Summary
다차원 고체 NMR 분광학 및 동적인 핵 분극 (DNP) 조사 13C,15N 표시 된 곰 팡이 및 식물 견본을 준비 하기 위한 프로토콜 제공 됩니다.
Abstract
이 프로토콜 보여줍니다 얼마나 균일 하 게 13C, 15N 표시 된 곰 팡이 자료 수 생산과 실험 어떻게이 부드러운 소재 고체 NMR 및 감도 향상 DNP 진행 한다. 식물 바이오 매스의 샘플 처리 절차 또한 상세한입니다. 이 방법을 사용 하면 일련의 1d 및 2D 13C-13C의 측정 /15N 상관 관계 스펙트럼, 최소한의 섭 동으로 그들의 네이티브 국가에서 복잡 한 생체 재료의 고해상도 구조 설명 있습니다. 동위 원소 라벨 1d 스펙트럼의 강도 및 2D 상관 관계 스펙트럼에 분극 전송 효율을 측정 하 여 시험 될 수 있다. 동적인 핵 분극 (DNP) 샘플 준비의 성공 감도 향상 요인에 의해 평가할 수 있습니다. 다 당 류와 단백질의 구조적 측면을 검토 하는 추가 실험 3 차원 구조의 모델 이어질 것입니다. 이러한 메서드를 수정 및 탄수화물이 풍부한 재료, 식물, 균 류, 조류, 박테리아의 자연 세포 벽을 포함 하 여 뿐 아니라 합성 또는 탄수화물 중합체 및 다른 그들의 복잡 한 디자인의 넓은 범위를 조사 하기 위해 적응 수 있습니다. 분자입니다.
Introduction
탄수화물은 에너지 저장, 구조 건물, 및 세포 인식 및 접착 등 다양 한 생물학 과정에서 중심 역할을 한다. 그들은 세포 벽에 식물, 균 류, 조류, 박테리아1,2,3의 기본적인 구성 요소는 농축 됩니다. 세포 벽 역할을 항균 요법4,,56,7,8 대 유망 대상으로 바이오 연료 및 바이오 소재의 생산에 대 한 중앙 소스 , 9.
이러한 복잡 한 자료의 현대 이해는 수 십년의 4 개의 주요 생 화 확 적인 또는 유전자 방법을 사용 하 여 구조적 특성에 전념 했다 노력에 의해 실질적으로 고급 되었습니다. 첫 번째 주요 방법 의존 순차적 치료 가혹한 화학 물질이 나 효소를 사용 하 여 다른 부분으로 세포 벽을 무 너 뜨 리는 뒤에 작곡 및 각 분수10에서 설탕의 연계 분석. 이 방법은 고분자, 도메인 배포에 광명 하지만 해석 생체의 화학 및 물리적 특성으로 인해 오해의 소지가 있을 수 있습니다. 예를 들어 알칼리 추출 물 분수 유래와 비교 해도 덜 구조화 된 분자의 단일 도메인에서 또는 공간적으로 분리 된 분자에서 여부를 결정 하기가 어렵습니다. 둘째, 추출 된 부분 또는 전체 세포 벽 또한 측정 될 수 있다 또한 다른 분자11,12,13, 사이의 가교 되 나 공유 결합을 솔루션 NMR을 사용 하 여 14,15. 이 방법에서는, 화학식 앵커의 상세한 구조를 탐색할 수, 있지만 제한 류, 상대적으로 적은 수의 가교 사이트 및 안정화 비 공유 효과의 무지의 낮은 용 해도 인해 있을 수 있습니다. 다 당 류 패킹, 수소 결합, 반 데르 발스 힘, 정전기 상호 작용 및 폴리머 녹 채를 포함 하 여. 셋째, 바인딩 선호도 결정 있다 생체 외에서 사용 하 여 절연된 류16,,1718,19, 정화 절차를 실질적으로 변경할 수 있습니다. 구조와 이러한 생체의 속성입니다. 이 메서드는 또한 정교한 증 착 및 생 합성 후 고분자의 어셈블리를 복제 하도록 실패 합니다. 마지막으로, 표현 형, 세포 형태학 및 특정 세포 벽 구성 요소의 감쇠 생산 유전 돌연변이의 기계적 성질 류의 구조 기능에 조명 하지만 더 분자 증거 이러한 다리 필요 단백질 기계20의 조작된 기능을 가진 거시적인 관측.
개발 및 응용 프로그램 다차원 고체 NMR 분광학의 최근 발전 구조 퍼즐을 해결 하기 위한 독특한 기회를 도입 했습니다. 2D/3D 고체 NMR 실험 구성의 고해상도 조사 및 주요 섭 동 하지 않고 기본 상태에서 탄수화물이 풍부한 재료의 아키텍처를 사용합니다. 1 차 및 2 차 세포 벽 식물, 촉매로 처리 바이오 매스의 구조 연구가 성공적으로 실시 되어 세균의 biofilm 안료 유령 버섯에 그리고, 최근에 작가, 병원 성 균 류에서 그대로 세포 벽에 의해 Aspergillus fumigatus 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31. 동적인 핵 분극 (DNP)32,33,34,35,36,,3738 의 개발 , 39 , 40 , 41 , DNP로 감도 향상 현저 하 게 단축에 이러한 복잡 한 생체 실험 시간 42 실질적으로 NMR 구조 설명을 촉진 한다. 여기에 설명 된 프로토콜 동위 원소 레이블 A. fumigatus 곰 팡이 및 곰 팡이 준비 절차 및 공장 샘플 고체 NMR 및 DNP 특성화에 대 한 자세히 설명 합니다. 유사한 라벨 절차 변경 된 매체와 다른 균에 적용 되어야 합니다 그리고 샘플 준비 절차 다른 탄수화물이 풍부한 생체 재료에 일반적으로 적용 되어야 합니다.
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Protocol
1. 13C, 15N 표시 Aspergillus fumigatus 성장의 액체 매체
- 레이블이 없는의 준비와 13C, 15N 표시 된 성장 매체
참고: 모두 효 모 추출 물 펩 포도 당 매체 (YPD)와 향상 된 최소한의 중간43 곰 팡이 문화 유지 관리를 위해 사용 되었다. 압력가 마로 소독 후 모든 단계는 오염을 최소화 하기 위해 층 류 후드에서 수행 됩니다.- 레이블이 없는 액체 매체의 준비: 6.5 g 100 mL의 증류수 그리고 134 ° c.에 25 분 압력솥에 YPD 분말의 분해
- 레이블이 없는 단단한 매체의 준비
- 100 mL의 증류수에 한 천의 YPD 분말 6.5 g 1.5 g을 추가 합니다.
- 고압 121 ° C 그리고 멋진 약 50 ° c.까지 25 분 매체
- 각 미리 살 균 플라스틱 페 트리 접시에 매체의 13-15 mL을 전송 하 고 즉시 뚜껑을 사용 하 여 요리를 커버.
- 13C, 15N 표시 된 액체 매체의 준비
참고: 동위 원소 라벨, 13를 포함 하는 최소 매체에 대 한 성장 솔루션을 준비 하 C-포도 당 및 15N-나트륨 질산염 및 추적 요소 솔루션은 별도로 준비와 다음 혼합 사용 하기 전에.- 표 1에 나열 된 동위 원소를 포함 하는 최소 매체의 100 mL를 준비 합니다. 6.6 NaOH (1 M) 또는 HCl (1m) 솔루션을 사용 하 여에 pH를 조정 합니다.
- 고압 121 ° c.에 25 분에 대 한 최소한의 매체
- 100 mL를 준비 (1, 000 x) 성분 솔루션의 분해는 증류수에 표 2 에 나열 된 소금. 오토 클레이 브 134 ° c.에 25 분을 위한 솔루션 진정 하 고 단기 사용을 위한 4 ° C에서 솔루션을 저장 합니다. PH 약 6.5 되며 pH 미터를 사용 하 여 확인할 수 있습니다.
- 사용 하기 전에 표 2 에 나열 된 성분 솔루션의 0.1 mL 13C, 15N 표시 된 최소 매체의 100 mL를 추가 합니다.
- 곰 팡이 재료의 성장
- 층 류 두건에 inoculating 루프를 사용 하는 YPD 접시에 저장소에서 버섯의 작은 금액을 전송 합니다. 인큐베이터에 2 일 동안 30 ° C에서 문화를 유지.
- Inoculating 루프를 사용 하 여 전송 13C에 활성 성장 균 가장자리, 층 류 두건에서15N 라벨링 솔루션. 떨고 인큐베이터에서 220 rpm에서 3-5 일에 30 ° C에서 문화를 유지.
- 4000 x g 20 분 제거는 상쾌한에 centrifuge 고 펠 릿을 수집 합니다.
- 트위터를 사용 하 여 수집 잘 수 화 된 펠 릿의 ~0.5 g (> 50 wt % 수 화) NMR 연구. 어떤 시점에서 수 분의 손실을 실질적으로 스펙트럼 분해능을 악화 됩니다.
참고: 필요한 경우, 수산화 사체의 소량 (0.1 g) 구분 고 후드 또는 수 화 수준 예측 하 고 건조 질량 백분율을 계산 하는 lyophilizer에서 N2 가스 흐름에서 완전히 건조. 일반적으로, 포함 하는 ~0.3 g 펠 렛 건조 질량 3 일 후에 얻어질 수 있다. NMR 실험 실시 긴 경우 (> 7 일) 또는 추가 처리 전에 곰 팡이 자료 10-20 분 동안 액체 N2 에 깊이 얼 수 있다 곰 팡이의 상태를 수정 하는 경우. 실험은 짧은 될 것입니다 (3-6 일), 동결 건너뛸 수 있습니다 샘플 신선한 남아 있을 수 있도록. - 원심 분리기 튜브에 글리세롤의 20% (v/v) 초과 소재를 믹스 하 고 장기 저장을 위한-80 ᵒC 냉동 실에 보관.
2. 솔리드 스테이트 NMR 및 DNP 연구 A. fumigatus 의 준비
- 고체 NMR 실험 A. fumigatus 의 준비
- 13C, 15N 표시 된 곰 팡이 샘플 (단계 1.2.4.) 총 3 일 동안 성장 매체에서 작은 분자를 제거 하는 3.5 kDa 분자량 컷오프와 투 석의 가방을 사용 하 여 4 ° C에서 10 m m 인산 버퍼 (pH 7.0)의 1 L에 대 한 dialyze 매일 두 번 버퍼를 변경 합니다.
참고: 또는 샘플 수 세척 될에 대 한 6-10 시간 잔여 작은 분자를 제거 하는 이온된 수를 사용 하 여. - 15 mL 튜브 및 벤치탑 원심 분리기를 사용 하 여 5 분 (10000 x g) 원심 분리기 샘플을 전송 합니다. 상쾌한을 제거 하 고 나머지 균 자료를 수집.
- 70-80 밀리 그램을 팩은 4 mm ZrO2 회전자 또는 NMR 실험에 대 한 3.2 m m로 터에 30-50 밀리 그램으로 균일 하 게 13C 표시 하 고 잘 수 화 된 샘플 붙여넣기. 반복적으로 부드럽게 금속 막대를 사용 하 여 샘플을 짜 내 고 종이 사용 하 여 초과 물을 흡수.
- 단단히 터 모자 고 고체 NMR 특성화에 대 한 분석기에 샘플을 삽입 합니다.
참고: 새로운로 터는로 터 충돌의 가능성을 최소화 하 고 샘플 NMR 분 광 기에서 유출 하는 제안입니다. 필요한 경우, 씰링 나사와 일회용 켈리 F 삽입으로 터 내부 보조 컨테이너 역할을 사용할 수 있습니다.
- 13C, 15N 표시 된 곰 팡이 샘플 (단계 1.2.4.) 총 3 일 동안 성장 매체에서 작은 분자를 제거 하는 3.5 kDa 분자량 컷오프와 투 석의 가방을 사용 하 여 4 ° C에서 10 m m 인산 버퍼 (pH 7.0)의 1 L에 대 한 dialyze 매일 두 번 버퍼를 변경 합니다.
- DNP 실험 A. fumigatus 샘플의 준비
- 13C,15N 표시 된 곰 팡이 샘플에 대 한 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 DNP 용29,44 (DNP 매트릭스 라고도 함)의 100 µ L를 준비 합니다. D8의 혼합물을 포함 하는이 DNP 매트릭스-글리세롤/D2O/H2O (60/30/10 Vol %).
참고: 레이블이 없는 샘플 하는 경우 조사, 준비 13C 고갈 d8을 사용 하 여 DNP 매트릭스-글리세롤 (12C3, 99.95%; D8, 98%)을 피하기 위해 13C D2O 및 H2O 신호는 용 매에서 기여. - AMUPol45 양식 10 mM 급진적인 재고 솔루션 DNP의 100 µ L의 0.7 mg을 디졸브. 래 디 칼은 솔루션에 완전히 용 해 되도록 2-3 분 동안 소용돌이.
- AMUPol 솔루션의 50 µ L로 (2.1.1, 2.1.2 단계) 이전 단계에 설명 된 대로 dialyzed 13C, 15N 표시 된 곰 팡이 재료의 10 mg을 흡수 하 고 약간 혼합 사용 하는 유 봉과 박격포에 래 디 칼의 침투를 갈기 다공성 세포 벽입니다.
참고: 수 분 손실의 속도 줄이기 위해, 연 삭 수 있습니다 또한 개최는 micropestle를 사용 하 여 microcentrifuge 튜브. - 곰 팡이 샘플 추가 수화물에 grinded 펠 릿에 급진적인 솔루션의 또 다른 30 µ L을 추가 합니다.
- 3.2 m m 사파이어로 터에 펠 릿을 포장 하 고 약간 짜 초과 DNP 용 매를 제거. 3.2 m m 실리콘 플러그 수 분의 손실을 방지 하기 위해 추가 합니다. 일반적으로, 샘플의 5-30 mg로 터에 포장 될 수 있다 정확한 금액은 실시 NMR 실험의 감도 요구에 의해 결정 될 필요가 있다.
- 삽입 및 DNP 분석기에서 샘플을 회전 마이크로파 방사선에서 DNP 강화 된 스펙트럼을 측정 하 고 전자 레인지에서 스펙트럼과 비교. 이 이어질 것입니다 한 향상 계수 ε온/오프는 20-40이 복잡 한 재료 이어야 한다. 세포 벽 구조를 결정 하는 설계 된 실험을 실행 합니다.
- 13C,15N 표시 된 곰 팡이 샘플에 대 한 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 DNP 용29,44 (DNP 매트릭스 라고도 함)의 100 µ L를 준비 합니다. D8의 혼합물을 포함 하는이 DNP 매트릭스-글리세롤/D2O/H2O (60/30/10 Vol %).
3. NMR 및 DNP 연구를 위한 식물 바이오 매스의 준비
- 고체 NMR에 대 한 식물 재료의 준비
- 13C 라는 식물 성장 챔버 또는 13C-포도 당 매체에서 앞에서 설명한46,47 13CO2 공급을 사용 하 여 내부를 균일 하 게 생산 또는 직접 레이블된 자료 구입 동위 원소 라벨 기업입니다.
참고: 13C-포도 당만 사용할 수 있습니다 어두운 성장에 12C의 소개를 피하기 위해 광합성에 의해. - 잘라는 13C 작은 조각 (차원에서 일반적으로 1-2 m m)으로 식물을 분류 하는 균일 하 게 실험실 면도날을 사용 하 여.
참고: 목적에 따라 추출 된 세포 벽은 가끔 사용 구조 특성화 고 상세한 프로토콜 이전 연구21,46에서 보고 됩니다. - 샘플은 이전 건조, 물 100 µ L 1.5 mL microcentrifuge 튜브, 식물 재료의 30 밀리 그램에 추가 소용돌이, 1 일 실 온에서 equilibrate. 4000 x g 10 분에 centrifuge 고를 피 펫을 사용 하 여 초과 물을 제거 합니다.
- 샘플은 언제 든 지 결코 건조, 경우 직접 추가 치료 없이 샘플을 사용 합니다.
- 고체 NMR 실험에 대 한 3.2 m m 또는 4mm ZrO2 로 터로 결과 식물 재료를 포장 하십시오.
- 13C 라는 식물 성장 챔버 또는 13C-포도 당 매체에서 앞에서 설명한46,47 13CO2 공급을 사용 하 여 내부를 균일 하 게 생산 또는 직접 레이블된 자료 구입 동위 원소 라벨 기업입니다.
- DNP 연구에 대 한 식물 재료의 준비
- 10 mm AMUPol 설명된 단계 2.2.1을 2.2.2로 급진적인 60 µ L 재고 솔루션을 준비 합니다.
- 잘라는 균일 하 게 13C 라는 작은 조각 (차원에서 1-2 m m)으로 공부 될 식물 재료 실험실 면도날을 사용 하 여 및 식물 재료의 20 밀리 그램의 무게.
- 손 갈기 식물 조각 작은 입자 (~ 1-2 m m 크기)에 박격포 및 방 앗 공이 사용 하 여. 최종 분말 동질적인 외관이 있다.
- 40 µ L DNP 재고 솔루션의 준비 이전 단계 (2.2.2) 공장 설비 재료를 추가 하 고 약간 균질 급진적인 혼합 되도록 5 분에 대 한 갈기.
- 더 연 삭 후 공장 설비 재료를 수 화를 재고 솔루션의 또 다른 20 µ L를 추가 합니다.
- DNP 실험에 대 한 3.2 m m 사파이어로 터에 equilibrated 공장 샘플 팩을. 수 분의 손실을 방지 하기 위해 실리콘 플러그를 삽입 합니다.
4. 탄수화물이 풍부한 생체 재료의 초기 특성 표준 고체 NMR 실험
참고: NMR 실험의 간략 한 개요는이 섹션에서 제공 됩니다. 그러나, 구조 설명에는 일반적으로 광범위 한 전문 지식이 필요합니다. 따라서, NMR spectroscopists와 공동 노력 것이 좋습니다.
- 측정 1 D 13C 교차 편광 (CP), 35-s 2-s와 13C 직접 분극 (DP) 재활용 지연과 1H-13C 무능48,49 스펙트럼은 동역학의 일반적인 이해를 세포 구성 요소 (그림 1a)의 분포. 세포 벽은 일반적으로 상대적으로 단단한 부분 하 고 CP 스펙트럼에서 지배적인 신호를 전시.
- 일련의 표준 2D 13C-13C 상관 관계 실험 공명 할당 13C 신호를 측정 합니다. 일련의 1.5 ms RFDR52 (그림 1b) 등 50 ms 코드 공간을 통해 실험에 의해 지원 될 필요가 refocused 부적당 한50,51 탄소 연결을 얻기 위해 시작/DARR53 실험.
참고: 기본 또는 보조 세포 벽, 풍부한 특정 구성 요소, 예를 들어 샘플을 찾을 수 관심의 경우 다음 여러 세그먼트 또는 여러 식물 해야 최적의 구성으로 샘플을 찾을 수 별도로 측정 되어야 합니다. - 단백질과 nitrogenated 탄수화물의 공명 할당을 촉진 하기 위하여 측정 될 수 있는 2D 15N-13C 상관 관계 실험을 실시 합니다.
참고: 공명 할당은 일반적으로 시간이 많이 걸리는. 메서드는 현재 탄수화물 신호 사전 경험 없이 그 과학자의 공명 지정을 촉진 하기 위하여 개발 되 고 있습니다. - 보다 전문적인된 실험 공간 근거리 (그림 1 c, d), 수 화 및 mobilities로 탄수화물이 풍부한 재료의 3 차원 구조를 결정 하는 복잡 한 생체의 결정을 측정합니다 체계적으로 기술 이전2922,.
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Representative Results
실질적으로 NMR 감도 강화 하 고 2D 13C-13C와 13C-15N 상관 관계 스펙트럼 분석 구성, 수 화, 이동성을 일련의 측정 및 포장의 가능 하 게 동위 원소 라벨 중합체 세포 벽 구조 (그림 1)의 3 차원 모델을 생성 하는 통합 된 것입니다. 성공 하면 균일 한 라벨 1 D 13C와 15N 스펙트럼의 완전 한 세트는 1 시간 이내 수령 하실 수 없습니다 그리고 각 표준 2D 스펙트럼 측정의 24 시간 보다 더 이상 걸릴 해야 합니다.
잘 준비 된 샘플은 일반적으로 모두 높은 NMR 농도 기대 하 고 날카로운 라인. 변수 매개 변수의 손상 되지 않은 최적화 된 샘플 준비를 나타냅니다. 곰 팡이 샘플 결코 건조 방식으로 준비 해야 하 고 포장 단계 부분 탈수는 선 폭의 주목할 만한 확대로 이어질 수 있습니다. 실험 시간이 실질적으로 완벽 하 게 포장된 NMR 샘플에 대 한 예상 보다 더 긴 경우 레이블 수준 낮은 수 있습니다. 떨어져 대각선 신호 2D 13C-13C 상관 관계 스펙트럼에 얻기 어려운 경우에, 통계 라벨 수 있습니다 발생 했습니다 (그림 1b). 96와 92 ppm에서 두 13C 봉우리는 포도 당54의 서명 탄소 1 신호, 따라서 양적 13C에에서 그들의 강한 농도 분극 (DP) 스펙트럼 35의 긴 재활용 지연 측정 s 일반적으로 나타냅니다 불완전 한 투 석 또는 세척 (그림 1a) 작은 분자의 지배. 잘 분류 샘플, 장거리 상관 관계는 생체 (그림 1c)의 공간 근거리를 감지 하 여 그대로 세포 벽 (그림 1의 d)의 구조 모델을 만드는 더 측정할 수 있습니다.
| 화학 이름 | 화학 공식 | 농도 (g/L) |
| Dipotassium 인산 염 | K2HPO4 | 1.045 g |
| 마그네슘 황산 염 Heptahydrate | MgSO4·7H2O | 0.52 g |
| Monopotassium 인산 염 | KH2포4 | 0.815 g |
| 15 N-질 산 나트륨 | 15 나노3 | 6.0 g |
| 염화 칼륨 | KCl | 0.52 g |
| U-13C-포도 당 | 13 C6H12O6 | 10.0 g |
표 1입니다. 최소한의 매체의 구성입니다.
| 화학 이름 | 화학 공식 | 농도 (g/L) |
| 암모늄 몰 리브 덴 Tetrahydrate | (NH4) 6 모7O24·4H2O | 11 g |
| 붕 소의 산 성 | H3보3 | 11 g |
| Cobaltous 염화 물 Hexahydrate | CoCl2·6H2O | 16 g |
| Cupric 황산 염 Pentahydrate | CuSO4·5H2O | 16 g |
| 철 황산 염 Heptahydrate | FeSO4·7H2O | 5 g |
| 염화 망간 Tetrahydrate | MnCl2·4H2O | 5 g |
| Tetrasodium Ethylenediaminetetraacetate | 나4EDTA·4H2O | 60 g |
| 아연 황산 염 Heptahydrate | ZnSO4·7H2O | 22 g |
표 2입니다. (집중) 추적 요소 솔루션의 구성. 레이블이 없는 버섯을 준비 하기 위한 유의 레이블이 없는 포도 당 및 질 산 나트륨 레이블이 없는 사용할 수 있습니다.
그림 1입니다. 고체 NMR을 사용 하 여 진 균 세포 벽 구조를 특성화에 대 한 순서도. 초기 (는) 1 D 스펙트럼 심사 샘플링. 하단에 위에서 무능, 13C DP 2-s 재활용 지연, 13C DP 35의 재활용 지연 및 감지 된 분자에 대 한 이동성 감소와 13C CP 스펙트럼. (b) 2D 13C-13C 상관 관계 스펙트럼 1.5 ms RFDR recoupling 사용 하 여 측정. (c) 대표 intermolecular 크로스 피크 15 ms 파 스펙트럼을 사용 하 여 검색. (d) 구조 모델 NMR 데이터에서 가져온. 패널은 을, c 와 d 에서 수정 된 강 외. 자연과학 Commun. 9, 2747 (2018). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
생 화 확 적인 방법에 비해, 고체 NMR 장점이 아닌-파괴 및 고해상도 기술로. NMR 작곡 분석, 양적 이며 또한 대부분의 다른 분석 방법과 달리 않습니다는 불확실성에 의해 소개 되지 biopolymers의 한정 된 가용성. 현재 프로토콜의 탄수화물이 풍부한 바이오 소재 및 기능성된 고분자에 대 한 미래의 연구를 촉진 한다. 그러나, 그것은 유의 공명 할당 및 데이터 분석 시간이 많이 소요 될 수 있습니다 및 일반적으로 체계적인 훈련을 요구 하십시오. 저자는 현재 개발 도구가이 장애물을 극복 하기 위해 사전 경험 없이 과학자 수 있도록 데이터베이스.
13C의 자연 동위 원소 풍부 1.1%만 이기 때문에, 관찰 하는 13C-13C 피크 재료 레이블 없음 사용 하 여 크로스 확률이입니다만 0.012% (1.1 x 1.1%)를 사용 하 여 균일 하 게 샘플을 표시. 따라서, 실질적으로이 프로토콜을 사용 하 여 달성 하는 동위 원소 농축 4 개의 크기 순서에 의해 NMR 감도 강화 하 고 구조 결정에 대 한 2D 상관 관계 실험을 수 있습니다.
최적화 된, 잘 수 화 된 샘플 2D 13C-13C 상관 관계 스펙트럼에서 날카로운 라인을 전시 한다. A. fumigatus 에서 β-glucans 식물에서 pectins 등 모바일 구성 요소 0.3-0.5의 절반-최대 (FWHM) 선 폭에서 전각 전시 한다 ppm 600-800 MHz 핵자기공명 분석기29,31에. 엄격한 구성 요소는 창설, 반복적인 설탕 단위의 구조적이 고 급속 한 분자 움직임의 부족으로 인해 약간 광범위 한 봉우리. 전형적인 13C 선 폭은 0.7-1.0 ppm으로 셀 루 로스 microfibrils 식물에 0.5-0.7 ppm 버섯55에 틴에 대 한. 셀 루 로스 그리고 키 틴의 날카로운 선 폭 고분자 결정에 의해 주로 발생, 따라서 부분적으로 탈수 및 DNP 실험56,57의 예를 들면, 극저온 온도, 온도 변화에 저항. 그러나 매트릭스 고분자의 피크 선명도, 폴리머 이동성에 영향을 주는 샘플 조건의 변화에 매우 민감한, 따라서, 그것은 샘플 수 분의 지시자로 사용할 수 있습니다. 매트릭스 고분자의 광범위 한 라인은 일반적으로 완전히 또는 부분적으로 다시 물58를 추가 하 여 복구할 수 있습니다 샘플에서 수 분의 부족을 지정 합니다. 일반적으로 50-80 wt %의 수 분 수준 식물과 곰 팡이 샘플에서 좋은 선 폭을 제공 하기 위한 충분 하다.
DNP는 종종 이러한 도전 전체 셀 시스템을 조사 하 고 필요 합니다. 일반적으로, 감도의 20-40 배 향상 600 MHz/395 GHz DNP 분석기에 최적화 된 샘플에 달성 될 수 및이 값이 감소 하는 필드, 예를 들어 400 MHz/263 GHz DNP26,59 에 거의 두 배로 증가 . DNP 효율에 영향을 미칠 수 있는 몇 가지 요인이 있다. 첫째, 세포 벽의 다공성 네트워크에 래 디 칼의 보급률은 매우 중요 하 고이 프로세스는 실질적으로 포함 하는 급진적인 DNP 매트릭스에는 생체의 온화한 연마 하 여 촉진 수 있습니다. 둘째, 물리적 특성, 강성 예를 들어 샘플의 영향을 전자 레인지 전력, DNP 매트릭스 "녹는" 12 W 조사는 엄격한 공장에 대 한 문제가 아니었다 1H 공명의 선명에 의해 입증으로 선택 60을유래한 다. 1H 용 매 피크의 더 등방성 패턴 관찰 결과,와 함께 실질적으로 낮은 회전 측 대역 감쇠 DNP 향상. 따라서, 약한 파워는 부드럽고 자료에 대 한 것이 좋습니다. 셋째, DNP 매트릭스의 구성 최적화 되어야 합니다. 그것은 밝혀 지 그 d8-글리세롤/D2O/H2O는 일반적으로 부드러운 소재에 대 한 최고의 용 D2O/H2O의 간단 하 고 저렴 한 선택 또한 효과적일 수 어떤 경우에는 설탕이는 시스템에 존재 하기 때문에 어느 정도 cryoprotectants 역할을 합니다. 반면, d6-DMSO/D2O/H2O 솔루션 실패 식물과 곰 팡이 샘플 보다 10 배 감도 향상의 따라서 그것은 하지 않는 것이 좋습니다 사용 하기 위해 특별 한 목적을 위해. 매트릭스-무료 프로토콜 최근 용 매 소모, 더 많은 자료34,,5661를 수용 하기 위해 추가 공간을 만듭니다 때문에 매우 효과적인 것으로 입증 되었습니다. 그러나, 수 분의 손실 생체의 구조를 주요 섭 동을 선물 한다, 따라서이 방법은 생물 학적 시스템에 적합 되지 않을 수도 있습니다. 레이블이 없는 세포 벽 있다면 공부, 13C 고갈 d8-글리세롤/D2O/H2O는 모든 자연 풍부 13C 신호를 기여 하지 않습니다 없으며 어떤 감도 희생 하는 최적의 용 매 향상입니다.
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Disclosures
공개 하는 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 국립 과학 재단 NSF OIA-1833040를 통해 지원 되었다. 국가 높은 자기장 실험실 (NHMFL) DMR 1157490와 플로리다의 상태를 통해 국립 과학 재단에 의해 지원 됩니다. NHMFL에서 매스 DNP 시스템 S10 OD018519 NIH와 NSF 체-1229170에 의해 일부 자금입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Molybdate Tetrahydrate | Acros Organics | 12054-85-2 | |
| AMUPol | Cortecnet | C010P002 | |
| Analytical weighing balance | Ohaus | B730439218 | Model PA84C |
| Bioclave 16 L | VWR | 470230-598 | |
| Biosafety Cabinet | Labconco corporation | 302319100 | |
| Boric acid | VWR | BDH9222 | store at 15-30 °C |
| Cobalt(II) Chloride Hexahydrate | Honeywell|Fluka | 60820 | ≥98 % |
| Copper(II) Sulfate Pentahydrate | BDH | BDH9312 | ≥98 % |
| Corning LSE shaking incubator | Thermo Fisher Scientific | 7202152 | |
| D2O | Sigma Aldrich | 151882 | 99.9 atom % D |
| d6-DMSO | Sigma Aldrich | 151874 | 99.9 atom % D |
| d8-glycerol | Sigma Aldrich | 447498 | ≥99 atom % D |
| Dialysis tubing 3.2 kDa | Sigma Aldrich | D2272 | 132724 |
| Dipotassium Phosphate | VWR | BDH9266 | ≥98 % |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | ≥99.5 % |
| Heraus Megafuge 16R Centrifuge | Thermo Fischer Scientific | 750004271 | Maximum RCF 25,830 x g |
| HR-MAS Disposable Insert Kit | Bruker | B4493 | Kel-F |
| Iron(II) Sulfate Heptahydrate | Alfa Aesar | 14498 | ≥99+ % |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | VWR | 10034998 | store at 18-26 °C |
| Manganese(II) Chloride Tetrahydrate | Alfa Aesar | 11563 | ≥99 % |
| Monopotassium Phosphate | VWR | 470302-254 | ≥99 % |
| pH Meter | Mettler Toledo | B706689216 | |
| Tetrasodium Ethylenediaminetetraacetate | Acros Organics | 13235-36-9 | ≥99.5 % |
| Zinc Sulfate Heptahydrate | Alfa Aesar | 33399 | ≥98 % |
| 12C3, d8-glycerol | Cambridge Isotope Laboratory | CDLM-8660 | 12C3, 99.95%; D8, 98% |
| 13C6-glucose | Sigma Alrdrich | 364606 | ≥99 % (CP) |
| 15N-sodium nitrate | Sigma Aldrich | 364606 | ≥98 % 15N, ≥99 (cp) |
| 3.2 mm sapphire NMR rotor | Cortecnet | B6939 | |
| 3.2 mm Silicone plug | Bruker | B7089 | |
| 4 mm MAS Rotor Kit | Bruker | H14355 | Zirconia |
References
- Murrey, H. E., Hsieh-Wilson, L. C. The chemical neurobiology of carbohydrates. Chemical Reviews. 108 (5), 1708-1731 (2008).
- Latge, J. P. The cell wall: a carbohydrate armour for the fungal cell. Molecular Microbiology. 66 (2), 279-290 (2007).
- Cosgrove, D. J. Growth of the plant cell wall. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 850-861 (2005).
- Furtado, A., et al. Modifying plants for biofuel and biomaterial production. Plant Biotechnology Journal. 12 (9), 1246-1258 (2014).
- Loqué, D., Scheller, H. V., Pauly, M. Engineering of plant cell walls for enhanced biofuel production. Current Opinion in Plant Biology. 25, 151-161 (2015).
- Latge, J. P. Aspergillus fumigatus and aspergillosis. Clinical Microbiology Reviews. 12 (2), 310-350 (1999).
- Ragauskas, A. J., et al. The path forward for biofuels and biomaterials. Science. 311 (5760), 484-489 (2006).
- Service, R. F. Cellulosic ethanol - Biofuel researchers prepare to reap a new harvest. Science. 315 (5818), 1488-1491 (2007).
- Somerville, C., Youngs, H., Taylor, C., Davis, S. C., Long, S. P. Feedstocks for Lignocellulosic Biofuels. Science. 329 (5993), 790-792 (2010).
- Schiavone, M., et al. A combined chemical and enzymatic method to determine quantitatively the polysaccharide components in the cell wall of yeasts. FEMS Yeast Research. 14 (6), 933-947 (2014).
- Cheng, K., Sorek, H., Zimmermann, H., Wemmer, D. E., Pauly, M. Solution-State 2D NMR Spectroscopy of Plant Cell Walls Enabled by a Dimethylsulfoxide-d(6)/1-Ethyl-3-methylimidazolium Acetate Solvent. Analytical Chemistry. 85 (6), 3213-3221 (2013).
- Mansfield, S. D., Kim, H., Lu, F. C., Ralph, J. Whole plant cell wall characterization using solution-state 2D NMR. Nature Protocols. 7 (9), 1579-1589 (2012).
- Tan, L., et al. An Arabidopsis Cell Wall Proteoglycan Consists of Pectin and Arabinoxylan Covalently Linked to an Arabinogalactan Protein. Plant Cell. 25 (1), 270-287 (2013).
- Kollar, R., Petrakova, E., Ashwell, G., Robbins, P. W., Cabib, E. Architecture of the Yeast-Cell Wall - the Linkage between Chitin and Beta(1-3)-Glucan. Journal of Biological Chemistry. 270 (3), 1170-1178 (1995).
- Kollar, R., et al. Architecture of the yeast cell wall - beta(1->6)-glucan interconnects mannoprotein, beta(1-3)-glucan, and chitin. Journal of Biological Chemistry. 272 (28), 17762-17775 (1997).
- Mccann, M. C., et al. Old and new ways to probe plant cell wall architecture. Canadian Journal of Botany. 73, S103-S113 (1995).
- Whitney, S. E. C., Brigham, J. E., Darke, A. H., Reid, J. S. G., Gidley, M. J. In-Vitro Assembly of Cellulose/Xyloglucan Networks - Ultrastructural and Molecular Aspects. The Plant Journal. 8 (4), 491-504 (1995).
- Zykwinska, A. W., Ralet, M. C. J., Garnier, C. D., Thibault, J. F. J. Evidence for in vitro binding of pectin side chains to cellulose. Plant Physiology. 139 (1), 397-407 (2005).
- Kiemle, S. N., et al. Role of (1,3)(1,4)-beta-Glucan in Cell Walls: Interaction with Cellulose. Biomacromolecules. 15 (5), 1727-1736 (2014).
- Pogorelko, G., Lionetti, V., Bellincampi, D., Zabotina, O. Cell wall integrity: targeted post-synthetic modifications to reveal its role in plant growth and defense against pathogens. Plant Signaling & Behavior. 8 (9), e25435 (2013).
- Wang, T., Park, Y. B., Cosgrove, D. J., Hong, M. Cellulose-Pectin Spatial Contacts Are Inherent to Never-Dried Arabidopsis thaliana Primary Cell Walls: Evidence from Solid-State NMR. Plant Physiology. 168 (3), 871-884 (2015).
- Wang, T., Salazar, A., Zabotina, O. A., Hong, M. Structure and dynamics of Brachypodium primary cell wall polysaccharides from two-dimensional 13C solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biochemistry. 53 (17), 2840-2854 (2014).
- Grantham, N. J., et al. An even pattern of xylan substitution is critical for interaction with cellulose in plant cell walls. Nature Plants. 3 (11), 859-865 (2017).
- Simmons, T. J., et al. Folding of xylan onto cellulose fibrils in plant cell walls revealed by solid-state NMR. Nature Communications. 7, 13902 (2016).
- Komatsu, T., Kikuchi, J. Selective Signal Detection in Solid-State NMR Using Rotor-Synchronized Dipolar Dephasing for the Analysis of Hemicellulose in Lignocellulosic Biomass. The Journal of Physical Chemistry Letters. 4 (14), 2279-2283 (2013).
- Perras, F. A., et al. Atomic-Level Structure Characterization of Biomass Pre- and Post-Lignin Treatment by Dynamic Nuclear Polarization-Enhanced Solid-State NMR. The Journal of Physical Chemistry A. 121 (3), 623-630 (2017).
- Chatterjee, S., Prados-Rosales, R., Itin, B., Casadevall, A., Stark, R. E. Solid-state NMR Reveals the Carbon-based Molecular Architecture of Cryptococcus neoformans Fungal Eumelanins in the Cell Wall. Journal of Biological Chemistry. 290 (22), 13779-13790 (2015).
- Zhong, J., Frases, S., Wang, H., Casadevall, A., Stark, R. E. Following fungal melanin biosynthesis with solid-state NMR: biopolymer molecular structures and possible connections to cell-wall polysaccharides. Biochemistry. 47 (16), 4701-4710 (2008).
- Kang, X., et al. Molecular architecture of fungal cell walls revealed by solid-state NMR. Nature Communications. 9 (1), 2747 (2018).
- Takahashi, H., et al. Solid-state NMR on bacterial cells: selective cell wall signal enhancement and resolution improvement using dynamic nuclear polarization. Journal of the American Chemical Society. 135 (13), 5105-5110 (2013).
- Wang, T., Hong, M. Solid-state NMR investigations of cellulose structure and interactions with matrix polysaccharides in plant primary cell walls. Journal of Experimental Botany. 67, 503-514 (2016).
- Mentink-Vigier, F., Akbey, Ü, Oschkinat, H., Vega, S., Feintuch, A. Theoretical aspects of magic angle spinning-dynamic nuclear polarization. Journal of Magnetic Resonance. 258, 102-120 (2015).
- Gupta, R., et al. Dynamic nuclear polarization enhanced MAS NMR spectroscopy for structural analysis of HIV-1 protein assemblies. The Journal of Physical Chemistry B. 120 (2), 329-339 (2016).
- Takahashi, H., Hediger, S., De Paëpe, G. Matrix-free dynamic nuclear polarization enables solid-state NMR 13 C-13 C correlation spectroscopy of proteins at natural isotopic abundance. Chemical Communications. 49 (82), 9479-9481 (2013).
- Ni, Q. Z., et al. High frequency dynamic nuclear polarization. Accounts of Chemical Research. 46 (9), 1933-1941 (2013).
- Koers, E. J., et al. NMR-based structural biology enhanced by dynamic nuclear polarization at high magnetic field. Journal of Biomolecular NMR. 60 (2-3), 157-168 (2014).
- Saliba, E. P., et al. Electron Decoupling with Dynamic Nuclear Polarization in Rotating Solids. Journal of the American Chemical Society. 139 (18), 6310-6313 (2017).
- Mentink-Vigier, F., et al. Efficient cross-effect dynamic nuclear polarization without depolarization in high-resolution MAS NMR. Chemical Science. 8 (12), 8150-8163 (2017).
- Smith, A. N., Twahir, U. T., Dubroca, T., Fanucci, G. E., Long, J. R. Molecular Rationale for Improved Dynamic Nuclear Polarization of Biomembranes. The Journal of Physical Chemistry B. 120 (32), 7880-7888 (2016).
- Su, Y., Andreas, L., Griffin, R. G. Magic angle spinning NMR of proteins: high-frequency dynamic nuclear polarization and 1H detection. Annual Reviews of Biochemistry. 84, 465-497 (2015).
- Hediger, S., Lee, S., Mentink-Vigier, F., Paepe, G. D. MAS-DNP Enhancements: Hyperpolarization, Depolarization, and Absolute Sensitivity. eMagRes. 7, 1-13 (2018).
- Ni, Q. Z., et al. In Situ Characterization of Pharmaceutical Formulations by Dynamic Nuclear Polarization Enhanced MAS NMR. The Journal of Physical Chemistry B. 121 (34), 8132-8141 (2017).
- Hill, T. W., Kafer, E. Improved protocols for Aspergillus minimal medium: trace element and minimal medium salt stock solutions. Fungal Genetics Reports. 48 (1), 20-21 (2001).
- Rossini, A. J., et al. Dynamic nuclear polarization surface enhanced NMR spectroscopy. Accounts of Chemical Research. 46 (9), 1942-1951 (2013).
- Sauvée, C., et al. Highly efficient, water-soluble polarizing agents for dynamic nuclear polarization at high frequency. Angewandte Chemie International Edition. 125 (41), 11058-11061 (2013).
- Phyo, P., et al. Gradients in Wall Mechanics and Polysaccharides along Growing Inflorescence Stems. Plant physiology. 175 (4), 1593-1607 (2017).
- White, P. B., Wang, T., Park, Y. B., Cosgrove, D. J., Hong, M. Water-polysaccharide interactions in the primary cell wall of Arabidopsis thaliana from polarization transfer solid-state NMR. Journal of the American Chemical Society. 136 (29), 10399-10409 (2014).
- Jippo, T., Kamo, O., Nagayama, K. Determination of long-range proton-carbon 13 coupling constants with selective two-dimensional INEPT. Journal of Magnetic Resonance. 66 (2), 344-348 (1969).
- Morris, G. A. Sensitivity enhancement in nitrogen-15 NMR: polarization transfer using the INEPT pulse sequence. Journal of the American Chemical Society. 102 (1), 428-429 (1980).
- Cadars, S., et al. The refocused INADEQUATE MAS NMR experiment in multiple spin-systems: interpreting observed correlation peaks and optimising lineshapes. Journal of Magnetic Resonance. 188 (1), 24-34 (2007).
- Lesage, A., Bardet, M., Emsley, L. Through-bond carbon− carbon connectivities in disordered solids by NMR. Journal of the American Chemical Society. 121 (47), 10987-10993 (1999).
- Bennett, A. E., et al. Homonuclear radio frequency-driven recoupling in rotating solids. The Journal of Chemical Physics. 108 (22), 9463-9479 (1998).
- Lu, X., Guo, C., Hou, G., Polenova, T. Combined zero-quantum and spin-diffusion mixing for efficient homonuclear correlation spectroscopy under fast MAS: broadband recoupling and detection of long-range correlations. Journal of Biomolecular NMR. 61 (1), 7-20 (2015).
- Wang, T., Zabotina, O., Hong, M. Pectin-cellulose interactions in the Arabidopsis primary cell wall from two-dimensional magic-angle-spinning solid-state nuclear magnetic resonance. Biochemistry. 51 (49), 9846-9856 (2012).
- Wang, T., Yang, H., Kubicki, J. D., Hong, M. Cellulose Structural Polymorphism in Plant Primary Cell Walls Investigated by High-Field 2D Solid-State NMR Spectroscopy and Density Functional Theory Calculations. Biomacromolecules. 17 (6), 2210-2222 (2016).
- Kirui, A., et al. Atomic Resolution of Cotton Cellulose Structure Enabled by Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR. Cellulose. , In Press (2019).
- Wang, T., et al. Sensitivity-enhanced solid-state NMR detection of expansin's target in plant cell walls. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (41), 16444-16449 (2013).
- Wang, T., Park, Y. B., Cosgrove, D. J., Hong, M. Cellulose-Pectin Spatial Contacts Are Inherent to Never-Dried Arabidopsis thaliana Primary Cell Walls: Evidence from Solid-State NMR. Plant Physiology. 168 (3), 871-884 (2015).
- Liao, S. Y., Lee, M., Wang, T., Sergeyev, I. V., Hong, M. Efficient DNP NMR of membrane proteins: sample preparation protocols, sensitivity, and radical location. Journal of Biomolecular NMR. 64 (3), 223-237 (2016).
- Kang, X., et al. Lignin-Polysaccharide Interactions in Plant Secondary Cell Walls Revealed by Solid-State NMR. Nature Communications. 10, 347 (2019).
- Takahashi, H., et al. Rapid Natural-Abundance 2D 13C-13C Correlation Spectroscopy Using Dynamic Nuclear Polarization Enhanced Solid-State NMR and Matrix-Free Sample Preparation. Angewandte Chemie International Edition. 51 (47), 11766-11769 (2012).
