Summary
Det här protokollet beskriver en mycket känslig och hög genomströmning neutrofila extracellulära fällan (NET) analys för halvautomatisk kvantifiering av ex vivo NET bildandet av immunofluorescens tredimensionella konfokalmikroskopi. Detta protokoll kan användas för att utvärdera NET bildning och nedbrytning efter olika stimuli och kan användas för att studera potentiella NET-riktade terapier.
Abstract
Neutrofila extracellulära fällor (nät) är immunogent extracellulära DNA-strukturer som kan frigöras av neutrofiler vid en mängd olika utlösare. NETs har visat sig fungera som ett viktigt värd försvarsmekanism som fällor och dödar mikroorganismer. Däremot, har de varit inblandade i olika systemiska autoimmuna sjukdomar. Nät är immunogena och giftiga strukturer som innehåller en pool av relevanta autoantigener inklusive anti neutrofiler cytoplasmatiska antikroppar (ANCA)-associerad vaskulit (AAV) och systemisk lupus erythematosus (SLE). Olika former av nät kan induceras beroende på stimulans. Mängden nät kan kvantifieras med hjälp av olika tekniker inklusive mäta DNA release i supernatanterna, mäta DNA-komplex med NET-molekyler som myeloperoxidas (MPO) eller neutrofila elastase (NE), mäta förekomsten av citrullinerade histoner genom fluorescensmikroskopi, eller flöde flödescytometrisk detektion av NET-komponenter som alla har olika funktioner avseende deras specificitet, känslighet, objektivitet och kvantitet. Här är ett protokoll för att kvantifiera ex vivo NET bildning i en mycket känslig, hög genomströmning sätt med hjälp av tredimensionella immunofluorescens konfokalmikroskopi. Detta protokoll kan tillämpas för att hantera olika forskningsfrågor om netto bildning och nedbrytning i hälsa och sjukdom.
Introduction
Bildningen av neutrofila extracellulära fällor (nät) är den process där neutrofiler släppa deras DNA i en extracellulär tredimensionella (3D) web liknande struktur, komplex med ett brett utbud av antimikrobiella och farliga molekyler, granulat och cytoplasmiska enzymer, peptider och proteiner. Dessa immunogent och giftiga strukturer har en viktig fysiologisk roll i det medfödda immunförsvaret hos friska individer genom svällning och dödande smittsamma patogener1. Dock har de också visat sig vara inblandade i trombos2 och olika systemiska autoimmuna sjukdomar, inklusive anti neutrofiler cytoplasmatiska antikroppar (ANCA)-associerade vaskulit (AAV)3, systemisk lupus erythematosus (SLE )4,5, antifosfolipidsyndrom (APS)2,6, reumatoid artrit (RA), psoriasis och gikt7,8,9.
In vitro-NET bildandet har studerats allmänt med den kemiska sammansatt phorbol 12-isopropylmyristat 13-acetat (PMA), som inducerar massiv NET bildandet. Men mest fysiologiska stimuli framkalla mycket lägre nivåer av NET bildandet10. Till studien NET-utlösare i, till exempel en autoimmun sjukdom behövs en standardiserad, känslig, hög genomströmning kvantitativ analys att påvisa och kvantifiera NET bildandet. Kvantifiering av nät har visat sig vara utmanande och utförs för närvarande av olika metoder, var och en med sina egna fördelar och begränsningar11. En vanligt förekommande metod är upptäckt av DNA i supernatanterna12, vilket är målet men inte diskriminerar mellan beskärningen av DNA (apoptotiska, nekrotiska, nät), och därför inte är mycket specifika för nät. För det andra, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) av DNA-komplex med NET-specifika proteiner, till exempel myeloperoxidas (MPO) eller neutrofila elastase (NE), är en mer specifik inställning till upptäcka nät och påvisades för att korrelera väl med citrullinerade Histon-3 (CitH3) positiva nät13. Det är dock inte känt om denna metod är tillräckligt känslig för att plocka upp alla nät (t.ex. MPO, NE, och CitH3 negativa nät). En tredje metod är immunofluorescens mikroskopi som används för att identifiera samtidig lokalisering av NET-associerade molekyler (NE, MPO, CitH3) med extracellulära DNA att kvantifiera nät. Denna metod är vanligen specifika för nät, men det kan inte tillämpas som en hög genomströmning metod och är inte mål på grund av observatör bias. Dessutom, tar den här metoden inte hänsyn MPO-, NE-, CitH3-negativa nät som är vanligt förekommande beroende på den använda NET-trigger14,15. Flöde flödescytometri metoder upptäcka nät genom en förändrad framåt/sidled scatter (FSC/SSC) som anger svullnad av kärnan i NET-ting neutrofiler16. Den här metoden tar inte hänsyn till olika former av NET formation som har identifierats, som inte skulle kunna medföra svullnad av kärnan, såsom avgörande NET bildandet17. Slutligen, immunofluorescens konfokalmikroskopi har tillämpats för att visualisera och kvantifiera NET bildandet av direkt färgning extracellulära DNA med ett cell-impermeable färgämne som fläckar extracellulära DNA12,18. Allmänhet, 5 till 10 high-power fält manuellt plockas och bedömas, som omfattar 1-5% av varje brunn en plattan med 96 brunnar11,17. Manuellt val av bilder är inte alltid objektiva, benägna att bias och inte attraktiv för hög genomströmning analys. En automatiserad, hög genomströmning NET kvantifiering analys utvecklades nyligen, som avbildas 11% av brunnen på en 3D sätt täcker 13 µm genom Z-staplade immunofluorescens konfokalmikroskopi, vilket ledde till en mycket känslig teknik att bedöma nät jämfört med de konventionella metoder10. Den aktuella rapporten beskriver den senaste protokollet för att kvantifiera NET bildning genom en automatiserad, mycket känslig analys använder 3D konfokalmikroskopi, som uppnår en avbildad yta av 45% av varje brunn och omfattar 27 µm igenom Z-högar. Detta protokoll är lämplig att kvantifiera, med en hög känslighet, låga nivåer av NET bildande på ett objektivt och opartiskt sätt.
Protocol
Alla patienter och friska kontroller har samtyckt till att delta i LUMC biobank. Båda biobanker studierna godkändes av LUMC etiska kommittén.
1. isolering av friska neutrofiler
- Få 20 mL av perifert blod från en frisk givare till två 10 mL EDTA-belagda rör.
- Placera 10 mL blod i en steril 50 mL tub och Lägg fosfatbuffrad saltlösning (PBS) upp till 32,5 mL.
-
Lägg till täthetlutning (t.ex.., Ficoll-amidotrizoaat) under cellerna.
- Ta upp 14 mL av täthet lutning med en 10 mL Pipettera och Pipettera controller.
- Placera Pipettera på botten av den 50 mL tub.
- Ta Pipettera regulatorn av Pipettera, möjliggör täthetlutningen strömma ur Pipettera självtryck tills maximalt nås genom kapillär effekt (1-2 mL lämnas), utan att använda motorn.
- Ta bort Pipettera genom att placera en tumme ovanpå den Pipettera, vilket hindrar täthetlutning från att läcka ut under borttagning av Pipettera.
- Snurra rören i 20 min vid 912 x g och rumstemperatur (RT) utan acceleration eller broms.
Obs: Röda blodkroppar (RBC) och neutrofiler har en hög densitet och är längst ned i en 50 mL tub. Perifera mononukleära blodceller (PBMC) är separerade och ovanpå täthetlutningen som en vit ring. PBS-utspädd plasma vara över PBMC. Om det behövs kan PBMC isoleras genom att överföra den vita ringen till en ny 50 mL tub med ytterligare tvätt steg med PBS. - Ta försiktigt bort den vita ringen som innehåller PBMC först, följt av borttagning av PBS-utspädd plasma och slutligen täthet lutning lagret så mycket som möjligt.
-
För att isolera neutrofiler från neutrofiler/erytrocyter mixen, lyse erytrocyter genom kallt sterilt destillerat vatten.
- Ta kallt sterilt destillerat vatten flaska och en 10 x koncentrerad PBS kolv från kylen.
- Arbeta snabbt för det här steget. Lägg till 36 mL kallt sterilt destillerat vatten direkt ovanpå pelleten och blanda en gång försiktigt. Tillsätt 4 mL 10 x PBS efter 20 s att göra en isoton lösning. Blanda en gång noggrant.
- Snurra tube för 5 min vid 739 x g och 4 ° C (för avlägsnande av röda blodkroppar). Neutrofiler är i vit pelleten.
- Noggrant avlägsna supernatanten. Utför steg 1.6.2 igen och kontrollera att pelleten stängs ordentligt.
- Snurra tube för 5 min på 328 x g och 4 ° C.
- Försiktigt avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 5 mL PBS. Räkna neutrofilerna och hålla dem på isen.
Obs: Förväntade avkastningen från 1 tub av blod (10 mL) är ungefärligt 15-75 miljoner neutrofiler.
2. röd fluorescerande Cell märkning av neutrofiler
- Gör en neutrofil suspension av 10-20 miljoner neutrofiler i 2 mL PBS i en 15 mL tub.
- Gör en lösning av 2 mL PBS med 4 µL av 2 µM röd fluorescerande cell länkare (se Tabell för material) på olika 15 mL tub. Lägg till detta försiktigt till neutrofila upphängningen och blanda försiktigt.
- Inkubera i mörkret för exakt 25 min vid 37 ° C att märka neutrofilerna med röd fluorescerande cell länkaren.
- Inaktivera märkningen genom att lägga till RPMI 1640 medium innehållande 10% värme inaktiverat fetalt bovint serum (FCS) på RT upp till 15 mL och blanda en gång noggrant. Kontrollera att pelleten är noggrant resuspended om en pellet har bildats.
- Snurra tube för 5 min på 328 x g och RT.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 5 mL fenol red-gratis RPMI 1640 medium innehållande 2% FCS och 10% P/S på RT. räkna neutrofilerna.
Obs: En cellförlust av 50% kan uppstå efter röd fluorescerande cell märkning.
3. induktion av neutrofila extracellulära fälla bildandet
- Göra en cellsuspension av 0,42 x 106 celler/mL i fenolrött gratis RPMI 1640 medium innehållande 2% FCS och 10% P/S.
- Lägga till 37 500 neutrofiler i 90 µL per brunn i en svart 96 brunnar, platt botten pläterar.
- Tillsätt 10 µL av den valda stimulansen (t.ex. serum av patienten) i tre exemplar till en koncentration av 10% i brunnen. Inkludera alltid en negativ kontroll (medium) i tre exemplar.
- Inkubera i mörker vid 37 ° C i önskad tid, allt från 30 min till 2, 4 eller 6 h. inkubation för 4 h föreslås.
- Beräkna volymen behövs för att lägga till 25 µL av 5 µM ogenomtränglig DNA färga (se Tabell för material), för att nå en slutlig koncentration på 1 µM i brunnen. Göra en förspädningen om nödvändigt i RPMI 1640 medium innehållande 2% FCS och 10% P/S att få en 5 µM koncentration.
- Tillsätt 25 µL av 5 µM ogenomtränglig DNA dye 15 min före utgången av inkubationstiden. Fortsätt inkubation för en annan 15 min vid 37 ° C i mörker.
- Ta bort supernatanten (~ 125 µL) mycket noggrant och förvara om det behövs. Tillsätt 100 µL av 4% PARAFORMALDEHYD (PFA). Hålla i mörkret, och omedelbart fortsätta med steg 4.
4. netto visualisering med 3D High-innehåll, högupplösta immunofluorescens konfokalmikroskopi
-
Konfigurera inställningar på mikroskopet immunofluorescens confocal genom att klicka på inställningen för förvärvet.
- Klicka på fliken Konfigurera .
- Välj målet och kameran. Välja målet 10 X Apo Lambda med ett förvärv av en confocal 60 µm pinhole.
- Klicka på plattan och välja 96 brunnar plast plattan. Välj platserna att besöka och välja ett fast antal platser. Fyll i 3 kolumner och 3 rader utan överlappning (0 µm), som omfattar totalt 45% av brunnen.
- Klicka på förvärvet. Välj Aktivera Laser-baserad fokusering. Välj Förvärva Z serien/tidsserier om det behövs.
- Klicka på webbplats autofokus.
- Klicka på fokus på platta botten | Av botten tjocklek. För inledande brunnen att hitta provet, Välj den första brunnen förvärvade. För webbplats autofokus, välja alla platser.
- Klicka på våglängder.
- För antal våglängder, Välj 2. Välj 2 för TL skuggning korrigering förfining nivå.
- För våglängden 1, Välj Texas Red.
- För autofokus alternativ, Välj laser med Z offset, bokföra laser offset 1,1 µm. använda Z-stack med ett eget intervall av 200-10.
- För våglängden 2, Välj FITC.
- För autofokus alternativ, Välj laser med Z förskjutning från w1 0 µm. använda Z-stack med en anpassad rad 200-10.
- För förvärvet alternativ, Välj Z-serien och 2D projektionsbild maximalt. För förvärvet alternativ, Välj skuggning korrigering | Av.
- Välj Z-serien. Välj antal steg: 10. Välj stegstorlek: 3 mm (total räckvidd blir 27 µm).
-
Sätt plattan i den immunofluorescens konfokalmikroskopi.
- Klicka på fliken Kör .
- Fyll plattan namn och beskrivning och välja lagringsplats.
- Välj de brunnar som behöver förvärvas.
- Klicka på fliken Kör .
- Välj exponeringstid för Texas röd och FITC.
- Klicka på Få plattan att starta förvärvet, som kommer att ta ungefär 1 timme per platta.
5. analys av NET bildandet
- Använda en bild bearbetningen program utformat för analys av vetenskapliga flerdimensionella bilder (se Tabell för material) att analysera NET bildandet.
- Överföra förvärvade bilddata till en separat hårddisk.
-
Välj den färg som du lägger till verktyg.
- Välj w1 och välj vilken mapp på hårddisken där data lagras.
- Välj w2 och välj vilken mapp på hårddisken där data lagras.
Obs: Använda en standard makro som använder w1 i filnamnet för att lägga röd färg till Texas röd bilder och använder w2 för att lägga grön färg till FITC bilderna.
-
Välj analys makro.
- Välj w1, Välj tröskelvärdet (intensitet tröskel), som vanligtvis är 10. Välj önskad pixelvärdet (storlek tröskel, t.ex. 100).
- Välj w2, Välj tröskelvärdet (intensitet tröskel), som vanligtvis är 10. Välj önskad pixelvärdet (storlek tröskel, t.ex. 500).
- Välja destination för kalkylbladsfilen, kör analys och spara loggfiler efteråt.
- Analysera data i ett kalkylblad.
Representative Results
Neutrofila extracellulära fällan (NET) bildandet är kvantifieras på 3D sätt av kvantifiera färgade extracellulära DNA över 10 Z-stackar med 3 µm distanserar start på fokalplanet i varje brunn. Genom att mäta den samlade ytan, känsligheten hos den assay ökar (figur 1A). Isolerade neutrofilerna har en genomsnittlig renhetsgrad 98,7% med standardavvikelse (SD) på 1,10% mätt i 14 olika prover från olika isoleringar. Genomsnittliga andelen röda blodkroppar är 1,04% ± 1,1% SD och den genomsnittliga andelen monocyter är 0,085% ± 0,17% SD (inga data anges). Den totala arealen av färgade neutrofiler avbildas är kvantifierade endast i fokalplanet i varje brunn, vilket korrelerar signifikant med ett totalt antal neutrofila granulocyter i varje brunn med en Pearson korrelationskoefficient på 0,99 (95% konfidensintervall [CI] 0.985-0.997, p < 0,0001) (figur 1B). Representativa resultatet av kvantifiering av NET bildandet i neutrofiler stimuleras med 10% serum av AAV patienter eller medium (MED) som en negativ kontroll, uttryckt som kumulativa färgade extracellulära DNA området över 10 Z-stackar per avbildad neutrofiler (figur 1 C). ögonblicksbilder av representativa bilder av ostimulerade neutrofiler (figur 2A) och nät i AAV-stimulerad neutrofiler (figur 2B) visas.
Figur 1: kvantifiering av NET bildande genom att mäta extracellulära DNA och neutrofiler. (A) område kvantifieras kumulativt över de 10 Z-staplarna för varje väl för ostimulerade neutrofiler (MED) och neutrofiler stimuleras med 10% serum av ANCA-associerad vaskulit (AAV) patienter (n = 4) kvantifieras med ett program för bildbehandling. Varje stimulans testades i tre exemplar, varje punkt representerar medianvärdet. (B) röd fluorescerande märkta områdes- och cellinformation celltal kvantifierades i fokalplanet i varje brunn av programmet bildbehandling (R2 = 0,99, p < 0,0001). (C) netto bildandet uttrycks som kumulativa areal per avbildad neutrofiler (cellområde). Medelvärde ± standardavvikelsen för medelvärdet (SEM) av varje tre exemplar ritas per stimulans. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: ögonblicksbilder av NET kvantifiering assay. Fluorescerande märkta neutrofiler visas i rött och färgade extracellulära DNA visas i grönt. 10 x planerar Apo Lambda mål. (A) ostimulerade neutrofiler. (B) neutrofiler stimuleras med AAV serum. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Den mest kritiska delen av denna analys är behovet av att använda färska isolerade neutrofiler för varje experiment eftersom neutrofiler är kortlivade och dör när frusen. Detta kräver en frisk givare varje gång, vilket kunde implicerade några variationer på grund av givare egenskaper. En av dessa variationer är aktiveringen ställningen av neutrofilerna. Neutrofiler kan aktiveras redan invivo före isolering. Dessutom neutrofiler kan aktiveras i hela isolering stegen särskilt under lys av erytrocyter, därför en erfaren hanterare av neutrofiler krävs att minimera aktivering av neutrofiler. I allmänhet, isolering av neutrofiler bör utföras så snart som möjligt efter blod och experimentet bör inte pausas för att undvika överdriven spontana aktivering. För det andra, ovarsam hantering av neutrofiler bör undvikas. Som sådan, är anmärkningsvärda fördelen med protokollet beskrivs minimal pipettering ingripanden när neutrofiler är seedade i en plattan med 96 brunnar. Ännu viktigare, bedöms aktiveringen ställningen av neutrofilerna bäst i ostimulerade tillstånd, i vilket denna analys känsligt kan upptäcka låga nivåer av NET bildandet. En annan faktor som kan påverka analysen är användningen av FCS i mediet. Procentandelen av FCS har sänkts från 10% till 2% för att undvika möjliga dämpning av NET bildandet av antioxidant aktivitet19,20 eller möjligt aktiveringen av neutrofilerna trots Värmeinaktivering. Kultur utan FCS eller med att använda olika typer av media har inte prövats. En ostimulerade eller medium kontroll tas alltid längs när du utför analysen att ha en indikation på den bakgrund signalen (t.ex., aktiveringen ställningen av neutrofilerna). Den faldig ökningen för varje stimulus jämfört ostimulerade provet visas för att uppnå konsekventa resultat över olika experiment med samma stimulans.
En viktig faktor för en möjlig hög bakgrund färgning av extracellulära DNA som är orelaterade till processen för NET bildandet. Närvarande analysen försöker minska detta genom att ta bort den extracellulära DNA färgning direkt efter den korta inkubationstiden för 15 min och genom att analysera plattan direkt efter fixering. Därför är det viktigt att använda en avancerad confocal Mikroskop som har tillräckligt fart och analytisk kraft att fånga plattan med 96 brunnar inom 1 till 2 h. automatisk inställning av exponeringstid och fokusera rekommenderas. Som sådan, kan inställningen Mikroskop varierar mellan varje prov och experimentera med avseende på tröskeln färg intensitet som är nödvändig för övergripande optimal bildkvalitet. De sistnämnda påverkan eventuella förmåga att korrekt kvantifiera neutrofiler och nät och optimal inställning bör därför bekräftas med hjälp av flera kontrollprover (t.ex. serum hos friska kontroller). Under analysen av tagna bilder tillåter användning av en pixel tröskel och storlekströskelvärdet i programmet analys för ett bättre urval av NET bildandet.
Extracellulära DNA härrör från netto formation kan vara resultatet av distinkta död upptagsvägar, inklusive NETosis, necroptosis, pyroptosis, ferroptosis eller ens icke-lytisk process av vitala NET bildandet1. Som sådan, är en begränsning av nuvarande analysen att genom färgning endast för extracellulära DNA finns ingen differentiering mellan netto bildandet och andra relevanta cell death vägar. Det är möjligt att uppnå detta genom att använda antingen selektiva hämmare av distinkta död vägar att diskriminera mellan olika former som underbygger NET bildandet eller bekräfta genom separata immunostainings förekomsten av specifika NET markörer, såsom citH3 och NE, Co lokaliserade med DNA. Samtidig localizationen av extracellulära DNA med citH3 och NE har nyligen bekräftats för denna analys10. Fördelen med att undvika NET specifika markörer i denna analys, tillåter för att bedöma alla former av NET bildandet leder till extrudering av DNA av neutrofiler komplett och så objektiv som möjligt med potential för hög genomströmning screening. Tillämpligheten av detta protokoll har visats i studier låg nivå NET induktion medieras av immunkomplex i autoimmun sjukdom där förmågan att upptäcka kvalitativa och kvantitativa skillnader kan vara viktigare än typen av process inblandade10,21,22. Illustrerar att denna roman NET kvantifiering analys kan vara till mervärde för olika forskare att undersöka olika aspekter av NET bildandet. Små justeringar till analysen genomförs enkelt: justering av perioden stimulering, användning av en favorit NET markör att fokusera på en specifik död väg leder till netto bildandet, användning av olika förstoring eller användning av olika NET kriterier i den kvantifiering och analys.
Sammanfattningsvis är protokollet föreskrivs en mycket känsliga allmänt tillämpliga analys för halvautomatisk kvantifiering av NET bildandet för utvärdering av ex vivo induktion av nät på olika stimuli.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Eline J. Arends och Y.K. Onno Teng arbete stöds av nederländsk njure Foundation (17OKG04), kliniska stipendium från Nederländerna organisationen för vetenskaplig forskning (90713460). Laura S. van Dams arbete stöds av Stiftelsen för forskning i reumatologi (FOREUM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aqua Sterile H2O | B. Braun, Melsungen, Germany | 12604052 | |
| Fetal bovine serum (FCS) | Bodinco, Alkmaar, The Netherlands | Used in high concentrations it could influcence NET formation | |
| Ficoll 5.7% - amidotrizoaat 9% density 1.077 g/mL | LUMC, Leiden, The Netherlands | 97902861 | |
| Immunofluorescence confocal microscope | Image Xpress Micro Confocal (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) | ||
| Neutralization PBS (10x) | Gibco, Paisley, UK | 70011-036 | |
| Penicillin/streptomycin (p/s) | Gibco, Paisley, UK | 15070063 | |
| Phenol red free RPMI 1640 (1x) | Gibco, Paisley, UK | 11835-063 | Phenol red can interfere with the immunofluorescence signal |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | B. Braun, Melsungen, Germany | 174628062 | |
| PKH26 2 μM Red fluorescent cell linker | Sigma Aldrich Saint-Louis, MO, USA | PKH26GL-1KT | PKH are patented fluorescent dyes and a cell labeling technology named after their discoverer Paul Karl Horan |
| Program for scientific multidimensional images analysis | ImageJ, Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA | ||
| RPMI medium 1640 (1x) | Gibco, Paisley, UK | 52400-025 | |
| Sytox green 5 mM Impermeable DNA dye | Gibco, Paisley, UK | 57020 | |
| Trypan blue stain 0.4% | Sigma Aldrich, Germany | 17942E | |
| 96 well, black, flat bottom, tissue culture treated plate | Falcon, NY, USA | 353219 |
References
- Jorgensen, I., Rayamajhi, M., Miao, E. A. Programmed cell death as a defence against infection. Nature Reviews Immunology. 17 (3), 151-164 (2017).
- Rao, A. N., Kazzaz, N. M., Knight, J. S. Do neutrophil extracellular traps contribute to the heightened risk of thrombosis in inflammatory diseases? World Journal of Cardiology. 7 (12), 829-842 (2015).
- Kessenbrock, K., et al. Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis. Nature Medicine. 15 (6), 623-625 (2009).
- Garcia-Romo, G. S., et al. Netting neutrophils are major inducers of type I IFN production in pediatric systemic lupus erythematosus. Science Translational Medicine. 3 (73), 73ra20 (2011).
- Lande, R., et al. Neutrophils activate plasmacytoid dendritic cells by releasing self-DNA-peptide complexes in systemic lupus erythematosus. Science Translational Medicine. 3 (73), 73ra19 (2011).
- Meng, H., Yalavarthi, S., et al. In Vivo Role of Neutrophil Extracellular Traps in Antiphospholipid Antibody-Mediated Venous Thrombosis. Arthritis & Rheumatology. 69 (3), 655-667 (2017).
- Desai, J., et al. Particles of different sizes and shapes induce neutrophil necroptosis followed by the release of neutrophil extracellular trap-like chromatin. Scientific Reports - Nature. 7 (1), 15003 (2017).
- Desai, J., et al. PMA and crystal-induced neutrophil extracellular trap formation involves RIPK1-RIPK3-MLKL signaling. European Journal of Immunology. 46 (1), 223-229 (2016).
- Apel, F., Zychlinsky, A., Kenny, E. F. The role of neutrophil extracellular traps in rheumatic diseases. Nature Reviews Rheumatology. , (2018).
- Kraaij, T., et al. A novel method for high-throughput detection and quantification of neutrophil extracellular traps reveals ROS-independent NET release with immune complexes. Autoimmunity Reviews. 15 (6), 577-584 (2016).
- Masuda, S., et al. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers. Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).
- Brinkmann, V., Goosmann, C., Kuhn, L. I., Zychlinsky, A. Automatic quantification of in vitro NET formation. Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).
- Nakazawa, D., et al. Enhanced formation and disordered regulation of NETs in myeloperoxidase-ANCA-associated microscopic polyangiitis. Journals of the American Society of Nephrology. 25 (5), 990-997 (2014).
- Konig, M. F., Andrade, F. A Critical Reappraisal of Neutrophil Extracellular Traps and NETosis Mimics Based on Differential Requirements for Protein Citrullination. Frontiers in Immunology. 7, 461 (2016).
- Kenny, E. F., et al. Diverse stimuli engage different neutrophil extracellular trap pathways. Elife. 6, (2017).
- Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis. Journal of Immunological Methods. 423, 104-110 (2015).
- Pilsczek, F. H., et al. A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus. The Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).
- Tanaka, K., et al. In vivo characterization of neutrophil extracellular traps in various organs of a murine sepsis model. PLoS One. 9 (11), e111888 (2014).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. Journal of Cell Biology. 176 (2), 231-241 (2007).
- von Köckritz-Blickwede, M., Chow, O., Nizet, V. Fetal calf serum contains heat-stable nucleases that degrade neutrophil extracellular traps. Blood. 114 (25), 5245-5246 (2009).
- Kraaij, T., et al. Excessive neutrophil extracellular trap formation in ANCA-associated vasculitis is independent of ANCA. Kidney International. , (2018).
- Kraaij, T., et al. The NET-effect of combining rituximab with belimumab in severe systemic lupus erythematosus. Journal of Autoimmunity. , (2018).
- Hahn, J., Schauer, C., et al. Aggregated neutrophil extracellular traps resolve inflammation by proteolysis of cytokines and chemokines and protection from antiproteases. The FASEB Journal. (Aug 21), (2018).
