Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

הכנת פטרייתי, צמח חומרי הבהרה מבניים באמצעות NMR של מצב מוצק קיטוב גרעיני דינמי

Published: February 12, 2019 doi: 10.3791/59152
Automatic Translation
*1, *1, 2, 3, 1, 1
1Department of Chemistry, Louisiana State University, 2National High Magnetic Field Laboratory, 3Departments of Pediatrics, and Microbiology, Immunology and Parasitology, Louisiana State University Health Sciences Center
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול להכנת 13ג,15דוגמאות פטרייתי וצמח התווית על-ידי N רב-ממדי ספקטרוסקופיה NMR של מצב מוצק וחקירות קיטוב גרעיני דינמי (DNP) מוצג.

Abstract

פרוטוקול זה מראה איך בצורה אחידה 13ג, 15התווית על-ידי N חומרים פטרייתי יכול להיות והופק כמה חומרים רכים אלה צריך להיות המשיך NMR של מצב מוצק, רגישות משופרת DNP ניסויים. ההליך דוגמת עיבוד של הצמח ביומסה גם מפורט. שיטה זו מאפשרת את המדידה של סדרת 1D ו- 2D 13C -13C /15N מתאמים ספקטרה, המאפשר הבהרה מבניים ברזולוציה גבוהה של מורכבות biomaterials במצב מקורי, עם ההפרעות מינימלי. האיזוטופ-תיוג יכולים להיבדק על ידי לכימות את עוצמת ב 1 י ספקטרה ואת יעילות העברת קיטוב ב- 2D המתאם ספקטרה. ניתן להעריך את ההצלחה של הכנת הדוגמא קיטוב גרעיני דינמי (DNP) על ידי הגורם שיפור הרגישות. לניסויים נוספים לבחון את ההיבטים המבניים של סוכרים, חלבונים יוביל מודל של הארכיטקטורה תלת מימדי. שיטות אלה ניתן לשנותם ולאחר הותאם לחקור מגוון רחב של חומרים עתירי פחמימות, כולל קירות התא הטבעי של צמחים, פטריות, אצות, חיידקים, וכן מסונתז או תוכנן פחמימות פולימרים ומורכב שלהם עם השני מולקולות.

Introduction

פחמימות תפקיד מרכזי בתהליכים ביולוגיים שונים כגון אחסון אנרגיה, בניין מבניים, ועל זיהוי הסלולר אדהזיה. הם מועשרים בקיר התא, אשר היא מרכיב מהותי צמחים, פטריות, אצות, חיידקים1,2,3. קיר התא מהווה מקור מרכזי הייצור של דלק ביולוגי, biomaterials, כמו גם מטרה מבטיחים טיפולים מיקרוביאלית4,5,6,7,8 , 9.

ההבנה העכשווית של חומרים מורכבים אלה כבר מתקדם באופן משמעותי על ידי עשורים של המאמצים הוקדשו אפיון מבניים בשיטות ארבע הגדולות ביוכימי או גנטי. השיטה הראשונה הגדולות מסתמך על טיפולים רציפים באמצעות כימיקלים קשים או אנזימים כדי לשבור את קירות התא לחלקים שונים, שבעקבותיה באה ההלחנה וניתוח הצמדה של סוכרים כל שבר10. שיטה זו שופך אור על התפלגות התחום של פולימרים, אך הפרשנות עלולה להטעות בשל המאפיינים הכימי והפיזי של מולקולות. לדוגמה, קשה לקבוע אם השבר אלקלי-לחילוץ מקורו מחשבים בודדת של מולקולות פחות מובנים או מולקולות נפרדות עם מסיסות דומות. שנית, חילוץ חלקים או את כל קירות התא ניתן גם למדוד באמצעות פתרון NMR כדי לקבוע את קישורים קוולנטיות, גם כינה crosslinking, בין מולקולות שונות11,12,13, 14,15. בדרך זו, יכול להיות ובחן את מבנה נתונים היסטוריים של עוגנים קוולנטיות, אך מגבלות יכולה להתקיים בשל המסיסות נמוכה של סוכרים, מספר קטן יחסית של אתרים crosslinking הבורות של תופעות שאינן קוולנטיות זה מייצבת אריזה רב-סוכר, כולל שטני של מימן, ואן דר Waals כוח, אינטראקציה אלקטרוסטטית, שזירה פולימר. שלישית, זיקה מחייבת היה נחוש במבחנה באמצעות פוליסכרידים מבודד16,17,18,19, אבל הטיהור הליכים עשוי לשנות באופן משמעותי מבנה ותכונות של מולקולות אלה. שיטה זו נכשלת גם לשכפל את התצהיר מתוחכמים והרכבה של מקרומולקולות לאחר ביוסינטזה. לבסוף, פנוטיפ, מורפולוגיה תאים, תכונות מכניות של מוטציות גנטיות עם ייצור הקלוש של רכיב מסוים דופן התא לשפוך אורות על התפקידים המבניים של סוכרים, אבל הראיות מולקולריות יותר יש צורך לגשר על אלה תצפיות מאקרוסקופית עם הפונקציה שעברו הנדסה לאחור של חלבון machineries20.

התפתחויות אחרונות פיתוח ויישום של רב-ממדי ספקטרוסקופיה NMR של מצב מוצק הציגו הזדמנות ייחודית לפתרון חידות מבניים אלה. ניסויים NMR של מצב מוצק דו-ממדי/תלת-ממדי לאפשר חקירה ברזולוציה גבוהה של הרכב, ארכיטקטורה של חומרים עתירי פחמימות במצב מקורי ללא ההפרעות הגדולות. מבניים מחקרים נערכו בהצלחה על ראשי והן קירות התא משני של צמחים, ביומסה שטופלו catalytically, biofilm חיידקי, הפיגמנט רוחות פטריות ו, לאחרונה על-ידי המחברים, קירות התא שלם בפטריה פתוגניים אספרגילוס fumigatus 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31. ההתפתחות של קיטוב גרעיני דינמי (DNP)32,33,34,35,36,37,38 , 39 , 40 , 41 , 42 מקלה באופן משמעותי על הבהרה מבניים NMR כמו שיפור הרגישות מאת DNP מקצר במידה ניכרת הזמן ניסיוני על biomaterials מורכבים אלה. הפרוטוקול המתואר כאן מפרט את נהלי איזוטופ-תיוג הפטריה fumigatus א והכנת פטרייתי ודוגמאות צמח על אפיון NMR, DNP של מצב מוצק. נהלים תיוג דומים צריך להיות רלוונטי פטריות אחרות שינו בינונית, ההליכים הכנת המדגם צריך להיות בדרך כלל החלים biomaterials עתירי פחמימות אחרות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. גידול של 13ג', 15התווית על-ידי N אספרגילוס fumigatus בינוני נוזלי

  1. הכנת ללא תווית ו- 13C, מדיום הגידול התווית על-ידי N 15
    הערה: שניהם דקסטרוז Peptone לחלץ שמרים בינונית (YPD), את שיפור בינונית מזערי43 שימשו לשם קיום תרבות פטרייתי. כל השלבים לאחר autoclaving מבוצעות בתא למינארי כדי למזער את הזיהום.
    1. הכנת בינוני נוזלי ללא תווית: להמיס 6.5 גר' אבקת YPD 100 מ של מים מזוקקים ולאחר מכן אוטוקלב במשך 25 דקות-134 מעלות צלזיוס.
    2. הכנת בינוני מוצק ללא תווית
      1. להוסיף 1.5 g של אגר, 6.5 גר' אבקת YPD 100 מ של מים מזוקקים.
      2. אוטוקלב המדיום במשך 25 דקות-121 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן מגניב עד כ 50 מעלות צלזיוס.
      3. להעביר 13-15 מ"ל של המדיום לתוך כל פלסטיק מראש עקר פטרי, מכסים את הכלי באמצעות מכסה באופן מיידי.
    3. הכנה של 13ג', 15התווית על-ידי N נוזלי בינוני
      הערה: כדי להכין את הפתרון צמיחה איזוטופ תיוג, מדיום מינימלי המכיל 13C-גלוקוז, 15N-נתרן חנקתי, פתרון יסוד קורט מוכן בנפרד הינם מעורבבים אז לפני השימוש.
      1. הכן 100 מ של המדיום מינימלי המכיל איזוטופ כמפורט בטבלה1. להתאים את ה-pH ל 6.6 באמצעות NaOH (1 מ') או פתרון HCl (1 מ').
      2. אוטוקלב אמצעי מינימלי עבור 25 דקות-121 מעלות צלזיוס.
      3. להכין 100 מ ל (1, 000 x) של יסודות קורט פתרון, לפזר את מלחי המופיעים בטבלה 2 במים מזוקקים. אוטוקלב הפתרון עבור 25 דקות-134 מעלות צלזיוס. לקרר ולאחסן את הפתרון ב 4 ° C לשימוש לטווח קצר. ה-pH יהיה בערך 6.5, ניתן לבדוק באמצעות מד pH.
      4. להוסיף 0.1 מ"ל של יסודות קורט פתרון 100 מ של 13ג', התווית על-ידי N בינונית מזערי 15כמפורט בטבלה מס ' 2 לפני השימוש.
  2. הצמיחה של החומרים פטרייתי
    1. העברת כמות קטנה של פטריות מהמחסן לצלחת YPD באמצעות ללולאה לחסן ב תא למינארי. שמור את התרבות ב 30 מעלות צלזיוס במשך יומיים בתוך אינקובטור.
    2. השתמש ללולאה לחסן להעברת פעיל היתרון פטרייתי גדל 13ג,15תיוג-N פתרון תא למינארי. לשמור על התרבות ב 30 מעלות צלזיוס במשך 3-5 ימים על 220 סל"ד ב חממה חזק.
    3. צנטריפוגה ב x 4,000 גרם במשך 20 דק. הסר תגובת שיקוע ולאסוף בגדר.
    4. השתמש פינצטה כדי לאסוף ~0.5 גר' צניפה שתיתן (> 50 wt % לחות) ללימודי NMR. אובדן לחות בכל נקודה להחמיר באופן משמעותי את הרזולוציה ספקטרלי.
      הערה: אם יש צורך, כמות קטנה (0.1 גר') של תפטיר רטוב ניתן להיות מופרדים, מיובש לחלוטין תחת זרימת גז2 N ברדס או של איזה שהוא לופילייזר כדי להעריך את רמת לחות ולחשב האחוז המוני יבש. בדרך כלל, גלולה המכילה ~0.3 g ניתן להשיג מסה יבש לאחר 3 ימים. אם הניסוי NMR להתנהל ארוך (> 7 ימים) ו/או אם המדינה של הפטריות צריך לתקן, החומר פטרייתי שיכול להיות עמוק קפוא נוזלי N2 למשך 10-20 דקות לפני עיבוד נוסף. אם הניסוי יהיה קצר (3-6 ימים), הקפאת יכול תדלג על כך לדוגמה יכול להישאר טריים.
    5. לערבב חומר עודף עם 20% (v/v) גליצרול בשפופרת צנטרפוגה ולשמור אותו במקפיא-80 ᵒC לאחסון לטווח ארוך.

2. הכנה של fumigatus א Solid-state NMR ולימודי DNP

  1. הכנת fumigatus א לניסויים NMR של מצב מוצק
    1. Dialyze 13ג, 15התווית על-ידי N פטרייתי דוגמת (שלב 1.2.4.) נגד 1 ליטר של 10 מ מ פוספט מאגר (pH 7.0) ב 4 ° C באמצעות שקית דיאליזה עם 3.5 kDa מולקולרית משקל סף כדי להסיר מולקולות קטנות מדיום הגידול לתקופה כוללת של 3 ימים. לשנות את המאגר פעמיים ביום.
      הערה: לחלופין, המדגם יכולים להישטף במשך 6 - 10 פעמים באמצעות מים יונים כדי להסיר שאריות מולקולות קטנות.
    2. להעביר את הדגימה לתוך צינור 15 מ"ל צנטריפוגה במשך 5 דקות (10,000 x g) באמצעות צנטריפוגה benchtop. הסר את תגובת שיקוע, לאסוף את החומרים פטרייתי.
    3. חבילת 70-80 מ"ג בצורה אחידה 13לדוגמה התווית על-ידי C, שתיתן הדבק לתוך הרוטור2 ZrO 4-מ מ או 30-50 מ"ג ל- 3.2 מ מ הרוטורים לניסויים NMR. שוב ושוב לסחוט את הדגימה בעדינות באמצעות מוט מתכת, לספוג את המים העודפים שימוש בנייר.
    4. בחוזקה קאפ הרוטור, להכניס את הדגימה ספקטרומטר עבור אפיון NMR של מצב מוצק.
      הערה: הרוטורים חדשים מוצעים כדי למזער את האפשרות של הרוטור התרסקות ולטעום נוזלים ב ספקטרומטר NMR. אם יש צורך, הוספה קל-F חד פעמיות עם איטום הברגים יכול לשמש כדי לשמש כגורם מכיל משני בתוך הרוטור.
  2. הכנת fumigatus א דוגמאות לניסויים DNP
    1. להכין µL 100 DNP ממיסים29,44 (הידוע גם בשם המטריקס DNP) צינור microcentrifuge 1.5 mL 13ג,15התווית על-ידי N דגימות פטרייתי. מטריצה זו DNP מכיל תערובת של d8-גליצרול/D2O H2O (60/30/10 Vol %).
      הערה: אם הם דוגמאות ללא תווית להיחקר, ואז להכין המטריקס DNP באמצעות 13מדולדל C d8-גליצרול (12ג3, 99.95%; ד8, 98%) ו- D2O ו- H2O להימנע 13ג אות התרומה ממיסים.
    2. להמיס 0.7 מ"ג של AMUPol45 ב- µL 100 DNP בממיסים טופס 10 מ מ מניות פתרון רדיקלי. מערבולת למשך 2-3 דקות על מנת להבטיח כי רדיקלים הם מומס באופן מלא הפתרון.
    3. משרים 10 מ ג של dialyzed 13C, התווית על-ידי N חומרים פטרייתי 15כפי שתואר בשלבים קודמים (שלבים 2.1.1 ו 2.1.2) לתוך µL 50 של פתרון AMUPol, במתינות לטחון את התערובת באמצעות כבעלי מרגמה כדי להבטיח חדירה של הגורמים הקיצוניים לתוך קירות התא נקבובי.
      הערה: כדי להפחית את קצב איבוד לחות, שהטחינה יכולה להתקיים גם צינור microcentrifuge באמצעות micropestle.
    4. להוסיף עוד 30 µL של הפתרון הרדיקלי בגדר חרקו כדי מימה נוספת הדגימה פטרייתי.
    5. לארוז בגדר לתוך רוטור ספיר 3.2 מ מ, לסחוט בעדינות ולהסיר הממס DNP עודף. להוסיף פקק סיליקון 3.2 מ מ כדי למנוע את אובדן לחות. בדרך כלל, עמוסים 5-30 מ"ג של הדגימה את הרוטור. הסכום המדויק צריך להיקבע על ידי הדרישה רגישות של הניסויים NMR להתנהל.
    6. הכנס לשחחר מדגם ספקטרומטר DNP, למדוד את קשת משופרת DNP תחת הקרנה במיקרוגל ולהשוות אותם עם הקשת מיקרוגל-off. זה יוביל שיפור מקדם חדוההפעלה/כיבוי, אשר אמור להיות 20-40 עבור חומרים מורכבים אלה. הפעל את הניסויים מעוצב כדי לקבוע מבנה דופן התא.

3. הכנה של הצמח ביומסה NMR ולימודי DNP

  1. הכנת חומרי צמח NMR של מצב מוצק
    1. לייצר בצורה אחידה 13התווית על-ידי C צמחים ללא צורך במיקור חוץ באמצעות 13CO2 אספקה קאמרית או 13C-גלוקוז מדיום הגידול כפי שתואר לעיל46,47 או ישירות לרכוש חומרים עם תוויות תיוג-איזוטופ חברות.
      הערה: 13C-גלוקוז יכול לשמש רק בצמיחה כהה כדי למנוע את כניסתה של 12C על ידי פוטוסינתזה.
    2. לחתוך בצורה אחידה 13ג שכותרתו חומר צמחי לחתיכות קטנות (בדרך כלל 1-2 מ. מ בממד) באמצעות תער מעבדה.
      הערה: בהתאם למטרה, קירות התא שהופרד נעשה שימוש לעיתים עבור אפיון מבניים, הפרוטוקולים מפורט מדווחים על מחקרים קודמים21,46.
    3. אם המדגם היה בעבר יבש, להוסיף 100 µL של מים 30 מ"ג של הצמח חומרים צינור microcentrifuge 1.5 mL, מערבולת, equilibrate בטמפרטורת החדר עבור יום אחד. צנטריפוגה ב x 4,000 g 10 דקות ולהסיר עודפי המים באמצעות פיפטה.
    4. אם המדגם היה מיובש מעולם לא בשלב כלשהו, להשתמש ישירות המדגם ללא טיפול נוסף.
    5. חבילת החומרים הצמח שתיווצר לתוך 3.2 מ מ או 4 מ מ ZrO2 רוטורים לניסויים NMR של מצב מוצק.
  2. הכנה של חומרים צמח ללימודי DNP
    1. להכין פתרון 60 של מניות µL 10 מ מ AMUPol רדיקלית כפי שמתואר שלבים 2.2.1 ו- 2.2.2.
    2. לחתוך בצורה אחידה 13ג שכותרתו חומר צמחי שילמדו לחתיכות קטנות (1-2 מ מ בממד) באמצעות תער מעבדה ולשקול 20 מ ג של החומרים הצמח.
    3. יד-לטחון החלקים צמח לתוך חלקיקים קטנים (~ 1-2 מ"מ) באמצעות ומכתש. אבקות הסופי יש מראה הומוגני.
    4. הוסף µL 40 של הפתרון מניות DNP המבושלות צעד קודם (שלב 2.2.2) לחומר צמח, לטחון במתינות למשך 5 דקות להבטיח הומוגנית ערבוב עם הקיצוני.
    5. להוסיף עוד 20 µL של הפתרון המניות עוד יותר מימה החומר הצמח לאחר שחיקה.
    6. חבילת המדגם צמח equilibrated לתוך 3.2 מ מ רוטור ספיר לניסויים DNP. להוסיף פקק סיליקון כדי למנוע את אובדן לחות.

4. תקן NMR של מצב מוצק ניסויים עבור משלב האפיון הראשוני של Biomaterials עתירי פחמימות

הערה: סקירה קצרה של הניסויים NMR מסופק בסעיף זה. עם זאת, הבהרה מבנית בדרך כלל דורש מומחיות מקיפה. לכן, מומלץ מאמצים משותפים עם NMR spectroscopists.

  1. מדד 1 י 13C לחצות קיטוב (CP), 13C ישירה קיטוב (DP) עם 2-s ו- 35-s המיחזור עיכובים, 1H -13C מיומן48,49 ספקטרה כדי להשיג הבנה כללית של דינמיות הפצה של רכיבים תא (איור 1 א'). קירות התא הם בדרך כלל החלק יחסית נוקשה ולהציג אותות דומיננטי בספקטרום CP.
  2. למדוד סדרת 2D תקן 13C -13C מתאם ניסויים עבור הקצאות תהודה של אותות 13C. להתחיל עם לקוי refocused50,51 לקבלת קישוריות פחמן, אשר צריך להיות בסיוע סדרה של ניסויים דרך-שטח כגון 1.5-ms RFDR52 (איור 1b) חוט 50-ms/דר53 ניסויים.
    הערה: אם זה עניין למצוא דוגמא עשירה רכיב מסוים, לדוגמה, ראשית או קירות התא משני, אז מקטעים מרובים או צמחים מרובים עשויים צריך למדוד בנפרד כדי למצוא את הדגימה עם הרכב מיטבי.
  3. לערוך ניסויים המתאם13C 2D 15N - אשר ניתן למדוד כדי להקל את ההקצאות תהודה של חלבונים ופחמימות nitrogenated.
    הערה: ההקצאה תהודה היא בדרך כלל זמן רב. שיטה כיום מפותח כדי להקל על המשימה תהודה של פחמימות אותות עבור המדענים הללו ללא ניסיון קודם.
  4. למדוד את הניסויים יותר מיוחדים כדי לקבוע את מרחבי proximities (איור 1 c, d), הידרציה ואת mobilities של מולקולות מורכבות כדי לקבוע למבנה התלת ממדי של החומרים עתירי פחמימות כמו באופן שיטתי שתוארה לעיל22,29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איזוטופ תיוג באופן משמעותי משפר את הרגישות NMR, מאפשרת מדידה של סדרת 2D 13C -13C ו 13C -15N מתאם ספקטרה כדי לנתח את הרכב, לחות, ניידות, אריזה של פולימרים, אשר ניתן לשלב בניית מודל תלת מימדי של דופן התא אדריכלות (איור 1). אם תיוג אחיד מצליחה, ערכה מלאה של 1 י 13C ו 15N ספקטרה ניתן לאסוף בתוך 1 h, כל ספקטרום 2D רגיל צריך לקחת לא יותר מ- 24 שעות של המדידה.

מצ'יטה בדרך כלל לצפות בשתי עוצמות NMR גבוהה ודוגמאות קווים חדים. להתפשר גם הפרמטר מציין הכנת הדוגמא משולחים שאינם מיטביים. הדגימות פטרייתי צריך להיות מוכן בצורה לא מיובשות, התייבשות חלקית במהלך השלבים האריזה יכול להוביל התרחבות הבולטים של linewidth. אם הזמן ניסיוני הוא באופן משמעותי זמן רב מהצפוי עבור מדגם NMR במלואו ארזה, רמת תיוג עלול להיות נמוך. אם את-אלכסון אותות קשה להשיג בספקטרום 2D 13C -13C המתאם, תיוג סטטיסטי ייתכן שאירעה (איור 1b). שתי הפסגות 13C ב- 96, 92 עמודים לדקה החתימה אותות פחמן 1 של גלוקוז54, לכן, שלהם בעוצמות חזקות כמותיים 13C ישיר קיטוב (DP) ספקטרום נמדד עם עיכובים המיחזור ארוך של 35 s מציינים בדרך כלל הדומיננטיות של מולקולות קטנות עקב דיאליזה לא שלם או שטיפה (איור 1 א'). עם הלחצנים הוסף דוגמיות, מתאמים ארוכי טווח ניתן למדוד עוד יותר את proximities המרחבי של מולקולות (איור 1 c) ויוכל לבנות את המודל המבני של קירות התא שלם (איור 1 d).

שם כימי כתיב כימי ריכוז (g/L)
Dipotassium פוספט K-2-HPO-4 1.045 g
מגנזיום גופרתי Heptahydrate MgSO4·7H2O 0.52 g
Monopotassium פוספט 2פו ח'4 0.815 g
15 N - נתרן חנקתי 15 ננו3 6.0 g
אשלגן כלורי אשלגן כלורי 0.52 g
U -13C-גלוקוז 13 12O C6ח6 10.0 g

טבלה 1. ההרכב של המדיום מינימלי.

שם כימי כתיב כימי ריכוז (g/L)
אמוניום Molybdate Tetrahydrate (NH4) 6 מו7O24·4H2O 11 גרם
חומצה בורית H3בו3 11 גרם
כלוריד cobaltous Hexahydrate CoCl2·6H2O 16 גרם
Pentahydrate סולפט cupric CuSO4·5H2O 16 גרם
Heptahydrate גופריתי מכל4·7H2O 5 g
כלוריד manganous Tetrahydrate MnCl2·4H2O 5 g
Tetrasodium Ethylenediaminetetraacetate נה4EDTA·4H2O 60 גרם
Heptahydrate אבץ גופרתי ZnSO4·7H2O 22 גרם

בטבלה 2. ההרכב של הפתרון יסוד קורט (מרוכז). שימו לב כי עבור הכנת פטריות ללא תווית, גלוקוז ללא תווית, ללא תווית נתרן חנקתי יכול לשמש.

Figure 1
איור 1. תרשים זרימה עבור אפיון מבנה קיר התא פטרייתי באמצעות NMR של מצב מוצק. () ד 1 ספקטרום להקרנה הדגימה הראשונית. בין החלק העליון לחלק התחתון הם INEPT, 13C DP עם 2-s המיחזור מעכב, 13C DP עם 35-s המיחזור ועיכובים 13ג CP ספקטרה, עם הפחתת ניידות עבור מולקולות שזוהו. (b) 2D 13C -13C המתאם ספקטרום נמדד באמצעות 1.5-ms RFDR recoupling. (ג) נציג הצלב הבין-מולקולרי שיא שזוהו באמצעות ספקטרום PAR 15-ms. (ד) מודל מבניים המתקבל NMR נתונים. לוחות , c ו- d שונו מ קאנג. ואח ', נט Commun. 9, 2747 (2018). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

לעומת שיטות ביוכימיות, NMR של מצב מוצק יש יתרונות כמו טכניקה הרסניות ו ברזולוציה גבוהה. NMR גם כמותיים בניתוח ההלחנה, בניגוד לרוב שיטות אנליטיות אחרות, לא צריך אי הוודאויות שהוצגו על ידי המסיסות מוגבל biopolymers. הקמת בפרוטוקול הנוכחי מקלה על מחקרים עתידיים על פחמימות-עשיר biomaterials, פולימרים functionalized. עם זאת, יצוין כי הקצאה תהודה וניתוח נתונים יכולה לגזול זמן רב, בדרך כלל דורשים הכשרה. המחברים כיום מפתחים כלים, מסדי נתונים כדי לעזור מדענים ללא ניסיון קודם כדי להתגבר על מחסום זה.

מאז שפע איזוטופ טבעי 13C הוא רק כ- 1.1%, ההסתברות להתבוננות של 13C -13C צלב שיא באמצעות תווית חומרים היא רק 0.012% (1.1% x 1.1%) של שימוש בצורה אחידה עם התווית דגימות. לכן, העשרת איזוטופ מושגת באמצעות פרוטוקול זה באופן משמעותי משפרת את הרגישות NMR על-ידי ארבעה סדרי גודל ומאפשר 2D מתאם ניסויים לקביעת מבנית.

הדגימות ממוטבת, שתיתן צריך להציג קווים חדים ב- 2D 13C -13C המתאם ספקטרה. הרכיבים ניידים, כגון β-glucans, א fumigatus את pectins בצמחים צריך להציג ברוחב-מלא-חצי-מקסימום linewidth (FWHM) של 0.3-0.5 ppm על 600-800 מגה-הרץ NMR ספקטרומטרים29,31. הרכיבים נוקשה יש בו מעט רחבה יותר בשל הטרוגניות הסתגלותי של יחידות סוכר קונסטיטוטיבי, החוזרות על עצמן ואת חוסר תנועות מולקולרית מהירה. Linewidth טיפוסי 13C הוא 0.7-1.0 ppm עבור תאית microfibrils צמחים ו 0.5-0.7 ppm עבור כיטין, פטריות55. Linewidth חד תאית, כיטין נגרמים בעיקר על ידי פולימר crystallinity, ולכן הוא עמיד חלקית בפני התייבשות ושינויי טמפרטורה, לדוגמה, הטמפרטורה קריוגני של DNP ניסוי56,57. החדות שיא של פולימרים מטריקס, עם זאת, רגישים מאוד השינוי של מדגם תנאים המשפיעים על ניידות פולימר, לכן, זה יכול לשמש כמחוון של מדגם לחות. קווים רחבה של מטריקס פולימרים לייעד בדרך כלל חוסר לחות במדגם, אשר עשוי להיות במלואה או בחלקה התאושש על ידי הוספת מים58מחדש. בדרך כלל, רמה הידרציה של 50-80% wt מספיקה על מתן של linewidth טוב צמח והן דוגמאות פטרייתי.

DNP נחוץ לעיתים קרובות על חקירת מערכות אלו תאים שלמים מאתגר. בדרך כלל, ניתן להשיג שיפור קיפול 20-40 של רגישות על דוגמה וממליצה על ספקטרומטר DNP 600 מגה-הרץ/395 ג'יגה-הרץ, ערך זה עולה עם הפחתת השדה, לדוגמה, כמעט הכפילה של 400 מגה-הרץ/263 GHz DNP26,59 . ישנם מספר גורמים אשר עשויים להשפיע על יעילות DNP. ראשית, החדירה של רדיקלים לתוך הרשת הנקבובי של קירות התא הוא קריטי, תהליך זה ניתן להקל באופן משמעותי על ידי שפשוף עדין של biomaterials המטריצה DNP המכילות רדיקלי. שנית, המאפיינים הפיזיים, הקשיחות לדוגמה, המדגם משפיע על הבחירה של כוח מיקרוגל, המטריקס DNP "נמס" הקרנה W 12 כפי שמעידים החידוד של 1H מגנטיים, אשר לא היתה בעיה של הצמח נוקשה נובעת60. כתוצאה מכך, נוצרת תבנית יותר איזוטרופיות הפסגה 1H. הממס, עם נמוך באופן משמעותי sidebands ספינינג ושיפור DNP הקלוש. לכן, החלשות כוח מומלץ חומרים רכים יותר. שלישית, ההרכב של מטריקס DNP צריך להיות מותאם. מתברר כי ד8-גליצרול/D2O H2O היא בדרך כלל ממיסים הטוב ביותר עבור חומרים רכים בעת בחירה יותר פשוט וזול של D2O H2O גם יכול להיות יעיל במקרים מסוימים כי סוכרים להציג במערכת משמש cryoprotectants במידה מסוימת. לעומת זאת, d6-דימתיל סולפוקסיד/D2פתרון2O O/H נכשל צמחים והן דגימות פטרייתי, עם פחות מ 10-fold של שיפור הרגישות, ולכן לא מומלץ לשימוש אלא אם כן למטרות מיוחדות. פרוטוקול ללא מטריצה לאחרונה הוכח יעיל מאוד עקב דלדול הממס, אשר יוצר שטח נוסף כדי להכיל יותר חומרים34,56,61. עם זאת, האובדן של לחות מציגה ההפרעות העיקריים של המבנה של מולקולות, ולכן שיטה זו עשוי לא להיות מתאים מערכות ביולוגיות. אם תווית קירות התא הם להיות למד, 13מדולדל C d8-גליצרול/D2O H2O הוא הממס האופטימלי זה לא תורם סימנים 13C טבעי שפע ולא מקריב כל רגישות שיפור.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין לנו לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע דרך ה-NSF אויה-1833040. נבחרת גבוהה השדה המגנטי מעבדה (NHMFL) נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע דרך DMR-1157490, פלורידה. מערכת MAS-DNP-NHMFL הוא מומן בחלקו על ידי NIH S10 OD018519 ואת ה-NSF צ'ה-1229170.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium Molybdate Tetrahydrate Acros Organics 12054-85-2
AMUPol Cortecnet C010P002
Analytical weighing balance Ohaus B730439218 Model PA84C
Bioclave 16 L VWR 470230-598
Biosafety Cabinet Labconco corporation 302319100
Boric acid VWR BDH9222 store at 15-30 °C
Cobalt(II) Chloride Hexahydrate Honeywell|Fluka 60820 ≥98 %
Copper(II) Sulfate Pentahydrate BDH BDH9312 ≥98 %
Corning LSE shaking incubator Thermo Fisher Scientific 7202152
D2O Sigma Aldrich 151882 99.9 atom % D
d6-DMSO Sigma Aldrich 151874 99.9 atom % D
d8-glycerol Sigma Aldrich 447498 ≥99 atom % D
Dialysis tubing 3.2 kDa Sigma Aldrich D2272 132724
Dipotassium Phosphate VWR BDH9266 ≥98 %
Glycerol Sigma Aldrich G5516 ≥99.5 %
Heraus Megafuge 16R Centrifuge Thermo Fischer Scientific 750004271 Maximum RCF 25,830 x g
HR-MAS Disposable Insert Kit Bruker B4493 Kel-F
Iron(II) Sulfate Heptahydrate Alfa Aesar 14498 ≥99+ %
Magnesium Sulfate Heptahydrate VWR 10034998 store at 18-26 °C
Manganese(II) Chloride Tetrahydrate Alfa Aesar 11563 ≥99 %
Monopotassium Phosphate VWR 470302-254 ≥99 %
pH Meter Mettler Toledo B706689216
Tetrasodium Ethylenediaminetetraacetate Acros Organics 13235-36-9 ≥99.5 %
Zinc Sulfate Heptahydrate Alfa Aesar 33399 ≥98 %
12C3, d8-glycerol Cambridge Isotope Laboratory CDLM-8660 12C3, 99.95%; D8, 98%
13C6-glucose Sigma Alrdrich 364606 ≥99 % (CP)
15N-sodium nitrate Sigma Aldrich 364606 ≥98 % 15N, ≥99 (cp)
3.2 mm sapphire NMR rotor Cortecnet B6939
3.2 mm Silicone plug Bruker B7089
4 mm MAS Rotor Kit Bruker H14355 Zirconia

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murrey, H. E., Hsieh-Wilson, L. C. The chemical neurobiology of carbohydrates. Chemical Reviews. 108 (5), 1708-1731 (2008).
  2. Latge, J. P. The cell wall: a carbohydrate armour for the fungal cell. Molecular Microbiology. 66 (2), 279-290 (2007).
  3. Cosgrove, D. J. Growth of the plant cell wall. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 850-861 (2005).
  4. Furtado, A., et al. Modifying plants for biofuel and biomaterial production. Plant Biotechnology Journal. 12 (9), 1246-1258 (2014).
  5. Loqué, D., Scheller, H. V., Pauly, M. Engineering of plant cell walls for enhanced biofuel production. Current Opinion in Plant Biology. 25, 151-161 (2015).
  6. Latge, J. P. Aspergillus fumigatus and aspergillosis. Clinical Microbiology Reviews. 12 (2), 310-350 (1999).
  7. Ragauskas, A. J., et al. The path forward for biofuels and biomaterials. Science. 311 (5760), 484-489 (2006).
  8. Service, R. F. Cellulosic ethanol - Biofuel researchers prepare to reap a new harvest. Science. 315 (5818), 1488-1491 (2007).
  9. Somerville, C., Youngs, H., Taylor, C., Davis, S. C., Long, S. P. Feedstocks for Lignocellulosic Biofuels. Science. 329 (5993), 790-792 (2010).
  10. Schiavone, M., et al. A combined chemical and enzymatic method to determine quantitatively the polysaccharide components in the cell wall of yeasts. FEMS Yeast Research. 14 (6), 933-947 (2014).
  11. Cheng, K., Sorek, H., Zimmermann, H., Wemmer, D. E., Pauly, M. Solution-State 2D NMR Spectroscopy of Plant Cell Walls Enabled by a Dimethylsulfoxide-d(6)/1-Ethyl-3-methylimidazolium Acetate Solvent. Analytical Chemistry. 85 (6), 3213-3221 (2013).
  12. Mansfield, S. D., Kim, H., Lu, F. C., Ralph, J. Whole plant cell wall characterization using solution-state 2D NMR. Nature Protocols. 7 (9), 1579-1589 (2012).
  13. Tan, L., et al. An Arabidopsis Cell Wall Proteoglycan Consists of Pectin and Arabinoxylan Covalently Linked to an Arabinogalactan Protein. Plant Cell. 25 (1), 270-287 (2013).
  14. Kollar, R., Petrakova, E., Ashwell, G., Robbins, P. W., Cabib, E. Architecture of the Yeast-Cell Wall - the Linkage between Chitin and Beta(1-3)-Glucan. Journal of Biological Chemistry. 270 (3), 1170-1178 (1995).
  15. Kollar, R., et al. Architecture of the yeast cell wall - beta(1->6)-glucan interconnects mannoprotein, beta(1-3)-glucan, and chitin. Journal of Biological Chemistry. 272 (28), 17762-17775 (1997).
  16. Mccann, M. C., et al. Old and new ways to probe plant cell wall architecture. Canadian Journal of Botany. 73, S103-S113 (1995).
  17. Whitney, S. E. C., Brigham, J. E., Darke, A. H., Reid, J. S. G., Gidley, M. J. In-Vitro Assembly of Cellulose/Xyloglucan Networks - Ultrastructural and Molecular Aspects. The Plant Journal. 8 (4), 491-504 (1995).
  18. Zykwinska, A. W., Ralet, M. C. J., Garnier, C. D., Thibault, J. F. J. Evidence for in vitro binding of pectin side chains to cellulose. Plant Physiology. 139 (1), 397-407 (2005).
  19. Kiemle, S. N., et al. Role of (1,3)(1,4)-beta-Glucan in Cell Walls: Interaction with Cellulose. Biomacromolecules. 15 (5), 1727-1736 (2014).
  20. Pogorelko, G., Lionetti, V., Bellincampi, D., Zabotina, O. Cell wall integrity: targeted post-synthetic modifications to reveal its role in plant growth and defense against pathogens. Plant Signaling & Behavior. 8 (9), e25435 (2013).
  21. Wang, T., Park, Y. B., Cosgrove, D. J., Hong, M. Cellulose-Pectin Spatial Contacts Are Inherent to Never-Dried Arabidopsis thaliana Primary Cell Walls: Evidence from Solid-State NMR. Plant Physiology. 168 (3), 871-884 (2015).
  22. Wang, T., Salazar, A., Zabotina, O. A., Hong, M. Structure and dynamics of Brachypodium primary cell wall polysaccharides from two-dimensional 13C solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biochemistry. 53 (17), 2840-2854 (2014).
  23. Grantham, N. J., et al. An even pattern of xylan substitution is critical for interaction with cellulose in plant cell walls. Nature Plants. 3 (11), 859-865 (2017).
  24. Simmons, T. J., et al. Folding of xylan onto cellulose fibrils in plant cell walls revealed by solid-state NMR. Nature Communications. 7, 13902 (2016).
  25. Komatsu, T., Kikuchi, J. Selective Signal Detection in Solid-State NMR Using Rotor-Synchronized Dipolar Dephasing for the Analysis of Hemicellulose in Lignocellulosic Biomass. The Journal of Physical Chemistry Letters. 4 (14), 2279-2283 (2013).
  26. Perras, F. A., et al. Atomic-Level Structure Characterization of Biomass Pre- and Post-Lignin Treatment by Dynamic Nuclear Polarization-Enhanced Solid-State NMR. The Journal of Physical Chemistry A. 121 (3), 623-630 (2017).
  27. Chatterjee, S., Prados-Rosales, R., Itin, B., Casadevall, A., Stark, R. E. Solid-state NMR Reveals the Carbon-based Molecular Architecture of Cryptococcus neoformans Fungal Eumelanins in the Cell Wall. Journal of Biological Chemistry. 290 (22), 13779-13790 (2015).
  28. Zhong, J., Frases, S., Wang, H., Casadevall, A., Stark, R. E. Following fungal melanin biosynthesis with solid-state NMR: biopolymer molecular structures and possible connections to cell-wall polysaccharides. Biochemistry. 47 (16), 4701-4710 (2008).
  29. Kang, X., et al. Molecular architecture of fungal cell walls revealed by solid-state NMR. Nature Communications. 9 (1), 2747 (2018).
  30. Takahashi, H., et al. Solid-state NMR on bacterial cells: selective cell wall signal enhancement and resolution improvement using dynamic nuclear polarization. Journal of the American Chemical Society. 135 (13), 5105-5110 (2013).
  31. Wang, T., Hong, M. Solid-state NMR investigations of cellulose structure and interactions with matrix polysaccharides in plant primary cell walls. Journal of Experimental Botany. 67, 503-514 (2016).
  32. Mentink-Vigier, F., Akbey, Ü, Oschkinat, H., Vega, S., Feintuch, A. Theoretical aspects of magic angle spinning-dynamic nuclear polarization. Journal of Magnetic Resonance. 258, 102-120 (2015).
  33. Gupta, R., et al. Dynamic nuclear polarization enhanced MAS NMR spectroscopy for structural analysis of HIV-1 protein assemblies. The Journal of Physical Chemistry B. 120 (2), 329-339 (2016).
  34. Takahashi, H., Hediger, S., De Paëpe, G. Matrix-free dynamic nuclear polarization enables solid-state NMR 13 C-13 C correlation spectroscopy of proteins at natural isotopic abundance. Chemical Communications. 49 (82), 9479-9481 (2013).
  35. Ni, Q. Z., et al. High frequency dynamic nuclear polarization. Accounts of Chemical Research. 46 (9), 1933-1941 (2013).
  36. Koers, E. J., et al. NMR-based structural biology enhanced by dynamic nuclear polarization at high magnetic field. Journal of Biomolecular NMR. 60 (2-3), 157-168 (2014).
  37. Saliba, E. P., et al. Electron Decoupling with Dynamic Nuclear Polarization in Rotating Solids. Journal of the American Chemical Society. 139 (18), 6310-6313 (2017).
  38. Mentink-Vigier, F., et al. Efficient cross-effect dynamic nuclear polarization without depolarization in high-resolution MAS NMR. Chemical Science. 8 (12), 8150-8163 (2017).
  39. Smith, A. N., Twahir, U. T., Dubroca, T., Fanucci, G. E., Long, J. R. Molecular Rationale for Improved Dynamic Nuclear Polarization of Biomembranes. The Journal of Physical Chemistry B. 120 (32), 7880-7888 (2016).
  40. Su, Y., Andreas, L., Griffin, R. G. Magic angle spinning NMR of proteins: high-frequency dynamic nuclear polarization and 1H detection. Annual Reviews of Biochemistry. 84, 465-497 (2015).
  41. Hediger, S., Lee, S., Mentink-Vigier, F., Paepe, G. D. MAS-DNP Enhancements: Hyperpolarization, Depolarization, and Absolute Sensitivity. eMagRes. 7, 1-13 (2018).
  42. Ni, Q. Z., et al. In Situ Characterization of Pharmaceutical Formulations by Dynamic Nuclear Polarization Enhanced MAS NMR. The Journal of Physical Chemistry B. 121 (34), 8132-8141 (2017).
  43. Hill, T. W., Kafer, E. Improved protocols for Aspergillus minimal medium: trace element and minimal medium salt stock solutions. Fungal Genetics Reports. 48 (1), 20-21 (2001).
  44. Rossini, A. J., et al. Dynamic nuclear polarization surface enhanced NMR spectroscopy. Accounts of Chemical Research. 46 (9), 1942-1951 (2013).
  45. Sauvée, C., et al. Highly efficient, water-soluble polarizing agents for dynamic nuclear polarization at high frequency. Angewandte Chemie International Edition. 125 (41), 11058-11061 (2013).
  46. Phyo, P., et al. Gradients in Wall Mechanics and Polysaccharides along Growing Inflorescence Stems. Plant physiology. 175 (4), 1593-1607 (2017).
  47. White, P. B., Wang, T., Park, Y. B., Cosgrove, D. J., Hong, M. Water-polysaccharide interactions in the primary cell wall of Arabidopsis thaliana from polarization transfer solid-state NMR. Journal of the American Chemical Society. 136 (29), 10399-10409 (2014).
  48. Jippo, T., Kamo, O., Nagayama, K. Determination of long-range proton-carbon 13 coupling constants with selective two-dimensional INEPT. Journal of Magnetic Resonance. 66 (2), 344-348 (1969).
  49. Morris, G. A. Sensitivity enhancement in nitrogen-15 NMR: polarization transfer using the INEPT pulse sequence. Journal of the American Chemical Society. 102 (1), 428-429 (1980).
  50. Cadars, S., et al. The refocused INADEQUATE MAS NMR experiment in multiple spin-systems: interpreting observed correlation peaks and optimising lineshapes. Journal of Magnetic Resonance. 188 (1), 24-34 (2007).
  51. Lesage, A., Bardet, M., Emsley, L. Through-bond carbon− carbon connectivities in disordered solids by NMR. Journal of the American Chemical Society. 121 (47), 10987-10993 (1999).
  52. Bennett, A. E., et al. Homonuclear radio frequency-driven recoupling in rotating solids. The Journal of Chemical Physics. 108 (22), 9463-9479 (1998).
  53. Lu, X., Guo, C., Hou, G., Polenova, T. Combined zero-quantum and spin-diffusion mixing for efficient homonuclear correlation spectroscopy under fast MAS: broadband recoupling and detection of long-range correlations. Journal of Biomolecular NMR. 61 (1), 7-20 (2015).
  54. Wang, T., Zabotina, O., Hong, M. Pectin-cellulose interactions in the Arabidopsis primary cell wall from two-dimensional magic-angle-spinning solid-state nuclear magnetic resonance. Biochemistry. 51 (49), 9846-9856 (2012).
  55. Wang, T., Yang, H., Kubicki, J. D., Hong, M. Cellulose Structural Polymorphism in Plant Primary Cell Walls Investigated by High-Field 2D Solid-State NMR Spectroscopy and Density Functional Theory Calculations. Biomacromolecules. 17 (6), 2210-2222 (2016).
  56. Kirui, A., et al. Atomic Resolution of Cotton Cellulose Structure Enabled by Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR. Cellulose. , In Press (2019).
  57. Wang, T., et al. Sensitivity-enhanced solid-state NMR detection of expansin's target in plant cell walls. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (41), 16444-16449 (2013).
  58. Wang, T., Park, Y. B., Cosgrove, D. J., Hong, M. Cellulose-Pectin Spatial Contacts Are Inherent to Never-Dried Arabidopsis thaliana Primary Cell Walls: Evidence from Solid-State NMR. Plant Physiology. 168 (3), 871-884 (2015).
  59. Liao, S. Y., Lee, M., Wang, T., Sergeyev, I. V., Hong, M. Efficient DNP NMR of membrane proteins: sample preparation protocols, sensitivity, and radical location. Journal of Biomolecular NMR. 64 (3), 223-237 (2016).
  60. Kang, X., et al. Lignin-Polysaccharide Interactions in Plant Secondary Cell Walls Revealed by Solid-State NMR. Nature Communications. 10, 347 (2019).
  61. Takahashi, H., et al. Rapid Natural-Abundance 2D 13C-13C Correlation Spectroscopy Using Dynamic Nuclear Polarization Enhanced Solid-State NMR and Matrix-Free Sample Preparation. Angewandte Chemie International Edition. 51 (47), 11766-11769 (2012).

Tags

ביוכימיה גיליון 144 Solid-state NMR קיטוב גרעיני דינמי (DNP) פחמימות קירות התא biomaterials צמחים פטריות
הכנת פטרייתי, צמח חומרי הבהרה מבניים באמצעות NMR של מצב מוצק קיטוב גרעיני דינמי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kirui, A., Dickwella Widanage, M.… More

Kirui, A., Dickwella Widanage, M. C., Mentink-Vigier, F., Wang, P., Kang, X., Wang, T. Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR. J. Vis. Exp. (144), e59152, doi:10.3791/59152 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter