Summary
אנחנו מדווחים על שיטה פשוטה רב-תכליתי לביצוע פלורסנט לחיות-הדמיה של עלים תודרנית לבנה על פני תקופה ארוכה של זמן. אנו משתמשים צמח תודרנית הטרנסגניים לבטא גן כתב פלורסנט תחת השליטה של יזם הקשורות חסינות כדוגמה להשגת הבנה ייתכן של תגובות חיסוניות הצמח.
Abstract
התגובה החיסונית צמח המשויך תעתיק הגנום כולו התכנות מאותחלת באתר של זיהום. לפיכך, התגובה החיסונית מוסדר במרחב של חנותם. השימוש של גנים פלורסנט תחת השליטה של יזם הקשורות חסינות בשילוב עם מיקרוסקופ פלורסצנטיות אוטומטיות הוא דרך פשוטה להבין ייתכן רגולציה של הצמח חסינות. בניגוד הרקמות שורש נעשה בהם שימוש במשך מספר intravital פלורסנט הדמיה ניסויים שונים, קיימים כמה דוגמאות הדמיה לחיות פלורסנט ברקמות עלה נתקל מערך של זיהומים חיידקים באוויר. לכן, פיתחנו שיטה פשוטה כדי לטעון עלים של צמחים תודרנית לבנה עבור הדמיה לחיות תאים על פני תקופה ארוכה של זמן. השתמשנו הטרנסגניים צמחים תודרנית לבטא את genefused צהוב חלבון פלואורסצנטי (YFP) לאות לוקליזציה גרעינית (שקל) תחת השליטה של האמרגן של גנים הקשורים להגנה סמן, Pathogenesis-Related 1 ( PR1). חדרנו עלה הטרנסגניים עם Pseudomonas syringae pv. עגבניות DC3000 (avrRpt2) זן (Pst_a2) וביצע ויוו הדמיה בצילום מואץ של האות YFP עבור סכום כולל של 40 h באמצעות stereomicroscope של קרינה פלואורסצנטית אוטומטית. יכול להיות מנוצל שיטה זו לא רק עבור מחקרים על תגובות חיסוניות הצמח, אלא גם עבור ניתוחים של התפתחותית ואירועים שונים התגובות סביבתיים המתרחשים ברקמות עלה.
Introduction
התגובה החיסונית צמח כרוך דינמי תעתיק התכנות מוסדר על ידי שעתוק מספר גורמים כמו גם phytohormones1. ההצטברות של נתונים transcriptome מספק הזדמנויות לאיסוף מידע על המערכת החיסונית צמח: לדוגמה, מבנה הרשת איתות מפלי2. עם זאת, הידע שלנו על הדינמיות יכולות של הצמח חסינות נשאר עדיין מוגבלת3,4,5.
במחקרים קודמים, ייתכן בקרת גנים הקשורים להגנה בעיקר נותחה באמצעות היברידיזציה וβ-glucuronidase (גאס) כתב assay6,7,8. שיטות אלה מאפשרים לנו לדמיין את הפעלת גנים ברמת השעתוק של גנים שונים עניין באתרו. עם זאת, הליכים אלה דורשים קיבוע כימי של דגימות, ובכך לגרום לאובדן כל המידע טמפורלית. אירועים ביולוגיים, כגון חסינות, התקדמות לאורך זמן. השימוש לוציפראז ככתב אפשרה לכידתו של הדינמיקה הטמפורלי של האמרגן של ריבית3. אולם, מבוססי לוציפראז וזמינותו מחייבת של המצע יקר וגלאים רגישים. כדי להגדיל את ההבנה שלנו של היבטים ייתכן של התגובה החיסונית צמח באמצעות הליך פשוט, יצרנו הטרנסגניים תודרנית לבנה צמחים לבטא את הצהוב חלבון פלואורסצנטי (YFP) הגן דבוקה לוקליזציה גרעיני אות (YFP-NLS) תחת השליטה של האמרגן של הגן סמן הקשורים להגנה, Pathogenesis-Related 1 (PR1)9. השתמשנו כלורופיל autofluorescence, סמן של תאים חיים, כדי ללכוד את תהליך מוות תאי מתוכנת (יהלומים), אשר מתרחשת לעתים קרובות במהלך המופעלות אפקטור חסינות (אתי), סוג של צמח חסינות הנגרמת על ידי זיהום פתוגן מסוים9 , 10. פיקוח על הדינמיקה הטמפורלי של קרינה פלואורסצנטית עוצמת האות ב בחופשיות הזזת אובייקטים, כגון חיים תודרנית עלים, דורש תמונה מורכבת עיבוד תוכנה שנבנו בתוך הבית או זמינים מסחרית. לחלופין, מניעת העברת דגימות היא שיטה פשוטה לפתרון הבעיה. . הנה, פיתחנו שיטה מגוונים ופשוטים להרכבת חי עלים של צמח תודרנית הטרנסגניים להשגחה לטווח ארוך תחת stereomicroscope קרינה פלואורסצנטית אוטומטית. השיטה מאפשרת לנו ללכוד את האמרגן הדינמיקה בתוך אדמה שגודלו צמח שלם משאיר על פני כמה ימים.
Protocol
הערה: חשוב למנוע שינה תנועת המגורים עלים דגימות במהלך דימות זמן לשגות. כדי למזער לחץ מכני על עלים, הכרחי קיבוע עדין של עלים. דגימות עלים מוכן כראוי היחידה להפיק תמונות בצילום מואץ מתאים ניתוחים שונים של התמונה. פרוטוקול באמצעות צמחים תודרנית הטרנסגניים לבטא YFP NLS פיוז'ן תחת השליטה של יזם ג'ין PR1 (pPR1-YFP-NLS צמחים), Pseudomonas syringae pv. עגבניות DC3000 זן (avrRpt2) (Pst_a2) מתואר להלן דוגמה.
1. הכנת הצמחים, פתוגנים
- למלא מגש הכנס תא פלסטיק (טבלה של חומרים) בלוק אדמה.
- לזרוע זרע תודרנית הטרנסגניים אחד בכל תא (איור 1א').
- להעביר את המגש לחדר צמיחה ומתוחזק על 23 ° C, לגדל את הצמחים תחת אור לבן רציף במשך 2-3 שבועות.
- יומיים לפני חיסון הפתוגן, צובעות Pseudomonas syringae pv. עגבניות DC3000 avrRpt2 זן (Pst_a2) של מניה גליצרול אל NYG בינונית (5 g/L peptone, תמצית שמרים 3 g/L, 20 מ"ל/L גליצרול, אגר בקטריולוגית 15 גרם/ליטר, pH 7.0) המכיל 100 מ ג/ליטר ריפאמפיצין ו- 50 מ"ג/ליטר kanamycin, דגירה-28 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות.
- לקצור תאי חיידקים המופיעים על פני השטח של המדיום באמצעות טיפים פלסטיק, להעביר אותם ל צינור פלסטיק המכיל 10 מ מ MgCl2, resuspend. מודדים את צפיפות אופטית (OD) של הפתרון על 600 nm (OD600). התאם את הריכוז תא הסופי של תאים חיידקיים 108 המושבה היווצרות יחידות (CFU) / mL, בדרך כלל המתאים OD600 = 0.211.
2. הפתוגן חיסון
- בזהירות לגזור פקק התא המכיל את צמח 2-3-בת שבוע ללא פגיעה הצמח. להגדיר את התא במגש הכנס תא ריק (2 x 2 תאים מספיקים) כדי לשמור על איזון טוב (איור 1B).
- בחר עלים בריאים בעליל על חיסון. השלישי, בדרך כלל, הרביעי, החמישי עלים (#3, #4 ו #5, בהתאמה, ב- איור 1C) מהחלק התחתון של הצמח הם קל לטפל. שימוש יוצא מאותו מיקום סדרה של ניסויים על הפארמצבטית טוב יותר. מים הקרקע להחזיק את הצמח לפני חיסון עבור הדמיה בצילום מואץ לטווח ארוך.
- לחילופין, במקרה של ניתוח היזמים מגיבים ללחץ כגון pPR1, כדי להבטיח כי צמחים לא לחוצה באופן טבעי, לבחון העלים תחת stereomicroscope קרינה פלואורסצנטית לפני חיסון הפתוגן כדי לוודא העדר YFP אות. אל תכלול יוצא מראה YFP אות מן הניסוי.
- ללבוש כפפות גומי חד פעמיות לפני חדירה כדי להימנע ממגע ישיר עם המחלה. באמצעות 1 מ"ל needleless פלסטיק מזרק, בזהירות לחדור את הצד abaxial של העלה עם המתלה חיידקי (108 CFU/mL)11 (איור 1D). חיסון של חלק קטן על חצי אחד של העלה מאפשר ויזואליזציה טובה של פעילות pPR1 ; האזור הסתנן הופך לגלוי ירוקה כהה בצבע לעומת העלה הנותרים. להיזהר מאוד לא לגרום נזק מכני העלה במהלך חדירה.
הערה: ודא כי כל הרווחים המערכת באזור הסתנן הם לחלוטין (אנכית) מילא עם המתלה הפתוגן; אחרת, התחום יהלומים יהיה קשה לדמיין תחת stereomicroscope פלורסנט. זה יכול להיות פשוט מאושרות על ידי השלמת ירוק כהה באזור הסתנן. - סופג את עודף של חיידקי השעיה של האזור הסובב את המקטע הסתנן של העלה הסתנן עם מגבת נייר רך.
3. הרכבה העלה חוסנו
- מיד לאחר חיסון לתקן זכוכית על מגש פלסטיק באמצעות הדבקה (טבלה של חומרים) כך העלה הסתנן הינו ממוקם במרכז של השקופית זכוכית. ודא כי הלהב עלה חוסנו מצויד לחלוטין בתוך השקופית זכוכית (איור 2א).
- להכין שכבות כפול הסרט הפלסטי (במקרה של 0.2 מ מ עבה, ראה טבלה של חומרים) לחתוך אותו לתוך שני חלקים (איור 2B; טורפדו 1 ו-2) כדי להתאים את החללים לאורך הפטוטרת של העלה הסתנן. לארגן את האורך של אלה שתי חתיכות, המצוין עם חץ דו-ראשי איור 2B, להתאים אורך החץ הדו-כיווני שמוצג באיור 2א.
הערה: חיתוך בפינה של כל אחד מהחלקים שני מסייע למנוע נזק הלהב עלה (איור 2B, ראשי חץ; ראה גם שלב 3.4 להלן). כל סוג של נייר דבק פלסטיק עם עובי דומה מתאים להכנת גשר מעל הפטוטרת. הנוקשות של הסרט הפלסטי חשוב לטיפול קל במהלך ההליך המתואר להלן. - בעזרת זוג מספריים בסדר, מקל את הקלטת טורפדו 1 ו-2 משני צדי הפטוטרת כך הפינות לחתוך כל פיסת ליישר עם הבסיס של הלהב עלה (איור 2C). ודא כי החלקים הקלטת אל תיגע הלהב פטוטרת או עלה.
הערה: שכבות כפול הקלטת פלסטיק חלקי האלה בבסיס הלהב עלה לשמש מפרידי ולמנוע לחץ פיזי על הפטוטרת במהלך ההרכבה. - להכין כלי נוסף של שכבות כפול דבק פלסטיק (איור 2B, היצירה 3) כדי להתאים את הגודל של החץ הדו-כיווני איור 2B . ואתקע אותה על גבי החלקים קלטת 1 ו- 2 כדי ליצור גשר מעל הפטוטרת ( איור 2D, E). להיות זהיר מאוד לא לתפוס את הלהב פטוטרת ועלה ישירות בין החלקים הקלטת ומעמדות המצוין עם החיצים באיור 2D, E.
- בעדינות מקל חתיכה קטנה של הדבקה (איור 2F, קטע 4) בשקופית זכוכית מעל קצה הלהב עלה כך הלהב עלה הוא קבוע ברכות רבה על השקופית זכוכית. רק לחץ בחוזקה את החלק של הדבקה ישירות לגעת השקופית זכוכית (איור 2F, אזור בקו אדום מקווקו), לא החלק השני המכסים העלה.
- בעדינות לדחוף עוד חתיכה קטנה של הדבקה (איור 2G, קטע 5) על הגבול של הפטוטרת, הקלטת פלסטיק חתיכות (1, 2 ו- 3) כך הפטוטרת ברכות רבה קבוע על גבי זכוכית והן הקלטת פלסטיק חתיכות. רק לצרף בחוזקה את החלק של הדבקה ישירות לגעת השקופית זכוכית זכוכית, פלסטיק הקלטת חתיכות (איור 2G, אזור בקו אדום מקווקו), לא החלק השני המכסים הפטוטרת.
- למנוע העלים הסמוכים לנוע לתוך שדה הראייה של המיקרוסקופ באמצעות µL 200 פיפטה טיפים (איור 2H). הכנס את הטיפים פיפטה בקרקע לאחוז בעדינות את העלים הסמוכים מן העלה הסתנן. יש להיזהר לא להכניס את הטיפים יותר מדי עמוק באדמה כדי למנוע נזק אפשרי שורש.
הערה: המפעל מוכן מוכן כעת עבור זריחה stereomicroscope הדמיה.
4. מיקרוסקופיים התבוננות בצילום מואץ
- הפעל את stereomicroscope פלורסנט.
הערה: הנה, stereomicroscope אוטומטית מצויד מונוכרום רגישה מאוד 1.4 מגה פיקסל מצלמה דיגיטלית במצב 12 סיביות משמש (טבלה של חומרים). המיקרוסקופ יוצב בחדר חשוך עם יחידת מזגן או בארון חשוך עם אוורור נאותים כדי לשמור על טמפרטורת החדר ב 23 מעלות צלזיוס במהלך דימות זמן לשגות. - הגדר את הצמח במרחב לעיל תחת עדשת אובייקטיבית stereomicroscope עבור הדמיה.
- הגדר את פרמטרי עבור הדמיה בצילום מואץ (ראה דוגמאות ב טבלה 1). ודא את שלבי התוכנית לאור החשיפה במהלך מרווח של הדמיה בצילום מואץ מאז אור יש השפעה גדולה על הצמח חסינות12.
- השתמש במסנן YFP קונבנציונאלי (nm עירור 500-520; פליטת 540-580 nm) כדי להמחיש את האות YFP.
- השתמש במסנן טקסס אדום (TXR) (עירור 540-580 nm; פליטת 610 nm מסירה ארוכה) לדמיין כלורופיל autofluorescence כך שגלוי התחום יהלומים כאזור כהה (לא autofluorescence) מוקף YFP-חיוביות תא שכבות9 (איור 3 A).
- להשתמש את ההגדרה המקובלת שדה בהיר אפינפרין צעדים נוספים לאור החשיפה.
הערה: לפני הניסוי, למדוד את עוצמת מקור אור בהיר אפינפרין, להתאים אותו לרמה של תנאי גידול הצמח עצמו.
- הפעל את התוכנית הדמיה בצילום מואץ. להשגחה לטווח ארוך על פני מספר ימים, שקול להשקות את הצמח. שמסמכי, לדוגמה, במהלך השלבים לאור החשיפה.
- לאחר ייבוא תמונות, להשמיט ערוצים נוספים בשימוש עבור חשיפה קלה את המרווחים (תואם ל- 3-8 ערוצים טבלה 1) מתוך ערכת הנתונים. ניתוח נתונים עם שיטות שונות, כגון ניתוח (ROI) אזור-של-ריבית, באמצעות תוכנת ניתוח תמונה שונה כגון פיג'י9.
Representative Results
כאן, היינו Pst_a2-induced אתי כדוגמה עבור הדמיה בצילום מואץ. נתוני זמן לשגות התקבלו סדרה של תמונות, כמה מהן מוצגות באיור איור 3B, וכן הסרט בצילום מואץ (1 סרט משלימה)9. בניסויים מוצלח באמצעות pPR1-YFP-NLS במהלך Pst_a2-אתי המושרה, הפעלה ארעית של pPR1 נצפתה, כמו מאליו מ YFP לבטא מוקדים, בכמה שכבות של תאים המקיפים את התחום יהלומים (איור 3ב) 9. הפעלת pPR1 תאים המקיפים את התחום יהלומים בדרך כלל מתחיל כ 5 שעות פוסט חיסון (מדד מחירי הבתים של), פסגות ב. מדד מחירי הבתים, של 12 ונמשך עד 40 מדד מחירי הבתים של (איור 3ב)9. מאז התמונות נרכשו באמצעות מערכת epi-פלורסנט, האותות YFP מתקבל כאן נוצרו מספר השכבות תא adaxial, כולל תאים באפידרמיס, כמו גם העליון mesophyll.
איור 1 : שיטת עבור חדירת פתוגן חיידקי לתוך תודרנית לבנה עלה- (א) שני - עד שבוע בן שלוש תודרנית הצמחים גדלו מגש הכנס לתא. תא אחד (B) חבר המכיל הצמח שנבחר לשמש חיסון והתבוננות לגזור והניח במגש הכנס תא ריק כדי לשמור על איזון. (ג) השלישי, הרביעי, החמישי עלים (#3, #4 ו #5, בהתאמה) מתאימים לניתוח תמונה. (ד) חדירה של ההשעיה הפתוגן עלה שנבחר באמצעות מזרק needleless. ניתן לזהות את האזור הסתנן בהתבסס על צבעה הירוק כהה יותר מאשר העלה הנותרים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : שיטת להרכבת הסתנן את תודרנית עלה עבור הדמיה בצילום מואץ. (א) תצלום של הצמח תודרנית עם מגלשת זכוכית קבוע תחת העלה חוסנו. העלה הסתנן הוצב במרכז השקופית זכוכית. החץ הדו-כיווני מציין את אורך הסרט הפלסטי קפיציות. (B) הכנת הסרט הפלסטי מפרידי וגשר. זוגי - הקלטת פלסטיק בשכבות נחצית לשתי חתיכות (1 ו 2) עבור קפיציות, קטע נוסף (3, בקו אדום מקווקו) נחתך כדי להכין גשר. אורך חצים דו-ראשי זהים כמעט אורך החץ הדו-כיווני (A). אחד בארבע הפינות של טורפדו 1 ו-2, המצוין עם חיצים, נחתכו (ג) שתי חתיכות דבק פלסטיק שכבות כפול (שמספרה 1 ו- 2) היו מודבקות היטב לתוך הזכוכית שקופיות לאורך הפטוטרת בעזרת זוג מספריים בסדר, מבלי ליצור קשר ישיר עם הלהב פטוטרת ועלה. (ד) כלי נוסף של שכבות כפול הסרט הפלסטי (מספר 3), אשר הוכנה מ (B), הונחה על שני מפרידי הבזליים (1 ו 2) להוות גשר מעל הפטוטרת, תוך הקפדה לא לתפוס הפטוטרת בין הקלטות 1 ו- 2- עמדות מסומן בחצים. תצלום (E) מציג הפטוטרת מוקלט. חשוב לא לתפוס רקמות הצמח ישירות בין החלקים הסרט הפלסטי ומעמדות המצוין עם חצים. חלק קטן (F) A הדבקה (מספר 4) הודבק בעדינות על השקופית זכוכית סביב קצה הלהב עלה. רק האזור שתואר על ידי קו מקווקו אדום היה לחוץ בחוזקה על גבי השקופית זכוכית. (G) קטן עוד נייר-דבק כירורגי (מספר 5) הודבק בעדינות על הגבול של פטוטרת וחתיכות הסרט הפלסטי. רק האזור שתואר על ידי קו מקווקו אדום היה לחוץ לתיקון הפטוטרת ברכות על שקופיות זכוכית ועל הסרט הפלסטי חתיכות. טיפים פיפטה חד פעמיות (H) 2 שימשו כדי למנוע העברת לתוך שדה הראייה של stereomicroscope העלים הסמוכים. הטיפים פיפטה נוספו ישירות לתוך האדמה-תפקידים המתאימים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : נציג תוצאות באמצעות תודרנית עלה גובר בשיטה. (א) פלורסנט תמונות stereomicroscopic של עלה תודרנית הטרנסגניים (pPR1-YFP-NLS צמח). חלק העלה חדרו עם Pst_a2 (108 CFU/mL) על פני כל שטח abaxial, תמונות נלקחו בשבי-22 שעות פוסט חיסון. מדד מחירי הבתים (. של). הגרעינים שבו הופעל האמרגן pPR1 אותרו באמצעות מסנן YFP ולאחר מות תאים מתוכנת (יהלומים) זוהה בהתבסס על האובדן של כלורופיל autofluorescence באמצעות מסנן טקסס אדום (TXR). סרגל קנה מידה = 2.5 מ"מ. (B) כמה תמונות בצילום מואץ נבחרים מתוך אוסף של 800 תמונות שהושג באמצעות פרוטוקול המתואר כאן. נתונים אלה מספקים סקירה ויוו ייתכן הדינמיקה של פעילות pPR1 עבור מדד מחירי הבתים של 40. התמונות הממוזגות של YFP ותמונות TXR מוצגים. סרגל קנה מידה = 2.5 מ"מ. (ג) ואימץ הסתננות של עלה הטרנסגניים (pPR1-YFP-NLS צמח). בהסתננות מעושה, 10 מ מ MgCl2 חדרו לתוך הצד abaxial של העלה, ואחריו הדמיה בצילום מואץ. טיפול תחליפי גרם פעילות חוץ רחמי pPR1 , לא התערבו עם autofluorescence כלורופיל-מדד מחירי הבתים של 13. חץ מציין המיקום של הסתננות מעושה. סרגל קנה מידה = 2.5 מ"מ. תמונות אלה שונו מן המחקר הקודם9. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
טבלה 1: תוכנת הדמיה בצילום מואץ השתמשו במחקר זה.
משלימה סרט 1: זמן לשגות הסרט מציג את הדינמיקה ייתכן של pPR1 הפעלת ב מהונדס תודרנית עלה חסינות המופעלות אפקטור הבאים (אתי) הנגרמת על ידי Pst_a2 חיסון. חלק בצד abaxial של הטרנסגניים עלה נושא הבונה YFP: pPR1-NLS חדרו עם Pst_a2 (108 CFU/mL). תמונות נרכשו במרווחים 3-מין עבור סכום כולל של 40 h. חותמת הזמן המוצג הוא dd:hh:mm:ss.sss התבנית. הסרט הזה היה שונה מן המחקר הקודם9. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
Discussion
כאן, אנו מדווחים על שיטה פשוטה כדי לטעון להתפרנס תודרנית העלה לבטא גן כתב פלורסנט תחת השליטה של אדם המקדם את עניין להשגחה לטווח ארוך באמצעות stereomicroscope פלורסנט אוטומטיות. הדמיה בצילום מואץ של עיתונאי פלורסנט בוצעה לעתים קרובות ברקמות שורש; עם זאת, רק מעט מחקרים דומים נערכו ברקמות עלה. זה ככל הנראה בגלל עלים מסוגלים לנוע בחופשיות בחלל, ואילו שורשים הם לעיתים קרובות קבור ותוקנו במדיום אגר מוצק.
בדו ח זה, התמקדנו על הדינמיקה ייתכן pPR1 פעילות במהלך אתי המושרה על ידי Pst_a2. בנוסף הקיבעון עדין של העלה שתוארו לעיל, חשוב בבירור להמחיש את הדינמיקה ייתכן של הסלולר אירועים כגון הפעלת המקדם יהלומים. אם ההבחנה בין תאים מציג פעילות pPR1 של יהלומים אינה חדה, ודא כי כל הרווחים המערכת באזור הסתנן מלאים לחלוטין עם המתלה פתוגן (ראה שלב 2.4). זה קריטי כאשר באמצעות שדה רחב זריחה stereomicroscopes מאז מיקרוסקופים אלה ללכוד כל הסימנים לזיהוי לאורך יהיה באותו מיקום אנכי של הדגימה. כלורופיל autofluorescence מתאי ששרדו מעל או מתחת התאים בתחום יהלומים מסכות בקלות את התאים המתים מפגין לא autofluorescence. הדבר נכון גם לסימן YFP.
התנאים עבור הדמיה בצילום מואץ צריכים להווצר בזהירות דרך מספר ראשוני ניסויים בתנאים שונים ניסיוני. פרמטרים עבור הדמיה בצילום מואץ תלויים במספר גורמים כגון מערכת מיקרוסקופיים, הצמחים הטרנסגניים וכן פתוגנים. כדי לקבל פרמטרים אלה, ניתחנו קודם זמני חשיפה שונים עבור YFP עוצמת האות ב העלה הסתנן ב 7 מדד מחירי הבתים של, אשר כמעט עולה בקנה אחד עם ההפעלה הראשונית של pPR1. חשיפה של 5 נקבע לפי הצורך עבור לכידת אותות YFP עם stereomicroscope השתמשו במחקר זה. מבחן דומה בוצעה הדמיה autofluorescence כלורופיל. חשיפה של הדגימה לאור בין מרווחי זמן 3 דקות היה מתוכנת לתוכנית הדמיה בצילום מואץ כמו נורמלי שדה בהיר הדמיה עם זמן חשיפה מקסימלית. המערכת שלנו (טבלה של חומרים) אפשר לנו לקבל 2.5 דקות בנוסף YFP TXR, שדה בהיר הדמיה. אילוץ זה היה הסיבה העיקרית לבחירת מרווח זמן 3 דקות. בשלב הבא, אנחנו אישר כי מצב זה זמן לשגות לפגיעה לכאורה הדגימות הצמח, אל תגרום / חוץ רחמי קלות הקשורות במתח ההפעלה של pPR1 (איור 3ב, ג). זה הוביל להתפתחות של התוכנית השתמשו במחקר זה. לפיכך, 3-מין במרווחים של קרינה פלואורסצנטית הדמיה נחשבו מספיק עבור לכידת pPR1 dynamics במהלך Pst_a2-מתווכת אתי9.
יזם-כתב בונה, במיוחד עם הכתב פלורסנט התמזגו לשירות המודיעין, היה להיות מנוצל על ידי הרבה קבוצות, זמינים בקלות מתוך קהילת המחקר; השתמשנו הבונה בהוצאת Kubo. et al. 13. לפיכך, הפרוטוקול המתואר כאן ניתן להשתמש בכל מחקר בביולוגיה צמח בדיקת רקמות עלים, אם הצמחים הטרנסגניים המתאימים זמינים. פרוטוקול פשוט וקל שלנו מספק הזדמנות גדולה עבור חוקרים להוט לנתח את הדינמיקה ייתכן של כל אירוע ביולוגי המתרחשים עלים, כגון תגובה חיסונית. . זה מתקבל על הדעת כי השיטה שלנו באמצעות הקלטת פיסות גורם הלחץ הפיזי קלה על דגימות. עם זאת, בעיה זו יכול להיות נשלט על ידי הכללת הפקדים חיוביים ושליליים המתאימים, כגון טיפולים מעושה, הניסויים (איור 3ג'). התנאים ניסיוני אפשרות נוספת לשנותם ולאחר אופטימיזציה על ידי ניתוח פקדים אלה בתנאים שונים.
בשנים האחרונות, התפתחות מהירה של כלים וטכניקות הדמיה יש מגורה האינטרס של חוקרים בהיבטים ייתכן מורכבים של אירועים ביולוגי. בניתוח הדמיה כלשהם, הרכבה ותיקון המתאים של דגימות הם בין הנושאים החשובים ביותר. השיטה פשוטה ופסיביות של הרכבה המגורים שעלים תודרנית שפותחו במחקר זה יכול להיות מיושם וממוטב לניסויים הדמיה שונים.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי הסוכנות טכנולוגיה ומדע יפן [PRESTO117665 כדי ומסווגים, ERATOJPMJER1502 כדי N.N.] ועל ידי האגודה יפן הקידום של המדע (Grants-in-Aid עבור מחקר פעילות סטארט-אפ [22880008 כדי ומסווגים], [מדענים צעירים (B) 23780040 כדי ומסווגים]). אנו מודים Senzaki א, סוזוקי י', י' Sugisawa, א Betsuyaku לקבלת סיוע טכני מעולה, ג'יי פארקר למתן את הלחץ Pst_a2 , ואת Demura ט על מתן וקטור pBGYN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | BD biosciences | 214010 | |
| Bacto Protease Peptone No. 3 | BD biosciences | 211693 | |
| Bacto Yeast Extract | BD biosciences | 212750 | |
| BM2 soil | Berger | ||
| Glycerol | nacalai tesque | 17017-35 | |
| Kanamycin sulfate | Wako | 113-00343 | |
| Leica M205FA with DFC365FX, LED_MCI and Leica EL6000 (Las X software-regulated) | Leica Microsystems | Yellow fluorescent protein (YFP) and Texas Red (TXR) filters installed | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Wako | 135-00165 | |
| Micro Slide Glass (Size: 76 mm × 26 mm, Thickness: 1.0–1.2 mm) | MATSUNAMI | S1112 | |
| Micropore Surgical Tape (1.25 cm × 9 m) | 3M | 1530-0 | |
| Needleless 1 ml plastic syringe | Terumo | SS-01T | |
| Plastic cell plug tray (cell size: 44 mm × 44mm × 44 mm) | Tanaka sangyo, Japan | htray-bk72 | Any tray with similar sized cells can be used |
| Rifampicin | nacalai tesque | 30259-81 | |
| Plastic Tape (0.2 mm thick × 19 mm wide × 10 m long) | Yamato | No0200-19-1 | Any plastic/vinyl tape with similar thickness can be used |
References
- Tsuda, K., Somssich, I. E. Transcriptional networks in plant immunity. New Phytologist. 206 (3), 932-947 (2015).
- Mine, A., Sato, M., Tsuda, K. Toward a systems understanding of plant-microbe interactions. Frontiers in Plant Science. 5, (2014).
- Murray, S. L., Thomson, C., Chini, A., Read, N. D., Loake, G. J. Characterization of a novel, defense-related Arabidopsis mutant, cir1, isolated by luciferase imaging. Molecular Plant-Microbe Interactions. 15 (6), 557-566 (2002).
- Spoel, S. H., Johnson, J. S., Dong, X. Regulation of tradeoffs between plant defenses against pathogens with different lifestyles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (47), 18842-18847 (2007).
- Asai, S., Shirasu, K. Plant cells under siege: plant immune system versus pathogen effectors. Current Opinion in Plant Biology. 28, 1-8 (2015).
- Schmelzer, E., Kruger-Lebus, S., Hahlbrock, K. Temporal and Spatial Patterns of Gene Expression around Sites of Attempted Fungal Infection in Parsley Leaves. The Plant Cell. 1 (10), 993-1001 (1989).
- Ohshima, M., Itoh, H., Matsuoka, M., Murakami, T., Ohashi, Y. Analysis of stress-induced or salicylic acid-induced expression of the pathogenesis-related 1a protein gene in transgenic tobacco. The Plant Cell. 2 (2), 95-106 (1990).
- Rushton, P. J., Reinstädler, A., Lipka, V., Lippok, B., Somssich, I. E. Synthetic plant promoters containing defined regulatory elements provide novel insights into pathogen- and wound-induced signaling. The Plant Cell. 14 (4), 749-762 (2002).
- Betsuyaku, S., et al. Salicylic Acid and Jasmonic Acid Pathways are Activated in Spatially Different Domains Around the Infection Site During Effector-Triggered Immunity in Arabidopsis thaliana. Plant & Cell Physiology. 59 (1), 8-16 (2018).
- Dodds, P. N., Rathjen, J. P. Plant immunity: towards an integrated view of plant-pathogen interactions. Nature Reviews Genetics. 11 (8), 539-548 (2010).
- Katagiri, F., Thilmony, R. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. Arabidopsis Book. , (2002).
- Zeier, J., Pink, B., Mueller, M. J., Berger, S. Light conditions influence specific defence responses in incompatible plant-pathogen interactions: uncoupling systemic resistance from salicylic acid and PR-1 accumulation. Planta. 219 (4), 673-683 (2004).
- Kubo, M., et al. Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation. Genes & Development. 19 (16), 1855-1860 (2005).
