für die Trennung auf die Trennsäule und anschließende Analyse bestücken Sie 5 µL verdaute Peptid Probe durch Massenspektrometrie im Detail16angegebenen Parametern.

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Representative Results

Eine schematische Übersicht über die Gewebe Dissoziation, differentielle Zentrifugation und gradient Reinigung von Vesikeln wird in Abbildung 1angezeigt. Die morphologische und Immunophenotypic Bestätigung der Gradient-gereinigte EVs wird in Abbildung 2hervorgehoben. Ein Diagramm der reproduzierbaren dichten nach Ultrazentrifugation des 10-30 % Iodixanol Verlaufs mit zwei unterschiedlichen Vesikel Populationen migrieren nach oben zu Bruch 2 (Licht EVs) und Teil 5 (Dichte EVs), abhängig vom Gewebetyp zeigt. Vertreter Immunoblots gradient Fraktionen weisen die effiziente Trennung und Reinigung von kleinen Tumor abgeleitet EVs in Teil 5. Der Hinweis Lunge Tumor Proben erschien angereichert in dichten EVs im Vergleich zum Licht EVs (im Bruch 2) vorher geerntet aus ganze Hirngewebe wieder hier hervorgehoben. Als eine globale Gewebeanalysen des EFD hervorgehen, es wird interessant sein zu bestimmen, die unterschiedliche Dichte des EFD durch einzigartige Gewebe produziert. Vertreter Nanoparticle Tracking-Analysen und Elektronenmikroskopie der Gewebe abgeleitet Vesikel in die vorherrschende Vesikel-haltigen Bruchteil zeigen die Anreicherung und Erhaltung des ganzen Vesikel mit bekannter Größe und Struktur des kleinen EVs. Schließlich zeigt Abbildung 3 die Nützlichkeit dieser Methode bei der Erleichterung der nachgeschalteten Massenspektrometrie Charakterisierung der Gradient-gereinigte Vesikel Proteine, demonstrieren die Erkennung von viele Proteine, die vorher im kleinen Rahmen des EFD identifiziert. Viele dieser identifizierte Proteine sind mit denen in kleinen Endosomal abgeleitet EVs zuvor von Théry und Hill Labs17,20vorgeschlagenen bereichert.

Figure 1
Abbildung 1 : Schematische Übersicht über Vesikel Isolierung und Reinigung von ganzen Gewebe. Nach Gewebe Dissoziation, Pre-Clearing differentielle Zentrifugation Schritte, Filtration und Ultrazentrifugation, grobe EV Pellets kann am unteren Rand ein Dichtegradient Iodixanol für Floating Trennung Nukleinsäuretablette. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Repräsentative morphologischen und Immunophenotypic Analyse des Gewebes abgeleitet EFD. (A) dichten von Iodixanol gradient folgende Ultrazentrifugation, gemittelt über unabhängige Experimente, Hervorhebung Brüche mit Licht und dichten EVs berechnet. (B) Vertreter Immunoblots von Gewebe stammenden Vesikeln demonstrieren die Isolation der überwiegend dichte Tumor EVs und Licht Gehirn EVs. Vesikel-Isolate sind von nicht-EV Protein Calnexin erschöpft. H, homogenisierte Gewebe. (C) Nanopartikel tracking-Analyse (NTA) Vertreter Farbverlauf-gereinigte Gewebe EVS. Die kleinsten erkannten Teilchen in diesem Beispiel wurde 78 nm und rund 92 % der Vesikel erkannt wurden 250 nm oder kleiner, im Einklang mit einer hohen Anreicherung von kleinen EVs. (D) repräsentativen Elektronenmikroskopie Bilder von Gehirn Gewebe abgeleitet EVs. Skalieren von Balken = 200 nm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Zusammenfassung der hervorgehobenen Vesikel Proteine erkannt durch Massenspektrometrie eines Vertreters Gewebe abgeleitet EV Probe. Nach EV Extraktion und gradient Reinigung wurde zu einem Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese und in Gel Trypsin-Verdauung 10 µg EV Protein angereicherten Bruchteil geladen. In diesem Gewebe abgeleitet EV repräsentativen wurden insgesamt 918 Proteine von LC-MS/MS-Analyse identifiziert. Peptide wurden identifiziert, analysiert und festgestellt, dass in Exosomal, lysosomale, und Plasma Membranproteine als zuvor beschriebenen16angereichert werden. Hier zeigen wir das Vorhandensein von kleinen EV oder Exosomal Proteinen bei unseren Vorbereitungen, die von Théry und Hill Labs17,20beschrieben wurden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Viel wissenschaftliches Interesse wurde im Hinblick auf die Rollen, die kleine EVs in der Mikroumgebung Tumor sowie in Organentwicklung, Reifung und Funktion spielen generiert. Insgesamt bietet diese Studie einen optimierten Workflow für die Gewinnung von intakten EVs aus Gesamt-Hirn oder Tumor Proben. Während hier wir einfach die Anwendbarkeit dieser Technik auf Lunge Tumor abgeleitet EVs zeigen, könnte diese Methode einfach angepasst werden für die Arbeit auf anderen festen Geweben, Möglichkeiten für weitere Ex Vivo Charakterisierung von kleinen sekretierten Vesikeln, die von biomedizinischen auf großes Interesse. Während über den Anwendungsbereich dieser Studie hinaus werden zukünftige Vergleich der EV Inhalt der stammende Gewebe Ausdruck auch wichtig, die Nützlichkeit des isolierten Vesikel als Biomarker für Gewebe und Krankheit herzustellen.

In der Studie, die zuvor von unserem Labor veröffentlicht zeigen wir deutlich die Vorteile der Float-basierte Dichtegradient über Sedimentation Gradienten für die Reinigung der angereicherten kleine Bläschen. Im wesentlichen verbessert eine Auftrieb-basierte Trennung Reinigung von Vesikeln durch die Vermeidung von Verunreinigungen Migration durch die Fraktionen von Interesse. Dieses Prinzip erscheint besonders wichtig, wenn komplexe Proben wie ganze Gewebe ab. Egal, betonen wir die Bedeutung der Pre-analytische Bestätigung Studien von isolierten Vesikel beschrieben, einschließlich der Prüfung der EV Morphologie durch ergänzende Techniken wie Elektronenmikroskopie und Nanopartikel tracking-Analyse, sowie als biochemische Analysen einschließlich Immunoblotting. EV-Proteine in angereicherte Fraktionen sollte bestätigt werden mit mindestens drei anerkannte EV Markierungen, einschließlich ein Tetraspanin Protein, wie durch die Minimale Informationen für Studien der EVs (MISEV) Bericht empfohlen in der Zeitschrift der extrazellulären veröffentlicht Vesikel-27. Eine negative EV-Markierung sollte nachgewiesen werden, abwesend zu sein oder in der EV Brüche im Vergleich zum Gewebe Homogenates stark reduziert. Alle oben genannten Schritte sind von entscheidender Bedeutung für die Qualitätssicherung der kleine Vesikel Reinigung. Frühzeitigen Demonstration der Labor - und Benutzer-spezifische Konsistenz in EV-haltigen Dichte Brüche kann darüber hinaus wertvolle Zeit und Kosten im Zusammenhang mit der Verarbeitung und Analyse aller Fraktionen nach dem Dichte-Gradienten Ultrazentrifugation Schritt speichern.

Es ist klar, dass Vesikel aus unterschiedlichen Geweben geringfügig unterschiedlicher Dichte Fraktionen schweben können oder in überwiegend helle oder dichten Subpopulationen trennen können. Diese Unterschiede wurden zuvor im ganzen gesehen, Brain-derived EVs im Vergleich zu EVs von dendritischen Zellen in Kultur16,17angebaut geerntet und sind weiter in dieser Studie nachgewiesen. Wir zeigen, dass die Lunge Tumor Proben überwiegend Hafen können dichten kleinen EVs im Vergleich zu den leichteren EVs von Gehirngewebe isoliert. Diese Unterschiede hervorgehoben durch die in dieser Studie vorgeschlagene Methode können fördern wertvolle Anfragen in die unterschiedliche Zusammensetzung des EFD, einschließlich Tumor-EVs, die mit dichten DNA-Stränge28,29,30gepackt werden können. Aufgrund dieser Unterschiede in der Zusammensetzung der EV unterstreichen wir nachdrücklich die Bedeutung dieser anfängliche technische Experimente. Zukünftige Anwendung dieser Technik auf die Isolation der EVs aus vielfältigen Tumor Proben werden um festzustellen, ob dicht EVs überwiegend abgesondert in das Interstitium sowie andere Tumorarten sind wichtig.

Während die vollständige Reinigung des kleinen EFD und Isolierung von verschiedenen Vesikel Subpopulationen eine Strombegrenzung über Labors bleibt, bietet diese Methode eine Grundlage für weitere Studien zu kleinen Bläschen aus einer Vielfalt von Gewebe- oder Tumor charakterisieren Typen, und kann daher ein größeres Verständnis für EV Vielfalt erleichtern. Den letzten Trennung von EV Partikeln durch asymmetrische Fluss Feld-Fluss Fraktionierung beleuchtet die Möglichkeit unterschiedliche Fracht und Funktionen von kleinen (60-80 nm) im Vergleich zu größeren (90-120 nm) Exosomen hat, und weitere identifiziert eine Teilmenge der nicht-Membran gebunden < 50 nm Teilchen bezeichnet als "Exomeres"31,32. Fracht, verpackt in diese einzigartige Vesikel-Populationen in Zelllinien, die erhebliche Heterogenität der sekretierten Vesikel hervorheben und unterstützen die Bedeutung der umfassende in-vitro- oder Ex-Vivo-Vesikel Analyse jedoch unterschiedlich. In dieser Studie bereichern wir wahrscheinlich für beide Klassen von Exosomen identifiziert. Ein Teil der kleinen Microvesicles mit ähnlicher Dichte, Exosomen kann in Isolate sowie vorhanden sein. Obwohl wir nicht, die Möglichkeit der Exomeres in unseren Isolaten ausschließen können, waren Membrane-springen Vesikel sicherlich am häufigsten in den Farbverlauf Fraktionen in Vesikel Protein angereichert. Neben kleinen EVs, große Oncosomes (> 1.000 nm) wurden kürzlich an Krebs Biologen33. Während das Protokoll in beschrieben dieser Studie filtert Vesikel größer als 450 nm, Ausschluss dieses Schrittes kann zu erleichtern, Prüfung von dieser größeren EVs beschrieben. Zukünftige Untersuchungen von dichten verschiedener Vesikel Subpopulationen zugeordnet werden diese Einrichtungen zusätzlich zu den beschriebenen Größen zu unterscheiden.

Schließlich, obwohl wir die Beschränkungen, einschließlich Kosten und Zeit im Zusammenhang mit dieser vorgeschlagene Technik zu schätzen wissen, erkennen wir auch die Notwendigkeit für strenge grundlegende Methoden Gewebe EVs zu charakterisieren und dienen als ein Endprodukt Vergleich für ständig sich entwickelnden und hoch entwickeltere Methoden in der Zukunft. Diese Weiterentwicklung von Technologien werden hoffentlich schnelle und klinisch-kompatible Techniken zum Extrahieren von EVs aus medizinischen oder chirurgischen Proben beleuchten.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Die Autoren danken Dr. Richard Nowakowski und die Florida State University Labor Tier Ressourcen für die Bereitstellung und Pflege für die Tiere zu diesem Protokoll respektvoll zu entwickeln. Wir danken Liu Xia, Dr. Rakesh Singh und Florida State University translationale Science Laboratory für Hilfe mit der Massenspektrometrie Arbeit zur nachgelagerten Vesikel Charakterisierung sowie die FSU Biological Science Imaging Resource-Anlage für die Verwendung des Transmissions-Elektronenmikroskop in dieser Studie. Zu guter Letzt danken wir Dr. Mandip Sachdeva (Florida A & M University) für die Spende der Tumor Proben bei der Entwicklung dieser Methode verwendet. Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse aus Florida Department of Health Ed und Ethel Moore Alzheimer Krankheit Forschungsprogramm an D.G.M. und J.M.O (6AZ11) und das National Cancer Institute der National Institutes of Health unter Prämiennummer vergeben R01CA204621 an D.G.M. vergeben

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 µm filter VWR 28145-505
12 mL ultracentrifuge tubes Beckman Coulter 331372
5.5 mL ultracentrifuge tubes Beckman Coulter 344057
anti-Alix antibody Santa Cruz sc-7129
anti-Calnexin antibody Santa Cruz sc-11397
anti-CD63 antibody Abcam ab59479
anti-CD81 antibody Santa Cruz sc-9158
anti-Flotillin 2 antibody Santa Cruz sc-25507
anti-HSC70 antibody Santa Cruz sc-7298
anti-Syntenin-1 antibody Santa Cruz sc-100336
anti-TSG101 antibody Santa Cruz sc-7964
EZQ protein quantification kit ThermoFisher Scientific R33200
FA-45-6-30 rotor  Eppendorf 5820715006
FEI CM120 Electron Microscope TSS Microscopy
goat anti-rabbit IgG (Fab fragment) Genetex 27171
HALT phosphatase inhibitor (100x solution) ThermoFisher Scientific 78420
HALT protease inhibitor (100x solution) ThermoFisher Scientific 78438
Hibernate E medium ThermoFisher Scientific A1247601
MLS-50 swinging-bucket rotor Beckman Coulter 367280
NanoSight LM10 Malvern
Optima MAX-XP Benchtop Ultracentrifuge  Beckman Coulter 393315
Optima XE-100 ultracentrifuge Beckman Coulter A94516
Optiprep Sigma D1556 60% iodixanol in sterile water solution
Q Exactive HF Mass Spectrometer ThermoFisher Scientific
rabbit anti-goat IgG Genetex 26741
rabbit anti-mouse IgG Genetex 26728
Refracto 30PX (refractometer) Mettler Toledo 51324650
S-4-104 rotor Eppendorf 5820759003
SW 41 Ti swinging-bucket Rotor Beckman Coulter 333790
Tabletop 5804R centrifuge Eppendorf 22623508

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References

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Cancer Research Ausgabe 144 Exosomen extrazelluläre Vesikel Gewebe Gehirn Tumor Massenspektrometrie Dichtegradient ex Vivo Oncosomes Biomarker
Gewinnung von extrazellulären Vesikel aus ganze Gewebe
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Hurwitz, S. N., Olcese, J. M.,… More

Hurwitz, S. N., Olcese, J. M., Meckes Jr., D. G. Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue. J. Vis. Exp. (144), e59143, doi:10.3791/59143 (2019).

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