Summary
多次元固体 NMR 分光法と動的核スピン偏極 (DNP) 調査の13C、15N 分類された真菌、植物サンプルを準備するためのプロトコルが表示されます。
Abstract
このプロトコルはどれだけ均一に13C, 15N 標識真菌材料はすることができますを示しています生産し、実験固体 NMR と DNP の高感度化のためこれらのソフトマテリアルを進んだ必要がありますどのように。植物バイオマスのサンプル処理手順も詳細に示します。このメソッドにより、1 D および 2 D の13c-13C の一連の測定/15N 相関スペクトル、最小限の摂動による、天然状態の複雑な生体材料の高分解能構造解明を可能にします。同位体ラベリングは、1 D スペクトルの強度と 2次元相関スペクトルの偏光転送効率を定量化することで調べることができます。感度増大係数による動的核スピン偏極 (DNP) サンプル準備の成功を評価できます。さらに実験とタンパク質・多糖類の構造的側面を調べることは、三次元のアーキテクチャのモデルに します。これらのメソッドを変更および炭水化物の豊富な材料、植物、菌類、藻類、細菌の自然な細胞壁を含む合成、または炭水化物ポリマーと他の複雑な設計の広い範囲を調査に適応できます。分子。
Introduction
炭水化物は、エネルギー貯蔵、構造の建物と細胞認識、接着など様々 な生物学的プロセスの中心的な役割を再生します。彼らは、植物、菌類、藻類、細菌1,2,3の基本的な部品である細胞壁で濃縮されています。細胞壁は抗菌療法4,5,6,7,8のための有望なターゲットと同様、バイオマテリアル、バイオ燃料の生産のための中央のソースとして提供しています,9。
これらの複合材料の現代理解は、4 つの主要な生化学的または遺伝学的方法を用いた構造解析に専念した努力の十年によって大幅に進められています。最初の主要な方法に依存している異なる部分に細胞壁を打破する過酷な化学物質や酵素を使用してシーケンシャル トリートメント組成が続いていると10の各分画中の糖の連鎖分析。このメソッドは、ポリマーのドメイン分布のライトを取除くが、解釈は、生体分子の化学的および物理的特性のため誤解を招く可能性があります。たとえば、アルカリ溶出画分匹敵する容解性の空間的分離分子から発生以下の構造分子の単一ドメインから元かどうかを判断することは困難です。第二に、抽出部分または全体の細胞壁も測定できます溶液 NMR を使用して共有結合連携、異なった分子11,12,13,間の架橋としてとも呼ばれますを決定する14,15。この方法で共有結合アンカーの詳細な構造を検出可能性があります。、しかし低溶解性多糖類、架橋サイトの比較的小さい数と安定非共有結合効果の無知により制限があります。水素結合、van der Waals 力、静電相互作用と高分子の絡み合いなどを含む多糖類のパッキング。第三に、結合親和性されている決定の in vitroプロシージャを変更可能性があります大幅に精製分離多糖類16,17,18,19, を使用して構造およびこれらの biomolecules のプロパティ。このメソッドは、高度な成膜および高分子の合成後にアセンブリをレプリケートするも失敗します。最後に、表現型、細胞の形態や特定の細胞壁成分の減衰の生産と遺伝的変異体の機械的特性、多糖類の構造機能上のライトを流したより分子証拠がこれらをブリッジに必要なタンパク質機械20のエンジニア リング関数と巨視的観察。
開発と多次元固体 NMR 分光法の応用における最近の進歩は、これらの構造のパズルを解くためのユニークな機会を導入しています。2 D ・ 3 D 固体 NMR 実験では、組成物の高解像度の調査および主要な摂動なしネイティブ状態での炭水化物の豊富な材料のアーキテクチャを有効にします。構造研究は、プライマリおよび二次細胞壁植物、触媒処理バイオマスで正常に行われている細菌のバイオ フィルム色素幽霊菌類で、最近筆者らは、病原性の真菌でそのまま細胞壁によってアスペルギルス21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31. 動的核スピン偏極 (DNP)32,33,34,35,36,37,38の開発,39,40,41,42 DNP による感度向上は著しくこれらの複雑な生体材料の実験時間を短縮、大幅に NMR 構造解析が容易になります。ここで説明したプロトコルの詳細同位体標識A. fumigatus真菌と真菌を準備するための手順と固体 NMR と DNP の特性評価のための植物のサンプル。同じような変更された媒体、その他の菌類を適用する必要があります手順ラベリング、試料調製方法は他の炭水化物の豊富な生体材料に一般的に適用する必要があります。
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Protocol
1. 13C、 15N 標識コウジカビの fumigatusの成長液体培地
- ラベルの準備と13C、 15N 標識培
注: 両方酵母エキス ペプトン デキスト ロース中小企業 (YPD) 改良された最小限の中43真菌の培養の維持のため使用されました。オートクレーブ後のすべてのステップは、汚染を最小限に抑えるための層流フードで実行されます。- ラベルの液体媒体の準備: 100 mL の蒸留水と、134 ° C で 25 分間オートクレーブに YPD パウダー 6.5 g を溶かす
- ラベルのない固体媒体の作製
- 100 mL の蒸留水に寒天と YPD パウダー 6.5 g 1.5 g を追加します。
- オートクレーブで 121 ° C、約 50 ° C に冷却し 25 分のための媒体
- 各滅菌済みプラスチック シャーレに 13-15 mL の培地を転送し、すぐに蓋を使用して料理をカバーします。
- 13C、 15N 標識液体培地の調製
注: 同位体標識、 13を含む最小培地の成長ソリューションを準備するには、C グルコースと15N ナトリウム硝酸塩および微量元素ソリューションは別途用意、使用する前に混合し。- 表 1に示すように同位体を含む最小培地 100 mL を準備します。水酸化ナトリウム (1 M) または塩酸 (1 M) を使用して 6.6 pH を調整します。
- オートクレーブ 121 ° C で 25 分最小媒体
- 100 ml (1、000 x) 微量元素溶液、蒸留水で表 2に記載されている塩を溶解します。オートクレーブ 134 ° C で 25 分のためのソリューションクールダウンし、短期的な使用のための 4 ° C でソリューションを保存します。PH 約 6.5、pH メーターを使用してチェックすることができます。
- 使用する前に、表 2に記載されている、 13C、 15N 標識最小媒体の 100 mL に微量元素溶液 0.1 mL を追加します。
- 真菌の材料の成長
- 接種したループを使用して層流フードの YPD プレート上にストレージから少量の菌を転送します。30 ° C でインキュベーターで 2 日間の文化を維持します。
- 接種したループを使用すると、 13C のアクティブ成長真菌エッジ、層流フードの15N 標識ソリューションを転送します。30 ° C で文化を保つため、揺れのインキュベーターで 220 rpm で 3-5 日。
- 4,000 x gで 20 分間削除上澄みで遠心し、ペレットを収集します。
- ピンセットを使用して、よく水和物ペレットの ~0.5 g を収集 (> 50 wt % 水和) NMR 研究。任意の時点で水分の損失は実質的にスペクトル分解能を悪化させるでしょう。
注: 必要な場合、水和の菌糸の少量 (0.1 g) 分離できフードまたは水和のレベルを推定し、乾燥質量割合を計算するエアカーテンで N2ガスの流れの下で完全に乾燥します。通常、ペレットの ~0.3 g を含む 3 日後の乾燥質量を得ることができます。実施する NMR 実験が長い場合 (> 7 日) 処理前に菌類の状態で固定する場合、真菌の材料が液体 N2 10 ~ 20 分で深く凍結されておよび/または。実験が短い場合 (3-6 日)、サンプルすることができます新鮮なままに凍結がスキップできます。 - 余分な材料を混ぜて遠心管中のグリセロールの 20% (v/v) 長期保存用-80 ᵒC 冷凍庫で保管してください。
2. A. fumigatusの固体 NMR と DNP の研究のための準備
- A. fumigatusのソリッドステート NMR 実験のための準備
- 13C、 15N 標識真菌サンプル (ステップ 1.2.4。) 10 mM リン酸緩衝 (pH 7.0) カットオフ 3.5 kDa の分子の重量と透析バッグを使用して 3 日間の合計期間成長媒体から小分子を削除する 4 ° C で 1 リットルに対してを dialyze します。1 日 2 回バッファーを変更します。
注: また、サンプルの洗浄することができる 6-10 回脱イオン水を使用して残留小さな分子を削除します。 - 15 mL チューブとベンチトップ遠心分離機を使用して 5 分 (10,000 x g) 遠心分離機にサンプルを転送します。上澄みを除去し、残りの真菌の材料を収集します。
- パックの 70-80 mg、4 mm ZrO2ローターや NMR 実験用 3.2 mm ローターに 30-50 mg に均一に13C 標識とよく水和サンプル貼り付け。繰り返し優しく金属の棒を使用してサンプルを絞るし、紙を使用して余分な水分を吸収します。
- しっかりとキャップ、ローター、サンプルを固体 NMR の特性のための分光器に挿入します。
注: 新品ローターはローター クラッシュの可能性を最小限に抑え、NMR 分光計の流出をサンプルに示唆されました。必要な場合は、回転翼の内部のセカンダリ コンテナーとして機能する封印ビスと使い捨てケル F 挿入を使用できます。
- 13C、 15N 標識真菌サンプル (ステップ 1.2.4。) 10 mM リン酸緩衝 (pH 7.0) カットオフ 3.5 kDa の分子の重量と透析バッグを使用して 3 日間の合計期間成長媒体から小分子を削除する 4 ° C で 1 リットルに対してを dialyze します。1 日 2 回バッファーを変更します。
- 大日本印刷実験のためA. fumigatus試料の調製
- 13C、15N 標識真菌サンプルの 1.5 mL 遠心チューブに DNP 溶剤29,44 (DNP 行列とも呼ばれます) の 100 μ L を準備します。この DNP 行列には d8の混合物が含まれています-グリセロール/D2O/H2O (60/30/10 Vol %)。
注: ラベルのサンプルを調査する場合は、その後、準備13C 枯渇 d8を使用して DNP マトリックス-グリセロール (12C399.95%;D898%) と D2O と H2O 13C を避けるために信号、溶剤からの貢献。 - AMUPol45大日本印刷フォーム 10 mM 過激な原液に溶剤の 100 μ L の 0.7 mg を溶解します。ラジカルがソリューション内に完全に溶解するように 2 〜 3 分の渦。
- AMUPol 溶液 50 μ L に前の手順 (手順 2.1.1 と 2.1.2) で説明されているように透析13C、 15N 標識真菌材料の 10 mg を浸漬し、穏やかにラジカルの溶込みを確保するため、乳棒と乳鉢を使用して混合物を挽く多孔性の細胞壁。
注: 水分の損失率を減らすためには、研削起こることができるまた、micropestle を使用して微量遠心チューブに。 - 根本的な解決のもう一つの 30 μ L さらに水和物を粉砕ペレット真菌のサンプルに追加します。
- 3.2 mm サファイア ローターにペレットをパック、軽度圧迫し、過剰な DNP 溶媒を除去します。水分の損失を防ぐために 3.2 mm のシリコン製プラグを追加します。通常、5-30 mg のサンプルは、ローターにパックできます。正確な金額は、実施する NMR 実験の感度の要件によって決定する必要があります。
- 挿入し、DNP 分析計のサンプルをスピン、マイクロ波照射下における DNP が強化されたスペクトルを測定、マイクロ波スペクトルと比較します。これはこれらの複合材料の 20-40 をすべきで、補正係数 εオン/オフに します。細胞壁の構造を決定するために設計された実験を実行します。
- 13C、15N 標識真菌サンプルの 1.5 mL 遠心チューブに DNP 溶剤29,44 (DNP 行列とも呼ばれます) の 100 μ L を準備します。この DNP 行列には d8の混合物が含まれています-グリセロール/D2O/H2O (60/30/10 Vol %)。
3. 植物バイオマスの NMR と DNP の研究のための準備
- 固体 NMR の植物材料の準備
- 13C 標識植物成長室や13C グルコース培地46,47を前述のように13CO2供給を使用して社内を均一に生成または直接からラベルの付いた材料を購入同位体標識会社。
注: 13C グルコースのみ使用できます暗い成長の12C の導入を避けるために光合成によって。 - カット、均一に13C 標識は、小さな断片 (通常はディメンションの 1-2 mm) に植物物質研究所のかみそりの刃を使用します。
注: 目的に応じて抽出した細胞壁にときどき使用される構造評価と詳細なプロトコルが以前研究21,46で報告されています。 - サンプルは、乾燥させた以前 1.5 mL 遠心チューブに植物材料の 30 mg に水の 100 μ L を追加渦、1 日室温で平衡します。4,000 x gで 10 分間遠心し、ピペットを使用して余分な水を取除きます。
- サンプルは、任意の時点で決して乾燥された場合直接さらに治療しなくてもサンプルを使用します。
- 結果として得られる植物材料をソリッドステート NMR 実験の 3.2 mm または 4 mm の ZrO2ローターにパックします。
- 13C 標識植物成長室や13C グルコース培地46,47を前述のように13CO2供給を使用して社内を均一に生成または直接からラベルの付いた材料を購入同位体標識会社。
- DNP 研究用植物材料の準備
- 10 mm AMUPol 2.2.1 と 2.2.2 説明されている手順に急進的 60 μ L 原液を準備します。
- カット、均一に13C ラベル小さな断片 (1-2 mm 寸法) に調査される植物材料研究室かみそりの刃を使用し、20 mg の植物材料の重量を量る。
- 手研磨工場部分を小さな粒子 (〜 1-2 mm) に乳鉢と乳棒を使用しています。最終的な粉末は、均質な外観を持っています。
- DNP 原液 40 μ 植物材料に前のステップ (ステップ 2.2.2) の準備を追加し、ラジカル混合均一ように 5 分間軽度挽きます。
- さらに植物材料を水和物研削後に原液の 20 μ L 別を追加します。
- DNP 実験用 3.2 mm サファイア ローターに平衡植物サンプルをパックします。水分の損失を防ぐためにシリコン製のプラグを挿入します。
4. 標準的な固体 NMR 実験炭水化物豊富な生体材料の初期特性
注: このセクションに NMR 実験の概要があります。ただし、構造は通常、広範な専門知識を必要です。そのため、NMR spectroscopists との共同の努力をお勧めします。
- メジャー 1 D 13C 交差偏波 (CP)、 13C 直接偏波 (DP) 2 s, 35 s とごみ遅延、および1h-13C 無能48,49スペクトル、力学の一般的な理解を得ること細胞成分 (図 1 a) の分布。細胞壁は通常比較的硬質で、CP スペクトルにおける支配的な信号を展示します。
- 一連の標準的な 2 D 13c-13C 相関実験共鳴割り当てに13C 信号を測定します。1.5 ms RFDR52 (図 1 b) と 50 ms コードなどを通じて宇宙実験のシリーズによって支援する必要があるリフォーカスシ不十分な50,51炭素接続を取得する開始/ダー53実験。
注: プライマリまたは二次細胞壁が豊富で特定のコンポーネント、たとえば、サンプルを見つけることに興味の場合、複数のセグメントや複数の植物必要があります最適な組成を持つサンプルを見つけるの個別に計測します。 - タンパク質の窒素炭水化物共鳴割り当てを容易にする測定することができます 2 D 15N-13C 相関実験を行います。
注: 共鳴割り当ては通常時間がかかるです。メソッドは、炭水化物信号経験することがなくそれらの科学者のための共鳴割り当てを容易にするために現在開発されています。 - 専門的な実験空間的近接電波 (図 1 cd)、水分補給として炭水化物の豊富な材料の三次元構造を決定する複雑な生体分子の移動度を測定します。前22,29に体系的に説明しました。
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Representative Results
実質的に NMR に対する感受性を高めるし、不可能な 2D 13c-13C と13C ・15N 相関スペクトル組成、水分補給、移動を分析するための一連の測定とのパッキングの同位体標識ポリマー、細胞壁アーキテクチャ (図 1) の三次元モデルを構築する統合されます。制服のラベリングが成功した場合 1 時間以内 1 D 13C、 15N スペクトルの完全なセットを収集できます、各標準的な 2次元スペクトルは測定の 24 時間よりも長くする必要があります。
よく準備されたサンプルは通常両方 NMR の強度を期待し、ラインをシャープします。最適化された試料を示しますいずれかのパラメーターの妥協します。真菌のサンプルは、決して乾燥の方法で準備されるべきし、梱包手順中に部分的な脱水は線幅の顕著な拡大に 。実験時間は完全にパックされた NMR サンプルは予想より大幅に長く、ラベリングのレベルが低い可能性があります。非対角信号 2 D 13c-13C スペクトル相関の入手が困難な場合は、統計分類発生した (図 1 b)。96 92 ppm で 2 つの13C のピークはグルコース54の署名炭素 1 信号、したがって、定量的13C で、強い強度が 35 の長いリサイクル遅延スペクトル偏光 (DP) を直接 s を通常示す不完全な透析または (図 1 a) を洗濯による小分子の優位性。よくラベルのサンプル (図 1 c) 生体分子の空間的近接を検出し、そのまま細胞壁 (図 1 d) の構造モデルを構築する長距離相関をさらに測定できます。
| 化学名 | 化学式 | 濃度 (g/L) |
| リン酸水素二カリウム | K2HPO4 | 1.045 g |
| 硫酸マグネシウム七水和物 | MgSO4·7H2O | 0.52 g |
| リン酸二水素カリウム | KH2PO4 | 0.815 g |
| 15N-硝酸ナトリウム | 15ナノ3 | 6.0 g |
| 塩化カリウム | KCl | 0.52 g |
| U-13C-グルコース | 13C6H12O6 | 10.0 g |
表 1。最小培地の組成物。
| 化学名 | 化学式 | 濃度 (g/L) |
| アンモニウム モリブデン酸四水和物 | (NH4)6Mo7O24·4H2O | 11 g |
| ホウ酸 | H3ボー3 | 11 g |
| 塩化コバルト六水和物 | CoCl2·6H2O | 16 g |
| 硫酸銅五水和物 | CuSO4·5H2O | 16 g |
| 硫酸第一鉄七水和物 | FeSO4·7H2O | 5 g |
| 塩化マンガン四水和物 | MnCl2·4H2O | 5 g |
| エチレンジアミン四酢酸ナトリウム | ナ4EDTA·4H2O | 60 g |
| 硫酸亜鉛七水和物 | ZnSO4·7H2O | 22 g |
表 2。(集中) 微量元素溶液組成します。ラベルのない菌を準備するため注意してください、ラベルのないブドウ糖とラベルのない硝酸ナトリウムを使用ことができます。
図 1。固体 NMR を用いた菌体細胞壁構造を特徴づけるためのフローチャート。初期サンプル検診 (、) 1 D スペクトル。上、下からから、INEPT、 13C DP 2 s リサイクル13C DP 35 のリサイクル遅延と13C CP スペクトル、分子の検出された移動性の減少を遅らせます。(b) 2 D 13c-13C スペクトル相関測定 1.5 ms RFDR シフトリします。(c) 代表的な分子間相互のピークが 15 ms パー スペクトルを使用して検出されました。(d) 構造モデルの NMR データから得られます。パネルは、 cとdから変更されているカンet al., 国立通。 9、2747 (2018 年)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
固体 NMR 生化学的方法と比較して、非破壊で高解像度技術として利点があります。NMR は定量的組成分析にも、他のほとんどの分析手法とは異なりはない不確実性導入して生体高分子の限られた溶解度によって。現在のプロトコルの確立は、炭水化物の豊富な生体材料、機能性高分子に関する今後の研究を促進します。しかし、共鳴割り当てとデータ分析が時間がかかりでき、通常、体系的なトレーニングを必要とする注意する必要があります。著者は、ツールと経験することがなくこの障壁を克服するために科学者を支援するデータベース開発中です。
13C の天然同位体豊富はわずか 1.1% なので13c-13C ピーク使用ラベル素材クロスを観察のための確率はわずか 0.012% (x 1.1% 1.1%) を標識試料を一様に使用するのです。したがって、実質的にこのプロトコルを使用して達成同位体濃縮 4 つの一桁によって NMR に対する感受性を高める、構造決定のための 2次元相関実験を有効に。
最適化された、よく水のサンプルは、2 D 13c-13C 相関スペクトルのシャープなラインを表わすべきであります。A. fumigatusの β-グルカンや植物ペクチンなど、モバイル コンポーネントは 0.3 0.5 (半値幅) 線を幅半分最大で全角を表わすべきである 600 800 MHz NMR 分光計29,31ppm。剛体のコンポーネントは、構成する、反復的な砂糖の単位の構造の不均一性と迅速な分子運動の不足のため少し広いピークを持っています。典型的な13C 幅は 0.7 〜 1.0 セルロースミクロフィブリル植物と 0.5 〜 0.7 ppm 菌55キチン ppm。セルロース、キチンのシャープな線幅ポリマー結晶化度によって主に引き起こされる、従って部分的に脱水し、DNP 実験56,57の低温などの温度変化に耐性があります。マトリックス高分子のピークの鋭さが、高分子の流動性に影響を与える試料条件の変更に非常に敏感、したがって、それはサンプルの水和反応の指標として使用できます。マトリックス高分子の太い線は通常水58を再追加することによって完全にまたは部分的に回復したサンプルで水和反応の欠如を指定します。通常、50-80 wt % の水分レベルは、植物と真菌のサンプルで良い幅を提供するために十分です。
DNP は、これらの挑戦的な細胞のシステムを調査するため必要があります。通常、600 MHz/395 GHz DNP 分光器の最適化されたサンプルの感度の 20-40 倍向上を達成できるし、この値は減少傾向のフィールド、たとえば、400 MHz/263 GHz DNP26,59 2 倍増加.DNP の効率に影響を与える可能性がありますいくつかの要因があります。まず、細胞壁の多孔質ネットワークへのラジカルの浸透が重要です、このプロセスは、DNP のラジカルを含む行列のバイオマテリアルのマイルドな研削によって大幅に促進されることができます。第二に、物理的性質、剛性などのサンプルの選択に影響するマイクロ波電力の DNP 行列「溶かし」下 12 W 照射硬め工場ための問題ではなかった1H 共鳴のシャープによって証明されるよう60を生じています。1H 溶媒ピークのより等方性パターンが観測される結果としてと大幅に低回転側波帯、弱毒 DNP 強化。したがって、な柔らかい材料より弱い力の使用をお勧めします。第三に、DNP マトリックスの組成を最適化する必要があります。それが判明その d8-グリセロール/D2O/H2O は一般的に軟質材料に最高の溶剤 D2O/H2O の単純で安価な選択肢も効果が期待できるいくつかのケースでシステムに存在する糖ためある程度凍結保護剤として機能します。対照的に、d6-10 倍未満と DMSO/D2O/H2O ソリューションは失敗植物と真菌のサンプルで高感度化の従ってそれがいらなければ用特別な目的のため。無料のマトリックスのプロトコルは最近より多く材料34,56,61を対応するために追加の領域を作成する溶媒の枯渇により高い有効性が実証されています。しかし、水和の損失は生体分子の構造に大きな摂動を提示、したがってこのメソッドが生物学的システムに適したできない場合があります。ラベルのない細胞壁が、 13C 枯渇 d8を検討するかどうか-グリセロール/D2O/H2O は、自然豊かな13C 信号を寄与しないも、感度を犠牲に最適な溶剤強化。
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Disclosures
何を開示する必要があります。
Acknowledgments
この作品は、NSF イア 1833040 を通じて全米科学財団によって支えられました。国立高磁場研究所 (NHMFL) は、DMR 1157490 とフロリダ州の国立科学財団によってサポートされます。NHMFL でマス DNP システムは NIH S10 OD018519 と NSF チェ 1229170 によって一部で賄われて。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Molybdate Tetrahydrate | Acros Organics | 12054-85-2 | |
| AMUPol | Cortecnet | C010P002 | |
| Analytical weighing balance | Ohaus | B730439218 | Model PA84C |
| Bioclave 16 L | VWR | 470230-598 | |
| Biosafety Cabinet | Labconco corporation | 302319100 | |
| Boric acid | VWR | BDH9222 | store at 15-30 °C |
| Cobalt(II) Chloride Hexahydrate | Honeywell|Fluka | 60820 | ≥98 % |
| Copper(II) Sulfate Pentahydrate | BDH | BDH9312 | ≥98 % |
| Corning LSE shaking incubator | Thermo Fisher Scientific | 7202152 | |
| D2O | Sigma Aldrich | 151882 | 99.9 atom % D |
| d6-DMSO | Sigma Aldrich | 151874 | 99.9 atom % D |
| d8-glycerol | Sigma Aldrich | 447498 | ≥99 atom % D |
| Dialysis tubing 3.2 kDa | Sigma Aldrich | D2272 | 132724 |
| Dipotassium Phosphate | VWR | BDH9266 | ≥98 % |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | ≥99.5 % |
| Heraus Megafuge 16R Centrifuge | Thermo Fischer Scientific | 750004271 | Maximum RCF 25,830 x g |
| HR-MAS Disposable Insert Kit | Bruker | B4493 | Kel-F |
| Iron(II) Sulfate Heptahydrate | Alfa Aesar | 14498 | ≥99+ % |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | VWR | 10034998 | store at 18-26 °C |
| Manganese(II) Chloride Tetrahydrate | Alfa Aesar | 11563 | ≥99 % |
| Monopotassium Phosphate | VWR | 470302-254 | ≥99 % |
| pH Meter | Mettler Toledo | B706689216 | |
| Tetrasodium Ethylenediaminetetraacetate | Acros Organics | 13235-36-9 | ≥99.5 % |
| Zinc Sulfate Heptahydrate | Alfa Aesar | 33399 | ≥98 % |
| 12C3, d8-glycerol | Cambridge Isotope Laboratory | CDLM-8660 | 12C3, 99.95%; D8, 98% |
| 13C6-glucose | Sigma Alrdrich | 364606 | ≥99 % (CP) |
| 15N-sodium nitrate | Sigma Aldrich | 364606 | ≥98 % 15N, ≥99 (cp) |
| 3.2 mm sapphire NMR rotor | Cortecnet | B6939 | |
| 3.2 mm Silicone plug | Bruker | B7089 | |
| 4 mm MAS Rotor Kit | Bruker | H14355 | Zirconia |
References
- Murrey, H. E., Hsieh-Wilson, L. C. The chemical neurobiology of carbohydrates. Chemical Reviews. 108 (5), 1708-1731 (2008).
- Latge, J. P. The cell wall: a carbohydrate armour for the fungal cell. Molecular Microbiology. 66 (2), 279-290 (2007).
- Cosgrove, D. J. Growth of the plant cell wall. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 850-861 (2005).
- Furtado, A., et al. Modifying plants for biofuel and biomaterial production. Plant Biotechnology Journal. 12 (9), 1246-1258 (2014).
- Loqué, D., Scheller, H. V., Pauly, M. Engineering of plant cell walls for enhanced biofuel production. Current Opinion in Plant Biology. 25, 151-161 (2015).
- Latge, J. P. Aspergillus fumigatus and aspergillosis. Clinical Microbiology Reviews. 12 (2), 310-350 (1999).
- Ragauskas, A. J., et al. The path forward for biofuels and biomaterials. Science. 311 (5760), 484-489 (2006).
- Service, R. F. Cellulosic ethanol - Biofuel researchers prepare to reap a new harvest. Science. 315 (5818), 1488-1491 (2007).
- Somerville, C., Youngs, H., Taylor, C., Davis, S. C., Long, S. P. Feedstocks for Lignocellulosic Biofuels. Science. 329 (5993), 790-792 (2010).
- Schiavone, M., et al. A combined chemical and enzymatic method to determine quantitatively the polysaccharide components in the cell wall of yeasts. FEMS Yeast Research. 14 (6), 933-947 (2014).
- Cheng, K., Sorek, H., Zimmermann, H., Wemmer, D. E., Pauly, M. Solution-State 2D NMR Spectroscopy of Plant Cell Walls Enabled by a Dimethylsulfoxide-d(6)/1-Ethyl-3-methylimidazolium Acetate Solvent. Analytical Chemistry. 85 (6), 3213-3221 (2013).
- Mansfield, S. D., Kim, H., Lu, F. C., Ralph, J. Whole plant cell wall characterization using solution-state 2D NMR. Nature Protocols. 7 (9), 1579-1589 (2012).
- Tan, L., et al. An Arabidopsis Cell Wall Proteoglycan Consists of Pectin and Arabinoxylan Covalently Linked to an Arabinogalactan Protein. Plant Cell. 25 (1), 270-287 (2013).
- Kollar, R., Petrakova, E., Ashwell, G., Robbins, P. W., Cabib, E. Architecture of the Yeast-Cell Wall - the Linkage between Chitin and Beta(1-3)-Glucan. Journal of Biological Chemistry. 270 (3), 1170-1178 (1995).
- Kollar, R., et al. Architecture of the yeast cell wall - beta(1->6)-glucan interconnects mannoprotein, beta(1-3)-glucan, and chitin. Journal of Biological Chemistry. 272 (28), 17762-17775 (1997).
- Mccann, M. C., et al. Old and new ways to probe plant cell wall architecture. Canadian Journal of Botany. 73, S103-S113 (1995).
- Whitney, S. E. C., Brigham, J. E., Darke, A. H., Reid, J. S. G., Gidley, M. J. In-Vitro Assembly of Cellulose/Xyloglucan Networks - Ultrastructural and Molecular Aspects. The Plant Journal. 8 (4), 491-504 (1995).
- Zykwinska, A. W., Ralet, M. C. J., Garnier, C. D., Thibault, J. F. J. Evidence for in vitro binding of pectin side chains to cellulose. Plant Physiology. 139 (1), 397-407 (2005).
- Kiemle, S. N., et al. Role of (1,3)(1,4)-beta-Glucan in Cell Walls: Interaction with Cellulose. Biomacromolecules. 15 (5), 1727-1736 (2014).
- Pogorelko, G., Lionetti, V., Bellincampi, D., Zabotina, O. Cell wall integrity: targeted post-synthetic modifications to reveal its role in plant growth and defense against pathogens. Plant Signaling & Behavior. 8 (9), e25435 (2013).
- Wang, T., Park, Y. B., Cosgrove, D. J., Hong, M. Cellulose-Pectin Spatial Contacts Are Inherent to Never-Dried Arabidopsis thaliana Primary Cell Walls: Evidence from Solid-State NMR. Plant Physiology. 168 (3), 871-884 (2015).
- Wang, T., Salazar, A., Zabotina, O. A., Hong, M. Structure and dynamics of Brachypodium primary cell wall polysaccharides from two-dimensional 13C solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biochemistry. 53 (17), 2840-2854 (2014).
- Grantham, N. J., et al. An even pattern of xylan substitution is critical for interaction with cellulose in plant cell walls. Nature Plants. 3 (11), 859-865 (2017).
- Simmons, T. J., et al. Folding of xylan onto cellulose fibrils in plant cell walls revealed by solid-state NMR. Nature Communications. 7, 13902 (2016).
- Komatsu, T., Kikuchi, J. Selective Signal Detection in Solid-State NMR Using Rotor-Synchronized Dipolar Dephasing for the Analysis of Hemicellulose in Lignocellulosic Biomass. The Journal of Physical Chemistry Letters. 4 (14), 2279-2283 (2013).
- Perras, F. A., et al. Atomic-Level Structure Characterization of Biomass Pre- and Post-Lignin Treatment by Dynamic Nuclear Polarization-Enhanced Solid-State NMR. The Journal of Physical Chemistry A. 121 (3), 623-630 (2017).
- Chatterjee, S., Prados-Rosales, R., Itin, B., Casadevall, A., Stark, R. E. Solid-state NMR Reveals the Carbon-based Molecular Architecture of Cryptococcus neoformans Fungal Eumelanins in the Cell Wall. Journal of Biological Chemistry. 290 (22), 13779-13790 (2015).
- Zhong, J., Frases, S., Wang, H., Casadevall, A., Stark, R. E. Following fungal melanin biosynthesis with solid-state NMR: biopolymer molecular structures and possible connections to cell-wall polysaccharides. Biochemistry. 47 (16), 4701-4710 (2008).
- Kang, X., et al. Molecular architecture of fungal cell walls revealed by solid-state NMR. Nature Communications. 9 (1), 2747 (2018).
- Takahashi, H., et al. Solid-state NMR on bacterial cells: selective cell wall signal enhancement and resolution improvement using dynamic nuclear polarization. Journal of the American Chemical Society. 135 (13), 5105-5110 (2013).
- Wang, T., Hong, M. Solid-state NMR investigations of cellulose structure and interactions with matrix polysaccharides in plant primary cell walls. Journal of Experimental Botany. 67, 503-514 (2016).
- Mentink-Vigier, F., Akbey, Ü, Oschkinat, H., Vega, S., Feintuch, A. Theoretical aspects of magic angle spinning-dynamic nuclear polarization. Journal of Magnetic Resonance. 258, 102-120 (2015).
- Gupta, R., et al. Dynamic nuclear polarization enhanced MAS NMR spectroscopy for structural analysis of HIV-1 protein assemblies. The Journal of Physical Chemistry B. 120 (2), 329-339 (2016).
- Takahashi, H., Hediger, S., De Paëpe, G. Matrix-free dynamic nuclear polarization enables solid-state NMR 13 C-13 C correlation spectroscopy of proteins at natural isotopic abundance. Chemical Communications. 49 (82), 9479-9481 (2013).
- Ni, Q. Z., et al. High frequency dynamic nuclear polarization. Accounts of Chemical Research. 46 (9), 1933-1941 (2013).
- Koers, E. J., et al. NMR-based structural biology enhanced by dynamic nuclear polarization at high magnetic field. Journal of Biomolecular NMR. 60 (2-3), 157-168 (2014).
- Saliba, E. P., et al. Electron Decoupling with Dynamic Nuclear Polarization in Rotating Solids. Journal of the American Chemical Society. 139 (18), 6310-6313 (2017).
- Mentink-Vigier, F., et al. Efficient cross-effect dynamic nuclear polarization without depolarization in high-resolution MAS NMR. Chemical Science. 8 (12), 8150-8163 (2017).
- Smith, A. N., Twahir, U. T., Dubroca, T., Fanucci, G. E., Long, J. R. Molecular Rationale for Improved Dynamic Nuclear Polarization of Biomembranes. The Journal of Physical Chemistry B. 120 (32), 7880-7888 (2016).
- Su, Y., Andreas, L., Griffin, R. G. Magic angle spinning NMR of proteins: high-frequency dynamic nuclear polarization and 1H detection. Annual Reviews of Biochemistry. 84, 465-497 (2015).
- Hediger, S., Lee, S., Mentink-Vigier, F., Paepe, G. D. MAS-DNP Enhancements: Hyperpolarization, Depolarization, and Absolute Sensitivity. eMagRes. 7, 1-13 (2018).
- Ni, Q. Z., et al. In Situ Characterization of Pharmaceutical Formulations by Dynamic Nuclear Polarization Enhanced MAS NMR. The Journal of Physical Chemistry B. 121 (34), 8132-8141 (2017).
- Hill, T. W., Kafer, E. Improved protocols for Aspergillus minimal medium: trace element and minimal medium salt stock solutions. Fungal Genetics Reports. 48 (1), 20-21 (2001).
- Rossini, A. J., et al. Dynamic nuclear polarization surface enhanced NMR spectroscopy. Accounts of Chemical Research. 46 (9), 1942-1951 (2013).
- Sauvée, C., et al. Highly efficient, water-soluble polarizing agents for dynamic nuclear polarization at high frequency. Angewandte Chemie International Edition. 125 (41), 11058-11061 (2013).
- Phyo, P., et al. Gradients in Wall Mechanics and Polysaccharides along Growing Inflorescence Stems. Plant physiology. 175 (4), 1593-1607 (2017).
- White, P. B., Wang, T., Park, Y. B., Cosgrove, D. J., Hong, M. Water-polysaccharide interactions in the primary cell wall of Arabidopsis thaliana from polarization transfer solid-state NMR. Journal of the American Chemical Society. 136 (29), 10399-10409 (2014).
- Jippo, T., Kamo, O., Nagayama, K. Determination of long-range proton-carbon 13 coupling constants with selective two-dimensional INEPT. Journal of Magnetic Resonance. 66 (2), 344-348 (1969).
- Morris, G. A. Sensitivity enhancement in nitrogen-15 NMR: polarization transfer using the INEPT pulse sequence. Journal of the American Chemical Society. 102 (1), 428-429 (1980).
- Cadars, S., et al. The refocused INADEQUATE MAS NMR experiment in multiple spin-systems: interpreting observed correlation peaks and optimising lineshapes. Journal of Magnetic Resonance. 188 (1), 24-34 (2007).
- Lesage, A., Bardet, M., Emsley, L. Through-bond carbon− carbon connectivities in disordered solids by NMR. Journal of the American Chemical Society. 121 (47), 10987-10993 (1999).
- Bennett, A. E., et al. Homonuclear radio frequency-driven recoupling in rotating solids. The Journal of Chemical Physics. 108 (22), 9463-9479 (1998).
- Lu, X., Guo, C., Hou, G., Polenova, T. Combined zero-quantum and spin-diffusion mixing for efficient homonuclear correlation spectroscopy under fast MAS: broadband recoupling and detection of long-range correlations. Journal of Biomolecular NMR. 61 (1), 7-20 (2015).
- Wang, T., Zabotina, O., Hong, M. Pectin-cellulose interactions in the Arabidopsis primary cell wall from two-dimensional magic-angle-spinning solid-state nuclear magnetic resonance. Biochemistry. 51 (49), 9846-9856 (2012).
- Wang, T., Yang, H., Kubicki, J. D., Hong, M. Cellulose Structural Polymorphism in Plant Primary Cell Walls Investigated by High-Field 2D Solid-State NMR Spectroscopy and Density Functional Theory Calculations. Biomacromolecules. 17 (6), 2210-2222 (2016).
- Kirui, A., et al. Atomic Resolution of Cotton Cellulose Structure Enabled by Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR. Cellulose. , In Press (2019).
- Wang, T., et al. Sensitivity-enhanced solid-state NMR detection of expansin's target in plant cell walls. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (41), 16444-16449 (2013).
- Wang, T., Park, Y. B., Cosgrove, D. J., Hong, M. Cellulose-Pectin Spatial Contacts Are Inherent to Never-Dried Arabidopsis thaliana Primary Cell Walls: Evidence from Solid-State NMR. Plant Physiology. 168 (3), 871-884 (2015).
- Liao, S. Y., Lee, M., Wang, T., Sergeyev, I. V., Hong, M. Efficient DNP NMR of membrane proteins: sample preparation protocols, sensitivity, and radical location. Journal of Biomolecular NMR. 64 (3), 223-237 (2016).
- Kang, X., et al. Lignin-Polysaccharide Interactions in Plant Secondary Cell Walls Revealed by Solid-State NMR. Nature Communications. 10, 347 (2019).
- Takahashi, H., et al. Rapid Natural-Abundance 2D 13C-13C Correlation Spectroscopy Using Dynamic Nuclear Polarization Enhanced Solid-State NMR and Matrix-Free Sample Preparation. Angewandte Chemie International Edition. 51 (47), 11766-11769 (2012).
