Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

מיצוי של שלפוחית חוץ-תאית מרקמות כל

Published: February 7, 2019 doi: 10.3791/59143

Summary

כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט כדי לבודד שלפוחית חוץ-תאית קטנה (EVs) של כל הרקמות, כולל דגימות המוח ואת הגידול. שיטה זו מציעה שיטה לשחזור כדי לחלץ EVs מרקמות מוצק עבור נוסף במורד הזרם ניתוחים.

Abstract

מחזורי, interstitial קטן מאוגד-ממברנה חוץ-תאית שלפוחית (EVs) מייצגים מטרות המבטיחים פיתוח מבחני הרומן סמן prognostic או אבחון, ולשמש סביר שחקנים חשובים ההתקדמות של ספקטרום עצום של מחלות. המחקר הנוכחי מתמקד אפיון שלפוחית מופרש מן התא מרובים, סוגי רקמות כדי להבין את התפקיד של EVs בפתוגנזה של תנאים לרבות הקשורים ניוון מוחיים, דלקת סרטן. עם זאת, באופן גלובלי עקבי וטכניקות לשחזור כדי לבודד ולטהר שלפוחית נשארים בתהליך. יתר על כן, שיטות לחילוץ של EVs של רקמה מוצק שמחוץ מתוארים בקושי. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לחילוץ EVs קטן עניין רקמות שלם טרי או קפוא, כולל דגימות המוח ואת הגידול, על אפיון נוסף. נדגים את יכולת ההתאמה של שיטה זו עבור מספר ניתוחים במורד הזרם, כולל מיקרוסקופ אלקטרונים, immunophenotypic אפיון של שלפוחית, כמו גם כמותיים ספקטרומטר מסה של חלבונים EV.

Introduction

שלפוחית קטנה חוץ-תאית (EVs) כוללים endosomal, נגזר exosomes קטן שלפוחיות זעירות ממברנה-המחסן יש עניין הביו-רפואית רחבה. EVs קטנות המורכבות אוכלוסיה הטרוגנית של 50-250 ננומטר מאוגד-קרום שלפוחית המכילה חלבונים אקטיביות ליפידים, חומצות גרעין, כי הם האמינו קולקטיבי לשחק תפקידים חשובים שפע של תהליכי מחלה. קידום מחקר במיוחד בהפרות אלה שלפוחית ניווניות, הפרעות פריון, תהליכים זיהומיות, תנאי אוטואימוניות או דלקתיים, ואת הגידול, גרורה1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. במהירות גוברת המחקר הביו-רפואי לתוך המשמעות של EVs בפתוגנזה של המחלה יצר עניין מקבילים בפיתוח שיטות מחמירות הדירים בידוד ולטיהור שלפוחית אלה.

אתגר היסטוריים, ב- EV אפיון היה חוסר היכולת הפרדה מלאה subpopulations EV קטן. אתגר זה נובע במידה רבה הבנתנו המנגנונים המולקולריים שונות המסדירים את להן של שלפוחית ברורים מוגבלת. חופפים גודל, צפיפות מטען ביולוגיים בין subpopulations נוספות convolutes הבחנות אלו. חלק באתגר זה היה שימוש נרחב העשרה טכניקות שונות, מתן עקביות בניתוח במורד הזרם של שלפוחית מבודד מעבר מעבדות, ערעור מהמאמץ העולמי כדי להאיר קטגורית אוכלוסיות EV.

ראוי לציין כי הרוב המכריע של EV אפיון בוצעה מאוסף במבחנה של תרבית תאים supernatant, עם מחקרים מאוחרים יותר ויוו המתארת טכניקות כדי לבודד שלפוחית של נוזלי הגוף בעל חיים או אדם, לרבות פלזמה, שתן , ורוק. בעוד EVs נמצאים בכמויות גדולות במחזור, גם זיהה כי שלפוחית אלה תפקיד חשוב אירועי תקשורת לתא, נמצאים interstitium של רקמות הסלולר. בהקשר של סרטן, interstitial EVs עשוי להיות חשובה במיוחד להתכוונן microenvironment הגידול של תא סרטני זריעה, גידול גרורתי14,15. כתוצאה מכך, יש ערך לפיתוח, אופטימיזציה של טכניקות כדי לחלץ שלפוחית דגימות רקמה מוצק. שיטות אלה תספק אמצעי ללמוד ישירות איברים - או גידול נגזר EVs שנקטפו דגימות קליניים, כולל ביופסיות קטן כריתות איברים חלקיים או מלאים.

במחקר זה, בדו ח הקודם שפרסם שלנו מעבדה16, אנו שואפים כתובת מספר חששות הנוכחי העיקריים ב- EV העשרה מתודולוגיה: 1) כדי לתאר שיטה לשחזור כדי לבודד ולטהר EVs בסטנדרטים הגבוהים ביותר כיום מתקבלים בשדה; 2) כדי לנסות לבודד subpopulations EV קטן מאוד מועשר בנגזר endosomal exosomes; ו 3) כדי לספק פרוטוקול על החילוץ של שלפוחית אלה של דגימות רקמה מוצק לצורך אפיון נוסף.

לאחרונה, Kowal ועמיתיו תיאר הדרגתי צפיפות iodixanol בקנה מידה קטן יחסית כדי להפריד ולטהר subpopulations EV עם יעילות רבה יותר מאשר סוכרוז דומות צפיפות מעברי צבע17. במחקר מצוטט, דנדריטים, נגזר תא EVs בשבי שבריר צפיפות נמוכה יחסית, בקנה אחד עם צפיפות של 1.1 g/mL, היו מועשר מאוד בחלבונים endosomal האמין להיות הכי עקבי עם שיעור גבוה של exosomes נוכח בזה שבר. על פי המחברים, חלבונים אלה exosomal "בתום לב" כללה גידול הרגישות ג'ין 101 (TSG101), syntenin-1, CD81, ADAM10, EHD4 ו- חלבונים annexin מספר17. אחר כך התאמנו בטכניקה זו כדי להצליח בשיטה של דיסוציאציה רקמות מתוארת על ידי פרז גונזאלס ואח18 ו פרוטוקול עוקבות צנטריפוגה דיפרנציאלית לבודד כל הנגזרות המוח EVs16. אנחנו גם הפגינו השירות של שיטה זו של אפיון EV proteomes על-ידי שילוב פרוטוקול רציפים עבור במורד הזרם כמותיים ולמשפט השוואתי ספקטרומטר מסה של חלבון vesicular, שתואר קודם לכן על ידי המעבדה שלנו19. עבודה זו הוקרב זה מהמעבדה היל, שבו היו EVs מועשר מאזור הקליפה הקדמית של המוח20.

במחקר זה, אנו להרחיב על טכניקה זו, להרחיב את היישום של פרוטוקול שפורסם לאחרונה מן המעבדה שלנו את בידודה של EVs של גידולים מוצקים ריאות. לידע שלנו, זהו המחקר הראשון לתאר את פרוטוקול להעשיר EVs מ ex דגימות הגידול vivo. בהתחשב להתעניינות של EVs כמו הרומן אבחון סמנים ביולוגיים ותפקידם tumorigenesis, שיטה זו צפויה להוכיח ערך מספר גדל והולך של חוקרי מדעי. מבחינה קלינית, interstitial EVs יכול הנמל ערך אבחוני רב, בפרט דגימות איפה הערכה היסטולוגית היא מוגבלת. תקוותנו היא כי השיטה שמפורטות כאן תספק בסיס שיטה לשחזור לקצור EVs מטרי או קפוא בעלי חיים או אדם ניתוח דגימות, לסלול את הדרך לעבודה עתידית לחשוף התפקידים משמעותית בפתוגנזה של המחלה אלה קטן שלפוחית עשוי לשחק.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל המוח התקבלו עם אישור של שימוש חיה מוסדיים ו טיפול הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת מדינת פלורידה. סכום כולל של 12 מוח העכבר (3 המוח של כל קבוצת גיל: 2, 4, 6, ו- 8 חודשים) מ- C57BL/6 J שימשו רקע עבור EV החילוץ, כפי שתואר לעיל16. ריאות הגידול דגימות נתרמו בנדיבות על ידי ד ר Mandip Sachdeva תחת אישור של פלורידה לחקלאות, IACUC אוניברסיטת מכני. גידולים ריאות נשאבו מתוך שורת תא אדנוקרצינומה האנושי H1975 גדלו ב עכברים עירום nu/nu Balb/c immunodeficient. נתוני הגידול נציג שתי משכפל מודגשים במחקר זה.

הערה: סקירה סכמטי של שיטת טיהור וניקוי בידוד שלפוחית מסופק באיור1.

1. רקמות דיסוציאציה, צנטריפוגה דיפרנציאלית

  1. הכינו 10 מיליליטר דיסוציאציה מאגר (10 מ"ג פפאין; 5.5 מ מ L-ציסטאין; 67 מיקרומטר מרקפטואתנול 1.1 מ מ EDTA) שינה-E בינוני לכל כ 0.4-1.0 g של רקמות. שים לב כי כל הפתרונות המשמש EV העשרה של טיהור צריך להיות מדולל במים מסוננים הנדסה גנטית.
  2. להוסיף רקמה שלם טרי או קפוא דיסוציאציה מאגר צינור חרוטי 50 מ ל, וכן דגירה במים חמים אמבט ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות רקמות יכול להיות לחתוך לחלקים קטנים לפני הדגירה במידת הצורך.
  3. בעקבות הדגירה, מוסיפים מעכבי פרוטאז, פוספטאז עבור ריכוז סופי 1 x למאגר דיסוציאציה המכיל את הרקמה.
  4. יוצקים את הפתרון המכיל את הרקמה לתוך מהמגן דאונס התאמה רופף, בעדינות מביצועם הרקמה באמצעות כ 30 קווים איטיים לדגימה. מספר קווים עשוי להיות מותאם בהתבסס על רקמות עקביות.
  5. העברת הפומבית רקמות במאגר צינור חרוטי 50 מ ל ו צנטריפוגה ב 500 x g למשך 5 דקות ב 4 ° C כדי הצניפה את התאים ואת והשריד רקמה סיבית או מלוכדת.
  6. להעביר את תגובת שיקוע צינור חרוטי נקי 50 מ ל ו צנטריפוגה ב 2,000 x g 10 דקות ב 4 ° C כדי הצניפה ולהשליך פסולת הסלולר גדול.
  7. להעביר את תגובת שיקוע שוב צינור חרוטי נקי 50 מ ל ו צנטריפוגה ב 10,000 x g למשך 40 דקות ב- 4 ° C עד הצניפה שלפוחית גדול רצויה או גופים מוות קטן.
    הערה: גלולה זו יכולים להיגאל עבור לימוד נוספים של שלפוחית גדול יותר במידת הצורך.
  8. Decant את תגובת שיקוע דרך מסנן מיקרומטר 0.45 לתוך צינור ultracentrifugation מ ל 12 נקי.
    הערה: ייתכן דגימות רקמה בצפיפות שהותירה תור הודעות ' לא לסנן בקלות. הדוגמיות הללו ניתן לסנן דרך מסננת תא 40 µm ולאחר מכן עבר מחטים קטנות באופן סדרתי (18 גרם, 20 גרם, 22 גרם) לפני סינון דרך המסנן 0.45 מיקרומטר.
  9. Ultracentrifuge הדגימה ב x 100,000 g עבור 2 h-4 ° C עד הצניפה EVs קטן.
  10. Decant את תגובת שיקוע ולהשאיר את צינורות ultracentrifugation הפוכה למשך 5-10 דקות, הקשה לעיתים קרובות כדי להסיר שאריות נוזל בצדדים של צינורות. נוזל שיורית יכול גם להיות aspirated באמצעות פיפטה של ואקום שואבת.
  11. מחדש להשעות EV גלולה ב- 1.5 מ של 0.25 M סוכרוז מאגר (10 מ מ טריס, pH 7.4). חשוב להבטיח re-שיכוך מלא של בגדר בשלב זה. כדי לעשות זאת, לכסות את הצינורות עם מצלמות-מיקרוסקופים לפני vortexing EVs לתוך פתרון. רוק הצינורות ultracentrifuge למשך 15-20 דקות בטמפרטורת החדר לפני שילוב מערבולת הסופי.
  12. בקצרה centrifuge הצינורות-מהירות לא יותר מ- 1,000 x g לשחזר ההשעיה נוזלים בתחתית הצינורית.
  13. להמשיך בשלבים הדרגתיים טיהור שלהלן, או אם יש צורך, לאחסן EV ההשעיה ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

2. צפיפות הדרגתיות טיהור

  1. להוסיף 1.5 מ של 60% iodixanol (מניות פתרון במים) למאגר סוכרוז/טריס 1.5 mL המכיל EVs כדי ליצור פתרון הסופי המכיל 30% iodixanol. פיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לערבב פתרון ביסודיות. להיות זהיר כדי להימנע מאובדן פתרון בקצה פיפטה, כמו גם ריכוז גבוה iodixanol צמיגה למדי.
  2. העברת 30% iodixanol בופר המכילה EVs לחלק התחתון של צינור ultracentrifugation 5.5 mL.
  3. להכין לפחות 1.5 מ"ל של פתרונות iodixanol 20% ו-10% עבור דגימה במים הנדסה גנטית מהפתרון 60% iodixanol מניות.
  4. מודדים מ 1.3 ל 20% iodixanol ובזהירות שכבה על גבי השכבה התחתונה מעבר צבע באמצעות מזרק עם מחט 18 גרם. כדי למנוע ערבוב השכבות-הממשק צפיפות, לשמור על השיקוע של המחט בקשר עם החלק הפנימי של הצינור ultracentrifugation מעל מניסקוס ולהוסיף את הפתרון dropwise.
  5. שכבת 1.2 מ של 10% iodixanol פתרון מעל השכבה iodixanol 20% תוך שימוש באותה השיטה כאמור לעיל.
  6. בזהירות לאזן ולטעון הצינורות ultracentrifugation לתוך הרוטור דליים, צנטריפוגה ברוטור סווינג-דלי ב 268,000 x g למשך 50 דקות ב 4 º C. הגדר את מהירות האצה והאטה לצנטריפוגה תעריפי המינימום המותר כדי למנוע הפרעה של השכבות צפיפות.
  7. תווית עשרה צינורות microcentrifuge 1.5 mL עבור כל דגימה שיתאימו שברים 1 עד 10 של המילוי ההדרגתי צפיפות. שבר 1 מיועדת כמו השבר העליון שיוסרו קודם, בעוד שבר 10 הוא השבר התחתון האחרון הוסר.
  8. לאחר השלמת ultracentrifugation הדרגתיות, בעדינות להסיר את הצינורות הדליים הרוטור, מקום בעל יציבה. לעיתים קרובות ניתן לראות להקה לעין של שלפוחית השבר של עניין. פיפטה 10 טורי שברים של µL 490 מהחלק העליון של מעבר הצבע לתוך הצינורות המתאימים. יהיה כמות קטנה של הנוזלים שנותרו בחלק התחתון של הצינור סביר מכיל חלבונים משחיתה. דוגמה זו שניתן שנמחקו או שייעשה בו שימוש בתור שבר 11 במידת הצורך.
  9. למדוד את מדדי השבירה של שברים בעזרת של משאבות-מעבדות. זה יכול להתבצע גם במילוי הדרגתי שליטה לפעול במקביל אם לדוגמה שימור נחוצה. Pipette µL 20-30 של כל שבר המכיל iodixanol על גבי המשטח משאבות-מעבדות ולאחר הערכת הצפיפות על-ידי השוואת את מדדי השבירה כדי iodixanol ידוע צפיפות. שימו לב כי שברים יכול להיות מאוחסן בן לילה הפתרון המכילות iodixanol במידת הצורך לפני שתמשיך לצעד רחיצת ultracentrifugation הבא.
  10. העברת כל שבר צינור ultracentrifugation מ ל 12 נקי. הוסף 5 מ של 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS; 137 מ מ NaCl, מ מ 2.7 אשלגן כלורי, 10 מ מ נה2HPO4, 2 מ מ ח'2PO4, pH 7.4) שפופרת ואת תערובת מאת pipetting לאט לאט למעלה ולמטה.
    הערה: PBS נוספו הדגימות צריך להיות ללא חלקיקים, מובטחת באמצעות סינון סטרילי PBS דרך מסנן מיקרומטר 0.22 ואחסון בטמפרטורת החדר, כדי להימנע משקעים מלח.
  11. להוסיף אוטם 6 נוספים ל- 1 x PBS אל הפסגה ולערבב שוב בזהירות.
  12. Ultracentrifuge הצינורות ב x 100,000 g עבור 2 h-4 ° C עד מחדש הצניפה שלפוחית קטנה. Decant את תגובת שיקוע והקש על הצינורות יבש לפני פירוק של שלפוחית לניתוח חלבון (שלב 3) או re-השעיה של EVs לניתוח מורפולוגיות (שלב 5).

3. פירוק ואישור Immunoblot של חלבונים EV

הערה: אם שימור שלפוחית כל אפיון מורפולוגיות או פעילות ביולוגית רצוי, חוקרים יכולים להמשיך ישירות בשלב 5. בניסויים הראשונית, או לפני ניתוח ספקטרומטר מסה, שברים כל התאושש צריך להיות מנותח על ידי immunoblot כדי לאשר שברים עם חלבונים EV.

  1. כדי lyse EVs לניתוח חלבון, להוסיף µL 40 פירוק חזקה מאגר (5% מרחביות, 10 מ מ EDTA, pH טריס-HCl 120 מ מ 6.8, 2.5% מרקפטואתנול, אוריאה מ' 8) עם התוספת של מעכבי פרוטאז EV צניפה בצינור ultracentrifuge.
    הערה: אם תנאים שאינם בהפחתת הם הרצויה לגילוי נוגדנים של חלבונים, להחליף את המים הנדסה גנטית מרקפטואתנול במאגר של פירוק חזק.
  2. להבטיח מלאה re-השעיית צניפה והמסה של EVs במאגר על-ידי הצבת מצלמות-מיקרוסקופים על ultracentrifugation הצינור, vortexing נמרצות, ואז נדנדה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר לפני מערבולת הסופי.
  3. בקצרה צנטריפוגה ב x 1000 גרם במשך 30-60 s כדי לשחזר את אמצעי האחסון המדגם כולו. להעביר את הדגימה צינור microcentrifuge 1.5 mL החדש, חנות ב-20 ° C ל-80 מעלות צלזיוס עד עיבוד נוסף.
  4. כדי להתכונן מטוהרים lysates ניתוח immunoblot, להוסיף מאגר מדגם x Laemmli (10% מרחביות, 250 מ מ pH טריס 6.8, 1 מ"ג/מ"ל bromophenol כחול, 0.5 M DTT, גליצרול 50%, 5% מרקפטואתנול) 5 הדגימות עבור ריכוז סופי של 1 x.
    הערה: אם התנאים שאינם בהפחתת הם הרצויה, להחליף את DTT מרקפטואתנול במים הנדסה גנטית.
  5. אם homogenate רקמות כל הפקדים הם הרצויה, lyse הרקמה ב שתנן המכילות חזקה פירוק מאגר שתוארו לעיל עם מעכב פרוטאז, ואז צנטריפוגה ב x 10,000 ג'י 10 דקות למחוק את הנותרים מטריצה חוץ-תאית, תאים שלמים, או פסולת הסלולר ללא פגע. להוסיף 5 מאגר מדגם x Laemmli homogenate רקמות על ריכוז סופי של 1 x.
  6. מרתיחים את המאגר מדגם המכיל דוגמאות homogenate EV או רקמות ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות ולאחר מכן טען נפח שווה (מן המקבילה של 0.1-0.3 גרם להקים הרקמה בחומר; 1-2 µg של חלבון מטוהרים EV) שברים 1-10 לתוך ג'ל מרחביות-דף 10%. לטעון שווה מסה של רקמה homogenate. ייתכן שיהיה צורך נפח גדול של דוגמאות לזיהוי באמצעות נוגדנים פחות רגישים.
  7. להמשיך עם אלקטרופורזה בג'ל וניתוח תספיג כמו בעבר מפורט21 לאשר EV חלבונים ב- lysates מטוהרים ולהשוות בין השפע היחסי EV בחלקים.
    הערה: ברגע EV חלבון הוכח reproducibly בחלקים עקבית, לשטוף את ultracentrifugation הסופית המתוארים שלב 2.12 עשוי להיות מוגבל שברים הדרגתי של עניין.

4. EV חלבון כמת

  1. שימוש assay מבוססי פלורסצנטיות דטרגנט, אוריאה-תואם אם רגיש כימות של חלבונים EV רצוי לצורך ניתוח נוסף (ראה טבלה של חומרים). שים לב כמה מבחני מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית תואם עם הכחול bromophenol קיים במאגר מדגם Laemmli, הקלה על פירוק ישירה של בגדר EV (ב- 2.12 שלב) במאגר הזה אם מועדף.
  2. אם ערכת כימות חלבון מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית הנ ל משמש, ספוט 1 µL של הדגימה או סטנדרטי לפחות לשכפל על נייר הסינון שסופקו ולהמשיך כימות חלבון על פי הוראות היצרן.

5. אפיון של מורפולוגיה EV

  1. כדי לבחון כל שלפוחית לאחר צנטריפוגה סופית לרחוץ ב- 2.12 צעד, ביסודיות מחדש להשעות EV גלולה ב- PBS חינם חלקיק 1 x. חנות EVs ב 4 ° C לא יותר שבוע עד עיבוד כדי להימנע מחזורים ההקפאה-הפשרה.
    הערה: . זה מועיל בעבר אישרו שברים בעקביות המכילה חלבון EV מועשר על-ידי ניתוח immunoblot להגבלת המורפולוגיים כדי שברים של עניין.
  2. לבצע מעקב ניתוח על כל דגימות EV כדי לקבוע את ריכוז והגודל של שלפוחית בהכנות, כמו בעבר מפורט22ננו-חלקיק.
  3. לאפיין EV מורפולוגיה ואשר מדידות גודל על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים של שלפוחית, אם רצונך בכך. EM רשתות ניתן להכין המתלים שלפוחית בעקבות צעד 5.123, או לחילופין יכול להיות מעובד כמו ההכנות בלוק24 של כדורי בעקבות צעד 2.12.

6. בג'ל לטיהור ועיכול טריפסין לניתוח ספקטרומטר מסה

  1. אם איפיון proteomes EV באמצעות ספקטרומטר מסה היא הרצויה, טען שווה מסה (לפחות 10 µg של חלבון) של שברים המכיל EVs לתוך ג'ל לזיהוי טרומי כדי להפריד ולטהר חלבונים. ג'לים טרומי היצרן שסופקו המועדפות כדי להפחית את הרמות של פוטנציאל לזיהום חלבונים (למשל, קרטין) להיות מוחדרים הדגימות.
  2. תריץ את דגימת לפחות 0.5 אינצי'ם לתוך הג'ל לזיהוי לטיהור חלבון, ולאחר מכן לתקן, כתם עם צבע Coomassie, כאמור תיאר בפירוט25.
  3. חותכים המסלול. ודוחפים 1 מ3 קוביות לעיכול טריפסין, כמו בעבר מפורט19,26.
  4. טען µL 5 פפטיד מתעכל מדגם LC-MS/MS מכשיר להפרדה על עמודה אנליטית, לאחר מכן ניתוח באמצעות ספקטרומטר מסה בהתאם לפרמטרים שצוינו בפרט16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מבט סכמטי של רקמות דיסוציאציה, צנטריפוגה דיפרנציאלית, טיהור הדרגתי של שלפוחית מוצג באיור1. אישור מורפולוגיות ו immunophenotypic של EVs מטוהרים הדרגתי מודגשת באיור2. דיאגרמה של צפיפויות לשחזור בעקבות ultracentrifugation של המילוי ההדרגתי iodixanol 10-30% מוצג, עם שתי האוכלוסיות שלפוחית נפרדים לפלטפורמת כלפי מעלה שבר 2 (אור EVs) ושבר 5 (EVs צפופה), תלוי בסוג הרקמה. נציג immunoblots שברים הדרגתיות להפגין את ההפרדה יעילה וטיהור של EVs נגזר הגידול קטן בחלק 5. ראוי לציין, ריאות הגידול דגימות הופיע מועשר ב- EVs צפוף לעומת האור EVs (ב שבר 2) בעבר שנקטפו רקמת המוח כולו, שוב מודגש כאן. כמו בדיקת רקמות הכללית של EVs להגיח, יהיה מעניין לקבוע את צפיפויות שונות של EVs המיוצר על ידי רקמות ייחודי. ננו-חלקיק נציג מעקב ניתוח ואלקטרון מיקרוסקופי של רקמות-derived שלפוחית ב השבר שלפוחית המכילה השולט להדגים את העשרה ואת שימור עקבי עם גודל ידוע כל שלפוחית והמבנה של EVs קטן. לבסוף, איור 3 מדגיש את התועלת של שיטה זו בקידום ספקטרומטר מסה במורד הזרם אפיון מטוהר הדרגתי שלפוחית חלבונים, הדגמת זיהוי חלבונים רבים זוהו בעבר EVs קטן. רבים של חלבונים אלה שזוהו הם עקביים עם אלה מועשר ב- EVs קטן נגזר endosomal, שהציע בעבר Théry והיל מעבדות17,20.

Figure 1
איור 1 : סקירה סכמטי של שלפוחית בידוד וטיהור מרקמות כל. בעקבות רקמות דיסוציאציה, ניקוי קדם צנטריפוגה דיפרנציאלית צעדים, סינון, ultracentrifugation, גולמי EV כדורי יכול להיות resuspended על החלק התחתון של מעבר צבע צפיפות iodixanol להפרדה ציפה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : נציג מורפולוגיות immunophenotypic וניתוח של EVs נגזר רקמות. (א) מחושבת צפיפות של ultracentrifugation הבאים מעבר צבע iodixanol, בממוצע ניסויים עצמאית, הדגשת שברים המכיל EVs אור וצפוף. (B) immunoblots נציג של רקמות-derived שלפוחית הממחיש את הבידוד של גידול צפוף יוכפל לאחר המרתו EVs ואור המוח EVs. שלפוחית מבודד דלה של חלבונים שאינם EV calnexin. H, רקמות homogenate. ננו-חלקיק (C) מעקב ניתוח (נ) של EVs רקמות מטוהרים הדרגתי נציג. החלקיק שזוהו הקטן ביותר במדגם זה היה 78 ננומטר ולאחר כ- 92% של שלפוחית זוהה היו 250 ננומטר או קטנים יותר, עקבית העשרת גבוהה של EVs קטן. (ד) תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים נציג של EVs נגזר רקמת המוח. גודל ברים = 200 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : סיכום של חלבונים שלפוחית המסומן שזיהה ספקטרומטר מסה של נציג רקמות-derived EV מדגם. בעקבות הפקת EV טיהור הדרגתיות, 10 µg EV החלבון בשבר מועשר היה נטען לזיהוי ג'ל אלקטרופורזה, בג'ל טריפסין לעיכול. זה נגזר רקמות EV במדגם מייצג, סך של חלבונים 918 אותרו על ידי ניתוח LC-MS/MS. פפטידים היו מזוהה, מנותח, ומצא כדי להיות מועשר exosomal, lysosomal, ואת קרום פלזמה חלבונים כמו שתואר לעיל16. כאן, נדגים את קיומו של EV קטן או חלבונים exosomal שלנו ההכנות שתוארו על-ידי Théry והיל מעבדות17,20. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

עניין מדעי הרבה נוצרה לגבי התפקידים ש-evs קטן לשחק את microenvironment הגידול, וכן התפתחות האיברים, התבגרות, ופועלים. באופן כללי, מחקר זה מספק זרימת עבודה מיטביים עבור החילוץ של EVs שלם כל המוח או דגימות הגידול. ואילו כאן פשוט נדגים את הישימות של טכניקה זו EVs ריאות נגזר הגידול, שיטה זו יכול בקלות להיות מותאם לעבודה על רקמות אחרות מוצק, מתן הזדמנויות נוספות לשעבר vivo אפיון של שלפוחית המופרש קטנות הנמצאות עניין הביו-רפואית רחבה. בזמן מעבר להיקף של מחקר זה, השוואה העתידי של EV תוכן לזה של שמקורם ברקמות ביטוי גם יהיה חשוב להקים את התועלת של שלפוחית מבודדים כמו סמנים ביולוגיים רקמות ומחלות.

במחקר שפורסם בעבר על ידי המעבדה שלנו, נדגים בצורה ברורה את היתרונות של מעבר הצבע צפיפות מבוססי ציפה על מעברי צבע שקיעת לטיהור של שלפוחית קטנה מועשר. בעיקרו של דבר, פרידה מבוססי ציפה משפר טיהור של שלפוחית על ידי הימנעות מזהם העברה דרך השברים של ריבית. עיקרון זה מופיע חשוב במיוחד כאשר החל מדוגמאות מורכבות כמו כל רקמה. ללא קשר, יש להדגיש את חשיבות המחקרים אישור מראש אנליטית של שלפוחית מבודד המתוארת, לרבות בחינת המורפולוגיה EV באמצעות טכניקות משלימים כגון מיקרוסקופ אלקטרוני ו ננו-חלקיק מעקב ניתוח, גם כמו ניתוחים הביוכימי כולל immunoblotting. EV חלבונים בחלקים מועשר צריך להיות מאושרות לפחות שלושה סמנים EV המוכרים, כולל חלבון tetraspanin אחד, כפי שהומלץ בדו ח מידע מינימלי עבור מחקרים של EVs (MISEV) לאור כתב העת של חוץ-תאית שלפוחית27. סמן EV שלילי צריך ניתן להדגים להיעדר או מופחתת מאוד בחלקים EV לעומת רקמות homogenates. כל הצעדים שצוין לעיל הינן קריטיות לצורך אבטחת איכות טיהור שלפוחית קטנה. בנוסף, הדגמה מוקדמת של עקביות ספציפיים מעבדה או משתמש בחלקים צפיפות המכילות EV באפשרותך לחסוך זמן יקר ועלות המשויך עיבוד וניתוח כל שברים בעקבות הצעד ultracentrifugation הדרגתיות צפיפות.

ברור כי שלפוחית מ ברקמות שונות עשויים לצוף אל שברים צפיפות שונה במקצת, או אולי להפריד יוכפל לאחר המרתו אור או subpopulations צפופה. הבדלים אלה בעבר נצפו כל הנגזרות המוח EVs בהשוואה EVs שנקטפו תאים דנדריטים גדלו ב תרבות16,17ולאחר מודגמות נוסף במחקר זה. אנו מראים כי דגימות סרטן ריאות יכול הנמל יוכפל לאחר המרתו שצפופה EVs קטן בהשוואה EVs בהיר יותר מבודד רקמת המוח. הבדלים אלה מודגשת על ידי השיטה המוצעת במחקר זה עשוי לקדם ערך חקירות ההרכב דיפרנציאלית של EVs, כולל EVs גידול זה ניתן לארוז עם צפיפות גבוהה DNA גדילי28,29,30. בגלל הבדלים אלה בהרכב EV, אנחנו חריפה קו תחתון את החשיבות של הניסויים הטכניים הראשונית. יישומים עתידיים של טכניקה זו את בידודה של EVs מן הגידול המגוונים דגימות יהיה חשוב לקבוע אם EVs צפופה יוכפל לאחר המרתו בבית את interstitium של סוגי גידולים אחרים גם כן.

בזמן הטיהור המלא של EVs קטן ובידוד של שלפוחית ברורים subpopulations נשאר מגבלה הנוכחי לאורך מעבדות, שיטה זו מספקת בסיס ללימודי לאפיין שלפוחית קטנה מתוך מגוון של רקמות או גידול סוגי, ולכן עשוי להקל על הבנה טובה יותר של גיוון EV. ההפרדה האחרונה של EV חלקיקים על ידי זרימה אסימטרי שדה זרימה fractionation יש האיר את האפשרות של מטענים ברורים ופונקציות של קטן (60-80 ננומטר) לעומת exosomes (90-120 ננומטר) גדול יותר, עוד יותר מזוהה תת-קבוצה של הלא-הממברנה מאוגד < 50 ננומטר חלקיקים מהתנודות כמו31,"exomeres"32. עם זאת, מטענים ארוז בתוך אוכלוסיות אלה שלפוחית ייחודי מגוונות על פני שורות תאים, המדגיש את הטרוגניות משמעותי של שלפוחית מופרשים ולסיוע את החשיבות של הפריה או לשעבר vivo שלפוחית ניתוח מקיף. במחקר זה, אנחנו קרוב לוודאי להעשיר עבור שתי מחלקות של exosomes מזוהה. שיעור של שלפוחיות זעירות קטנות עם צפיפות דומה כדי exosomes עשוי להיות נוכח מבודד גם כן. למרות נוכל לפסול את האפשרות של exomeres ב שלנו מבודד, מאוגד-קרום שלפוחית היו בהחלט הנפוץ בחלקים הדרגתיות מועשר בחלבון שלפוחית. בנוסף EVs קטן, oncosomes גדול (> 1,000 ננומטר) היה עניין אחרונים סרטן ביולוגים33. בעוד הפרוטוקול המתוארים במחקר זה מסנן שלפוחית גדול מ- 450 nm, אי-הכללה של שלב זה עשויה להקל בחינה של EVs גדולים אלה המתוארים. בעתיד בחינת צפיפויות המשויך subpopulations שלפוחית שונים יהיה חשוב להבחין בין ישויות אלה בנוסף הגדלים המתוארים שלהם.

בסופו של דבר, אבל אנחנו מעריכים את מגבלות כולל עלות ושעה המשויכים טכניקה זו המוצעת, אנו גם להכיר את הצורך בשיטות למעין קפדני כדי לאפיין את רקמת EVs וכדי לשמש השוואה המוצר הסופי עבור כל הזמן מתפתחת יותר מתוחכם ושיטות בעתיד. אלה לקידום טכנולוגיות בתקווה דולקת יותר מהירה קלינית תואמי וטכניקות לחלץ EVs דגימות רפואית או כירורגית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחברים תודה ד ר ריצ'רד Nowakowski פלורידה המדינה אוניברסיטת מעבדה חיה המשאבים עבור מתן ודאגה לבעלי החיים השתמשו לפתח פרוטוקול זה, עם כל הכבוד. אנו מודים שיה ליו ר ראקש סינג, פלורידה המדינה אוניברסיטת Translational מדעי המעבדה לקבלת סיוע עם העבודה ספקטרומטר מסה המשמש אפיון שלפוחית במורד הזרם, וכן במתקן חמ ע מדע ביולוגי הדמיה משאבים עבור השימוש של המיקרוסקופ האלקטרוני שידור במחקר זה. לבסוף, אנו מודים ד ר Mandip Sachdeva (פלורידה A & M באוניברסיטת) על תרומה של דגימות הגידול בשימוש בפיתוח של שיטה זו. מחקר זה נתמך על ידי מענקים משרד הבריאות של פלורידה אד אתל מור אלצהיימר המחלה מחקר תוכנית הוענק D.G.M., J.M.O (6AZ11), המכון הלאומי לסרטן של מכוני הבריאות הלאומיים תחת מספר פרס R01CA204621 הוענק D.G.M.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 µm filter VWR 28145-505
12 mL ultracentrifuge tubes Beckman Coulter 331372
5.5 mL ultracentrifuge tubes Beckman Coulter 344057
anti-Alix antibody Santa Cruz sc-7129
anti-Calnexin antibody Santa Cruz sc-11397
anti-CD63 antibody Abcam ab59479
anti-CD81 antibody Santa Cruz sc-9158
anti-Flotillin 2 antibody Santa Cruz sc-25507
anti-HSC70 antibody Santa Cruz sc-7298
anti-Syntenin-1 antibody Santa Cruz sc-100336
anti-TSG101 antibody Santa Cruz sc-7964
EZQ protein quantification kit ThermoFisher Scientific R33200
FA-45-6-30 rotor  Eppendorf 5820715006
FEI CM120 Electron Microscope TSS Microscopy
goat anti-rabbit IgG (Fab fragment) Genetex 27171
HALT phosphatase inhibitor (100x solution) ThermoFisher Scientific 78420
HALT protease inhibitor (100x solution) ThermoFisher Scientific 78438
Hibernate E medium ThermoFisher Scientific A1247601
MLS-50 swinging-bucket rotor Beckman Coulter 367280
NanoSight LM10 Malvern
Optima MAX-XP Benchtop Ultracentrifuge  Beckman Coulter 393315
Optima XE-100 ultracentrifuge Beckman Coulter A94516
Optiprep Sigma D1556 60% iodixanol in sterile water solution
Q Exactive HF Mass Spectrometer ThermoFisher Scientific
rabbit anti-goat IgG Genetex 26741
rabbit anti-mouse IgG Genetex 26728
Refracto 30PX (refractometer) Mettler Toledo 51324650
S-4-104 rotor Eppendorf 5820759003
SW 41 Ti swinging-bucket Rotor Beckman Coulter 333790
Tabletop 5804R centrifuge Eppendorf 22623508

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bobrie, A., Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Exosome secretion: molecular mechanisms and roles in immune responses. Traffic. 12 (12), 1659-1668 (2011).
  2. Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
  3. Howitt, J., Hill, A. F. Exosomes in the Pathology of Neurodegenerative Diseases. Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26589-26597 (2016).
  4. Sardar Sinha, M., et al. Alzheimer's disease pathology propagation by exosomes containing toxic amyloid-beta oligomers. Acta Neuropathologica. 136 (1), 41-56 (2018).
  5. Meckes, D. G., Raab-Traub, N. Microvesicles and viral infection. Journal of Virology. 85 (24), 12844-12854 (2011).
  6. Meckes, D. G. Exosomal communication goes viral. Journal of Virology. 89 (10), 5200-5203 (2015).
  7. Schorey, J. S., Cheng, Y., Singh, P. P., Smith, V. L. Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions. EMBO Reports. 16 (1), 24-43 (2015).
  8. Zhang, X., et al. Exosomes in cancer: small particle, big player. Journal of Hematology Oncology. 8, 83 (2015).
  9. Janas, A. M., Sapoń, K., Janas, T., Stowell, M. H. Exosomes and other extracellular vesicles in neural cells and neurodegenerative diseases. Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (6), 1139-1151 (2016).
  10. Chahar, H. S., Bao, X., Casola, A. Exosomes and Their Role in the Life Cycle and Pathogenesis of RNA Viruses. Viruses. 7 (6), 3204-3225 (2015).
  11. Pegtel, D. M., Peferoen, L., Amor, S. Extracellular vesicles as modulators of cell-to-cell communication in the healthy and diseased brain. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1652), (2014).
  12. Raposo, G., et al. B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles. Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).
  13. Katsiougiannis, S. Extracellular Vesicles: Evolving Contributors in Autoimmunity. Forum on immunopathological diseases and therapeutics. 6 (3-4), 163-170 (2015).
  14. Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).
  15. Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
  16. Hurwitz, S. N., et al. An optimized method for enrichment of whole brain-derived extracellular vesicles reveals insight into neurodegenerative processes in a mouse model of Alzheimer's disease. Journal of Neuroscience Methods. 307, 210-220 (2018).
  17. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).
  18. Perez-Gonzalez, R., Gauthier, S. A., Kumar, A., Levy, E. The exosome secretory pathway transports amyloid precursor protein carboxyl-terminal fragments from the cell into the brain extracellular space. Journal of Biological Chemistry. 287 (51), 43108-43115 (2012).
  19. Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. An Adaptable Polyethylene Glycol-Based Workflow for Proteomic Analysis of Extracellular Vesicles. Methods in Molecular Biology. 1660, 303-317 (2017).
  20. Vella, L. J., et al. A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885 (2017).
  21. Hurwitz, S. N., et al. CD63 Regulates Epstein-Barr Virus LMP1 Exosomal Packaging, Enhancement of Vesicle Production, and Noncanonical NF-.κB Signaling. Journal of Virology. 91 (5), (2017).
  22. Hurwitz, S. N., Conlon, M. M., Rider, M. A., Brownstein, N. C., Meckes, D. G. Nanoparticle analysis sheds budding insights into genetic drivers of extracellular vesicle biogenesis. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 31295 (2016).
  23. Lässer, C., Eldh, M., Lötvall, J. Isolation and characterization of RNA-containing exosomes. Journal of Visualized Experiments. (59), e3037 (2012).
  24. Jung, M. K., Mun, J. Y. Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (131), (2018).
  25. Meckes, D. G. Affinity purification combined with mass spectrometry to identify herpes simplex virus protein-protein interactions. Methods in Molecular Biology. 1144, 209-222 (2014).
  26. Rider, M. A., Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. ExtraPEG: A Polyethylene Glycol-Based Method for Enrichment of Extracellular Vesicles. Scientific Reports. 6, 23978 (2016).
  27. Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
  28. Thakur, B. K., et al. Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection. Cell Research. 24 (6), 766-769 (2014).
  29. Balaj, L., et al. Tumour microvesicles contain retrotransposon elements and amplified oncogene sequences. Nature Communications. 2, 180 (2011).
  30. Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nature Cell Biology. 10 (12), 1470-1476 (2008).
  31. Zhang, H., et al. Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation. Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).
  32. Zijlstra, A., Di Vizio, D. Size matters in nanoscale communication. Nature Cell Biology. 20 (3), 228-230 (2018).
  33. Meehan, B., Rak, J., Di Vizio, D. Oncosomes - large and small: what are they, where they came from. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 33109 (2016).

Tags

לחקר הסרטן גיליון 144 exosomes שלפוחית חוץ-תאית רקמות המוח גידול ספקטרומטר מסה צפיפות הצבע ex-vivo oncosomes סמנים ביולוגיים
מיצוי של שלפוחית חוץ-תאית מרקמות כל
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hurwitz, S. N., Olcese, J. M.,More

Hurwitz, S. N., Olcese, J. M., Meckes Jr., D. G. Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue. J. Vis. Exp. (144), e59143, doi:10.3791/59143 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter