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Biochemistry

गतिशील परमाणु ध्रुवीकरण ठोस राज्य एनएमआर का उपयोग कर संरचनात्मक Elucidation के लिए कवक और संयंत्र सामग्री की तैयारी

Published: February 12, 2019 doi: 10.3791/59152
Automatic Translation
*1, *1, 2, 3, 1, 1
1Department of Chemistry, Louisiana State University, 2National High Magnetic Field Laboratory, 3Departments of Pediatrics, and Microbiology, Immunology and Parasitology, Louisiana State University Health Sciences Center
* These authors contributed equally

Summary

बहुआयामी ठोस-राज्य एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी और गतिशील परमाणु ध्रुवीकरण (DNP) जांच के लिए 13सी,15एन-लेबल कवक और संयंत्र के नमूनों की तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है ।

Abstract

इस प्रोटोकॉल से पता चलता है कि कैसे समान रूप से 13सी, 15N-लेबल कवक सामग्री का उत्पादन किया जा सकता है और कैसे इन नरम सामग्री ठोस राज्य एनएमआर और संवेदनशीलता-बढ़ाया DNP प्रयोगों के लिए रवाना किया जाना चाहिए । संयंत्र बायोमास के नमूना प्रसंस्करण प्रक्रिया भी विस्तृत है । इस विधि की एक श्रृंखला के माप की अनुमति देता है 1 डी और 2d 13c-13c/15N सहसंबंध्स स्पेक्ट्रा, जो उनके देशी राज्य में जटिल सामग्री के उच्च संकल्प संरचनात्मक elucidation सक्षम बनाता है, न्यूनतम गड़बड़ी के साथ. आइसोटोप-लेबलिंग 1 डी स्पेक्ट्रा में तीव्रता और 2d सहसंबंध स्पेक्ट्रा में ध्रुवीकरण हस्तांतरण दक्षता को बढ़ाता द्वारा जांच की जा सकती है । गतिशील परमाणु ध्रुवीकरण की सफलता (DNP) नमूना तैयारी संवेदनशीलता बढ़ाने के कारक द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है । इसके अलावा polysaccharides और प्रोटीन के संरचनात्मक पहलुओं की जांच प्रयोगों तीन आयामी वास्तुकला का एक मॉडल के लिए नेतृत्व करेंगे । इन पद्धतियों को संशोधित और कार्बोहाइड्रेट युक्त सामग्री की एक विस्तृत श्रृंखला की जांच के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, पौधों की प्राकृतिक कोशिका दीवारें, कवक, शैवाल और बैक्टीरिया, साथ ही साथ संश्लेषित या डिजाइन कार्बोहाइड्रेट पॉलिमर और अन्य के साथ उनके परिसर अणुओं.

Introduction

कार्बोहाइड्रेट ऊर्जा भंडारण, संरचनात्मक निर्माण, और सेलुलर मांयता और आसंजन के रूप में विभिंन जैविक प्रक्रियाओं में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं । वे सेल की दीवार है, जो पौधों, कवक, शैवाल और बैक्टीरिया1,2,3में एक मौलिक घटक है में समृद्ध कर रहे हैं । सेल दीवार जैव ईंधन और सामग्री के उत्पादन के लिए एक केंद्रीय स्रोत के रूप में कार्य करता है, साथ ही रोगाणुरोधी उपचार के लिए एक होनहार लक्ष्य4,5,6,7,8 , 9.

इन जटिल सामग्री की समकालीन समझ काफी है कि चार प्रमुख जैव रासायनिक या आनुवंशिक तरीकों का उपयोग संरचनात्मक लक्षण वर्णन करने के लिए समर्पित किया गया प्रयासों के दशकों से उंनत किया गया है । पहला प्रमुख तरीका है अनुक्रमिक उपचार पर निर्भर करता है कठोर रसायनों या एंजाइमों का उपयोग करने के लिए नीचे अलग भागों, जो में शर्करा की संरचना और लिंकेज विश्लेषण के बाद है में सेल दीवारों को तोड़ने के प्रत्येक10अंश । यह विधि पॉलिमर के डोमेन वितरण पर प्रकाश डालता है, लेकिन व्याख्या जैव अणुओं के रासायनिक और भौतिक गुणों के कारण भ्रामक हो सकता है । उदाहरण के लिए, यह निर्धारित करना मुश्किल है कि क्षार निकालने वाला अंश कम संरचित अणुओं के एक एकल डोमेन से या तुलनात्मक घुलनशीलता के साथ स्थानिक रूप से अलग अणुओं से उत्पन्न होता है या नहीं. दूसरा, निकाले गए भागों या पूरे सेल दीवारों को भी आबंध लिंकेज निर्धारित करने के लिए समाधान एनएमआर का उपयोग कर मापा जा सकता है, भी crosslinking के रूप में उद्धृत, विभिन्न अणुओं के बीच11,12,13, 14,15. इस तरह, आबंध एंकरों की विस्तृत संरचना की जांच की जा सकती है, लेकिन सीमाएं polysaccharides के कम घुलनशीलता के कारण मौजूद हो सकती हैं, crosslinking साइटों की अपेक्षाकृत छोटी संख्या, और गैर-आबंध प्रभावों की अनभिज्ञता जो स्थिर होती है polysaccharide पैकिंग, जिसमें हाइड्रोजन-बॉन्डिंग, वान डेर Waals फोर्स, इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरेक्शन और पॉलिमर उलझाव शामिल हैं । तीसरा, बाध्यकारी समानता अलग polysaccharides16,17,18,19का उपयोग कर इन विट्रो में निर्धारित किया गया है, लेकिन शुद्धि प्रक्रिया काफी बदल सकता है संरचना और इन अणुओं के गुण । इस विधि भी अणुओं के परिष्कृत जमाव और विधानसभा के बाद से दोहराने के लिए विफल रहता है । अंत में, phenotype, सेल आकृति विज्ञान और कुछ कोशिका दीवार घटक के तनु उत्पादन के साथ आनुवंशिक म्यूटेंट के यांत्रिक गुणों polysaccharides के संरचनात्मक कार्यों पर रोशनी शेड, लेकिन अधिक आणविक सबूत के लिए इन पुल की जरूरत है प्रोटीन मशीनरी20के इंजीनियर समारोह के साथ macroscopic टिप्पणियों ।

विकास और बहुआयामी ठोस राज्य एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी के आवेदन में हाल ही में अग्रिम इन संरचनात्मक पहेली को सुलझाने के लिए एक अनूठा अवसर पेश किया है । 2d/ठोस राज्य एनएमआर प्रयोगों देशी राज्य में कार्बोहाइड्रेट युक्त सामग्री की संरचना और वास्तुकला की उच्च संकल्प की जांच को सक्षम प्रमुख गड़बड़ी के बिना । संरचनात्मक अध्ययन सफलतापूर्वक दोनों प्राथमिक और माध्यमिक संयंत्रों के सेल दीवारों पर आयोजित किया गया है, उत्प्रेरक का इलाज बायोमास, बैक्टीरियल फिल्म, कवक में वर्णक भूत और, हाल ही में लेखकों द्वारा, एक रोगजनक कवक में बरकरार सेल दीवारों Aspergillus fumigatus 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31. गतिशील परमाणु ध्रुवीकरण का विकास (DNP)३२,३३,३४,३५,३६,३७,३८ , ३९ , ४० , ४१ , ४२ काफी DNP द्वारा संवेदनशीलता बढ़ाने के रूप में एनएमआर संरचनात्मक elucidation की सुविधा स्पष्ट रूप से इन जटिल सामग्री पर प्रयोगात्मक समय छोटा । प्रोटोकॉल यहां वर्णन किया गया आइसोटोप के लिए प्रक्रियाओं का विवरण-fumigatus और ठोस-राज्य एनएमआर और DNP लक्षण वर्णन के लिए कवक और संयंत्र नमूने तैयार कर रहा है । इसी तरह की लेबलिंग प्रक्रियाओं को बदल माध्यम के साथ अन्य कवक के लिए लागू किया जाना चाहिए, और नमूना तैयारी प्रक्रियाओं आम तौर पर अन्य कार्बोहाइड्रेट युक्त सामग्री के लिए लागू किया जाना चाहिए.

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Protocol

1. 13सी की वृद्धि, 15एन-त्यसपछि Aspergillus fumigatus तरल माध्यम

  1. अनलेबलिंग और 13सी, 15एन-लेबल ग्रोथ मीडियम की तैयारी
    नोट: दोनों खमीर निकालने Peptone डेक्सट्रोज मध्यम (YPD) और सुधार ंयूनतम मध्यम४३ कवक संस्कृति के रखरखाव के लिए इस्तेमाल किया गया । autoclaving के बाद सभी कदम एक लामिना प्रवाह हुड में प्रदर्शन के लिए संदूषण को कम कर रहे हैं ।
    1. अनलेबल्ड लिक्विड मीडियम की तैयारी: आसुत जल की १०० मिलीलीटर में YPD पाउडर का ६.५ ग्राम भंग और फिर १३४ डिग्री सेल्सियस पर 25 मिनट के लिए आटोक्लेव ।
    2. अनलेबल्ड सॉलिड मीडियम की तैयारी
      1. YPD पाउडर के १.५ ग्राम और आसुत जल के १०० मिलीलीटर में ६.५ ग्राम जोड़ें ।
      2. १२१ डिग्री सेल्सियस पर 25 मिनट के लिए मध्यम आटोक्लेव और फिर लगभग ५० डिग्री सेल्सियस के लिए शांत हो जाओ ।
      3. प्रत्येक पूर्व बाँझ प्लास्टिक पेट्री डिश में मध्यम के 13-15 मिलीलीटर स्थानांतरण और तुरंत एक ढक्कन का उपयोग कर पकवान को कवर किया ।
    3. 13सी, 15एन-लेबल तरल माध्यम की तैयारी
      नोट: आइसोटोप लेबलिंग के लिए वृद्धि समाधान तैयार करने के लिए, 13सी ग्लूकोज और 15एन सोडियम नाइट्रेट युक्त एक न्यूनतम मध्यम और एक ट्रेस तत्व समाधान अलग से तैयार कर रहे हैं और फिर उपयोग करने से पहले मिश्रित.
      1. १०० मिलीलीटर के आइसोटोप-युक्त न्यूनतम माध्यम के रूप में तालिका 1में सूचीबद्ध तैयार करें । NaOH (1 मी) या एचसीएल (1m) समाधान का उपयोग कर ६.६ के लिए पीएच समायोजित करें ।
      2. १२१ डिग्री सेल्सियस पर 25 मिनट के लिए ंयूनतम मध्यम आटोक्लेव ।
      3. १०० मिलीलीटर (1, 000x) ट्रेस तत्वों समाधान की तैयारी, आसुत पानी में तालिका 2 में सूचीबद्ध लवण भंग । १३४ डिग्री सेल्सियस पर 25 मिनट के लिए समाधान आटोक्लेव । शांत हो जाओ और कम अवधि के उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान की दुकान । पीएच के बारे में ६.५ होगा और एक पीएच मीटर का उपयोग कर जांच की जा सकती है ।
      4. का उपयोग करने से पहले तालिका 2 में सूचीबद्ध के रूप में ०.१ एमएल ट्रेस तत्वों के समाधान के 13सी, 15N के १०० मिलीलीटर जोड़ने के न्यूनतम माध्यम लेबल ।
  2. कवक सामग्री के विकास
    1. एक लामिना प्रवाह हूड में एक inoculating लूप का उपयोग कर एक YPD प्लेट पर भंडारण से कवक की एक छोटी राशि हस्तांतरण । एक मशीन में 2 दिनों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति रखो ।
    2. एक लामिना प्रवाह हूड में 13सी,15एन-लेबलिंग समाधान के लिए एक सक्रिय बढ़ते कवक बढ़त हस्तांतरण करने के लिए एक inoculating पाश का प्रयोग करें । 3-5 दिन के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति एक मिलाते हुए मशीन में २२० rpm पर रखो ।
    3. 20 मिनट के लिए ४,००० x जी पर केंद्रापसारक supernatant निकालें और गोली इकट्ठा ।
    4. एनएमआर अध्ययन के लिए अच्छी तरह से हाइड्रेटेड गोली (> 50 wt% जलयोजन) के ~ ०.५ जी इकट्ठा करने के लिए एक नोचना का प्रयोग करें । जलयोजन के किसी भी बिंदु पर नुकसान काफी वर्णक्रमीय संकल्प खराब हो जाएगा ।
      नोट: यदि आवश्यक हो, हाइड्रेटेड mycelia के एक छोटे से राशि (०.१ ग्राम) अलग किया जा सकता है और पूरी तरह से एक हुड या एक lyophilizer में N2 गैस प्रवाह के तहत सूख जलयोजन स्तर का अनुमान है और शुष्क जन प्रतिशत की गणना । आमतौर पर, एक गोली युक्त ~ ०.३ g शुष्क द्रव्यमान 3 दिनों के बाद प्राप्त किया जा सकता है । यदि एनएमआर प्रयोग को आयोजित किया जाना लंबे समय (> 7 दिन) और/या यदि कवक की स्थिति तय की जरूरत है, कवक सामग्री गहरा तरल एन2 में आगे प्रसंस्करण से पहले 10-20 मिनट के लिए जम सकता है । यदि प्रयोग कम होगा (3-6 दिन), ठंड को छोड़ दिया जा सकता है ताकि नमूने ताजा रह सकते हैं ।
    5. एक केंद्रापसारक ट्यूब में ग्लिसरॉल के 20% (वी/वी) के साथ अतिरिक्त सामग्री मिश्रण और लंबी अवधि के भंडारण के लिए एक-८० ᵒ सी फ्रीजर में रखना ।

2. ठोस-राज्य एनएमआर और DNP अध्ययन के लिए अ. fumigatus की तैयारी

  1. ठोस-राज्य एनएमआर प्रयोगों के लिए अ. fumigatus की तैयारी
    1. Dialyze 13सी, 15एन-लेबल कवक नमूना (कदम 1.2.4.) के 1 एल के खिलाफ 10 मिमी फॉस्फेट बफर (पीएच ७.०) 4 डिग्री सेल्सियस से कम एक डायलिसिस बैग का उपयोग कर के साथ ३.५ केडीए आणविक भार कटऑफ के लिए विकास माध्यम से छोटे अणुओं को निकाल कर 3 दिन की कुल अवधि के लिए. बफ़र को प्रतिदिन दो बार परिवर्तित करें ।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, नमूने के लिए धोया जा सकता 6-10 बार जल का उपयोग अवशिष्ट छोटे अणुओं को हटाने के लिए ।
    2. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में नमूना हस्तांतरण और 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक (१०,००० x g) एक benchtop केंद्रापसारक का उपयोग कर । supernatant निकालें और शेष कवक सामग्री इकट्ठा ।
    3. पैक 70-80 एक 4 मिमी ZrO2 रोटर या 30-50 मिलीग्राम एनएमआर प्रयोगों के लिए ३.२ mm रोटर में समान रूप से 13सी-लेबल और अच्छी तरह से हाइड्रेटेड नमूना पेस्ट की मिलीग्राम । दोहराया नमूना धीरे निचोड़ एक धातु रॉड का उपयोग कर और अधिक कागज का उपयोग कर पानी को अवशोषित ।
    4. कसकर रोटर टोपी और ठोस राज्य एनएमआर लक्षण वर्णन के लिए स्पेक्ट्रोमीटर में नमूना डालें ।
      नोट: एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर में रोटर क्रैश और नमूना फैल की संभावना को कम करने के लिए ब्रांड नए रोटर सुझाव दिया जाता है । यदि आवश्यक हो, सील शिकंजा के साथ एक डिस्पोजेबल Kel-एफ डालने के रोटर के अंदर एक द्वितीयक कंटेनर के रूप में सेवा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  2. DNP प्रयोगों के लिए ए. fumigatus नमूनों की तैयारी
    1. तैयार १०० µ एल के DNP सॉल्वैंट्स29,४४ (DNP मैट्रिक्स के रूप में भी जाना जाता है) में एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब के लिए 13ग,15N-के लिए फंगल नमूने लेबल । इस DNP मैट्रिक्स d8-ग्लिसरॉल/d2o/एच2ओ (60/30/10 Vol%) का एक मिश्रण होता है ।
      नोट: यदि बिना लेबल वाले नमूनों की जांच की जानी है, तो 13c-समाप्त d8-ग्लिसरॉल (12c3, ९९.९५% का उपयोग करके DNP मैट्रिक्स तैयार करें; डी8, ९८%) और डी2ओ और एच2ओ सॉल्वैंट्स से 13सी संकेत योगदान से बचने के लिए ।
    2. भंग ०.७ AMUPol४५ की मिलीग्राम १०० µ एल में DNP सॉल्वैंट्स के 10 मिमी कट्टरपंथी शेयर समाधान के रूप में । 2-3 मिनट के लिए भंवर सुनिश्चित करने के लिए कि कण पूरी तरह से समाधान में भंग कर रहे हैं ।
    3. सोख 10 dialyzed 13सी के मिलीग्राम, 15एन-पूर्व चरणों में वर्णित के रूप में कवक सामग्री लेबल (५० कदम और 2.1.2) AMUPol समाधान के एल में µ, और हल्के से एक मूसल और एक मोर्टार का उपयोग कर मिश्रण पीसने में कण के प्रवेश सुनिश्चित करने के लिए छिद्रित कोशिका दीवारें ।
      नोट: जलयोजन हानि की दर को कम करने के लिए, पीसने भी एक micropestle का उपयोग कर एक microcentrifuge ट्यूब में जगह ले सकते हैं ।
    4. फफूंद नमूना आगे हाइड्रेट करने के लिए पीस गोली को कट्टरपंथी समाधान के एक और 30 µ एल जोड़ें ।
    5. एक ३.२-mm नीलमणि रोटर में गोली पैक, हल्का निचोड़ और अतिरिक्त DNP विलायक हटा दें । एक ३.२-mm सिलिकॉन प्लग जोड़ें जलयोजन के नुकसान को रोकने के लिए । आमतौर पर, 5-30 मिलीग्राम के नमूने रोटर करने के लिए पैक किया जा सकता है । सटीक राशि एनएमआर प्रयोगों की संवेदनशीलता आवश्यकता द्वारा आयोजित किया जा करने के लिए निर्धारित की जरूरत है ।
    6. डालें और एक DNP स्पेक्ट्रोमीटर में नमूना स्पिन, माइक्रोवेव विकिरण के तहत एक DNP बढ़ाया स्पेक्ट्रम को मापने और माइक्रोवेव बंद स्पेक्ट्रम के साथ तुलना करें । यह एक वृद्धि कारक εपर/बंदहै, जो इन जटिल सामग्री के लिए 20-40 होना चाहिए नेतृत्व करेंगे । कक्ष दीवार संरचना निर्धारित करने के लिए डिज़ाइन किए गए प्रयोगों चलाएँ ।

3. एनएमआर और DNP अध्ययन के लिए संयंत्र बायोमास की तैयारी

  1. ठोस राज्य एनएमआर के लिए पौध सामग्रियों की तैयारी
    1. उत्पादन में समान रूप से 13सी-लेबल संयंत्र घर में 13CO2 आपूर्ति का उपयोग करते हुए एक विकास कक्ष या 13सी-ग्लूकोज माध्यम के रूप में वर्णित पहले४६,४७ या सीधे खरीद से लेबल सामग्री आइसोटोप-लेबलिंग कंपनियों.
      नोट: 13सी-ग्लूकोज केवल प्रकाश संश्लेषण द्वारा 12सी की शुरूआत से बचने के लिए अंधेरे विकास में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    2. एक प्रयोगशाला उस्तरा ब्लेड का उपयोग कर (आमतौर पर आयाम में 1-2 mm) छोटे टुकड़ों में समान रूप से 13सी लेबल संयंत्र सामग्री में कटौती ।
      ध्यान दें: उद्देश्य पर निर्भर करता है, निकाले गए सेल दीवारों कभी संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल कर रहे है और विस्तृत प्रोटोकॉल पिछले अध्ययन में सूचित कर रहे है21,४६।
    3. नमूना पहले सूख गया था, तो 1 दिन के लिए कमरे के तापमान पर एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब, भंवर, equilibrate में संयंत्र सामग्री की 30 मिलीग्राम के लिए पानी की १०० µ एल जोड़ें । 10 मिनट के लिए ४,००० x g पर केंद्रापसारक और एक पिपेट का उपयोग कर अतिरिक्त पानी निकालें ।
    4. नमूना किसी भी बिंदु पर कभी सूख गया था, तो सीधे आगे के इलाज के बिना नमूने का उपयोग करें ।
    5. ठोस राज्य एनएमआर प्रयोगों के लिए ३.२ मिमी या 4 मिमी ZrO2 रोटर में परिणामी संयंत्र सामग्री पैक ।
  2. DNP अध्ययन के लिए पौध सामग्री तैयार करना
    1. 10 मिमी AMUPol कट्टरपंथी की ६० µ एल शेयर समाधान तैयार के रूप में वर्णित कदम 2.2.1 और -8 ।
    2. काटा समान रूप से 13सी लेबल संयंत्र सामग्री छोटे टुकड़ों में अध्ययन किया जा करने के लिए (आयाम में 1-2 mm) एक प्रयोगशाला उस्तरा ब्लेड का उपयोग कर और वजन 20 संयंत्र सामग्री की मिलीग्राम ।
    3. हाथ-छोटे कणों में संयंत्र के टुकड़ों को पीसने (~ आकार में 1-2 मिमी) एक मोर्टार और मूसल का उपयोग कर । अंतिम चूर्ण एक समरूप रूप है ।
    4. DNP शेयर पहले कदम में तैयार समाधान के ४० µ एल जोड़ें (चरण -8) संयंत्र सामग्री के लिए और 5 मिनट के लिए हल्के से पीसने के लिए कट्टरपंथी के साथ सजातीय मिश्रण सुनिश्चित करते हैं ।
    5. शेयर समाधान के एक और 20 µ एल जोड़ें आगे पीसने के बाद संयंत्र सामग्री हाइड्रेट ।
    6. DNP प्रयोगों के लिए एक ३.२ मिमी नीलमणि रोटर में equilibrated संयंत्र नमूना पैक । जलयोजन के नुकसान से बचने के लिए एक सिलिकॉन प्लग डालें ।

4. कार्बोहाइड्रेट युक्त के प्रारंभिक लक्षण के लिए मानक ठोस राज्य एनएमआर प्रयोगों-रिच सामग्री

नोट: इस अनुभाग में एनएमआर प्रयोगों का संक्षिप्त अवलोकन प्रदान किया गया है । हालांकि, संरचनात्मक elucidation आम तौर पर व्यापक विशेषज्ञता की आवश्यकता है । इसलिए, एनएमआर spectroscopists के साथ सहयोगात्मक प्रयासों की सिफारिश की है ।

  1. माप 1 डी 13सी क्रॉस ध्रुवीकरण (सीपी), 13सी प्रत्यक्ष ध्रुवीकरण (डीपी) 2-s और ३५-s रीसायकल देरी के साथ , और एक एच13सी अयोग्य४८,४९ स्पेक्ट्रा गतिशील के एक सामान्य समझ प्राप्त करने के लिए सेल घटकों का वितरण (आंकड़ा 1a) । सेल दीवारों आमतौर पर अपेक्षाकृत कठोर भाग रहे है और प्रदर्शन वाणिज्यिक पत्र स्पेक्ट्रम में प्रमुख संकेतों ।
  2. 13 सी संकेतों की प्रतिध्वनि कार्य के लिए मानक 2d 13सी-13सी सहसंबंध प्रयोगों की एक श्रृंखला को मापने । refocused अपर्याप्त५०के साथ शुरू,५१ कार्बन कनेक्टिविटी प्राप्त करने के लिए, जो के माध्यम से अंतरिक्ष प्रयोगों की एक श्रृंखला की सहायता की जरूरत है जैसे १.५-ms RFDR५२ (आंकड़ा 1b) और ५०-ms गर्भनाल/DARR५३ गडबड आहे.
    नोट: यदि यह ब्याज की है एक विशिष्ट घटक में अमीर एक नमूना मिल, उदाहरण के लिए, प्राथमिक या माध्यमिक सेल दीवारों, तो एक से अधिक क्षेत्रों या एकाधिक संयंत्रों के लिए इष्टतम संरचना के साथ नमूना खोजने के लिए अलग से मापा जा करने की आवश्यकता हो सकती है ।
  3. आचरण 2d 15N-13सी सहसंबंध प्रयोगों जो प्रोटीन और nitrogenated कार्बोहाइड्रेट की प्रतिध्वनि कार्य की सुविधा के लिए मापा जा सकता है ।
    नोट: प्रतिध्वनि असाइनमेंट आम तौर पर समय लेने वाली है । एक विधि वर्तमान में पूर्व अनुभव के बिना उन वैज्ञानिकों के लिए कार्बोहाइड्रेट संकेतों की प्रतिध्वनि काम की सुविधा के लिए विकसित किया जा रहा है ।
  4. स्थानिक proximities निर्धारित करने के लिए और अधिक विशिष्ट प्रयोगों को मापने (चित्रा 1c, डी), जटिल अणुओं के जलयोजन और मोबिल कार्बोहाइड्रेट युक्त सामग्री के रूप में तीन आयामी संरचना का निर्धारण करने के लिए व्यवस्थित पहले22,29वर्णित है ।

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Representative Results

लेबलिंग आइसोटोप काफी एनएमआर संवेदनशीलता को बढ़ाता है और यह 2 डी 13सी की एक श्रृंखला को मापने के लिए संभव बनाता है-13सी और 13सी-15N सहसंबंध स्पेक्ट्रा की संरचना, जलयोजन, गतिशीलता और पैकिंग का विश्लेषण करने के लिए पॉलिमर, जो सेल दीवार वास्तुकला का एक तीन आयामी मॉडल का निर्माण करने के लिए एकीकृत किया जाएगा (चित्रा 1). यदि समान लेबलिंग सफल होता है, तो 1 घंटे के भीतर एक पूर्ण सेट और 15N स्पेक्ट्रा १ एच के अंदर एकत्र किया जा सकता है और प्रत्येक मानक 2d स्पेक्ट्रम माप के 24 एच से अधिक नहीं रखना चाहिए ।

अच्छी तरह से तैयार नमूनों आमतौर पर दोनों उच्च एनएमआर तीव्रता और तेज लाइनों की उंमीद है । या तो पैरामीटर का समझौता संयुक्त राष्ट्र अनुकूलित नमूना तैयारी इंगित करता है । कवक के नमूनों में एक कभी नहीं सूख तरीके से तैयार किया जाना चाहिए, और पैकिंग कदम के दौरान आंशिक निर्जलीकरण linewidth का एक उल्लेखनीय विस्तार करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । प्रायोगिक समय एक पूरी तरह से पैक एनएमआर नमूना के लिए अपेक्षा से अधिक लंबी है, तो लेबलिंग स्तर कम हो सकता है । यदि बंद विकर्ण संकेतों को 2 डी 13सी-13सी सहसंबंध स्पेक्ट्रम में प्राप्त करना मुश्किल है, सांख्यिकीय लेबलिंग हुई है (आंकड़ा 1b) हो सकता है । दो 13सी चोटियों ९६ और ९२ पीपीएम पर हस्ताक्षर कार्बन ग्लूकोज५४के 1 संकेत हैं, इसलिए, मात्रात्मक 13सी प्रत्यक्ष ध्रुवीकरण में उनके मजबूत तीव्रता (डीपी) स्पेक्ट्रा ३५ एस के लंबे समय रीसायकल देरी के साथ मापा आम तौर पर संकेत मिलता है अपूर्ण डायलिसिस या धुलाई (figure 1a) के कारण छोटे अणुओं का प्रभुत्व होता है । अच्छी तरह के नमूने लेबल के साथ, लंबी दूरी के सहसंबंध आगे के लिए (चित्रा 1c) अणुओं के स्थानिक proximities का पता लगाने के मापा जा सकता है और बरकरार सेल दीवारों के संरचनात्मक मॉडल का निर्माण (1 d) ।

रासायनिक नाम रासायनिक सूत्र एकाग्रता (जी एल/
Dipotassium फॉस्फेट K2HPO4 १.०४५ छ
मैग्नीशियम सल्फेट Heptahydrate MgSO4· 7H2हे ०.५२ छ
Monopotassium फॉस्फेट KH2पो4 ०.८१५ छ
15 एन-सोडियम नाइट्रेट 15 नैनो3 ६.० छ
पोटेशियम क्लोराइड KCl ०.५२ छ
यू-13सी-ग्लूकोज 13 C6ज12O6 १०.० छ

तालिका 1. न्यूनतम माध्यम की संरचना ।

रासायनिक नाम रासायनिक सूत्र एकाग्रता (जी एल/
अमोनियम Molybdate टेट्राहाइड्रेट (एनएच4) 6 मो7ा o24· 4H2हे 11 ग्राम
बोरिक एसिड ज3बो3 11 ग्राम
कोबाल्ट क्लोराइड Hexahydrate CoCl2· 6H2हे 16 ग्राम
Cupric सल्फेट Pentahydrate CuSO4· 5H2हे 16 ग्राम
लौह सल्फेट Heptahydrate FeSO4· 7H2हे 5 ग्राम
Manganous क्लोराइड टेट्राहाइड्रेट MnCl2· 4H2हे 5 ग्राम
Tetrasodium Ethylenediaminetetraacetate न4EDTA · 4H2हे ६० छ
जिंक सल्फेट Heptahydrate ZnSO4· 7H2हे 22 ग्राम

तालिका 2. ट्रेस तत्व समाधान (केंद्रित) की संरचना । ध्यान दें कि अनलेबल्ड कवक तैयार करने के लिए, अनलेबल्ड ग्लूकोज और अनलेबल्ड सोडियम नाइट्रेट का इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Figure 1
चित्र 1. ठोस राज्य एनएमआर का उपयोग कर निस्र्पक कवक कोशिका दीवार संरचना के लिए फ़्लोचार्ट । (क) प्रारंभिक नमूना स्क्रीनिंग के लिए 1 डी स्पेक्ट्रा. ऊपर से नीचे करने के लिए अयोग्य हैं, 13सी डीपी के साथ 2-s रीसायकल देरी, 13सी डी पी के साथ ३५-s रीसायकल देरी और 13सी सीपी स्पेक्ट्रा, पता लगाया अणुओं के लिए गतिशीलता को कम करने के साथ. (ख) 2d 13सी-13सी सहसंबंध स्पेक्ट्रम १.५ का उपयोग कर मापा-एमएस RFDR recouplन । (ग) प्रतिनिधि आणविक पार चोटी 15-ms सममूल्य स्पेक्ट्रम का उपयोग कर पता लगाया । (घ) एनएमआर डेटा से प्राप्त संरचनात्मक मॉडल. पैनल ए, सी और डी कांग एट अल से संशोधित किया गया है, Nat. कम्यून .9, २७४७ (२०१८) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

जैव रासायनिक तरीकों के साथ तुलना में, ठोस राज्य एनएमआर एक गैर विनाशकारी और उच्च संकल्प तकनीक के रूप में लाभ है । एनएमआर संरचना विश्लेषण में भी मात्रात्मक है, और सबसे अंय विश्लेषणात्मक तरीकों के विपरीत, एक अनिश्चितताओं के सीमित घुलनशीलता द्वारा शुरू की नहीं है । वर्तमान प्रोटोकॉल की स्थापना कार्बोहाइड्रेट युक्त भौतिक और कार्यात्मक पॉलिमर पर भविष्य के अध्ययनों की सुविधा । हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि प्रतिध्वनि असाइनमेंट और डेटा विश्लेषण समय लेने वाली हो सकता है और आम तौर पर व्यवस्थित प्रशिक्षण की आवश्यकता है । लेखक वर्तमान में उपकरणों और डेटाबेस के विकास के लिए पूर्व अनुभव के बिना वैज्ञानिकों की मदद के लिए इस बाधा को दूर कर रहे हैं ।

13सी के प्राकृतिक आइसोटोप बहुतायत के बाद से केवल १.१% है, एक 13सी-13सी पार unlabel किए गए सामग्री का उपयोग कर पीक देख के लिए संभाव्यता केवल ०.०१२% (१.१% x १.१%) है कि समान रूप से लेबल नमूने का उपयोग कर के । इसलिए, आइसोटोप संवर्धन इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर हासिल की काफी परिमाण के चार आदेश द्वारा एनएमआर संवेदनशीलता को बढ़ाता है और संरचनात्मक संकल्प के लिए 2d सहसंबंध प्रयोगों सक्षम बनाता है ।

अनुकूलित, अच्छी तरह से हाइड्रेटेड नमूनों 2d 13सी-13सी सहसंबंध स्पेक्ट्रा में तेज लाइनों का प्रदर्शन करना चाहिए । मोबाइल घटक, जैसे कि β-glucans में a. fumigatus और पौधों में pectins में एक पूर्ण-चौड़ाई का प्रदर्शन करना चाहिए आधा-अधिकतम (FWHM) linewidth पर 0.3-0.5 पीपीएम की 600-800 मेगाहर्ट्ज एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर29,31। कठोर घटकों के गठन, दोहराव चीनी इकाइयों और तेजी से आणविक गति की कमी की संरचना के विविधता के कारण थोड़ा व्यापक चोटियों है । ठेठ 13सी linewidth पौधों में फाइबर microfibrils के लिए 0.7-1.0 पीपीएम और५५कवक में काइटिन के लिए 0.5-0.7 पीपीएम है । फाइबर और काइटिन के तेज linewidth मुख्य रूप से बहुलक crystallinity की वजह से कर रहे हैं, इस प्रकार आंशिक रूप से निर्जलीकरण और तापमान परिवर्तन के लिए प्रतिरोधी है, उदाहरण के लिए, DNP प्रयोग के क्रायोजेनिक तापमान५६,५७। मैट्रिक्स पॉलिमर के शिखर तेज, तथापि, अत्यधिक नमूना स्थितियों है कि बहुलक गतिशीलता को प्रभावित करने के परिवर्तन के प्रति संवेदनशील हैं, इसलिए, यह नमूना जलयोजन के एक संकेतक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । मैट्रिक्स पॉलिमर की व्यापक लाइनों आम तौर पर नमूने में जलयोजन की कमी है, जो पूरी तरह से या आंशिक रूप से पुनः पानी५८जोड़ने से बरामद किया जा सकता है निर्दिष्ट । आमतौर पर, एक जलयोजन स्तर 50-80 wt% दोनों संयंत्र और कवक के नमूनों में एक अच्छा linewidth प्रदान करने के लिए पर्याप्त है ।

DNP अक्सर इन चुनौतीपूर्ण पूरे सेल सिस्टम की जांच के लिए आवश्यक है । आमतौर पर, संवेदनशीलता के एक 20-40 गुना वृद्धि एक ६०० मेगाहर्ट्ज पर एक अनुकूलित नमूना पर प्राप्त किया जा सकता है/395 ghz DNP स्पेक्ट्रोमीटर और इस मान बढ़ाता है घटते क्षेत्र के साथ, उदाहरण के लिए, लगभग एक ४०० MHz पर दोगुनी/263 ghz DNP26,५९ . वहां कई कारकों है कि DNP क्षमता को प्रभावित कर सकते हैं । सबसे पहले, कणों के सेल दीवारों के छिद्रित नेटवर्क में प्रवेश महत्वपूर्ण है और इस प्रक्रिया को काफी हद तक कट्टरपंथी-युक्त DNP मैट्रिक्स में सामग्री के हल्के पीसने से सुविधा हो सकती है । दूसरा, भौतिक गुण, उदाहरण के लिए कठोरता, नमूने के माइक्रोवेव शक्ति के चुनाव को प्रभावित करता है, DNP मैट्रिक्स "पिघला" के तहत 12 डब्ल्यू विकिरण के रूप में 1एच अनुनादों, जो कड़ा संयंत्र के लिए एक समस्या नहीं थी की पैनापन द्वारा सबूत ६०उपजा है । नतीजतन, 1एच विलायक चोटी के एक अधिक आइसोट्रोपिक पैटर्न, काफी कम कताई sidebands और तनु DNP वृद्धि के साथ मनाया जाता है । इसलिए, कमजोर शक्ति नरम सामग्री के लिए सिफारिश की है । तीसरा, DNP मैट्रिक्स की संरचना अनुकूलित किया जाना चाहिए । यह पता चला है कि d8-ग्लिसरॉल/d2 o/एच2 ओ आम तौर पर नरम सामग्री के लिए सबसे अच्छा सॉल्वैंट्स है जबकि डी2ओ/एच2ओ का एक सरल और सस्ता विकल्प भी कुछ मामलों में प्रभावी हो सकता है क्योंकि सिस्टम में मौजूद शर्करा कुछ हद तक cryoprotectants के रूप में कार्य करता है । इसके विपरीत, d6-DMSO/d2o/एच2ओ समाधान दोनों पौधों और कवक के नमूनों में विफल रहता है, के साथ कम 10 से संवेदनशीलता बढ़ाने के गुना, इस प्रकार यह अनुशंसित नहीं है उपयोग के लिए जब तक विशेष प्रयोजनों के लिए । एक मैट्रिक्स मुक्त प्रोटोकॉल हाल ही में अत्यधिक विलायक कमी है, जो अधिक सामग्री३४,५६,६१को समायोजित करने के लिए अतिरिक्त स्थान बनाता है के कारण प्रभावी होने का प्रदर्शन किया गया है । हालांकि, जलयोजन के नुकसान जैव अणुओं की संरचना के लिए एक प्रमुख गड़बड़ी प्रस्तुत करता है, इस प्रकार इस विधि जैविक प्रणालियों के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है । यदि unlabel्ड सेल दीवारों का अध्ययन किया जा करने के लिए कर रहे हैं, 13सी समाप्त d8-ग्लिसरॉल/डी2ओ/एच2ओ इष्टतम विलायक कि किसी भी प्राकृतिक बहुतायत में योगदान नहीं है 13सी संकेतों और न ही किसी भी संवेदनशीलता बलिदान वृद्धि.

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Disclosures

हमारे पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस कार्य को नेशनल साइंस फाउंडेशन द्वारा NSF OIA-१८३३०४० के माध्यम से समर्थन दिया गया । राष्ट्रीय उच्च चुंबकीय क्षेत्र प्रयोगशाला (NHMFL) DMR के माध्यम से राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित है-११५७४९० और फ्लोरिडा के राज्य । MAS-DNP प्रणाली NHMFL में NIH S10 OD018519 और NSF चे-१२२९१७० द्वारा भाग में वित्त पोषित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium Molybdate Tetrahydrate Acros Organics 12054-85-2
AMUPol Cortecnet C010P002
Analytical weighing balance Ohaus B730439218 Model PA84C
Bioclave 16 L VWR 470230-598
Biosafety Cabinet Labconco corporation 302319100
Boric acid VWR BDH9222 store at 15-30 °C
Cobalt(II) Chloride Hexahydrate Honeywell|Fluka 60820 ≥98 %
Copper(II) Sulfate Pentahydrate BDH BDH9312 ≥98 %
Corning LSE shaking incubator Thermo Fisher Scientific 7202152
D2O Sigma Aldrich 151882 99.9 atom % D
d6-DMSO Sigma Aldrich 151874 99.9 atom % D
d8-glycerol Sigma Aldrich 447498 ≥99 atom % D
Dialysis tubing 3.2 kDa Sigma Aldrich D2272 132724
Dipotassium Phosphate VWR BDH9266 ≥98 %
Glycerol Sigma Aldrich G5516 ≥99.5 %
Heraus Megafuge 16R Centrifuge Thermo Fischer Scientific 750004271 Maximum RCF 25,830 x g
HR-MAS Disposable Insert Kit Bruker B4493 Kel-F
Iron(II) Sulfate Heptahydrate Alfa Aesar 14498 ≥99+ %
Magnesium Sulfate Heptahydrate VWR 10034998 store at 18-26 °C
Manganese(II) Chloride Tetrahydrate Alfa Aesar 11563 ≥99 %
Monopotassium Phosphate VWR 470302-254 ≥99 %
pH Meter Mettler Toledo B706689216
Tetrasodium Ethylenediaminetetraacetate Acros Organics 13235-36-9 ≥99.5 %
Zinc Sulfate Heptahydrate Alfa Aesar 33399 ≥98 %
12C3, d8-glycerol Cambridge Isotope Laboratory CDLM-8660 12C3, 99.95%; D8, 98%
13C6-glucose Sigma Alrdrich 364606 ≥99 % (CP)
15N-sodium nitrate Sigma Aldrich 364606 ≥98 % 15N, ≥99 (cp)
3.2 mm sapphire NMR rotor Cortecnet B6939
3.2 mm Silicone plug Bruker B7089
4 mm MAS Rotor Kit Bruker H14355 Zirconia

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जैव रसायन अंक १४४ ठोस राज्य एनएमआर गतिशील परमाणु ध्रुवीकरण (DNP) कार्बोहाइड्रेट सेल की दीवारों जैव सामग्री संयंत्र कवक
गतिशील परमाणु ध्रुवीकरण ठोस राज्य एनएमआर का उपयोग कर संरचनात्मक Elucidation के लिए कवक और संयंत्र सामग्री की तैयारी
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Kirui, A., Dickwella Widanage, M.… More

Kirui, A., Dickwella Widanage, M. C., Mentink-Vigier, F., Wang, P., Kang, X., Wang, T. Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR. J. Vis. Exp. (144), e59152, doi:10.3791/59152 (2019).

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