Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Hücre dışı veziküller çekme--dan tüm doku

Published: February 7, 2019 doi: 10.3791/59143
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biomedical Sciences, Florida State University College of Medicine

Summary

Burada, küçük hücre dışı veziküller (EVs) tüm dokular, beyin ve tümör örnekleri de dahil olmak üzere gelen yalıtmak için detaylı bir protokol sağlar. Bu yöntem daha da aşağı akım analizleri için sağlam doku EVs ayıklamak için tekrarlanabilir bir teknik sunar.

Abstract

Dolaşımdaki ve interstisyel küçük membran bağlı hücre dışı veziküller (EVs) roman tanılama ya da prognostik biyomarker deneyleri geliştirilmesi için umut verici hedefleri temsil ve büyük olasılıkla a geniş tayf-in ilerleme önemli oyuncular olarak hizmet hastalıklar. EVs rolünü ateş, inflamasyon ve kanser gibi koşullardan patogenezinde daha iyi doku türlerini anlamak ve mevcut araştırma birden çok hücreden salgılanan veziküller karakterizasyonu üzerine odaklanmıştır. Ancak, genel olarak tutarlı ve tekrarlanabilir teknikleri yalıtmak ve veziküller arındırmak için devam eden kalır. Ayrıca, sağlam doku ex vivo EVs, çıkarılması için yöntem pek açıklanmıştır. Burada, biz daha fazla karakterizasyonu için beyin ve tümör örnekleri de dahil olmak üzere bütün taze veya dondurulmuş dokular, ilgi küçük EVs çıkarma için detaylı bir protokol sağlar. Elektron mikroskobu ve veziküller immunophenotypic karakterizasyonu, hem de nicel kütle spektrometresi EV proteinlerin de dahil olmak üzere birden çok aşağı akım analizleri için bu yöntemin uyum göstermektedir.

Introduction

Küçük hücre dışı veziküller (EVs) endosomal elde edilen exosomes ve geniş Biyomedikal ilgi vardır küçük membran-döken microvesicles içerir. Küçük EVs 50-250 nm membran bağlı veziküller biyolojik olarak aktif proteinler, lipidler ve topluca hastalığı işlemleri çok sayıda önemli rol oynarlar inanılıyor nükleik asitler içeren türdeş olmayan nüfusu oluşur. Araştırma ilerleyen özellikle bu veziküller nörodejeneratif ve prion hastalıkları, bulaşıcı süreçleri, otoimmün veya enflamatuar ve tümör büyümesini ve metastaz1,2,3 karıştığı , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. Biyomedikal araştırma EVs önemini hastalık patogenezinde içine hızla yalıtım ve bu veziküller arınma için tekrarlanabilir ve titiz yöntemleri gelişmekte olan paralel faiz oluşturulan.

EV karakterizasyonu tarihsel ve güncel mücadelesine küçük EV altgrupları tamamen ayırmak için yetersizlik olmuştur. Bu büyük ölçüde farklı veziküller Biyogenez yöneten farklı moleküler mekanizmaları bizim sınırlı anlayış nedeniyle mücadeledir. Boyutu, yoğunluk ve biyolojik kargo daha fazla altgrupları arasında örtüşen bu farklılıklar convolutes. Bu sınama bir parçası da yaygın olarak zenginleştirme teknikleri farklı laboratuvarlar arasında tutarsızlık izole veziküller aşağı akım analizi sağlayan ve kategorik EV nüfus aydınlatmak için küresel çaba zayıflatmayı kullanımı olmuştur.

Bu EV karakterizasyonu çoğunluğu veziküller hayvan veya insan vücut sıvıları, plazma, idrar da dahil olmak üzere gelen yalıtmak için teknikleri açıklayan daha yeni içinde vivo çalışmalar ile hücre kültürü süpernatant, tüp bebek koleksiyonundan gerçekleştirildikten dikkati çekiyor ve tükürük. EVs büyük miktarlarda dolaşımda iken, aynı zamanda bu veziküller hücre hücre iletişim olaylarda önemli rol oynarlar ve hücresel doku interstitium içinde bulunan tanıdı. Kanser bağlamında, interstisyel EVs tümör microenvironment tohum kanser hücresi ve metastatik büyüme14,15için modüle özellikle önemli olabilir. Sonuç olarak, geliştirme ve optimizasyon teknikleri veziküller sağlam doku örnekleri ayıklamak için değeri vardır. Bu yöntemleri doğrudan organ - okumak için bir yol sağlar veya tümör küçük biyopsi ve kısmi veya tam organ rezeksiyonu da dahil olmak üzere Klinik numune--dan hasat EVs türetilmiş.

Bu çalışmada ve bizim laboratuvar16tarafından yayımlanan bir önceki rapor, biz birkaç önemli Şu anki endişelerini EV zenginleştirme yöntembilim amacı: 1) yalıtmak ve şu anda en yüksek standartlarda EVs arındırmak için bir tekrarlanabilir tekniğini tanımlamak için alanını kabul; 2) son derece endosomal elde edilen exosomes zenginleştirilmiş küçük EV altgrupları yalıtmak girişimi için; ve 3) bir iletişim kuralı üzerinden sağlam doku örnekleri daha fazla karakterizasyonu amacıyla bu veziküller çıkarma için sağlamak için.

Son zamanlarda, Kowal ve meslektaşları ayırmak ve EV altgrupları karşılaştırılabilir sükroz yoğunluk gradyanlar17daha büyük etkinlik ile arındırmak için nispeten küçük ölçekli iodixanol yoğunluğu degrade nitelendirdi. Atıf çalışmada, dendritik hücre kaynaklı EVs esir nispeten hafif yoğunluk kesir, 1.1 g/mL, bir yoğunluk ile tutarlı olarak son derece exosomes bu mevcut yüksek bir oran ile en tutarlı olduğuna inanılan endosomal proteinler zenginleştirilmiş kesir. Yazarlara göre bu "iyi niyetli" exosomal proteinler tümör duyarlılık gen 101 (TSG101), syntenin-1, CD81, ADAM10, EHD4 ve birkaç annexin proteinler17dahil. Daha sonra doku ayrılma Perez-Gonzalez ve ark18 ve bütün beyin kaynaklı EVs16izole etmek için bir sonraki fark Santrifüjü protokol tarafından açıklanan yöntemin başarılı olması için bu tekniği uyarlanmış. Biz de bu yöntemin aşağı akım nicel ve karşılaştırmalı kütle spektrometresi veziküler protein, daha önce bizim laboratuvar19tarafından açıklanan için sıralı bir protokol birleştirerek EV proteomes karakterize içinde gösterdi. Bu eser bu hangi beyin20frontal korteks EVs zenginleştirilmiş Hill laboratuvarından paralellik.

Bu çalışmada bu tekniği ayrıntılı ve son zamanlarda EVs izolasyonu sağlam akciğer tümörleri için bizim laboratuardan yayınlanan Protokolü uygulamayı genişletebilir. Bilgimizi, bu EVs üzerinden ex vivo tümör numuneler zenginleştirmek için iletişim kuralı tanımlamak için ilk çalışmadır. Yeni tanı Biyomarkörler ve tumorigenesis içindeki rollerine EVs yaygın ilgi göz önüne alındığında, bu yöntem büyük olasılıkla bilimsel araştırmacılar, giderek artan sayıda için değerli olacağını. Klinik bir bakış açısından, interstisyel EVs büyük tanı değeri, özellikle numuneler histolojik değerlendirme sınırlı nerede liman. Burada özetlenen Yöntem hastalığın patogenezinde önemli roller bunlar küçük ortaya çıkarmak yapılacak çalışmalar için önünü taze veya dondurulmuş hayvan veya insan cerrahi numuneler, üzerinden EVs hasat tekrarlanabilir bir tekniği için bir temel sağlayacaktır bizim umudumuz veziküller oynayabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bütün beyin bakım Komitesi (IACUC) Florida State University ve kurumsal hayvan kullanım onayı ile elde edilmiştir. On iki fare beyni toplam (her yaş grubundan 3 beyin: 2, 4, 6 ve 8 ay) C57BL/6 J arka plan için EV çekimi, yukarıda açıklanan16olarak kullanılmıştır. Akciğer tümörü numuneler cömertçe Florida tarım ve mekanik Üniversitesi IACUC onay altında Dr Mandip Sachdeva tarafından bağışlandı. Akciğer tümörleri insan adenokarsinom hücre kültürünü immünyetmezligi Balb/c nu/nu Çıplak fareler içinde yetiştirilen H1975 elde edilmiştir. İki temsilcisi tümör çoğaltır verilerden Bu çalışmada vurgulanmıştır.

Not: Vezikül yalıtım ve arıtma yönteminin şematik bir bakış Şekil 1' de verilmiştir.

1. doku ayrılma ve diferansiyel Santrifüjü

  1. Ayrılma arabellek (papain 10 mg; 5.5 mM L-sistein; 1,1 mM EDTA 67 µM 2-mercaptoethanol) 10 mL başına yaklaşık 0,4 1,0 hazırda beklet-E ortamda hazırlamak g doku. EV zenginleştirme ve arıtma için kullanılan tüm çözümler ultrasaf süzülmüş suda seyreltilmiş unutmayın.
  2. 50 mL konik tüp arabellekte ayrılma bütün taze veya dondurulmuş doku eklemek ve kuluçkaya ılık suda banyo 20 dk. doku için 37 ° C'de kuluçka önce küçük parçalara gerekirse kesilebilir.
  3. Kuluçka fosfataz ve proteaz inhibitörleri Son 1 x konsantrasyon için doku içeren ayrılma arabelleğe ekleyin.
  4. Doku gevşek-fit Dounce homogenizer içeren solüsyonu dökün ve yavaşça örnek başına yaklaşık 30 yavaş vuruş kullanarak doku ayırmak. Vuruş sayısı bağlı doku tutarlılık olarak ayarlanabilir.
  5. 50 mL konik tüp ve 4 ° C'de hücreler ve kalan fibröz veya uyumlu doku parçaları cips için 5 min için 500 x g , santrifüj arabelleğe ayrışmış transferi doku.
  6. Transfer süpernatant temiz 50 mL konik tüp ve 2.000 x g , santrifüj 4 ° C'de cips ve büyük hücresel enkaz atmak için 10 dakika.
  7. Süpernatant tekrar temiz 50 mL konik tüp ve 4 ° C'de istenmeyen daha büyük veziküller veya küçük apoptotik organları cips için 40 min için 10.000 x g , santrifüj aktarmak.
    Not: Daha büyük veziküller ek çalışma için bu pelet istenirse kaydedilebilmesi için.
  8. Süpernatant 0,45 µm filtreden temiz 12 mL ultrasantrifüj tüpüne dikkatle boşaltmak.
    Not: Yoğun fibrotik doku örneklerini kolayca göre filtre uygulanabilir değil. Bu örnekler bir 40 µm hücre süzgeç aracılığıyla filtre sonra seri olarak daha küçük iğne (18 G, 20 G, 22 G) ile 0,45 µm filtreden filtre uygulamadan önce geçti.
  9. 100.000 x g 4 ° C'de küçük EVs cips için 2 h için de örnek ultracentrifuge.
  10. Süpernatant dikkatle boşaltmak ve 5-10 dk, tüpler tarafında kalan sıvı kaldırmak için sık sık dokunarak için ters ultrasantrifüj tüpler bırakın. Kalan sıvı da alıyorum bir vakum pipet kullanarak Aspire.
  11. EV pelet 1,5 mL 0.25 M Sükroz arabellek (10 mM Tris, pH 7,4) yeniden askıya alma. Bu adımda Pelet tam re-süspansiyon emin olmak önemlidir. Bunu yapmak için parafilm vortexing EVs çözüm içine önce ile tüplerin kapak. 15-20 dk önce son girdap karışımı oda sıcaklığında ultracentrifuge tüpler rock.
  12. Kısaca alt kısmındaki tüp sıvı süspansiyon kurtarmak için bir hız fazla 1000 x g , tüpler santrifüj kapasitesi.
  13. Degrade arıtma merdiven aşağı devam etmek veya gerekirse, EV süspansiyon 4 ° C'de gecede saklayabilirsiniz.

2. yoğunluk Gradient arıtma

  1. % 60 iodixanol (su içinde stok çözelti) 1,5 mL % 30 iodixanol içeren son bir çözüm oluşturmak için EVs içeren 1,5 mL sukroz/Tris arabelleğe ekleyin. Pipet yukarı ve çözüm iyice karıştırmak için birkaç kez aşağı. Yüksek iodixanol konsantrasyonu çok viskoz olduğu gibi pipet ucu, çözümde kaybetmemek için dikkatli olun.
  2. EVs 5.5 mL ultrasantrifüj tüp altına içeren % 30 iodixanol arabellek çözüm aktarın.
  3. En az 1,5 mL % 60 iodixanol hisse senedi çözümden Ultrasaf Su örnek başına % 20 ve % 10 iodixanol çözümleri hazırlayın.
  4. 1.3 mL % 20 iodixanol ve dikkatli bir şırınga ve bir 18 G iğne kullanarak alt degrade katman üzerine katman ölçmek. Katmanların yoğunluğu arayüz karıştırma önlemek için iğne ile temas hemen üstünde menisküs ultrasantrifüj tüp içine eğimi tutmak ve çözüm dropwise ekleyin.
  5. 1.2 mL % 10 iodixanol çözeltisi yukarıdaki gibi aynı teknikle % 20 iodixanol katman üzerine katman.
  6. Dikkatle denge ve ultrasantrifüj tüpler rotor kovalar ve santrifüj 50 dk 4 ° C'de bir salıncak-kova Open End-268,000 x g de yüklemek Santrifüj hızlanma ve yavaşlama hızı yoğunluğu tabakalarının bozulma önlemek için izin verilen en düşük oranları ayarlayın.
  7. On 1.5 mL microcentrifuge tüpler yoğunluğu geçişin kesirler için 1'den 10 karşılık gelecek şekilde her örnek için etiket. Kesir 1 kesir 10 son kaldırıldı alt kısmı ise ilk, kaldırılacak olan en üstteki fraksiyonu belirlenmiştir.
  8. Degrade ultrasantrifüj tamamladıktan sonra yavaşça tüpler rotor kova çıkarın ve istikrarlı bir tutucuya yerleştirin. Veziküller görünür bir grup kez faiz kısmını görülecektir. Geçişin üstten 490 µL on seri kesirler ilgili tüpler içine pipet. Sıvı bulaşıcı proteinlerin büyük olasılıkla içeren tüp alt kısmında kalan küçük bir miktar olacaktır. Bu örnek, atılan veya isterseniz bir olarak kesir 11 korudu.
  9. Bir Refraktometre kullanarak kesirler Kırılma endeksi ölçmek. Bu da örnek korunması gerekli ise paralel olarak çalıştır denetim degrade ile gerçekleştirilir. Refraktometre yüzeyine iodixanol içeren her kesir 20-30 µL pipette ve yoğunluğu bilinen iodixanol yoğunlukları için kırılma endeksi karşılaştırarak tahmin ediyoruz. Kesirler gecede iodixanol içeren çözüm sonraki ultrasantrifüj yıkama adıma devam etmeden önce gerekli saklanabilir olduğunu unutmayın.
  10. Her kesir bir temiz 12 mL ultrasantrifüj tüp aktarın. 1 fosfat tamponlu tuz (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4) x 5 mL tüp için yukarı ve aşağı yavaş yavaş pipetting tarafından ekleyip karıştırın.
    Not: PBS için örnekleri eklendi steril PBS 0,22 µm filtresi filtre ve tuz yağış önlemek için oda sıcaklığında saklanması tarafından parçacık bırakmayan, olmalıdır.
  11. 1 x PBS bir ek 6 mL dön tekrar ve dikkatlice karıştırın.
  12. Ultracentrifuge tüpler 100.000 x g 4 ° C'de küçük veziküller yeniden cips için 2 h için de. Süpernatant dikkatle boşaltmak ve veziküller protein analizi (adım 3) için lizis veya re-süspansiyon EVs morfolojik analiz (adım 5) için önce kuru tüpler dokunun.

3. lizis ve EV proteinlerin Immunoblot onay

Not: Morfolojik karakterizasyonu veya biyolojik aktivitesi için tüm veziküller korunması isteniyorsa, araştırmacılar doğrudan adım 5'e geçebilirsiniz. İlk deneylerde veya kütle spektrometresi analiz önce kurtarılan tüm kesirler kesirler EV proteinler ile onaylamak için immunoblot tarafından analiz edilmelidir.

  1. EVs protein analizi için koşullar EV Pelet ultracentrifuge tüp için güçlü lizis arabellek (%5 SDS, 10 mM EDTA, 120 mM Tris-HCl pH 6.8, %2.5 2-mercaptoethanol, 8 M üre) 40 µL proteaz inhibitörü ilavesi ile ekleyin.
    Not: Proteinler antikor tespiti için koşullar sigara azaltmak isterseniz, 2-mercaptoethanol güçlü lizis arabelleği için ultrasaf su yerine.
  2. Pelet tam re-süspansiyon ve EVs lizis arabelleği ultrasantrifüj parafilm yerleştirerek olun Tüp, vortexing şiddetle, son bir girdap önce oda sıcaklığında 20 dk için sallanan.
  3. Kısa bir süre için tüm örnek birimi kurtarmak için 30-60 s 1000 x g de santrifüj kapasitesi. Örnek bir yeni 1.5 mL microcentrifuge tüp ve mağaza-80 ° c-20 ° C'de daha fazla işleme kadar aktarın.
  4. Saf lysates immunoblot analiz için hazırlamak için 1 x son bir konsantrasyon örnekleri için 5 x Laemmli örnek arabellek (% 10 SDS, 250 mM Tris pH 6.8, 1 mg/mL bromophenol mavi, 0,5 M DTT, % 50 gliserol, %5 2-mercaptoethanol) ekleyin.
    Not: Koşullar sigara azaltmak isterseniz, DTT ve 2-mercaptoethanol Ultrasaf Su ile değiştirin.
  5. Bütün doku homogenate denetimleri istenen, parçalayıcı Eğer üre-içeren güçlü dokusunda lizis arabellek proteaz inhibitörü ile yukarıda ayrıntılı, 10.000 x g kalan hücre dışı matriks, tüm hücreler, atmak 10 dk de santrifüj kapasitesi veya sağlam hücresel enkaz. 5 x Laemmli örnek arabellek doku homogenate 1 x son bir konsantrasyon için ekleyin.
  6. 95 ° c 5-10dk için EV veya doku homogenate örnekleri içeren örnek arabellek kaynatın, sonra yük eşit birim (0,1-0,3 denk gelen doku malzeme başlayan g; 1-2 µg arıtılmış EV protein), kesirler 1-%10 10 SDS-sayfa jel içine. Eşit kitle doku homogenate yükleyin. Örnekleri daha fazla hacim algılaması için daha az duyarlı antikorlar tarafından gerekli olabilir.
  7. Jel Elektroforez ve Western blot analizi ile arıtılmış lysates EV proteinler onaylamak ve göreli EV bereket kesirler karşılaştırmak için daha önce detaylı21 olarak devam edin.
    Not: Bir kez EV protein tekrarlanarak tutarlı kesirler gösterdi, adım 2.12 içinde açıklanan son ultrasantrifüj yıkama faiz degrade kesirler için sınırlı olabilir.

4. EV Protein miktar

  1. EV proteinlerin hassas miktar daha ayrıntılı bir çözümleme için isterseniz floresans tabanlı bir deterjan ve üre uyumlu tahlil kullanın (bkz. Tablo malzeme). Floresans tabanlı bazı deneyleri bromophenol mavi EV Pelet (içinde adım 2.12) doğrudan lizis bu arabellekte tercih Eğer kolaylaştırılması Laemmli örnek, arabelleğindeki ile uyumlu olduğunu unutmayın.
  2. Anılan floresans tabanlı protein miktar kiti kullanılıyorsa, nokta 1 µL örnek veya standardında en az sağlanan filtre kağıt üzerinde çoğaltın ve protein miktar üreticinin yönergelerine uygun devam.

5. EV morfoloji karakterizasyonu

  1. Son Santrifüjü yıkadıktan sonra adım 2.12 bütün veziküller incelemek, iyice EV Pelet parçacık ücretsiz 1 x PBS yeniden askıya alabiliriz. Mağaza EVs donma-çözülme döngüsü önlemek için artık işleme kadar bir hafta daha 4 ° C'de.
    Not: Daha önce sürekli kesirler ilgi için morfolojik analiz sınırlamak için immunoblot Analizi tarafından zenginleştirilmiş EV protein içeren kesirleri doğruladı faydalıdır.
  2. Nanopartikül konsantrasyonu ve müstahzarları, veziküller boyutunu daha önce ayrıntılı22olarak belirlemek için tüm EV örnekleri üzerinde izleme çözümlemesi gerçekleştirin.
  3. EV kara delik karakterize ve boyut ölçüleri veziküller, elektron mikroskobu tarafından istenirse onaylayın. EM ızgaralar adım 5.123takip vezikül süspansiyonlar hazırlanan veya alternatif olarak blok hazırlıkları24 kimden adım 2.12 takip granül olarak işlenebilir.

6. içinde-arıtma ve tripsin sindirim kütle spektrometresi analiz için jel

  1. EV proteomes kütle spektrometresi tarafından karakterizasyonu isterseniz, eşit kesirler EVs bir önceden döküm polyacrylamide ayırmak ve proteinler arındırmak için jel içeren kütlesi (en az 10 µg protein) yükleyin. Üretici tarafından sağlanan önceden döküm jelleri örnekleri tanıtılıyor proteinler (örneğin, keratin) kirletici potansiyeli düzeyde azaltmak için tercih edilmektedir.
  2. Polyacrylamide jel protein arıtma, örnek en az 0,5 inç girmek sonra tamir ve Coomassie boya, daha önce ayrıntılı25içinde açıklandığı gibi leke.
  3. Şerit 1 mm3 küpler olarak daha önce ayrıntılı19,26tripsin sindirim için kesilmiş.
  4. Ayrıntı16' belirtilen parametrelere göre kütle spektrometresi tarafından sindirilmiş peptid örneği 5 µL LC-MS/MS enstrüman ayrılması analitik sütun ve daha sonraki analiz için yüklemek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Doku ayrılma, farklı aralıklarla ve veziküller degrade arıtma şematik bir bakış Şekil 1' de görüntülenir. Degrade saf EVs morfolojik ve immunophenotypic onay Şekil 2' de vurgulanır. Tekrarlanabilir yoğunlukları ultrasantrifüj % 10-30 iodixanol geçişin aşağıdaki diyagram, yukarı doğru kesir 2 (açık EVs) ve kesir 5 (yoğun EVs), geçiş iki ayrı vezikül nüfus ile doku türü bağımlı gösterilir. Degrade kesirler temsilcisi immunoblots verimli ayrılık ve küçük tümör kaynaklı EVs kesir 5 arıtma sergi. Belirtmek gerekirse akciğer tümörü örnekler içinde yoğun EVs ışık daha önce tüm beyin dokusundan hasat EVs (içinde kesir 2) karşılaştırıldığında zenginleştirilmiş ortaya çıktı burada vurgulanan tekrar. EVs bir küresel doku analizi ortaya, benzersiz dokular tarafından üretilen EVs farklı yoğunluğunu belirlemek ilginç olacak. Temsilcisi nanopartikül izleme analizleri ve elektron mikroskobu doku kaynaklı veziküller baskın vezikül içeren kesir, zenginleştirme ve bütün veziküller ile bilinen boyutu tutarlı korunması ve yapısını göstermek küçük EVs. Son olarak, Şekil 3 aşağı akım kütle spektrometresi karakterizasyonu degrade saf vezikül proteinlerin kolaylaştıran bu yöntemin yarar gösteren birçok protein daha önce küçük EVs tanımlanmış tespiti vurgulamaktadır. Daha önce Théry ve Hill labs17,20tarafından önerilen küçük endosomal elde edilen EVs zenginleştirilmiş tutarlı saptanan bu proteinler çoğu.

Figure 1
Resim 1 : Vezikül yalıtım ve arıtma bütün dokusundan şematik bakış. Doku ayrılma, ön temizleme fark Santrifüjü adımları, filtrasyon ve ultrasantrifüj, ham EV peletleri aşağıdaki alt flotasyon ayırma için bir iodixanol yoğunluğu geçişin resuspended. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : Doku kaynaklı EVs temsilcisi morfolojik ve immunophenotypic analizi. (A)hesaplanan ışık ve yoğun EVs içeren kesirleri vurgulayarak bağımsız deneyler ortalama olarak iodixanol degrade aşağıdaki ultrasantrifüj yoğunlukları. (B) temsilcisi immunoblots yalıtım ağırlıklı yoğun tümör EVs ve ışık gösteren doku kaynaklı veziküller ile EVs beyin. Vezikül yalıtır EV protein calnexin tükenmiş. H, doku homogenate. (C) nanopartikül temsilcisi degrade saf doku EVs izleme çözümlemesi (NTA). Bu örnekteki tespit edilen en küçük parçacık 78 yapıldı nm ve yaklaşık %92-in veziküller tespit edildi 250 nm veya daha küçük, küçük EVs yüksek bir zenginlik ile tutarlı. (D) beyin doku kaynaklı EVs temsilcisi elektron mikroskobu görüntüleri. Ölçek Bar = 200 nm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : Vurgulanan vezikül proteinler özetini doku kaynaklı EV örnek bir temsilcisi kütle spektrometresi tarafından algılandı. EV çıkarma ve degrade arıtma 10 µg EV protein zenginleştirilmiş kesir polyacrylamide Jel Elektroforez ve jel tripsin sindirim için içine yüklendi. Bu temsilcisi doku kaynaklı EV örnek, toplam 918 proteinlerin LC-MS/MS analizi ile tespit edildi. Peptidler tespit, analiz ve exosomal, lizozomal ve plazma membran proteinlerinin yukarıda açıklanan16olarak zenginleştirilmiş için bulundu. Burada, Théry ve Hill labs17,20tarafından açıklanan hazırlıklarımız içinde küçük EV veya exosomal protein varlığını göstermektedir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Çok bilimsel ilgi küçük EVs tümör microenvironment yanı sıra organ gelişimi, olgunlaşma ve işlev oynamak rolleri açısından oluşturuldu. Genel olarak, bu çalışmada olduğu gibi EVs çekme--dan tüm beyin veya tümör numuneler için en iyi duruma getirilmiş bir iş akışı sağlar. Burada biz sadece tümör kaynaklı akciğer EVs bu tekniğe uygulanabilirliği göstermek iken, bu yöntem kolayca daha fazla ex vivo karakterizasyonu olan küçük salgılanan veziküller dinleyicilere diğer sağlam dokular üzerinde çalışmak için adapte olabilir geniş Biyomedikal faiz. Süre EV içeriği olan doku ifade kaynaklanan için gelecekteki karşılaştırılması da izole veziküller programı doku ve hastalık biyolojik olarak kurmak önemli olacaktır Bu çalışmanın kapsamı dışındadır.

Daha önce bizim laboratuvar tarafından yayınlanan çalışmada açıkça flotasyon tabanlı yoğunluk gradient avantajları sedimantasyon degradeler zenginleştirilmiş küçük veziküller arınma için gösteriyor. Özünde, bir yüzdürme tabanlı ayrılık veziküller arıtma kirletici geçiş faiz kesirler ile kaçınarak artırır. Bu ilke tüm doku gibi karmaşık örnekleri başlayarak özellikle önemli görünür. Ne olursa olsun, biz izole veziküller açıklanan, elektron mikroskobu ve izleme çözümlemesi, de nanopartikül gibi tamamlayıcı teknikleri EV morfoloji incelenmesi de dahil olmak üzere önceden analitik onay çalışmalarının önemini vurgulamak biyokimyasal analizler immunoblotting dahil. EV proteinler zenginleştirilmiş kesirler teyit en az üç tanınan EV işaretleyicilerle EVs çalışmaları için en az bilgi (MISEV) raporu tarafından önerildiği gibi bir tetraspanin protein, dahil olmak üzere ekstraselüler günlüğü içinde yayınlandı Veziküller27. Negatif bir EV marker yok olmak için gösterdiği veya EV kesirler için doku homogenates karşılaştırıldığında son derece düşük. Yukarıda belirtilen tüm adımları küçük vezikül arıtma kalite güvencesi için büyük önem taşımaktadır. Buna ek olarak, EV içeren yoğunluğu kesirler laboratuvar ve kullanıcıya özel tutarlı erken gösteri değerli zaman ve işleme ve analiz yoğunluğu degrade ultrasantrifüj adım takip tüm kesirler ile ilişkili maliyet kaydedebilirsiniz.

Bu veziküller çeşitli dokularda üzerinden biraz farklı yoğunluk kesirler savrulabilir veya ağırlıklı ışık veya yoğun altgrupları ayrı açıktır. Bu farklılıklar daha önce beyin kaynaklı EVs dendritik hücrelerden yetiştirilen kültür16,17' hasat EVs karşılaştırıldığında ve daha fazla bu çalışmada gösterilenSQL ServerKitaplar, bütün olarak görülmüştür. Akciğer tümörü numuneler çoğunlukla yoğun küçük EVs beyin dokusundan izole hafif EVs karşılaştırıldığında olabilir liman göster. Bu çalışmada önerilen yöntem tarafından vurgulanan bu farklılıklar EVs, yoğun DNA iplikçikleri28,29,30ile Paketli tümör EVs dahil olmak üzere farklı bileşimi içine değerli sorular teşvik edebilir. EV kompozisyon bu farklılıkları nedeniyle, bu ilk teknik deneyler önemini güçlü altını çiziyor. Çeşitli tümör örnekler üzerinden EVs yalıtım için bu tekniğin yönelik uygulama yoğun EVs diğer tümör türleri de interstitium salgılanan ağırlıklı olup olmadığını belirlemek önemli olacaktır.

Küçük EVs tam arıtma ve farklı vezikül altgrupları işlemleri olan geçerli bir sınırlama laboratuvarlar arasında kalırken, bu yöntem doku veya tümör çeşitlilik gelen küçük veziküller karakterize etmek daha fazla çalışmalar için bir temel sağlar türleri ve bu nedenle EV çeşitlilik daha büyük bir anlayış kolaylaştırabilir. Son EV moleküller tarafından asimetrik akışı alan Akış ayırma ayrılması daha büyük (90-120 nm) exosomes karşı farklı kargo imkanı ve işlevleri küçük (60-80 nm) aydınlatılmış ve membran bağlı alt kümesini daha da tespit < 50 nm parçacıklar "exomeres"31,32cinsinden. Ancak, bu benzersiz vezikül nüfus içinde paketlenmiş kargo salgılanan veziküller önemli heterojen vurgulama ve kapsamlı tüp bebek veya ex vivo vezikül tahlilinin önemi destekleyen hücre hatları üzerinden çeşitli. Bu çalışmada, büyük olasılıkla tespit exosomes her iki sınıflar için zenginleştirmek. Exosomes için benzer yoğunlukları ile küçük microvesicles bir kısmı yalıtır de mevcut olabilir. Ne kadar exomeres olasılığı bizim yalıtır dışlayamazsınız, membran bağlı veziküller vezikül protein zenginleştirilmiş degrade kesirler kesinlikle en bol edildi. Ek olarak küçük EVs, büyük oncosomes (> 1000 nm) kanser biyologlar33son ilgi olmuştur. Protokol açıklandığı iken bu çalışmada veziküller 450 büyük filtreler nm, bu adımın dışlama açıklanan bu büyük EVs incelenmesi kolaylaştırmak. Yoğunlukları ile çeşitli vezikül altgrupları ilgili gelecekteki incelenmesi bu varlıklar açıklanan boyutlarının yanı sıra ayırt etmek önemli olacaktır.

Maliyet ve zaman bu önerilen tekniği ile ilgili de dahil olmak üzere sınırlamalar için teşekkür ederiz de, son olarak, biz da doku EVs karakterize ve son ürün karşılaştırma için sürekli hizmet etmek titiz temel yöntemleri için ihtiyaç kabul gelişen ve daha gelişmiş yöntemleri içinde belgili tanımlık gelecek. Bunlar teknolojileri ilerleyen Umarım EVs tıbbi veya cerrahi örnekler ayıklamak için daha hızlı ve klinik olarak uyumlu teknikleri yanacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Yazarlar Dr Richard Nowakowski ve sağlayan ve bu iletişim kuralı, saygıyla geliştirmek için kullanılan hayvanlar için bakım için Florida Devlet Üniversitesi laboratuvar hayvan kaynakları teşekkür ederiz. Biz aşağı akım vezikül karakterizasyonu yanı sıra FSU biyolojik bilim görüntüleme kaynak tesis için kullanılan kütle spektrometresi çalışma ile Xia Liu, Dr Rakesh Singh ve Florida Devlet Üniversitesi translasyonel bilim laboratuvarı yardım için teşekkür Transmisyon Elektron mikroskobu bu çalışmanın kullanımı. Son olarak, Dr Mandip Sachdeva (Florida A & M Üniversitesi) Bu yöntem geliştirmede kullanılan tümör örneklerin bağış için teşekkürler. Bu çalışmada Florida Bölümü Sağlık Ed ve Ethel Moore Alzheimer hastalığı araştırma D.G.M. ve J.M.O (6AZ11) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Ödülü numarası altında Ulusal Kanser Enstitüsü için ödül programı gelen hibe tarafından desteklenmiştir D.G.M. için verilen R01CA204621

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 µm filter VWR 28145-505
12 mL ultracentrifuge tubes Beckman Coulter 331372
5.5 mL ultracentrifuge tubes Beckman Coulter 344057
anti-Alix antibody Santa Cruz sc-7129
anti-Calnexin antibody Santa Cruz sc-11397
anti-CD63 antibody Abcam ab59479
anti-CD81 antibody Santa Cruz sc-9158
anti-Flotillin 2 antibody Santa Cruz sc-25507
anti-HSC70 antibody Santa Cruz sc-7298
anti-Syntenin-1 antibody Santa Cruz sc-100336
anti-TSG101 antibody Santa Cruz sc-7964
EZQ protein quantification kit ThermoFisher Scientific R33200
FA-45-6-30 rotor  Eppendorf 5820715006
FEI CM120 Electron Microscope TSS Microscopy
goat anti-rabbit IgG (Fab fragment) Genetex 27171
HALT phosphatase inhibitor (100x solution) ThermoFisher Scientific 78420
HALT protease inhibitor (100x solution) ThermoFisher Scientific 78438
Hibernate E medium ThermoFisher Scientific A1247601
MLS-50 swinging-bucket rotor Beckman Coulter 367280
NanoSight LM10 Malvern
Optima MAX-XP Benchtop Ultracentrifuge  Beckman Coulter 393315
Optima XE-100 ultracentrifuge Beckman Coulter A94516
Optiprep Sigma D1556 60% iodixanol in sterile water solution
Q Exactive HF Mass Spectrometer ThermoFisher Scientific
rabbit anti-goat IgG Genetex 26741
rabbit anti-mouse IgG Genetex 26728
Refracto 30PX (refractometer) Mettler Toledo 51324650
S-4-104 rotor Eppendorf 5820759003
SW 41 Ti swinging-bucket Rotor Beckman Coulter 333790
Tabletop 5804R centrifuge Eppendorf 22623508

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bobrie, A., Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Exosome secretion: molecular mechanisms and roles in immune responses. Traffic. 12 (12), 1659-1668 (2011).
  2. Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
  3. Howitt, J., Hill, A. F. Exosomes in the Pathology of Neurodegenerative Diseases. Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26589-26597 (2016).
  4. Sardar Sinha, M., et al. Alzheimer's disease pathology propagation by exosomes containing toxic amyloid-beta oligomers. Acta Neuropathologica. 136 (1), 41-56 (2018).
  5. Meckes, D. G., Raab-Traub, N. Microvesicles and viral infection. Journal of Virology. 85 (24), 12844-12854 (2011).
  6. Meckes, D. G. Exosomal communication goes viral. Journal of Virology. 89 (10), 5200-5203 (2015).
  7. Schorey, J. S., Cheng, Y., Singh, P. P., Smith, V. L. Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions. EMBO Reports. 16 (1), 24-43 (2015).
  8. Zhang, X., et al. Exosomes in cancer: small particle, big player. Journal of Hematology Oncology. 8, 83 (2015).
  9. Janas, A. M., Sapoń, K., Janas, T., Stowell, M. H. Exosomes and other extracellular vesicles in neural cells and neurodegenerative diseases. Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (6), 1139-1151 (2016).
  10. Chahar, H. S., Bao, X., Casola, A. Exosomes and Their Role in the Life Cycle and Pathogenesis of RNA Viruses. Viruses. 7 (6), 3204-3225 (2015).
  11. Pegtel, D. M., Peferoen, L., Amor, S. Extracellular vesicles as modulators of cell-to-cell communication in the healthy and diseased brain. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1652), (2014).
  12. Raposo, G., et al. B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles. Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).
  13. Katsiougiannis, S. Extracellular Vesicles: Evolving Contributors in Autoimmunity. Forum on immunopathological diseases and therapeutics. 6 (3-4), 163-170 (2015).
  14. Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).
  15. Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
  16. Hurwitz, S. N., et al. An optimized method for enrichment of whole brain-derived extracellular vesicles reveals insight into neurodegenerative processes in a mouse model of Alzheimer's disease. Journal of Neuroscience Methods. 307, 210-220 (2018).
  17. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).
  18. Perez-Gonzalez, R., Gauthier, S. A., Kumar, A., Levy, E. The exosome secretory pathway transports amyloid precursor protein carboxyl-terminal fragments from the cell into the brain extracellular space. Journal of Biological Chemistry. 287 (51), 43108-43115 (2012).
  19. Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. An Adaptable Polyethylene Glycol-Based Workflow for Proteomic Analysis of Extracellular Vesicles. Methods in Molecular Biology. 1660, 303-317 (2017).
  20. Vella, L. J., et al. A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885 (2017).
  21. Hurwitz, S. N., et al. CD63 Regulates Epstein-Barr Virus LMP1 Exosomal Packaging, Enhancement of Vesicle Production, and Noncanonical NF-.κB Signaling. Journal of Virology. 91 (5), (2017).
  22. Hurwitz, S. N., Conlon, M. M., Rider, M. A., Brownstein, N. C., Meckes, D. G. Nanoparticle analysis sheds budding insights into genetic drivers of extracellular vesicle biogenesis. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 31295 (2016).
  23. Lässer, C., Eldh, M., Lötvall, J. Isolation and characterization of RNA-containing exosomes. Journal of Visualized Experiments. (59), e3037 (2012).
  24. Jung, M. K., Mun, J. Y. Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (131), (2018).
  25. Meckes, D. G. Affinity purification combined with mass spectrometry to identify herpes simplex virus protein-protein interactions. Methods in Molecular Biology. 1144, 209-222 (2014).
  26. Rider, M. A., Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. ExtraPEG: A Polyethylene Glycol-Based Method for Enrichment of Extracellular Vesicles. Scientific Reports. 6, 23978 (2016).
  27. Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
  28. Thakur, B. K., et al. Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection. Cell Research. 24 (6), 766-769 (2014).
  29. Balaj, L., et al. Tumour microvesicles contain retrotransposon elements and amplified oncogene sequences. Nature Communications. 2, 180 (2011).
  30. Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nature Cell Biology. 10 (12), 1470-1476 (2008).
  31. Zhang, H., et al. Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation. Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).
  32. Zijlstra, A., Di Vizio, D. Size matters in nanoscale communication. Nature Cell Biology. 20 (3), 228-230 (2018).
  33. Meehan, B., Rak, J., Di Vizio, D. Oncosomes - large and small: what are they, where they came from. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 33109 (2016).

Tags

Kanser Araştırmaları sayı: 144 exosomes hücre dışı vezikül doku beyin tümör kütle spektrometresi ex vivo oncosomes biyolojik yoğunluk gradient
Hücre dışı veziküller çekme--dan tüm doku
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hurwitz, S. N., Olcese, J. M.,… More

Hurwitz, S. N., Olcese, J. M., Meckes Jr., D. G. Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue. J. Vis. Exp. (144), e59143, doi:10.3791/59143 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter