Summary
Qui, forniamo un protocollo dettagliato per isolare piccole vescicole extracellulari (SVE) dai tessuti interi, compresi i campioni di cervello e del tumore. Questo metodo offre una tecnica riproducibile per estrarre SVE da tessuto solido per ulteriori analisi a valle.
Abstract
Circolante e interstiziale piccole membrana-limita (SVE) vescicole di extracellulare rappresentano un bersaglio promettente per lo sviluppo di saggi di nuovo biomarcatore diagnostico o prognostico e probabilmente servono come giocatori importanti nella progressione di un vasto spettro di malattie. Ricerca corrente è focalizzata sulla caratterizzazione delle vescicole secernuta da cellule multiple e tipi di tessuto al fine di meglio comprendere il ruolo di EVs nella patogenesi di condizioni tra cui neurodegenerazione, infiammazione e cancro. Tuttavia, globalmente coerenti e riproducibili tecniche per isolare e purificare le vescicole rimangono in corso. Inoltre, a malapena vengono descritti metodi per l'estrazione del SVE da tessuto solido ex vivo . Qui, forniamo un protocollo dettagliato per estrarre piccoli EVs di interesse dai tessuti intero freschi o congelati, compreso i campioni del cervello e del tumore, per ulteriore caratterizzazione. Dimostriamo l'adattabilità di questo metodo per analisi multiple a valle, tra cui la microscopia elettronica e immunophenotypic caratterizzazione delle vescicole, così come la spettrometria di massa quantitativa delle proteine di EV.
Introduction
Piccole vescicole extracellulari (SVE) includono endosomal-derivato esosomi e microvescicole membrana-capannone piccolo di ampio interesse biomedico. Piccoli SVE sono composti da una popolazione eterogenea di vescicole di membrana-limitano nm 50-250 contenenti proteine biologicamente attive, i lipidi e gli acidi nucleici che collettivamente sono creduti per svolgere ruoli importanti in una moltitudine di processi di malattia. Progresso della ricerca è particolarmente implicata queste vescicole in neurodegenerative e malattie da prioni, processi infettivi, condizioni infiammatorie o autoimmuni e la crescita del tumore e metastasi1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. ricerca biomedica in rapida crescita del significato di EVs nella patogenesi della malattia ha generato interesse parallela allo sviluppo di metodi riproducibili e rigorosi per l'isolamento e la purificazione di queste vescicole.
Una sfida storica e attuale nella caratterizzazione di EV è stata l'incapacità di separare completamente piccola EV sottopopolazioni. Questa sfida è in gran parte a causa della nostra comprensione limitata dei differenti meccanismi molecolari che regolano la biogenesi delle vescicole distinte. Sovrapposizione di dimensioni, densità e carico biologico tra sottopopolazioni ulteriormente spire queste distinzioni. Parte di questa sfida è stato anche l'uso di diverse tecniche di arricchimento, fornendo un'incoerenza in analisi a valle delle vescicole isolate attraverso laboratori e minare lo sforzo globale per illuminare categorico EV popolazioni ampiamente.
Vale la pena notare che la maggior parte della caratterizzazione EV è stata eseguita da collezione in vitro della coltura delle cellule surnatante, con studi in vivo più recenti che descrivono le tecniche per isolare le vescicole da fluidi corpo umani o animale, tra cui plasma, urina e la saliva. Mentre SVE sono presenti in grandi quantità in circolazione, ha anche riconosciuto che queste vescicole svolgono un ruolo importante negli eventi di comunicazione cellula-cellula e sono presenti nell'interstizio dei tessuti cellulari. Nel contesto di cancro, EVs interstiziale può essere particolarmente importante nella modulazione del microambiente tumorale per la semina delle cellule di cancro e crescita metastatica14,15. Di conseguenza, non c'è valore nello sviluppo e nell'ottimizzazione delle tecniche per estrarre le vescicole da campioni di tessuto solido. Questi metodi fornirà un mezzo per studiare direttamente organo - o tumore - derivato EVs raccolti da campioni clinici, tra cui piccole biopsie e resezioni organo parziale o completo.
In questo studio e in un precedente rapporto pubblicato dal nostro laboratorio16, intendiamo affrontare parecchie preoccupazioni attuali principali nella metodologia di arricchimento EV: 1) per descrivere una tecnica riproducibile per isolare e purificare EVs ai più alti standard attualmente accettato nel campo; 2) per tentare di isolare piccole sottopopolazioni EV altamente arricchite in endosomal-derivato esosomi; e 3) per fornire un protocollo per l'estrazione di queste vescicole da campioni di tessuto solido ai fini di ulteriore caratterizzazione.
Recentemente, Kowal e colleghi descritti una pendenza di densità relativamente piccoli iodixanol per separare e purificare le sottopopolazioni di EV con maggiore efficacia rispetto paragonabile saccarosio densità gradienti17. Nello studio citato, EVs di derivati da cellule dendritiche catturato in una frazione di densità relativamente leggera, coerenza con una densità di 1,1 g/mL, altamente sono stati arricchiti in proteine endosomal credute di essere più coerente con una proporzione elevata degli esosomi presenti in questo frazione. Secondo gli autori, queste proteine "bona fide" exosomal includevano gene di suscettibilità del tumore 101 (TSG101), syntenin-1, CD81, ADAM10, EHD4 e diversi annessina proteine17. Più tardi abbiamo adattato questa tecnica per avere successo un metodo di dissociazione del tessuto descritto da Gonzalez Perez et al.18 e un protocollo di successiva centrifugazione differenziale per isolare l'intero cervello-derivato SVE16. Inoltre, abbiamo dimostrato l'utilità di questo metodo nella caratterizzazione dei proteomi EV combinando un protocollo sequenza per la spettrometria di massa a valle quantitativo e comparativo della proteina vescicolare, precedentemente descritta dal nostro laboratorio19. Questo lavoro era equivalente a quello del laboratorio di Hill, in cui SVE sono state arricchite dalla corteccia frontale del cervello20.
In questo studio, abbiamo elaborato su questa tecnica ed estendere l'applicazione del protocollo recentemente pubblicato dal nostro laboratorio all'isolamento del SVE da tumori solidi del polmone. A nostra conoscenza, questo è il primo studio per descrivere un protocollo per arricchire SVE da ex vivo esemplari del tumore. Visto il diffuso interesse verso EVs come nuovi biomarcatori diagnostici e il loro ruolo nella tumorigenesi, questo metodo probabilmente si rivelerà prezioso per un numero crescente di ricercatori scientifici. Da un punto di vista clinico, EVs interstiziale potrebbe porto grande valore diagnostico, in particolare negli esemplari dove la valutazione istologica è limitata. La nostra speranza è che il metodo descritto qui fornirà un fondamento per una tecnica riproducibile raccogliere EVs in freschi o surgelati umani o animali esemplari chirurgici, spianando la strada per il lavoro futuro scoprire i ruoli significativi nella patogenesi della malattia questi piccoli le vescicole possono giocare.
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Protocol
Tutto cervelli sono stati ottenuti con approvazione dall'uso animale istituzionale e cura Committee (IACUC) della Florida State University. Un totale di dodici cervelli di topo (3 cervelli da ogni gruppo d'età: 2, 4, 6 e 8 mesi) da un C57BL/6 J sfondo sono stati utilizzati per l'estrazione di EV, come descritto in precedenza16. Esemplari del tumore del polmone sono stati generosamente donati da Dr. Mandip Sachdeva sotto approvazione del Florida agricola e meccanica Università IACUC. Tumori del polmone sono stati derivati dalla linea cellulare umana dell'adenocarcinoma H1975 coltivato in immunodeficienti topi nudi di Balb/c nu/nu. Dati da due repliche rappresentativo del tumore sono evidenziati in questo studio.
Nota: Una descrizione schematica del metodo di isolamento e purificazione di vescicola è fornita nella Figura 1.
1. tessuto dissociazione e centrifugazione differenziale
- Preparare 10 mL di tampone di dissociazione (10 mg di papaina; 5,5 mM L-cisteina; 67 µM 2-mercaptoetanolo; 1,1 mM EDTA) nel mezzo di sospensione-E a circa 0,4-1,0 g di tessuto. Si noti che tutte le soluzioni utilizzate per la purificazione e l'arricchimento di EV devono essere diluite in acqua ultrapura filtrata.
- Aggiungere tessuto intero fresco o congelato a buffer di dissociazione in una provetta conica da 50 mL e incubare in un acqua calda vasca a 37 ° C per 20 min. del tessuto può essere tagliato in frammenti più piccoli prima dell'incubazione, se necessario.
- Dopo l'incubazione, aggiungere inibitori di proteasi e fosfatasi per una concentrazione finale di 1 x per il buffer di dissociazione che contiene il tessuto.
- Versare la soluzione contenente il tessuto in un omogeneizzatore lisata-morbida e delicatamente dissociare il tessuto utilizzando circa 30 colpi lenti per campione. Il numero di tratti può essere regolato in base alla consistenza del tessuto.
- Tessuto di trasferimento dissociato nel buffer di una provetta conica da 50 mL e centrifugare a 500 g per 5 min a 4 ° C per agglomerare le cellule e i rimanenti frammenti di tessuto fibroso o coesivi.
- Trasferire il surnatante di un tubo conico pulito da 50 mL e centrifugare a 2.000 x g per 10 min a 4 ° C di pellet e scartare grandi detriti cellulari.
- Trasferire il surnatante nuovamente un tubo conico pulito da 50 mL e centrifugare a 10.000 x g per 40 min a 4 ° C a pellet indesiderate più grandi vescicole o corpi apoptotici piccolo.
Nota: Questo pellet possono essere salvate per ulteriore studio delle vescicole più grande se lo si desidera. - Decantare il supernatante attraverso un filtro a 0,45 µm in una provetta di ultracentrifugazione di mL 12 pulita.
Nota: Campioni di tessuto densamente fibrotico non possono essere facilmente filtrati. Questi campioni possono essere filtrati attraverso un colino di cella 40 µm, quindi passavano in serie più piccoli aghi (18 G, 20 G, 22 G) prima di filtraggio attraverso il filtro da 0,45 µm. - Ultracentrifuga il campione a 100.000 x g per 2 h a 4 ° C a pellet piccola EVs.
- Decantare il supernatante e lasciare i tubi di ultracentrifugazione invertiti per 5-10 min, toccando spesso per rimuovere il liquido residuo sui lati dei tubi. Liquido residuo può anche essere aspirato per mezzo di una pipetta sottovuoto ad aspirazione.
- Risospendere il pellet di EV in 1,5 mL di tampone di 0,25 M saccarosio (10 mM Tris, pH 7.4). È importante garantire completa risospensione del pellet in questo passaggio. A tale scopo, coprire le provette con parafilm prima Vortex EVs in soluzione. I tubi di ultracentrifuga per 15-20 minuti a temperatura ambiente prima di un mix di vortice finale della roccia.
- Centrifugare brevemente le provette a una velocità non superiore a 1.000 x g per recuperare la sospensione liquida nella parte inferiore del tubo.
- Procedere con i passaggi di purificazione gradiente qui sotto, o se necessario, conservare EV sospensione a 4 ° C durante la notte.
2. densità gradiente purificazione
- Aggiungere 1,5 mL di iodixanol 60% (soluzione in acqua) nel buffer di saccarosio/Tris di 1,5 mL contenente EVs per creare una soluzione finale che contiene 30% iodixanol. Pipettare fino e giù più volte per mescolare la soluzione. Essere cauti per evitare di perdere la soluzione nella punta della pipetta, come la concentrazione di iodixanol alta è abbastanza viscosa.
- Trasferire la soluzione tampone di iodixanol 30% contenente EVs il fondo di una provetta di ultracentrifugazione 5,5 mL.
- Preparare almeno 1,5 mL di 20% e 10% soluzioni di iodixanol per campione in acqua ultrapura dalla soluzione madre di iodixanol di 60%.
- Misura 1,3 mL di iodixanol di 20% e con attenzione il livello sopra il livello di sfumatura di fondo utilizzando una siringa e un ago da 18 G. Per evitare gli strati all'interfaccia densità di miscelazione, la smussatura dell'ago a contatto con l'interno del tubo ultracentrifugazione appena sopra il menisco e aggiungere goccia a goccia la soluzione.
- Strato di 1,2 mL di soluzione di 10% iodixanol sopra lo strato di iodixanol 20% usando la stessa tecnica come sopra.
- Attentamente equilibrio e caricare i tubi ultracentrifugazione in bucket di rotore e della centrifuga in un rotore di swing-benna a 268.000 x g per 50 min a 4 ° C. Impostare la velocità di accelerazione e decelerazione della centrifuga i tassi minimi ammessi per evitare perturbazioni degli strati di densità.
- Etichetta dieci provette per microcentrifuga da 1,5 mL per ogni campione corrispondono a frazioni di 1 a 10 del gradiente di densità. Frazione 1 viene designato come la frazione più in alto che verrà prima rimosso, mentre la frazione 10 è la frazione di fondo Ultima rimossa.
- Una volta completata l'ultracentrifugazione di pendenza, delicatamente togliere le provette dal rotore secchi e posto in un supporto stabile. Una banda visibile delle vescicole spesso sarà visibili nella frazione di interesse. Pipettare seriale dieci frazioni di 490 µ l dalla parte superiore della sfumatura nelle provette corrispondenti. Ci sarà una piccola quantità di liquido restante nella parte inferiore del tubo che probabilmente contiene proteine contaminanti. Questo esempio può essere scartato, o mantenuto come frazione 11 Se si desidera.
- Misurare gli indici di rifrazione delle frazioni utilizzando un rifrattometro. Ciò può anche essere eseguito con una sfumatura di controllo eseguita in parallelo, se è necessaria la conservazione del campione. Pipettare 20-30 µ l di ciascuna frazione contenente iodixanol sulla superficie del rifrattometro e stimare la densità confrontando gli indici di rifrazione di iodixanol noto densità. Si noti che le frazioni possono essere memorizzate durante la notte nella soluzione contenente iodixanol se necessario prima di procedere al passaggio successivo per la lavaggio ultracentrifugazione.
- Trasferire ogni frazione in una provetta di ultracentrifugazione mL 12 pulita. Aggiungere 5 mL di tampone fosfato salino (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mm Na2HPO4, 2mm KH2PO4, pH 7.4): 1x tubo e mescolare pipettando lentamente su e giù.
Nota: PBS aggiunto ai campioni deve essere priva di particelle, assicurata da PBS sterile che filtra attraverso un filtro da 0,22 µm e la conservazione a temperatura ambiente per evitare la precipitazione del sale. - Aggiungere un ulteriore 6 mL di 1X PBS all'inizio e ancora una volta mescolate con cura.
- Ultracentrifuga i tubi a 100.000 x g per 2 h a 4 ° C a ri-pellet piccole vescicole. Decantare il supernatante e toccare i tubi asciutte prima di lisi delle vescicole per l'analisi della proteina (passaggio 3) o risospensione di EVs per analisi morfologica (passo 5).
3. Lisi e Immunoblot conferma delle proteine di EV
Nota: Se la conservazione delle vescicole tutta per la caratterizzazione morfologica o attività biologica è voluta, i ricercatori possono procedere direttamente al passo 5. Negli esperimenti iniziali, o prima dell'analisi di spettrometria di massa, dovrebbero essere analizzate tutte le frazioni recuperate da immunoblot per confermare le frazioni con proteine di EV.
- Per lisare EVs per l'analisi della proteina, aggiungere 40 µ l di tampone di lisi forte (5% SDS, 10 mM EDTA, 120 mM Tris-HCl pH 6.8, 2,5% 2-mercaptoetanolo, urea 8 M) con l'aggiunta dell'inibitore di proteasi a pellet EV in tubo ultracentrifuga.
Nota: Se le condizioni non riducenti sono desiderate per il rilevamento di anticorpi delle proteine, sostituire acqua ultrapura per 2-mercaptoetanolo nel buffer di lisi forte. - Garantire la completa risospensione del pellet e lisi del SVE nel buffer mettendo parafilm sopra l'ultracentrifugazione tubo Vortex vigorosamente, poi a dondolo per 20 min a temperatura ambiente prima di un vortice finale.
- Centrifugare brevemente a 1.000 x g per 30-60 s recuperare il volume del campione intero. Trasferire il campione di un nuovo microcentrifuga da 1,5 mL e conservare a-20 ° C a-80 ° C fino a ulteriore elaborazione.
- Per preparare lisati purificato per l'analisi di immunoblot, aggiungere 5 x Laemmli tampone (10% SDS, 250 mM Tris-HCl pH 6.8, 1 mg/mL di bromofenolo, 0,5 M DTT, glicerolo al 50%, 5% 2-mercaptoetanolo) ai campioni per una concentrazione finale di 1 x.
Nota: Se le condizioni non riducenti sono desiderate, è possibile sostituire il DTT e 2-mercaptoetanolo con acqua ultrapura. - Se intero tessuto omogeneato controlli sono desiderati, lisare il tessuto nell'urea-che contiene forte buffer di lisi dettagliata sopra con l'inibitore della proteasi, poi Centrifugare a 10.000 x g per 10 min a scartare i rimanenti della matrice extracellulare, le cellule intere, o detriti cellulari intatti. Aggiungere 5 x Laemmli tampone omogeneato del tessuto per una concentrazione finale di 1 x.
- Far bollire la sample buffer contenente campioni di omogenato EV o tessuto a 95 ° C per 5-10 minuti, quindi uguale volume di carico (dall'equivalente di 0,1-0,3 g di tessuto materiale di partenza; 1-2 µ g di proteina purificata EV) delle frazioni 1-10 in un gel di SDS-PAGE 10%. Carico uguale massa dell'omogeneato del tessuto. Maggiore volume dei campioni può essere necessaria per il rilevamento di anticorpi meno sensibili.
- Procedere con elettroforesi e Western blot analisi come precedentemente dettagliate21 per confermare proteine di EV nei lisati purificati e confrontare l'abbondanza relativa di EV in frazioni.
Nota: Una volta EV proteina è stata dimostrata in modo riproducibile in frazioni coerente, il lavaggio finale ultracentrifugazione descritto nel passo 2.12 può essere limitato a gradiente frazioni di interesse.
4. quantificazione della proteina EV
- Utilizzare un'analisi di fluorescenza-basata di detersivo e urea compatibili se sensibili quantificazione delle proteine di EV è desiderato per ulteriori analisi (Vedi Tabella materiali). Si noti che alcune analisi di fluorescenza-based sono compatibili con il blu di bromofenolo presente nel buffer del campione di Laemmli, facilitando lisi diretta del pellet EV (a passo 2.12) in questo buffer, se si preferisce.
- Se viene utilizzato il kit di quantificazione della suddetta proteina basata a fluorescenza, spot 1 µ l di campione o standard in almeno duplicare della carta da filtro fornita e continuare quantificazione di proteine secondo le istruzioni del produttore.
5. caratterizzazione della morfologia di EV
- Per esaminare tutta vescicole dopo la centrifugazione finale lavare in passo 2.12, accuratamente risospendere EV pellet in PBS 1X priva di particelle. Archivio EVs a 4 ° C per non più di una settimana fino al procedimento per evitare cicli di gelo-disgelo.
Nota: È utile in precedenza hanno confermato le frazioni contenenti costantemente arricchito EV proteina dall'analisi del immunoblot per limitare l'analisi morfologiche alle frazioni di interesse. - Eseguire nanoparticella analisi di rilevamento su intero EV campioni per determinare la concentrazione e le dimensioni delle vescicole nelle preparazioni, come precedentemente dettagliate22.
- Caratterizzare la morfologia EV e confermare le misure da microscopia elettronica delle vescicole, se lo si desidera. Griglie di EM possono essere preparati da sospensioni di vescicola seguendo passo 5.123, o in alternativa possono essere elaborate come blocco preparati24 da pellet seguendo passo 2.12.
6.-gel di purificazione e digestione della tripsina per analisi di spettrometria di massa
- Se si desidera la caratterizzazione dei proteomi EV mediante spettrometria di massa, carico uguale massa (almeno 10 µ g di proteina) di frazioni contenenti SVE in un prefabbricato gel di poliacrilammide per separare e purificare proteine. Gel pre-cast forniti dal produttore sono preferiti per ridurre i livelli di potenziale contaminazione proteine (ad es., cheratina) introdotti nei campioni.
- Eseguire l'esempio almeno 0,5 pollici in gel di poliacrilammide per purificazione della proteina, quindi difficoltà e macchia con colorante Coomassie, come precedentemente descritto in dettaglio25.
- Tagliare le corsie a 1 mm3 cubi per la digestione della tripsina, come in precedenza dettagliate19,26.
- Caricare 5 µ l di campione digerito peptide in LC-MS/MS strumento per separazione sulla colonna analitica e successiva analisi mediante spettrometria di massa secondo i parametri specificati in dettaglio16.
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Representative Results
Nella Figura 1viene visualizzata una descrizione schematica della dissociazione del tessuto, centrifugazione differenziale e gradienti purificazione delle vescicole. Conferma della morfologica e immunophenotypic del gradiente-purificato sve è evidenziata nella Figura 2. Un diagramma di densità riproducibile dopo ultracentrifugazione di pendenza di iodixanol il 10-30% viene mostrato, con due popolazioni distinte della vescicola la migrazione verso l'alto a frazione 2 (luce EVs) e frazione 5 (denso EVs), dipendono dal tipo di tessuto. Rappresentante immunoblots di gradiente frazioni esibiscono l'efficiente separazione e purificazione di piccoli tumore-derivato SVE in frazione 5. Della nota, gli esemplari di tumore del polmone è apparsi arricchiti in EVs denso rispetto alla luce EVs (in frazione 2) precedentemente raccolte dal tessuto di cervello intero, ancora una volta evidenziato qui. Come un'analisi globale del tessuto del SVE emergono, sarà interessante determinare le densità distinte del SVE prodotte dai tessuti unici. Rappresentante nanoparticle tracking analisi e microscopia elettronica del tessuto-derivato di vescicole nella frazione predominante delle vescicole contenenti dimostrano l'arricchimento e la conservazione delle vescicole intere coerente con la dimensione nota e la struttura del piccolo EVs. Infine, nella figura 3 evidenzia l'utilità di questo metodo nel facilitare la caratterizzazione di spettrometria di massa a valle delle proteine gradiente-purificato della vescicola, dimostrando la rilevazione di molte proteine precedentemente identificati in piccoli EVs. Molte di queste proteine identificate sono coerenti con quelli arricchiti in piccoli EVs endosomal-derivato precedentemente proposto da Théry e Hill labs17,20.
Figura 1 : Descrizione schematica della vescicola isolamento e purificazione dal tessuto tutto. Seguendo pellet EV dissociazione, passaggi di centrifugazione differenziale pre-schiarimento, filtrazione e ultracentrifugazione, di tessuto grezzo può essere risospeso sul fondo di un gradiente di densità di iodixanol per la separazione di galleggiamento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Analisi morfologica e immunophenotypic rappresentativa del tessuto-derivato sve. (A) calcolato densità di ultracentrifugazione seguente di pendenza di iodixanol, calcolato in media su esperimenti indipendenti, evidenziando le frazioni contenenti EVs leggero e denso. (B) rappresentante immunoblots di tessuto-derivato vescicole dimostrando l'isolamento del tumore denso prevalentemente EVs e luce del cervello EVs. Vescicola isolati sono vuotati di proteine non-EV calnexin. H, omogeneato del tessuto. (C) Nanoparticle tracking analysis (NTA) del rappresentante gradiente-purificato tessuto sve. La più piccola particella rilevata in questo campione era 78 nm e circa il 92% delle vescicole rilevati erano 250 nm o più piccoli, coerente con un alto arricchimento del piccoli sve. (D) immagini di microscopia elettronica rappresentante del cervello tessuto-derivano EVs. Scala bar = 200 nm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Sintesi delle proteine della vescicola evidenziato rilevato mediante spettrometria di massa di un rappresentante campione di tessuto-derivato EV. A seguito di EV estrazione e purificazione di gradiente, 10 µ g di proteine di EV in frazione arricchita è stato caricato in un gel di poliacrilammide per elettroforesi e digestione della tripsina in-gel. In questo campione EV tessuto-derivato rappresentativo, un totale di 918 proteine sono state identificate da analisi LC-MS/MS. Peptidi sono stati identificati, analizzati e trovati per essere arricchito in proteine di membrana plasmatica ed exosomal, lisosomiale, come descritto in precedenza16. Qui, dimostriamo la presenza di piccoli EV o exosomal proteine nelle nostre preparazioni che sono state descritte da Théry e Hill labs17,20. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Interesse molto scientifico è stato generato per quanto riguarda i ruoli che piccoli EVs giocare nel microambiente tumorale, come pure in funzione, la maturazione e lo sviluppo dell'organo. Nel complesso, questo studio fornisce un flusso di lavoro ottimizzato per l'estrazione del SVE intatti da intero cervello o esemplari del tumore. Mentre qui abbiamo semplicemente dimostrare l'applicabilità di questa tecnica per EVs derivate da tumore del polmone, questo metodo potrebbe essere facilmente adattato per lavoro su altri tessuti solidi, fornendo opportunità per ulteriore caratterizzazione vivo di ex di piccole vescicole di secrezione che sono di vasto interesse biomedico. Mentre oltre lo scopo di questo studio, futuro confronto del contenuto di EV a quella di originari espressione tissutale sarà anche importante per stabilire l'utilità delle vescicole isolate come biomarcatori del tessuto e la malattia.
Nello studio pubblicato in precedenza dal nostro laboratorio, dimostriamo chiaramente i vantaggi del gradiente di densità di galleggiamento-basato su gradienti di sedimentazione per purificazione di arricchito piccole vescicole. In sostanza, una base di galleggiamento separazione migliora la purificazione delle vescicole evitando migrazione di contaminanti attraverso le frazioni di interesse. Questo principio appare particolarmente importante quando a partire da campioni complessi come intero tessuto. Indipendentemente da ciò, sottolineiamo l'importanza degli studi pre-analitiche conferma delle vescicole isolate descritte, compreso l'esame della morfologia EV attraverso tecniche complementari quali la microscopia elettronica e analisi, nonché di monitoraggio delle nanoparticelle come le analisi biochimiche tra cui immunoblotting. Proteine di EV in frazioni arricchite dovrebbe essere confermata con almeno tre riconosciuti indicatori di EV, compreso uno studi della proteina, come raccomandato dal rapporto Informazioni minime per gli studi di EVs (MISEV) pubblicato nel giornale di extracellulare Vescicole27. Un indicatore EV negativo deve essere dimostrato per essere assente o molto ridotto in frazioni di EV rispetto ai omogenati. Tutti i passaggi sopra indicati sono fondamentali per garantire la qualità di purificazione di piccole vescicole. Inoltre, prime dimostrazioni di coerenza di laboratorio e utente specifiche in EV-contenenti frazioni di densità possono risparmiare tempo prezioso e costo connesso con l'elaborazione e l'analisi di tutte le frazioni seguendo il passo di ultracentrifugazione di pendenza di densità.
È chiaro che vescicole da diversi tessuti possono galleggiare per frazioni leggermente diversa densità, oppure possono separare in prevalentemente leggero o dense sottopopolazioni. Queste differenze sono stati visti in precedenza in tutto cervello-derivato EVs rispetto al SVE raccolte dalle cellule dentritiche coltivate in cultura16,17e sono ulteriormente dimostrato in questo studio. Mostriamo che gli esemplari del tumore del polmone possono harbor prevalentemente che denso EVs piccolo rispetto al più leggero SVE isolato dal tessuto di cervello. Queste differenze evidenziate dal metodo proposto in questo studio possono promuovere preziose indagini la composizione differenziale del SVE, tra cui EVs di tumore che può essere imballato con denso DNA strands28,29,30. A causa di queste differenze nella composizione di EV, abbiamo fortemente sottolineare l'importanza di questi esperimenti tecnici iniziali. Futura applicazione di questa tecnica per l'isolamento del SVE da esemplari diversi del tumore sarà importante determinare se dense SVE sono prevalentemente secernuta nell'interstizio di altri tipi di tumore.
Mentre la purificazione completa di piccoli EVs e isolamento delle sottopopolazioni distinte vescicola rimane una limitazione corrente attraverso laboratori, questo metodo fornisce una base per ulteriori studi caratterizzare piccole vescicole da una diversità del tessuto o del tumore i tipi e può quindi facilitare una maggiore comprensione della diversità di EV. Recente separazione di particelle EV di frazionamento in campo-flusso asimmetrico-flusso ha illuminata la possibilità di carico distinta e funzioni di piccolo (60-80 nm) contro più grandi (90-120 nm) esosomi e ulteriormente identificati un sottoinsieme del limite di non-membrana < 50 nm particelle denominate come "exomeres"31,32. Tuttavia, carico confezionato in queste popolazioni di unica vescicola variava tra linee cellulari, mettendo in evidenza la sostanziale eterogeneità delle vescicole di secrezione e sostenendo l'importanza dell'analisi a vescicola completa in vitro o ex vivo. In questo studio, abbiamo molto probabilmente arricchire per entrambe le classi di esosomi identificati. Una proporzione di piccoli microvescicole con densità simile a esosomi può essere presente negli isolati come bene. Anche se non possiamo escludere la possibilità di exomeres in nostri isolati, vescicole di membrana-limiti erano certamente più abbondante nelle frazioni gradiente arricchite in proteine della vescicola. Oltre a piccoli EVs, oncosomes grande (> 1.000 nm) sono state di recente interesse per cancro biologi33. Mentre il protocollo descritto questo studio filtra vescicole maggiore di 450 nm, l'esclusione di questo passaggio può facilitare l'esame di questi grandi EVs descritto. Esame futuro delle densità associati con varie sottopopolazioni di vescicola sarà importante distinguere queste entità oltre alle loro dimensioni descritte.
Infine, anche se apprezziamo le limitazioni tra cui costi e tempi connessi con questa tecnica proposta, riconosciamo anche la necessità di rigorosi metodi fondamentali per caratterizzare il tessuto EVs e per servire come un confronto di prodotto finale per costantemente metodi più sofisticati e in evoluzione nel futuro. Speriamo che queste tecnologie illuminerà più rapide e clinicamente compatibile con tecniche per estrarre SVE da esemplari medicali o chirurgici.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano il Dr. Richard Nowakowski e la Florida State University laboratorio animale risorse per fornire e la cura per gli animali utilizzati per sviluppare questo protocollo, rispettosamente. Ringraziamo Liu Xia, Dr. Rakesh Singh e il Florida State University traslazionale Science Laboratory per assistenza con il lavoro di spettrometria di massa utilizzato per la caratterizzazione della vescicola a valle, come pure del fondo per la FSU biologico Scienza Imaging Resource l'utilizzo del microscopio elettronico trasmissione in questo studio. Infine, ringraziamo il dottor Mandip Sachdeva (Florida A & M University) per la donazione degli esemplari del tumore utilizzato nello sviluppo di questo metodo. Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni dal programma di ricerca di la Florida reparto di salute Ed ed Ethel Moore Alzheimer malattia assegnato a d. G.M. e J.M.O (6AZ11) e il National Cancer Institute, del National Institutes of Health, premio numero R01CA204621 assegnato a d. G.M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 µm filter | VWR | 28145-505 | |
| 12 mL ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| 5.5 mL ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344057 | |
| anti-Alix antibody | Santa Cruz | sc-7129 | |
| anti-Calnexin antibody | Santa Cruz | sc-11397 | |
| anti-CD63 antibody | Abcam | ab59479 | |
| anti-CD81 antibody | Santa Cruz | sc-9158 | |
| anti-Flotillin 2 antibody | Santa Cruz | sc-25507 | |
| anti-HSC70 antibody | Santa Cruz | sc-7298 | |
| anti-Syntenin-1 antibody | Santa Cruz | sc-100336 | |
| anti-TSG101 antibody | Santa Cruz | sc-7964 | |
| EZQ protein quantification kit | ThermoFisher Scientific | R33200 | |
| FA-45-6-30 rotor | Eppendorf | 5820715006 | |
| FEI CM120 Electron Microscope | TSS Microscopy | ||
| goat anti-rabbit IgG (Fab fragment) | Genetex | 27171 | |
| HALT phosphatase inhibitor (100x solution) | ThermoFisher Scientific | 78420 | |
| HALT protease inhibitor (100x solution) | ThermoFisher Scientific | 78438 | |
| Hibernate E medium | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
| MLS-50 swinging-bucket rotor | Beckman Coulter | 367280 | |
| NanoSight LM10 | Malvern | ||
| Optima MAX-XP Benchtop Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 393315 | |
| Optima XE-100 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94516 | |
| Optiprep | Sigma | D1556 | 60% iodixanol in sterile water solution |
| Q Exactive HF Mass Spectrometer | ThermoFisher Scientific | ||
| rabbit anti-goat IgG | Genetex | 26741 | |
| rabbit anti-mouse IgG | Genetex | 26728 | |
| Refracto 30PX (refractometer) | Mettler Toledo | 51324650 | |
| S-4-104 rotor | Eppendorf | 5820759003 | |
| SW 41 Ti swinging-bucket Rotor | Beckman Coulter | 333790 | |
| Tabletop 5804R centrifuge | Eppendorf | 22623508 |
References
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