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Cancer Research

पूरे ऊतक से Extracellular बुलबुले के निष्कर्षण

Published: February 7, 2019 doi: 10.3791/59143
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biomedical Sciences, Florida State University College of Medicine

Summary

यहां, हम मस्तिष्क और ट्यूमर नमूनों सहित पूरे ऊतकों से छोटे extracellular बुलबुले (ईवीएस) को अलग करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । इस विधि को आगे बहाव के विश्लेषण के लिए ठोस ऊतक से ईवीएस निकालने के लिए एक reproducible तकनीक प्रदान करता है ।

Abstract

परिसंचारी और मध्य छोटी झिल्ली बंधे extracellular बुलबुले (ईवीएस) उपंयास नैदानिक या शकुन के विकास के लिए आशाजनक लक्ष्य परख का प्रतिनिधित्व करते हैं, और संभावना की एक विशाल स्पेक्ट्रम की प्रगति में महत्वपूर्ण खिलाड़ियों के रूप में सेवा रोगों. वर्तमान अनुसंधान के क्रम में बेहतर neurodegeneration, सूजन, और कैंसर सहित शर्तों के रोगजनन में ईवीएस की भूमिका को समझने के लिए कई कोशिका और ऊतक प्रकार से स्रावित बुलबुले के लक्षण वर्णन पर ध्यान केंद्रित किया है । हालांकि, वैश्विक रूप से सुसंगत और reproducible तकनीकों को अलग करने और बुलबुले शुद्ध प्रगति में रहते हैं । इसके अलावा, ईवीएस के ठोस ऊतक से पूर्व vivo निष्कर्षण के लिए तरीके शायद ही वर्णित हैं । यहाँ, हम पूरे ताजा या जमे हुए ऊतकों से ब्याज की छोटी ईवीएस निकालने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, मस्तिष्क और ट्यूमर नमूनों सहित, आगे लक्षण वर्णन के लिए. हम कई अनुप्रवाह विश्लेषण के लिए इस विधि के अनुकूलन क्षमता का प्रदर्शन, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और बुलबुले के immunophenotypic लक्षण वर्णन, साथ ही EV प्रोटीन के मात्रात्मक द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री सहित ।

Introduction

छोटे extracellular बुलबुले (ईवीएस) शामिल endosomal-व्युत्पंन exosomes और छोटी झिल्ली-शेड microvesicles कि व्यापक जैव चिकित्सा हित के हैं । छोटे ईवीएस के एक विषम जनसंख्या से बना रहे है 50-250 एनएम झिल्ली-जैविक रूप से सक्रिय प्रोटीन, लिपिड युक्त बुलबुले, और न्यूक्लिक एसिड है कि सामूहिक रूप से रोग प्रक्रियाओं के एक भीड़ में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए माना जाता है । अनुसंधान को आगे बढ़ाने विशेष रूप से neurodegenerative और prion विकारों, संक्रामक प्रक्रियाओं, स्व-प्रतिरक्षित या भड़काऊ स्थितियों में इन बुलबुले फंसाया है, और ट्यूमर के विकास और मेटास्टेसिस1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. तेजी से बढ़ते जैव चिकित्सा अनुसंधान रोग रोगजनन में ईवीएस के महत्व में reproducible और अलगाव और इन बुलबुले के शोधन के लिए कठोर तरीकों के विकास में समानांतर रुचि पैदा की है ।

ev लक्षण वर्णन में एक ऐतिहासिक और मौजूदा चुनौती के लिए पूरी तरह से अलग छोटे EV उपआबादी की अक्षमता रही है । इस चुनौती को काफी हद तक अलग अलग बुलबुले की उत्पत्ति को नियंत्रित आणविक तंत्र की हमारी सीमित समझ के कारण है । उपआबादी के बीच अतिव्यापी आकार, घनत्व, और जीवविज्ञान कार्गो आगे इन भेद convolutes । इस चुनौती का हिस्सा भी व्यापक रूप से अलग संवर्धन तकनीक का उपयोग किया गया है, प्रयोगशालाओं में पृथक बुलबुले के बहाव विश्लेषण में विसंगति प्रदान, और वैश्विक स्पष्ट EV आबादी प्रबुद्ध प्रयास को पार ।

यह ध्यान देने योग्य है कि EV लक्षण वर्णन के अधिकांश में सेल संस्कृति supernatant के इन विट्रो संग्रह से प्रदर्शन किया गया है, vivo में और अधिक हाल के साथ अध्ययन तकनीक का वर्णन करने के लिए पशु या मानव शरीर के तरल पदार्थ से बुलबुले अलग, प्लाज्मा सहित, मूत्र , और लार । जबकि ईवीएस परिसंचरण में बड़ी मात्रा में मौजूद हैं, यह भी मांयता प्राप्त है कि इन बुलबुले सेल में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए सेल संचार की घटनाओं और सेलुलर ऊतकों के interstitium में मौजूद हैं । कैंसर के संदर्भ में, मध्यवर्ती ईवीएस कैंसर सेल सीडिंग और मेटास्टेटिक विकास के लिए ट्यूमर microenvironment का नियमन करने में विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो सकता है14,15. नतीजतन, वहां विकास और तकनीकों के अनुकूलन के लिए ठोस ऊतक नमूनों से बुलबुले निकालने में मूल्य है । इन तरीकों को सीधे अंग का अध्ययन करने के लिए एक साधन प्रदान करेगा-या ट्यूमर-व्युत्पंन ईवीएस नैदानिक नमूनों से काटा, छोटे बायोप्सी और आंशिक या पूर्ण अंग लकीरें शामिल हैं ।

इस अध्ययन में, और हमारे16प्रयोगशाला द्वारा प्रकाशित एक पिछले रिपोर्ट में, हम EV संवर्धन पद्धति में कई प्रमुख वर्तमान चिंताओं का पता उद्देश्य: 1) के लिए एक reproducible तकनीक का वर्णन करने के लिए अलग और उच्चतम मानकों को ईवीएस शुद्ध वर्तमान में क्षेत्र में स्वीकार किए जाते हैं; 2) endosomal-व्युत्पंन exosomes में अत्यधिक समृद्ध छोटी EV उपआबादी को अलग करने का प्रयास करना; और 3) आगे लक्षण वर्णन के प्रयोजन के लिए ठोस ऊतक नमूनों से इन बुलबुले के निष्कर्षण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करने के लिए ।

हाल ही में, Kowal और सहकर्मियों ने एक अपेक्षाकृत छोटे पैमाने iodixanol घनत्व ढाल के लिए अलग और तुलनीय सुक्रोज घनत्व ढाल17से अधिक से अधिक प्रभावकारिता के साथ EV उपआबादी को शुद्ध बताया । उद्धृत अध्ययन में, वृक्ष सेल-व्युत्पंन ईवीएस एक अपेक्षाकृत प्रकाश घनत्व अंश में कब्जा कर लिया, १.१ ग्राम के घनत्व के अनुरूप/एमएल, अत्यधिक endosomal प्रोटीन में समृद्ध किया गया इस में मौजूद exosomes के एक उच्च अनुपात के साथ सबसे सुसंगत माना अंश. लेखकों के अनुसार, इन "बोना" exosomal प्रोटीन्स में ट्यूमर झेलते जीन १०१ (TSG101), syntenin-1, CD81, ADAM10, EHD4, और कई annexin प्रोटीन17शामिल थे । हम बाद में इस तकनीक को अनुकूलित करने के लिए ऊतक पृथक्करण की एक विधि को सफल पेरेस द्वारा वर्णित-गोंजालेज एट अल18 और एक बाद अंतर केंद्रापसारक प्रोटोकॉल पूरे मस्तिष्क को अलग-16ईवीएस व्युत्पंन । हम भी vesicular प्रोटीन के बहाव मात्रात्मक और तुलनात्मक जन स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए एक अनुक्रमिक प्रोटोकॉल के संयोजन से निस्र्पक EV proteomes में इस पद्धति की उपयोगिता का प्रदर्शन किया, पहले हमारी प्रयोगशाला द्वारा वर्णित19। यह काम समानांतर है कि पहाड़ी प्रयोगशाला से, जिसमें ईवीएस दिमाग के ललाट प्रांतस्था से समृद्ध थे20.

इस अध्ययन में, हम इस तकनीक पर विस्तृत और हाल ही में ठोस फेफड़े के ट्यूमर से ईवीएस के अलगाव के लिए हमारी प्रयोगशाला से प्रकाशित प्रोटोकॉल के आवेदन का विस्तार । हमारे ज्ञान के लिए, यह पहले एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए पूर्व vivo ट्यूमर नमूनों से ईवीएस को समृद्ध अध्ययन है । उपंयास नैदानिक ईवीएस और tumorigenesis में उनकी भूमिका के रूप में व्यापक ब्याज को देखते हुए, इस विधि की संभावना वैज्ञानिक शोधकर्ताओं की बढ़ती संख्या के लिए मूल्यवान साबित होगा । एक नैदानिक परिप्रेक्ष्य से, मध्यवर्ती ईवीएस महान नैदानिक मूल्य बंदरगाह सकता है, विशेष रूप से नमूनों में जहां histologic मूल्यांकन सीमित है । हमारी आशा है कि यहां उल्लिखित विधि के लिए एक reproducible तकनीक के लिए एक नींव प्रदान करेगा ईवीएस फसल को ताजा या जमे हुए जानवर या मानव शल्य चिकित्सा नमूनों से, भविष्य के काम के लिए रास्ता फ़र्श रोगजनन रोग में महत्वपूर्ण भूमिकाओं को उजागर इन छोटे बुलबुले खेल सकते हैं ।

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Protocol

पूरे दिमाग संस्थागत पशु उपयोग और देखभाल समिति (फ्लोरिडा राज्य विश्वविद्यालय के IACUC) से अनुमोदन के साथ प्राप्त किया गया । बारह माउस दिमाग की कुल (प्रत्येक आयु समूह से 3 दिमाग: 2, 4, 6, और 8 महीने) एक C57BL से/6 जंमू पृष्ठभूमि EV निष्कर्षण के लिए इस्तेमाल किया गया, के रूप में पहले16वर्णित है । फेफड़ों के ट्यूमर नमूनों उदारता फ्लोरिडा कृषि और यांत्रिक विश्वविद्यालय IACUC के अनुमोदन के तहत डॉ Mandip सचदेवा द्वारा दान किया गया । फेफड़े के ट्यूमर मानव ग्रंथिकर्कटता सेल लाइन immunodeficient बालब में उगाया H1975 से प्राप्त किया गया/सी nu/ इस अध्ययन में दो प्रतिनिधि ट्यूमर प्रतिकृति से डेटा हाइलाइट किए गए हैं ।

नोट: पुटिका अलगाव और शुद्धि विधि का एक योजनाबद्ध सिंहावलोकन चित्रा 1में प्रदान की जाती है ।

1. ऊतक पृथक्करण और विभेदक केंद्रापसारक

  1. पृथक्करण बफर के 10 मिलीलीटर तैयार (papain के 10 मिलीग्राम; ५.५ मिमी एल-cysteine; ६७ µ एम 2-mercaptoethanol; १.१ मिमी EDTA) में लगभग 0.4-1.0 ग्राम ऊतक के प्रति हाइबरनेट-E मध्यम । ध्यान दें कि सभी समाधान EV संवर्धन और शुद्धि के लिए इस्तेमाल किया ultrapure फ़िल्टर्ड पानी में पतला किया जाना चाहिए ।
  2. एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में पृथक्करण बफर करने के लिए पूरे ताजा या जमे हुए ऊतक जोड़ें, और 20 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म पानी के स्नान में गर्मी । यदि आवश्यक हो तो गर्मी से पहले ऊतक छोटे टुकड़ों में काटा जा सकता है ।
  3. मशीन के बाद, पृथक्करण बफर ऊतक युक्त करने के लिए एक अंतिम 1x एकाग्रता के लिए छेड़ने और फॉस्फेट अवरोधकों जोड़ें ।
  4. एक ढीला-फिट Dounce homogenizer में ऊतक युक्त समाधान डालो, और धीरे नमूने प्रति लगभग 30 धीमी स्ट्रोक का उपयोग कर ऊतक अलग कर देना । स्ट्रोक की संख्या ऊतक स्थिरता के आधार पर समायोजित किया जा सकता है ।
  5. एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब करने के लिए बफर में असंबद्ध ऊतक स्थानांतरण और 5 मिनट के लिए ५०० x g पर 4 डिग्री सेल्सियस के लिए कोशिकाओं और शेष रेशेदार या एकजुट ऊतक टुकड़े गोली ।
  6. एक साफ ५० एमएल शंकु ट्यूब के लिए supernatant स्थानांतरण और 10 मिनट के लिए २,००० x g पर 4 डिग्री सेल्सियस पर गोली और बड़े सेलुलर मलबे को त्यागने के लिए ।
  7. supernatant फिर से एक साफ करने के लिए स्थानांतरण ५० एमएल शंकु ट्यूब और ४० मिनट के लिए १०,००० x g पर 4 डिग्री सेल्सियस के लिए अवांछित बड़ा बुलबुले या छोटे अपोप्तोटिक निकायों गोली करने के लिए ।
    नोट: इस गोली बड़ा बुलबुले के अतिरिक्त अध्ययन के लिए बचाया जा सकता है अगर वांछित ।
  8. एक साफ 12 मिलीलीटर ultracentrifugation ट्यूब में एक ०.४५ µm फिल्टर के माध्यम से supernatant खिचड़ी भाषा ।
    नोट: घनी fibrotic ऊतक के नमूने आसानी से फ़िल्टर नहीं किए जा सकते. इन नमूनों को एक ४० µm सेल छलनी के माध्यम से फ़िल्टर किया जा सकता है, तो ०.४५ µm फिल्टर के माध्यम से छानने से पहले प्रश्नपत्र छोटे सुइयों (18 जी, 20 जी, 22 ग्राम) के माध्यम से पारित कर दिया ।
  9. Ultracentrifuge 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 ज के लिए १००,००० x g पर नमूना छोटे ईवीएस गोली करने के लिए ।
  10. supernatant और ultracentrifugation ट्यूबों 5-10 मिनट के लिए औंधा छोड़, अक्सर दोहन ट्यूबों के पक्षों पर अवशिष्ट तरल हटाने के लिए । अवशिष्ट द्रव भी एक aspirating वैक्यूम पिपेट का उपयोग कर aspirated जा सकता है ।
  11. फिर से ०.२५ एम सुक्रोज बफर (10 मिमी Tris, पीएच ७.४) के १.५ मिलीलीटर में EV गोली सस्पेंड । यह इस कदम में पूर्ण पुनः गोली का निलंबन सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है । ऐसा करने के लिए, समाधान में ईवीएस भंवर से पहले parafilm के साथ ट्यूबों को कवर । एक अंतिम भंवर मिश्रण से पहले कमरे के तापमान पर 15-20 मिनट के लिए ultracentrifuge ट्यूबों रॉक ।
  12. संक्षेप में ट्यूबों एक गति से अधिक नहीं १,००० एक्स जी के लिए ट्यूब के तल पर तरल निलंबन ठीक हो ।
  13. नीचे ग्रेडिएंट शुद्धिकरण चरणों में आगे बढ़ें या यदि आवश्यक हो, तो रात भर 4 डिग्री पर EV सस्पेंशन को स्टोर करें ।

2. घनत्व ढाल शुद्धि

  1. 30% iodixanol युक्त अंतिम समाधान बनाने के लिए १.५ मिलीलीटर सुक्रोज/Tris बफर को ईवीएस युक्त ६०% iodixanol (पानी में स्टॉक सॉल्यूशन) की १.५ मिलीलीटर जोड़ें । पिपेट ऊपर और नीचे कई बार मिश्रण करने के लिए अच्छी तरह से हल । पिपेट टिप में समाधान खोने से बचने के लिए सतर्क रहें, क्योंकि उच्च iodixanol एकाग्रता काफी चिपचिपा है ।
  2. एक ५.५ मिलीलीटर ultracentrifugation ट्यूब के नीचे करने के लिए ईवीएस युक्त 30% iodixanol बफर समाधान स्थानांतरण ।
  3. ६०% iodixanol स्टॉक सॉल्यूशन से ultrapure के पानी में प्रति नमूना 20% और 10% iodixanol सॉल्यूशन का कम से १.५ मिलीलीटर तैयार करें ।
  4. उपाय १.३ 20% iodixanol की मिलीलीटर और ध्यान से परत नीचे ढाल परत के शीर्ष पर एक सिरिंज और एक 18 जी सुई का उपयोग कर । घनत्व अंतरफलक पर परतों मिश्रण से बचने के लिए, बस meniscus के ऊपर ultracentrifugation ट्यूब के अंदर के साथ संपर्क में सुई के बेवल रखने और समाधान dropwise जोड़ें ।
  5. ऊपर के रूप में एक ही तकनीक का उपयोग कर 20% iodixanol परत के शीर्ष पर 10% iodixanol समाधान की परत १.२ मिलीलीटर ।
  6. ध्यान से संतुलन और रोटर बाल्टी में ultracentrifugation ट्यूबों लोड और २६८,००० x g पर एक स्विंग बाल्टी रोटर में ५० मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस में केंद्रापसारक । त्वरण और न्यूनतम घनत्व परतों के विघटन से बचने की अनुमति दरों के लिए केंद्रापसारक के मंदी गति निर्धारित करें ।
  7. लेबल दस १.५ मिलीलीटर प्रत्येक नमूने के लिए microcentrifuge ट्यूबों घनत्व ढाल के 10 के माध्यम से 1 अंशों के अनुरूप है । अंश 1 को पहले निकाल दिया जाएगा जो शीर्ष अंश के रूप में निर्दिष्ट किया गया है, जबकि भिन्न 10 नीचे अंश अंतिम निकाल दिया गया है ।
  8. एक बार ढाल ultracentrifugation पूरा कर लिया है, धीरे से रोटर बाल्टी और एक स्थिर धारक में जगह से ट्यूबों को हटा दें । बुलबुले के एक दृश्य बैंड अक्सर ब्याज के अंश में देखा जाएगा । पिपेट दस ४९० µ एल के धारावाहिक भागों इसी ट्यूबों में ढाल के ऊपर से । वहां ट्यूब कि संभावना दूषित प्रोटीन शामिल है के तल पर शेष द्रव की एक छोटी राशि होगी । यह नमूना छोड़ दिया जा सकता, या यदि इच्छित अंश 11 के रूप में बनाए रखे ।
  9. एक refractometer का उपयोग कर अंशों के अपवर्तन सूचकांकों को मापने । यह भी एक नियंत्रण ढाल समानांतर में चलाने के साथ किया जा सकता है अगर नमूना संरक्षण आवश्यक है । पिपेट 20-30 refractometer सतह पर iodixanol युक्त प्रत्येक अंश का µ एल, और अपवर्तन सूचकांकों की तुलना करके घनत्व का अनुमान iodixanol घनत्व को जाता है. ध्यान दें कि भिंन iodixanol-युक्त समाधान में रातोंरात संग्रहीत किया जा सकता है अगर अगले ultracentrifugation धोने कदम के लिए आगे बढ़ने से पहले की जरूरत है ।
  10. प्रत्येक अंश को एक साफ 12 मिलीलीटर ultracentrifugation ट्यूब पर स्थानांतरित करें । 1x फॉस्फेट बफर खारा के 5 मिलीलीटर जोड़ें (पंजाबियों; १३७ मिमी NaCl, २.७ मिमी KCl, 10 मिमी न2HPO4, 2 मिमी KH2पीओ4, पीएच ७.४) ट्यूब और मिश्रण धीरे ऊपर और नीचे pipetting द्वारा ।
    नोट: पंजाब के नमूनों में जोड़ा कण मुक्त, एक ०.२२ µm फिल्टर के माध्यम से बाँझ पंजाबियों को छानने और कमरे के तापमान पर भंडारण करने के लिए नमक वर्षण से बचने के द्वारा सुनिश्चित किया जाना चाहिए ।
  11. शीर्ष करने के लिए 1x पंजाबियों के एक अतिरिक्त 6 मिलीलीटर जोड़ें और फिर ध्यान से मिश्रण ।
  12. Ultracentrifuge 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए १००,००० x g पर ट्यूबों को फिर से गोली छोटे बुलबुले । supernatant और प्रोटीन विश्लेषण (चरण 3) या सुघड़ विश्लेषण (चरण 5) के लिए ईवीएस का पुन: निलंबन के लिए बुलबुले के lysis से पहले सूखी ट्यूबों नल ।

3. Lysis और Immunoblot EV प्रोटीन की पुष्टि

नोट: यदि सुघड़ लक्षण वर्णन या जैविक गतिविधि के लिए पूरे बुलबुले के संरक्षण वांछित है, शोधकर्ताओं ने सीधे कदम 5 के लिए आगे बढ़ सकते हैं । प्रारंभिक प्रयोगों में, या मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण से पहले, सभी अंश बरामद immunoblot द्वारा EV प्रोटीन के साथ अंशों की पुष्टि करने के लिए विश्लेषण किया जाना चाहिए ।

  1. प्रोटीन विश्लेषण के लिए ईवीएस लाइसे करने के लिए, मजबूत lysis बफर के ४० µ एल जोड़ें (5% एसडीएस, 10 मिमी EDTA, १२० मिमी Tris-एचसीएल पीएच ६.८, २.५% 2-mercaptoethanol, 8 मीटर यूरिया) ultracentrifuge ट्यूब में EV गोली के लिए चिढ़ाना अवरोधक के अलावा के साथ ।
    नोट: गैर-कम शर्तों प्रोटीन का पता लगाने एंटीबॉडी के लिए वांछित हैं, तो मजबूत lysis बफर में 2-mercaptoethanol के लिए ultrapure पानी स्थानापन्न ।
  2. पूर्ण पुनः सुनिश्चित करें-गोली और बफर में ईवीएस के lysis के निलंबन ultracentrifugation ट्यूब पर parafilm रखकर, सख्ती से भंवर, तो एक अंतिम भंवर से पहले कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए कमाल ।
  3. संक्षेप में १,००० एक्स जी के लिए 30-60 एस के लिए पूरे नमूना मात्रा की वसूली पर केंद्रापसारक । नमूना एक नया १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब और स्टोर करने के लिए-20 डिग्री सेल्सियस करने के लिए-८० ° c आगे प्रसंस्करण तक स्थानांतरण ।
  4. immunoblot विश्लेषण के लिए शुद्ध lysates तैयार करने के लिए, 5x Laemmli नमूना बफर जोड़ें (10% एसडीएस, २५० मिमी Tris पीएच ६.८, 1 मिलीग्राम/एमएल bromophenol ब्लू, ०.५ एम डीटीटी, ५०% ग्लिसरॉल, 5% 2-mercaptoethanol) 1x के एक अंतिम एकाग्रता के लिए नमूनों के लिए ।
    नोट: यदि गैर-कम शर्तों वांछित हैं, डीटीटी और 2-mercaptoethanol ultrapure पानी के साथ बदलें ।
  5. यदि पूरे ऊतक homogenate नियंत्रण वांछित हैं, लाइसे यूरिया में ऊतक-मजबूत lysis के साथ ऊपर विस्तृत बफर अवरोध करनेवाला, तो १०,००० पर 10 मिनट के लिए शेष extracellular मैट्रिक्स , पूरी कोशिकाओं को त्यागने के लिए, केंद्रापसारक बरकरार सेलुलर मलबे । 5x Laemmli नमूना बफर 1x के एक अंतिम एकाग्रता के लिए ऊतक homogenate के लिए जोड़ें ।
  6. 5-10 मिनट के लिए ९५ ° c पर EV या ऊतक homogenate नमूनों युक्त नमूना बफर उबाल लें, उसके बाद बराबर मात्रा (शुरू ऊतक सामग्री के 0.1-0.3 g के बराबर से) लोड करें । एक 10% एसडीएस-पृष्ठ जेल में अंश 1-10 के शुद्ध ev प्रोटीन के µ जी । ऊतक homogenate के बराबर द्रव्यमान लोड । नमूनों की अधिक मात्रा कम संवेदनशील एंटीबॉडी द्वारा पता लगाने के लिए आवश्यक हो सकता है.
  7. पहले विस्तृत के रूप में जेल ट्रो और पश्चिमी दाग विश्लेषण के साथ आगे बढ़ें21 शुद्ध lysates में ev प्रोटीन की पुष्टि करने के लिए और भागों में सापेक्ष ev बहुतायत की तुलना करें ।
    नोट: एक बार EV प्रोटीन के अनुरूप अंशों में reproducibly का प्रदर्शन किया गया है, २.१२ चरण में वर्णित अंतिम ultracentrifugation वाश ब्याज के ग्रेडिएंट अंशों तक सीमित हो सकती है ।

4. ईवी प्रोटीन ठहराव

  1. एक डिटर्जेंट का प्रयोग करें-और यूरिया संगत प्रतिदीप्ति आधारित परख अगर EV प्रोटीन के संवेदनशील ठहराव आगे विश्लेषण के लिए वांछित है ( सामग्री की तालिकादेखें) । ध्यान दें कि कुछ प्रतिदीप्ति आधारित परख bromophenol नीले Laemmli नमूना बफर में मौजूद के साथ संगत कर रहे हैं, इस बफर में EV गोली के प्रत्यक्ष lysis (२.१२ चरण में) की सुविधा अगर पसंद है ।
  2. यदि aforementioned प्रतिदीप्ति-आधारित प्रोटीन ठहराव किट का प्रयोग किया जाता है, तो नमूना या मानक के 1 µ l को कम से उपलब्ध कराए गए फिल्टर पेपर पर डुप्लिकेट करें, और निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रोटीन ठहराव जारी रखें ।

5. EV आकृति का लक्षण

  1. के लिए पूरे बुलबुले की जांच के बाद २.१२ कदम में अंतिम केंद्रापसारक धोने, अच्छी तरह से फिर से कण मुक्त 1x पंजाबियों में EV गोली सस्पेंड । फ्रीज-गल चक्र से बचने के लिए प्रसंस्करण तक अब से एक सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ईवीएस स्टोर ।
    नोट: यह पहले की पुष्टि की है immunoblot विश्लेषण द्वारा लगातार समृद्ध EV प्रोटीन युक्त भिंन है लाभप्रद है करने के लिए ब्याज के अंश को रूपात्मक विश्लेषण सीमा ।
  2. पूरा EV नमूनों पर nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण प्रदर्शन एकाग्रता और तैयारियों में बुलबुले के आकार का निर्धारण करने के लिए, के रूप में पहले22विस्तृत ।
  3. EV आकृति की विशेषता और यदि वांछित, बुलबुले के इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा आकार माप की पुष्टि करें । EM ग्रिड कदम ५.१23के बाद पुटिका निलंबन से तैयार किया जा सकता है, या वैकल्पिक रूप से ब्लॉक की तैयारी के रूप में संसाधित किया जा सकता24 छर्रों से कदम २.१२ के बाद ।

6. जेल शुद्धि और मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए Trypsin पाचन में

  1. यदि बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा EV proteomes के लक्षण वर्णन वांछित है, लोड बराबर द्रव्यमान (प्रोटीन के ंयूनतम 10 µ ग्राम) एक पूर्व कास्ट polyacrylamide जेल में ईवीएस युक्त अंशों की अलग और प्रोटीन शुद्ध करने के लिए । निर्माता की आपूर्ति पूर्व कास्ट जैल नमूनों में पेश किया जा रहा संभावित दूषित प्रोटीन (जैसे, केरातिन) के स्तर को कम करने के लिए पसंद कर रहे हैं ।
  2. प्रोटीन शुद्धि के लिए polyacrylamide जेल में नमूना कम से ०.५ इंच भागो, तो ठीक है और Coomassie डाई के साथ दाग, के रूप में पहले से विस्तार25में वर्णित है ।
  3. trypsin पाचन के लिए 1 मिमी3 cubes में गलियों में कटौती, पहले विस्तृत के रूप में19,26।
  4. लोड 5 µ में पचा पेप्टाइड नमूना के एल-एमएस/एमएस इंस्ट्रूमेंट विश्लेषणात्मक कॉलम पर जुदाई के लिए और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा बाद में विश्लेषण16विस्तार में निर्दिष्ट मापदंडों के अनुसार ।

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Representative Results

ऊतक पृथक्करण के एक योजनाबद्ध सिंहावलोकन, विभेदक केंद्रापसारक, और बुलबुले के ढाल शुद्धि चित्रा 1में प्रदर्शित होता है । ग्रैडिएंट-शुद्धि ईवीएस की सुघड़ और immunophenotypic पुष्टि चित्रा 2में हाइलाइट किया गया है । 10-30% iodixanol ढाल के ultracentrifugation निंनलिखित reproducible घनत्व का एक आरेख दिखाया गया है, दो अलग पुटिका आबादी के साथ भाग 2 (प्रकाश ईवीएस) और अंश 5 (घने ईवीएस), ऊतक के प्रकार पर निर्भर की ओर पलायन । प्रतिनिधि immunoblots ढाल अंशों के कुशल जुदाई प्रदर्शन और छोटे ट्यूमर के शुद्धि-अंश 5 में ईवीएस व्युत्पंन । नोट की, फेफड़े के ट्यूमर नमूनों घने ईवीएस में प्रकाश ईवीएस की तुलना में समृद्ध दिखाई (2 अंश में) पहले पूरे मस्तिष्क ऊतक से काटा, फिर यहां पर प्रकाश डाला । ईवीएस के एक वैश्विक ऊतक विश्लेषण के रूप में उभरने, यह अद्वितीय ऊतकों द्वारा उत्पादित ईवीएस के विशिष्ट घनत्व का निर्धारण करने के लिए दिलचस्प हो जाएगा । प्रतिनिधि nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण और ऊतक के इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी-प्रमुख पुटिका में बुलबुले व्युत्पंन युक्त अंश के संवर्धन और पूरे बुलबुले के संरक्षण और ज्ञात आकार और संरचना के साथ संगत का प्रदर्शन छोटा ईवीएस. अंत में, चित्रा 3 ढाल-शुद्ध पुटिका प्रोटीन के बहाव में जन स्पेक्ट्रोमेट्री लक्षण वर्णन की सुविधा में इस विधि की उपयोगिता पर प्रकाश डाला गया, कई पहले छोटे ईवीएस में पहचान प्रोटीन का पता लगाने का प्रदर्शन । इन की पहचान प्रोटीन के कई छोटे endosomal में समृद्ध उन लोगों के साथ संगत-व्युत्पंन ईवीएस पहले Théry और हिल लैब्स17,20द्वारा प्रस्तावित कर रहे हैं ।

Figure 1
चित्रा 1 : पुटिका अलगाव और पूरे ऊतक से शुद्धि की योजनाबद्ध सिंहावलोकन । निंनलिखित ऊतक पृथक्करण, पूर्व-समाशोधन विभेदक केंद्रापसारक कदम, निस्पंदन, और ultracentrifugation, क्रूड EV छर्रों फ्लोटिंग जुदाई के लिए एक iodixanol घनत्व ढाल के तल पर resuspend किया जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : प्रतिनिधि सुघड़ और ऊतक-व्युत्पंन ईवीएस के immunophenotypic विश्लेषण । (क) iodixanol ढाल निंनलिखित ultracentrifugation की गणना घनत्व, स्वतंत्र प्रयोगों पर औसत, प्रकाश और घने ईवीएस युक्त अंशों पर प्रकाश डाला । (ख) ऊतक-व्युत्पंन predominately घने ट्यूमर ईवीएस और प्रकाश मस्तिष्क ईवीएस के अलगाव का प्रदर्शन बुलबुले के प्रतिनिधि immunoblots । पुटिका अलग गैर EV प्रोटीन calnexin के समाप्त हो रहे हैं । ज, टिशू homogenate । (ग) प्रतिनिधि ग्रैडिएंट-शुद्धि ऊतक ईवीएस के Nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण (ंत्) । इस नमूने में सबसे छोटा पता चला कण ७८ एनएम था, और लगभग ९२% का पता लगाया बुलबुले २५० एनएम या छोटे थे, छोटी ईवीएस के एक उच्च संवर्धन के अनुरूप । (घ) मस्तिष्क ऊतक के प्रतिनिधि इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियाँ-व्युत्पन्न ईवीएस. स्केल बार्स = २०० एनएम । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : एक प्रतिनिधि ऊतक के जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पाया डाला पुटिका प्रोटीन का सारांश-व्युत्पंन EV नमूना । ev निष्कर्षण और ढाल शुद्धि के बाद, समृद्ध अंश में ev प्रोटीन के 10 µ g को ट्रो और जेल trypsin पाचन के लिए polyacrylamide जेल में लोड किया गया था । इस प्रतिनिधि ऊतक में EV नमूना व्युत्पंन, ९१८ प्रोटीन की कुल नियंत्रण रेखा से पहचाना-ms/ पेप्टाइड्स की पहचान की, विश्लेषण किया गया, और पाया exosomal, lysosomal में समृद्ध हो, और प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन के रूप में पहले16वर्णित है । यहां, हम अपनी तैयारी है कि Théry और हिल लैब्स17,20द्वारा वर्णित किया गया है में छोटे EV या exosomal प्रोटीन की उपस्थिति का प्रदर्शन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

बहुत वैज्ञानिक हित के साथ उत्पंन किया गया है भूमिकाओं के संबंध में छोटे ईवीएस के ट्यूमर microenvironment में खेलते हैं, साथ ही साथ अंग विकास, परिपक्वता, और समारोह में । कुल मिलाकर, इस अध्ययन के पूरे मस्तिष्क या ट्यूमर नमूनों से बरकरार ईवीएस की निकासी के लिए एक अनुकूलित कार्यप्रवाह प्रदान करता है । यहां जबकि हम सिर्फ फेफड़ों के ट्यूमर के लिए इस तकनीक की प्रयोज्यता प्रदर्शित-ईवीएस व्युत्पंन, इस विधि को आसानी से अंय ठोस ऊतकों पर काम के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, आगे के पूर्व छोटे स्रावित बुलबुले कि के के लिए अवसर प्रदान करने के लिए vivo के लक्षण है कि व्यापक जैव चिकित्सा हित । जबकि इस अध्ययन के दायरे से परे, EV सामग्री के भविष्य की तुलना करने के लिए है कि ऊतक अभिव्यक्ति की उत्पत्ति भी ऊतक और रोग के रूप में अलग बुलबुले की उपयोगिता स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण होगा ।

पहले हमारी प्रयोगशाला द्वारा प्रकाशित अध्ययन में, हम स्पष्ट रूप से समृद्ध छोटे बुलबुले के शुद्धिकरण के लिए तलछट पर आधारित घनत्व ढाल के लाभों को प्रदर्शित करता है । संक्षेप में, एक उछाल आधारित जुदाई ब्याज के अंशों के माध्यम से contaminant प्रवास से बचने के द्वारा बुलबुले की शुद्धि में सुधार । इस सिद्धांत को विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब पूरे ऊतक की तरह जटिल नमूनों से शुरू होता है । बावजूद, हम इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण के रूप में पूरक तकनीकों के माध्यम से EV आकृति विज्ञान की परीक्षा सहित वर्णित अलग बुलबुले के पूर्व विश्लेषणात्मक पुष्टि अध्ययन के महत्व को बल, के रूप में अच्छी तरह से immunoblotting सहित जैव रासायनिक विश्लेषण के रूप में. समृद्ध अंशों में ev प्रोटीन्स को ईवीएस (MISEV) की Extracellular के जर्नल में प्रकाशित रिपोर्ट के अध्ययन के लिए न्यूनतम जानकारी द्वारा अनुशंसित के रूप में एक tetraspanin प्रोटीन, सहित कम से कम तीन मांयता प्राप्त ev मार्कर के साथ पुष्टि की जानी चाहिए बुलबुले27. ऊतक homogenates की तुलना में ev अंशों में अनुपस्थित या अत्यधिक कम होने के लिए एक नकारात्मक EV मार्कर का प्रदर्शन किया जाना चाहिए । सभी कदम ऊपर कहा छोटे पुटिका शुद्धि की गुणवत्ता आश्वासन के लिए महत्वपूर्ण हैं । इसके अलावा, प्रयोगशाला के प्रारंभिक प्रदर्शन और EV-युक्त घनत्व भागों में उपयोगकर्ता-विशिष्ट संगति मूल्यवान समय और प्रसंस्करण और घनत्व ढाल ultracentrifugation कदम के बाद सभी भागों का विश्लेषण के साथ जुड़े लागत को बचा सकता है ।

यह स्पष्ट है कि विविध ऊतकों से बुलबुले थोड़ा अलग घनत्व भागों के लिए नाव, या predominately प्रकाश या घने उपआबादी में अलग हो सकता है । इन मतभेदों को पहले पूरे मस्तिष्क में देखा गया है-वृक्ष संस्कृति16,17में उगाया कोशिकाओं से काटा ईवीएस की तुलना में ईवीएस व्युत्पंन, और आगे इस अध्ययन में प्रदर्शित कर रहे हैं । हम बताते है कि फेफड़ों के ट्यूमर नमूनों predominately घने छोटे ईवीएस की तुलना में हल्का मस्तिष्क ऊतक से अलग ईवीएस बंदरगाह सकता है । इन मतभेदों को इस अध्ययन में प्रस्तावित विधि द्वारा पर प्रकाश डाला ईवीएस के अंतर संरचना में मूल्यवान जांच को बढ़ावा देने, कर सकते है कि घने डीएनए किस्में28,29,30के साथ पैक किया जा सकता है ट्यूमर ईवीएस सहित । EV संरचना में इन मतभेदों के कारण, हम दृढ़ता से इन प्रारंभिक तकनीकी प्रयोगों के महत्व को रेखांकित । विविध ट्यूमर नमूनों से ईवीएस के अलगाव के लिए इस तकनीक के भविष्य के आवेदन अगर घने ईवीएस predominately अन्य ट्यूमर प्रकार के रूप में अच्छी तरह से interstitium में स्रावित कर रहे हैं निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण हो जाएगा.

जबकि छोटे ईवीएस और अलग पुटिका उपआबादी के अलगाव की पूरी शुद्धि प्रयोगशालाओं में एक मौजूदा सीमा बनी हुई है, इस विधि को आगे के अध्ययन के लिए एक आधार प्रदान करता है ऊतक या ट्यूमर की विविधता से छोटे बुलबुले विशेषताएं प्रकार, और इसलिए EV विविधता की अधिक से अधिक समझ की सुविधा हो सकती है । असममित-प्रवाह क्षेत्र-प्रवाह अंश द्वारा EV कणों का हाल जुदाई अलग माल और छोटे (60-80 एनएम) बनाम बड़ा (90-120 एनएम) exosomes के कार्यों की संभावना प्रबुद्ध है, और आगे गैर की एक सबसेट की पहचान की झिल्ली बंधे < 50 एनएम कणों "exomeres"31,३२के रूप में मनोनीत । हालांकि, इन अद्वितीय पुटिका सेल लाइनों के पार विभिंन आबादियों में माल पैक, गुप्त बुलबुले के पर्याप्त विविधता पर प्रकाश डाला, और इन विट्रो या पूर्व vivo पुटिका विश्लेषण में व्यापक के महत्व का समर्थन । इस अध्ययन में, हम सबसे अधिक संभावना exosomes की पहचान दोनों वर्गों के लिए समृद्ध । exosomes करने के लिए समान घनत्व के साथ छोटे microvesicles के अनुपात के रूप में अच्छी तरह से अलग में मौजूद हो सकता है । हालांकि हम हमारे अलग, झिल्ली बंधे बुलबुले में exomeres की संभावना को बाहर नहीं कर सकते है निश्चित रूप से सबसे प्रचुर मात्रा में ढाल पुटिका प्रोटीन में समृद्ध भागों में थे । छोटे ईवीएस के अलावा, बड़े oncosomes (> 1000 एनएम) कैंसर जीव३३के लिए हाल ही में ब्याज की गई है । हालांकि इस अध्ययन में वर्णित प्रोटोकॉल ४५० एनएम से अधिक बुलबुले बाहर फिल्टर, इस कदम का अपवर्जन इन बड़े ईवीएस की परीक्षा की सुविधा हो सकती है वर्णित है । विभिन्न पुटिका उपआबादी से संबद्ध घनत्व की भावी परीक्षा में इन संस्थाओं को उनके वर्णित आकारों के अतिरिक्त भेद करना महत्वपूर्ण होगा.

अंत में, हालांकि हम लागत और इस प्रस्तावित तकनीक के साथ जुड़े समय सहित सीमाओं की सराहना करते हैं, हम भी कठोर मूलभूत विधियों के लिए की जरूरत है ऊतक ईवीएस की विशेषता को स्वीकार करते है और एक अंत के लिए उत्पाद की तुलना के रूप में लगातार सेवा विकसित और भविष्य में और अधिक परिष्कृत तरीकों । इन प्रौद्योगिकियों को आगे बढ़ाने की उंमीद है और अधिक तेजी से और चिकित्सकीय चिकित्सकीय या शल्य चिकित्सा नमूनों से ईवीएस निकालने के लिए संगत तकनीक रोशन करेंगे ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों Dr. रिचर्ड Nowakowski और फ्लोरिडा राज्य विश्वविद्यालय प्रयोगशाला पशु संसाधनों और प्रदान करने के लिए इस प्रोटोकॉल, संमान विकसित करने के लिए इस्तेमाल जानवरों की देखभाल के लिए धंयवाद । हम ज़िया लियू, डॉ राकेश सिंह, और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री बहाव पुटिका लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल किया काम के साथ सहायता के लिए फ्लोरिडा राज्य विश्वविद्यालय शोधों विज्ञान प्रयोगशाला, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से FSU जैविक विज्ञान इमेजिंग संसाधन सुविधा के लिए धंयवाद इस अध्ययन में संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग. अंत में, हम Dr. Mandip सचदेवा (फ्लोरिडा एक & एम विश्वविद्यालय) ट्यूमर इस पद्धति के विकास में प्रयुक्त नमूनों के दान के लिए धंयवाद । इस अध्ययन में स्वास्थ्य प्रवर्तन निदेशालय और Ethel मूर अल्जाइमर रोग अनुसंधान कार्यक्रम के फ्लोरिडा विभाग से अनुदान द्वारा समर्थित D.G.M. और जे. एम. ओ (6AZ11) और राष्ट्रीय कैंसर के राष्ट्रीय संस्थान पुरस्कार संख्या के अंतर्गत स्वास्थ्य संस्थानों से संमानित किया गया R01CA204621 D.G.M. को किया सम्मानित

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 µm filter VWR 28145-505
12 mL ultracentrifuge tubes Beckman Coulter 331372
5.5 mL ultracentrifuge tubes Beckman Coulter 344057
anti-Alix antibody Santa Cruz sc-7129
anti-Calnexin antibody Santa Cruz sc-11397
anti-CD63 antibody Abcam ab59479
anti-CD81 antibody Santa Cruz sc-9158
anti-Flotillin 2 antibody Santa Cruz sc-25507
anti-HSC70 antibody Santa Cruz sc-7298
anti-Syntenin-1 antibody Santa Cruz sc-100336
anti-TSG101 antibody Santa Cruz sc-7964
EZQ protein quantification kit ThermoFisher Scientific R33200
FA-45-6-30 rotor  Eppendorf 5820715006
FEI CM120 Electron Microscope TSS Microscopy
goat anti-rabbit IgG (Fab fragment) Genetex 27171
HALT phosphatase inhibitor (100x solution) ThermoFisher Scientific 78420
HALT protease inhibitor (100x solution) ThermoFisher Scientific 78438
Hibernate E medium ThermoFisher Scientific A1247601
MLS-50 swinging-bucket rotor Beckman Coulter 367280
NanoSight LM10 Malvern
Optima MAX-XP Benchtop Ultracentrifuge  Beckman Coulter 393315
Optima XE-100 ultracentrifuge Beckman Coulter A94516
Optiprep Sigma D1556 60% iodixanol in sterile water solution
Q Exactive HF Mass Spectrometer ThermoFisher Scientific
rabbit anti-goat IgG Genetex 26741
rabbit anti-mouse IgG Genetex 26728
Refracto 30PX (refractometer) Mettler Toledo 51324650
S-4-104 rotor Eppendorf 5820759003
SW 41 Ti swinging-bucket Rotor Beckman Coulter 333790
Tabletop 5804R centrifuge Eppendorf 22623508

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक १४४ exosomes extracellular पुटिका ऊतक मस्तिष्क ट्यूमर मास स्पेक्ट्रोमेट्री घनत्व ढाल पूर्व vivo oncosomes बायोमास
पूरे ऊतक से Extracellular बुलबुले के निष्कर्षण
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Hurwitz, S. N., Olcese, J. M.,… More

Hurwitz, S. N., Olcese, J. M., Meckes Jr., D. G. Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue. J. Vis. Exp. (144), e59143, doi:10.3791/59143 (2019).

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