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Biochemistry

Préparation de champignons et de matières végétales pour l’élucidation de la structure dynamique de polarisation nucléaire RMN à l’état solide

Published: February 12, 2019 doi: 10.3791/59152
* These authors contributed equally

Summary

Un protocole pour la préparation de 13C,15échantillons fongiques et plantes marquées N pour la spectroscopie RMN à l’état solide multidimensionnelle et enquêtes de polarisation nucléaire dynamique (DNP) est présenté.

Abstract

Ce protocole montre comment uniformément 13C, 15N-étiqueté fongiques matériaux peuvent être produites et comment ces matériaux souples devrait être traitée pour la RMN à l’état solide et DNP sensibilité améliorée des expériences. La procédure de traitement des échantillons de la biomasse végétale est aussi détaillée. Cette méthode permet la mesure d’une série de 1D et 2D 13C -13C /15N des spectres de corrélations, qui permet l’élucidation de la structure à haute résolution des biomatériaux complexes dans leur état natif, avec une perturbation minimale. Le marquage isotopique peut être examiné en quantifiant l’intensité dans les spectres de 1D et l’efficacité de transfert de polarisation dans les spectres de corrélation 2D. Le succès de la préparation d’échantillons de polarisation nucléaire dynamique (DNP) peut être évalué par le facteur de mise en valeur de sensibilité. D’autres expériences examinant les aspects structurels des polysaccharides et protéines conduira à un modèle de l’architecture en trois dimensions. Ces méthodes peuvent être modifiés et adaptés afin d’étudier un large éventail de matériaux riches en glucides, y compris les parois naturelles des plantes, des champignons, des algues et des bactéries, ainsi que de synthèse ou conçu de polymères glucidiques et leur complexe avec d’autres molécules.

Introduction

Glucides jouent un rôle central dans divers processus biologiques tels que le stockage de l’énergie, renforcement structurel et reconnaissance cellulaire et adhérence. Ils sont enrichis dans la paroi cellulaire, qui est une composante fondamentale dans les plantes, les champignons, les algues et les bactéries1,2,3. La paroi cellulaire est une source centrale pour la production de biocarburants et de biomatériaux, mais aussi une cible prometteuse pour des thérapies antimicrobiennes4,5,6,7,8 , 9.

La compréhension contemporaine de ces matériaux complexes a été considérablement avancée par des décennies d’efforts qui ont été consacrées à la caractérisation à l’aide de quatre méthodes biochimiques ou génétiques importants. La première méthode majeure s’appuie sur des traitements séquentiels à l’aide de produits chimiques agressifs ou enzymes pour briser les parois cellulaires en différentes portions, qui est suivie par la composition et l’analyse de liaison de sucres dans chaque fraction de10. Cette méthode apporte un éclairage sur la répartition du domaine des polymères, mais l’interprétation peut prêter à confusion en raison des propriétés chimiques et physiques des biomolécules. Par exemple, il est difficile de déterminer si la fraction extractible à l’alcali provient d’un domaine unique de molécules moins structurées ou de molécules séparées dans l’espace avec la solubilité comparable. Deuxièmement, les parties extraites ou toute les parois cellulaires peut également être mesurées à l’aide de solution NMR pour déterminer les liaisons covalentes, aussi appelées réticulation, entre les différentes molécules11,12,13, 14,,15. De cette façon, la structure détaillée des ancres covalentes peut être sondée, mais limites peuvent exister en raison de la faible solubilité de polysaccharides, le relativement petit nombre de sites de réticulation et l’ignorance des effets non covalentes qui stabilise emballage de polysaccharide, y compris la liaison hydrogène, interaction électrostatique et force de van der Waals, enchevêtrement de polymère. Troisièmement, l’affinité de liaison a été déterminée in vitro à l’aide de polysaccharides isolées16,17,18,19, mais la purification procédures peuvent modifier considérablement la structure et les propriétés de ces biomolécules. Cette méthode échoue aussi à reproduire la déposition sophistiquée et l’assemblage des macromolécules après la biosynthèse. Enfin, le phénotype, de la morphologie cellulaire et de propriétés mécaniques des mutants génétiques dont la production atténuée certain composant de la paroi cellulaire hangar lumières sur les fonctions structurelles des polysaccharides, mais les preuves moléculaires plus est nécessaire pour combler ces observations macroscopiques avec la fonction ingénierie des protéines machineries20.

Les progrès récents dans l’élaboration et l’application de la spectroscopie RMN à l’état solide multidimensionnelle ont introduit une occasion unique pour résoudre ces casse-tête structurel. Expériences de RMN à l’état solide 2D/3D permettent une enquête à haute résolution de la composition et l’architecture de matériaux riches en hydrates de carbone à l’état natif sans perturbation majeure. Des études structurales ont été menées avec succès à la fois primaire et parois secondaires des plantes, la biomasse catalytiquement traitée, biofilm bactérien, le pigment fantômes chez les champignons et récemment par les auteurs, les parois des cellules intactes dans un champignon pathogène Aspergillus fumigatus 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31. le développement de polarisation nucléaire dynamique (DNP)32,33,34,35,36,,du3738 , 39 , 40 , 41 , 42 facilite considérablement l’élucidation de la structure NMR comme l’accroissement de la sensibilité par DNP nettement réduit le temps expérimental sur ces biomatériaux complexes. Le protocole décrit ici en détail les procédures de marquage isotopique du champignon a. fumigatus et préparation fongique et des échantillons de végétaux pour la caractérisation de DNP et RMN à l’état solide. Procédures d’étiquetage similaires devraient s’appliquer aux autres champignons avec milieu modifié, et les procédures de préparation d’échantillon devraient être généralement applicables aux autres biomatériaux riches en glucides.

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Protocol

1. croissance de 13C, 15N-étiqueté Aspergillus fumigatus milieu liquide

  1. Préparation sans étiquette et 13C, milieu de croissance marquée N 15
    NOTE : Les moyen de levure Extract Peptone Dextrose (DPJ) et l’amélioration moyenne minime43 ont été utilisés pour l’entretien des cultures fongiques. Toutes les étapes après la stérilisation sont effectuées dans une hotte à flux laminaire pour minimiser la contamination.
    1. Préparation du milieu liquide sans étiquette : dissoudre 6,5 g de poudre de la DPJ dans 100 mL d’eau distillée, puis stériliser pendant 25 minutes à 134 ° C.
    2. Préparation du milieu solide sans étiquette
      1. Ajouter 1,5 g d’agar et 6,5 g de poudre de la DPJ dans 100 mL d’eau distillée.
      2. Stériliser le milieu pendant 25 min à 121 ° C, puis laissez refroidir à 50 ° c environ.
      3. Transférer les 13-15 mL de milieu dans chaque pré stérile plastique pétri et couvrir le plat à l’aide d’un couvercle immédiatement.
    3. Préparation de 13C, 15N marqué un milieu liquide
      Remarque : Pour préparer la solution de croissance isotope labeling, un milieu minimal contenant 13C-glucose et 15N-sodium nitrate et une solution d’oligo-éléments sont préparés séparément et ensuite mélangés avant utilisation.
      1. Préparer 100 mL de milieu minimal contenant des isotopes comme indiqué au tableau 1. Ajuster le pH à 6,6 à l’aide de NaOH (1 M) ou une solution de HCl (1M).
      2. Stériliser le milieu minimal pendant 25 min à 121 ° C.
      3. Préparation de 100 mL (1, 000 x) de solution d’oligo-éléments, dissoudre les sels énumérés au tableau 2 de l’eau distillée. Autoclave la solution pendant 25 min à 134 ° C. Refroidir et conserver la solution à 4 ° C pour une utilisation à court terme. Le pH sera environ 6,5 et peut être vérifié à l’aide d’un pH-mètre.
      4. Ajouter 0,1 mL de solution d’oligo-éléments pour 100 mL de 13C, un milieu minimal marqué N 15figurant au tableau 2 avant utilisation.
  2. Croissance des matériaux fongiques
    1. Transférer une petite quantité de champignons du stockage sur une plaque de la DPJ en utilisant une boucle inoculer dans une hotte à flux laminaire. Conserver la culture à 30 ° C pendant 2 jours dans un incubateur.
    2. Une boucle d’inoculation permet de transférer un actif bord fongique croissant aux 13C, solution de marquage N15sous une hotte à flux laminaire. Conserver la culture à 30 ° C pendant 3 à 5 jours à 220 tr/min dans un incubateur à agitation.
    3. Centrifuger à 4 000 x g pendant 20 min. Retirez le surnageant et recueillir le culot.
    4. Utiliser une pince pour collecter ~0.5 g de granulés bien hydratée (> 50 % d’hydratation wt) pour les études de RMN. Perte d’hydratation à n’importe quel point s’aggravera considérablement la résolution spectrale.
      Remarque : Si nécessaire, une petite quantité (0,1 g) des mycéliums hydratés peut être séparée et complètement desséchée sous flux de gaz N2 dans une hotte ou un lyophilisateur pour estimer le niveau d’hydratation et de calculer le pourcentage en masse sèche. Généralement, un culot contenant ~0.3 g masse sèche peut être obtenue après 3 jours. Si l’expérience de NMR à effectuer est long (> 7 jours) ou si l’état des champignons doit être fixée, le matériel fongique peut être profondément figé en liquide N2 pour 10-20 min avant traitement ultérieur. Si l’expérience sera courte (3 à 6 jours), le gel peut être ignoré alors que l’échantillon peut rester fraîche.
    5. Mélanger le matériau excédentaire avec 20 % (v/v) de glycérol dans un tube à centrifuger et gardez-le dans un congélateur à-80 ᵒC pour le stockage à long terme.

2. Elaboration d’a. fumigatus pour Solid-State NMR et études de DNP

  1. Préparation d’a. fumigatus pour des expériences RMN à l’état solide
    1. Dialyser le 13C, 15N-étiqueté fongiques échantillon (étape 1.2.4.) contre 1 L de tampon de phosphate de 10 mM (pH 7,0) à 4 ° C à l’aide d’un sac de dialyse dont le poids moléculaire kDa 3.5 coupure pour enlever les petites molécules depuis le milieu de culture pour une durée totale de 3 jours. Changer le tampon deux fois par jour.
      Remarque : Par ailleurs, l’échantillon pourrait être lavé pour 6 à 10 fois à l’aide de l’eau déionisée pour enlever les résidus petites molécules.
    2. Transférer l’échantillon dans un tube de 15 mL et centrifuger pendant 5 min (10 000 x g) à l’aide d’une centrifugeuse de paillasse. Retirer le surnageant et récupérer le matériel fongique restant.
    3. Pack de 70-80 mg de l’uniforme 13échantillon C marqué et bien hydratée collez dans un ZrO2 rotor de 4 mm ou 30-50 mg à rotors de 3,2 mm pour des expériences RMN. Répétitivement squeeze l’échantillon délicatement à l’aide d’une tige de métal et absorber l’excès d’eau à l’aide de papier.
    4. Fermement, cap rotor et introduire l’échantillon dans le spectromètre pour la caractérisation de NMR à l’état solide.
      Remarque : Les rotors flambant neufs sont suggérées pour réduire les risques d’écrasement de rotor et les exemples de déversement dans le spectromètre RMN. Si nécessaire, un insert jetable de Kel-F avec vis d’étanchéité peut être utilisé pour servir de conteneur secondaire à l’intérieur du rotor.
  2. Préparation des échantillons d’a. fumigatus pour expériences DNP
    1. Préparer 100 µL de DNP solvants29,44 (également connu sous le nom la matrice DNP) dans un tube de microtubes de 1,5 mL pour 13C,15N marquée des échantillons fongiques. Cette matrice DNP contient un mélange de d8-glycérol/D2O/H2O (30/60/10 % en volume).
      NOTE : Si non étiquetées échantillons doivent être analysés, puis préparer la matrice DNP utilisant 13appauvris en C d8-glycérol (12C3, 99,95 % ; D8, 98 %) et D2O et H2O pour éviter 13C signal contribution de solvants.
    2. Dissoudre 0,7 mg de AMUPol de45 à 100 µL de solvants DNP de solution-mère radical forme 10 mM. Vortex pour 2-3 min pour s’assurer que les radicaux sont entièrement dissous dans la solution.
    3. Faire tremper 10 mg des dialysés 13C, 15N-étiqueté fongiques matériaux tel que décrit dans les étapes antérieures (points 2.1.1 et 2.1.2) dans 50 µL de solution de AMUPol et légèrement hachez le mélange à l’aide d’un pilon et un mortier pour assurer une pénétration des radicaux dans les parois poreuses.
      Remarque : Pour réduire le taux de perte d’hydratation, le broyage peut également avoir lieu dans un tube de microcentrifuge à l’aide d’un micropestle.
    4. Ajouter un autre 30 µL de la solution radicale au culot broyé à l’hydrate davantage l’échantillon fongique.
    5. Emballer le culot dans un rotor de saphir de 3,2 mm, presser légèrement et retirer l’excès de solvant DNP. Ajouter une fiche de 3,2 mm silicone pour empêcher la perte d’hydratation. En général, 5 à 30 mg d’échantillon peuvent être transporté vers le rotor. La quantité exacte doit être déterminée par l’exigence de la sensibilité de l’expériences de RMN à effectuer.
    6. Insérer et lancer l’échantillon dans un spectromètre de DNP, mesurer un spectre DNP améliorée sous irradiation hyperfréquence et comparez-le avec le spectre micro-ondes-off. Cela conduira à une amélioration facteur εmarche/arrêt, qui devrait être de 20 à 40 pour ces matériaux complexes. Exécuter les expériences conçues pour déterminer la structure de la paroi cellulaire.

3. préparation de la biomasse végétale pour la RMN et des études DNP

  1. Préparation des matières végétales pour NMR à semi-conducteurs
    1. Produire uniformément 13plantes marquées C internes à l’aide de 13CO2 fournitures dans une chambre ou 13C-glucose milieu de croissance comme décrit plus haut46,47 ou acheter directement des matériaux marqués de sociétés de marquage isotopique.
      NOTE : 13C-glucose utilisable uniquement en croissance sombre pour éviter l’introduction de 12C de la photosynthèse.
    2. Couper l’uniformément 13C marqué matériel végétal en petits morceaux (généralement 1-2 mm de dimension) à l’aide d’une lame de rasoir de laboratoire.
      Remarque : Selon le but, les parois des cellules extraites sont parfois utilisés pour la caractérisation structurale et les protocoles détaillés sont signalés dans les précédentes études21,46.
    3. Si l’échantillon a été préalablement séché, ajouter 100 µL d’eau à 30 mg de matières végétales dans un tube de microtubes de 1,5 mL, vortex, équilibrer à température ambiante pendant 1 jour. Centrifuger à 4 000 x g pendant 10 min et enlever l’excès d’eau à l’aide d’une pipette.
    4. Si l’échantillon n’était jamais séché à tout moment, directement utiliser l’échantillon sans autre traitement.
    5. Emballer le matériel végétal qui en résulte dans 3,2 mm ou 4 mm ZrO2 rotors pour des expériences RMN à l’état solide.
  2. Préparation des matières végétales pour études DNP
    1. Préparer 60 µL solution de 10 mM AMUPol radical comme étapes décrites 2.2.1 et 2.2.2.
    2. Couper l’uniformément 13C marqué matière végétale à être étudiés en petits morceaux (1-2 mm de dimension) à l’aide d’une lame de rasoir de laboratoire et peser 20 mg des matières végétales.
    3. Main-broyer les morceaux de plante en petites particules (~ 1-2 mm de la taille) à l’aide d’un mortier et un pilon. Les poudres finales ont un aspect homogène.
    4. Ajouter 40 µL de la solution mère de DNP préparées à l’étape précédente (étape 2.2.2) pour le matériel végétal et broyer légèrement pendant 5 min pour homogène mélange avec le radical.
    5. Ajouter un autre 20 µL de la solution mère à hydrater davantage le matériel végétal après broyage.
    6. Emballer l’échantillon de plante équilibrée dans un rotor de saphir de 3,2 mm pour des expériences DNP. Mettez une cheville de silicone pour éviter la perte d’hydratation.

4. des expériences de RMN à l’état solide standard pour la caractérisation initiale des biomatériaux riches en glucides

Remarque : Un bref aperçu de l’expériences RMN est fourni dans cette section. Cependant, l’élucidation de la structure nécessite généralement une vaste expertise. Par conséquent, des efforts de collaboration avec les spectroscopistes NMR est recommandé.

  1. Mesure 1D 13C Cross polarisation (CP), 13polarisation directe C (DP) avec 2 s et 35-s recycler les retards et 1H -13C INEPTE48,49 spectra afin d’obtenir une compréhension générale de la dynamique distribution de composants cellulaires (Figure 1 a). Les parois cellulaires sont en général la partie relativement rigide et pièce dominantes signaux dans le spectre de CP.
  2. Mesurer une série d’expériences de corrélation 2D standard 13C -13C pour les affectations de résonance des signaux 13C. Commencez par recentré insuffisante50,51 pour obtenir la connectivité de carbone, qui ont besoin d’être assisté par une série d’expériences à travers l’espace comme 1,5-ms RFDR52 (Figure 1 b) et cordon de 50 ms/DARR53 des expériences.
    Remarque : Si il est intéressant de trouver un échantillon riche en un composant spécifique, par exemple, le primaire ou secondaire parois, puis plusieurs segments ou plusieurs usines devrez peut-être être mesuré séparément pour rechercher l’exemple avec la composition optimale.
  3. Mener des expériences de corrélation 2D 15N -13C qui peuvent être mesurées pour faciliter les affectations de résonance des protéines et des glucides azotées.
    Remarque : La cession de résonance est en général beaucoup de temps. Une méthode est actuellement développée pour faciliter la cession de la résonance des signaux de glucides pour les scientifiques sans expérience préalable.
  4. Mesurer les expériences plus spécialisés pour déterminer les proximités spatiales (Figure 1 c, d), l’hydratation et la mobilités des biomolécules complexes pour déterminer la structure tridimensionnelle des matières riches en glucides comme systématiquement décrits précédemment22,29.

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Representative Results

L’isotope labeling sensiblement augmente la sensibilité de NMR et rend possible pour mesurer une série de 2D 13C -13C et spectres de corrélation15N 13C - d’analyser la composition, l’hydratation, la mobilité et de l’emballage de polymères, qui seront intégrés à construire un modèle tridimensionnel de l’architecture de la paroi cellulaire (Figure 1). Si l’étiquetage uniforme réussit, un ensemble complet de 1D 13C et 15N spectres peut être recueilli à moins de 1 h et chaque spectre 2D standard ne prenne pas plu de 24h de mesure.

Échantillons bien préparés généralement attendent deux fortes intensités NMR et sharp lignes. Compromission de chaque paramètre indique la préparation de l’échantillon non optimisé. Les échantillons fongiques devraient être établis d’une manière jamais séché, et déshydratation partielle pendant les étapes de l’emballage pourrait conduire à un élargissement notable de la largeur des raies. Si le temps expérimental est sensiblement plus longtemps que prévu pour un échantillon de NMR entièrement emballé, le niveau de l’étiquetage peut être faible. Si des signaux hors diagonale sont difficiles à obtenir dans le spectre de corrélation 2D 13C -13C, étiquetage statistiques seraient intervenues (Figure 1 b). Les deux sommets de 13C à 96 et 92 ppm sont des signaux de carbone 1 signature du glucose54, par conséquent, leurs intensités fortes dans le quantitatif 13C directement spectres de polarisation (DP) mesurés avec recycler longs retards de 35 s indique généralement la prédominance de petites molécules par dialyse incomplète ou le lavage (Figure 1 a). Avec des échantillons bien étiquetés, corrélations à longue portée peuvent être plus mesurées afin de détecter les proximités spatiales des biomolécules (Figure 1C) et construire le modèle structurel de parois intactes (Figure 1D).

Nom chimique Formule chimique Concentration (g/L)
Phosphate Dipotassique K2HPO4 1,045 g
Sulfate de magnésium Heptahydraté MgSO4·7H2O 0,52 g
Phosphate Monopotassique KH2PO4 g 0,815
15 N - Nitrate de Sodium 15 NaNO3 6,0 g
Chlorure de potassium KCl 0,52 g
U -13C-Glucose 13 C6H12O6 10,0 g

Le tableau 1. La composition du milieu minimal.

Nom chimique Formule chimique Concentration (g/L)
Tétrahydraté de Molybdate d’ammonium (NH4) 6 Mo7O24·4H2O 11 g
Acide borique H3BO3 11 g
Chlorure de cobalt Hexahydraté CoCl2·6H2O 16 g
Sulfate de cuivre pentahydraté CuSO4·5H2O 16 g
Sulfate ferreux Heptahydraté FeSO4·7H2O 5 g
Chlorure de manganèse tétrahydraté MnCl2·4H2O 5 g
Éthylènediaminetétraacétate de tétrasodium Na4EDTA·4H2O 60 g
Sulfate de zinc Heptahydraté ZnSO4·7H2O 22 g

Le tableau 2. La composition de la solution d’oligo-éléments (concentrée). Notez que pour la préparation de champignons non étiquetées, glucose sans étiquette et sans étiquette du nitrate de sodium peuvent être utilisées.

Figure 1
Figure 1. Organigramme pour caractériser la structure de la paroi cellulaire des champignons par RMN à l’état solide. (un) 1D spectres pour le dépistage de l’échantillon initial. Du haut vers le bas sont INEPT, 13C DP avec 2 s recycle retarde, 13C DP avec 35-s recycle retards et spectres de C CP 13, avec une diminution de mobilité pour les molécules détectées. (b) 2D 13C -13C corrélation spectre mesuré à l’aide de 1,5 ms RFDR recouplage. (c), à la croix intermoléculaire représentant le pic détecté en utilisant le spectre PAR 15-ms. (d) modèle structurel obtenu à partir des données de la RMN. Panneaux a, c et d ont été modifiés de Kang et al., nat. pers. 9, 2747 (2018). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Comparé à des méthodes biochimiques, NMR à semi-conducteurs a des avantages comme une technique non destructive et haute résolution. RMN est également quantitative à l’analyse de la composition, et contrairement à la plupart des autres méthodes analytiques, ne fait pas ont les incertitudes introduites par la solubilité limitée de biopolymères. Mise en place du protocole actuel facilite les études futures sur les riches en glucides de biomatériaux et polymères fonctionnalisés. Toutefois, il est à noter que l’analyse de données et de la cession de résonance peut prendre beaucoup de temps et exigent habituellement une formation systématique. Les auteurs élaborent actuellement des outils et bases de données pour aider les scientifiques sans expérience préalable de surmonter cet obstacle.

Étant donné l’abondance isotopique naturelle de 13C n'est que de 1,1 %, la probabilité d’observer un de 13C -13C croix à l’aide de la pointe non matériaux est seulement 0,012 % (1,1 % x 1,1 %) cette utilisation étiqueté uniformément les échantillons. Par conséquent, l’enrichissement isotopique atteint sensiblement sur ce protocole améliore la sensibilité NMR en quatre ordres de grandeur et permet des expériences de corrélation 2D pour la détermination de structure.

Les échantillons optimisées et bien hydratées devraient posséder des lignes nettes dans les spectres de corrélation 2D 13C -13C. Les composants mobiles, tels que les β-glucanes dans a. fumigatus et les pectines dans les usines devraient posséder une pleine largeur à moitié-maximum (FWHM) largeur de 0,3 à 0,5 ppm sur les spectromètres de RMN 600-800 MHz29,31. Les composants rigides ont légèrement plus larges sommets conformationnelle hétérogénéité des unités de sucre constituant, répétitif et le manque de mouvements moléculaires rapides. La largeur des raies typique 13C sont 0,7-1,0 ppm pour les microfibrilles de cellulose dans les plantes et de 0,5 à 0,7 ppm pour la chitine en champignons55. La largeur de raie nette de cellulose et la chitine sont principalement causées par la cristallinité de polymère, est donc partiellement résistant à la déshydratation et changement de température, par exemple, la température cryogénique de DNP expérience56,,57. La netteté de la crête de polymères de matrice, cependant, sont très sensibles au changement des conditions d’échantillon qui affectent la mobilité de polymère, par conséquent, il peut être utilisé comme un indicateur de l’hydratation de l’échantillon. Grandes lignes des polymères matrice désignent généralement le manque d’hydratation de l’échantillon, lesquelles peut-être être entièrement ou partiellement remboursée par rajouter l’eau58. En règle générale, un niveau d’hydratation de 50 à 80 % en poids est suffisant pour fournir une bonne largeur de raie en usine et échantillons fongiques.

DNP est souvent nécessaire pour enquêter sur ces systèmes de cellules entières difficiles. En règle générale, une amélioration de pli de 20-40 de sensibilité pourrait être atteint un échantillonnage optimisé sur un spectromètre DNP 600 MHz/395 GHz et cette valeur augmente avec la diminution de champ, par exemple, a presque doublé sur un 400 MHz/GHz 263 DNP26,59 . Il y a plusieurs facteurs qui pourraient influer sur l’efficacité DNP. Tout d’abord, la pénétration des radicaux dans le réseau poreux des parois cellulaires est cruciale et ce processus peut être considérablement facilité par meulage doux des biomatériaux dans la matrice DNP contenant des radicaux. Deuxièmement, les propriétés physiques, la rigidité, par exemple, de l’échantillon influe sur le choix de la puissance des micro-ondes, la matrice DNP « fond » moins 12 irradiation W comme en témoigne l’affûtage des résonances 1H, qui n’était pas un problème pour la plante plus rigide tiges de60. Ainsi, on observe un motif plus isotrope du pic de solvant 1H, avec abaisser sensiblement des bandes latérales de filature et de la valorisation de DNP atténuée. Une puissance plus faible est donc recommandée pour les matériaux tendres. En troisième lieu, la composition de DNP matrice doit être optimisée. Il s’avère que d8-glycérol/D2O/H2O est généralement les meilleurs solvants pour les matériaux tendres, alors qu’un choix plus simple et moins cher de D2O/H2O peut aussi être efficace dans certains cas, parce que les sucres présent dans le système sert de cryoprotecteurs dans une certaine mesure. En revanche, la d6-DMSO/D2O/H2O solution échoue dans les usines et les échantillons fongiques, avec moins de 10 fois de l’accroissement de la sensibilité, ainsi il n’est pas recommandé pour une utilisation à moins que des fins particulières. Un matrice un protocole d’entente a été démontré récemment très efficace en raison de l’épuisement des solvant, qui crée un espace supplémentaire pour accueillir plusieurs matériaux34,56,61. Cependant, la perte d’hydratation présente une perturbation majeure de la structure des biomolécules, donc cette méthode pourrait ne pas convenir aux systèmes biologiques. Si les parois cellulaires non étiquetés sont d’être étudié, 13appauvris en C d8-glycérol/D2O/H2O est le solvant optimal qui ne contribue pas toute abondance naturelle 13C signaux ni sacrifie toute sensibilité mise en valeur.

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Disclosures

Nous n’avons rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par la National Science Foundation, par le biais de NSF OIA-1833040. Le laboratoire National de champ magnétique élevé (NHMFL) est pris en charge par la National Science Foundation, par le biais de DMR-1157490 et l’état de Floride. Le système MAS-DNP au NHMFL est financé en partie par les NIH S10 OD018519 et NSF CHE-1229170.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium Molybdate Tetrahydrate Acros Organics 12054-85-2
AMUPol Cortecnet C010P002
Analytical weighing balance Ohaus B730439218 Model PA84C
Bioclave 16 L VWR 470230-598
Biosafety Cabinet Labconco corporation 302319100
Boric acid VWR BDH9222 store at 15-30 °C
Cobalt(II) Chloride Hexahydrate Honeywell|Fluka 60820 ≥98 %
Copper(II) Sulfate Pentahydrate BDH BDH9312 ≥98 %
Corning LSE shaking incubator Thermo Fisher Scientific 7202152
D2O Sigma Aldrich 151882 99.9 atom % D
d6-DMSO Sigma Aldrich 151874 99.9 atom % D
d8-glycerol Sigma Aldrich 447498 ≥99 atom % D
Dialysis tubing 3.2 kDa Sigma Aldrich D2272 132724
Dipotassium Phosphate VWR BDH9266 ≥98 %
Glycerol Sigma Aldrich G5516 ≥99.5 %
Heraus Megafuge 16R Centrifuge Thermo Fischer Scientific 750004271 Maximum RCF 25,830 x g
HR-MAS Disposable Insert Kit Bruker B4493 Kel-F
Iron(II) Sulfate Heptahydrate Alfa Aesar 14498 ≥99+ %
Magnesium Sulfate Heptahydrate VWR 10034998 store at 18-26 °C
Manganese(II) Chloride Tetrahydrate Alfa Aesar 11563 ≥99 %
Monopotassium Phosphate VWR 470302-254 ≥99 %
pH Meter Mettler Toledo B706689216
Tetrasodium Ethylenediaminetetraacetate Acros Organics 13235-36-9 ≥99.5 %
Zinc Sulfate Heptahydrate Alfa Aesar 33399 ≥98 %
12C3, d8-glycerol Cambridge Isotope Laboratory CDLM-8660 12C3, 99.95%; D8, 98%
13C6-glucose Sigma Alrdrich 364606 ≥99 % (CP)
15N-sodium nitrate Sigma Aldrich 364606 ≥98 % 15N, ≥99 (cp)
3.2 mm sapphire NMR rotor Cortecnet B6939
3.2 mm Silicone plug Bruker B7089
4 mm MAS Rotor Kit Bruker H14355 Zirconia

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References

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Biochimie numéro 144 Solid-State NMR polarisation nucléaire dynamique (DNP) glucides parois cellulaires biomatériaux plantes champignons
Préparation de champignons et de matières végétales pour l’élucidation de la structure dynamique de polarisation nucléaire RMN à l’état solide
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Kirui, A., Dickwella Widanage, M.More

Kirui, A., Dickwella Widanage, M. C., Mentink-Vigier, F., Wang, P., Kang, X., Wang, T. Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR. J. Vis. Exp. (144), e59152, doi:10.3791/59152 (2019).

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